הידרוליזה אנזימטית פותחה עבור האנזימים המסחריים המתאימים בדרגת מזון

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

2.2. השפעת סינון אולטרה על תכונות הקולגן הידרוליזט

תהליך סינון אולטרה עשוי להיות שיטה שימושית, מועילה מבחינה תעשייתית, לייצור שברי פפטיד קטנים בעלי גודל מולקולרי רצוי ופעילות ביולוגית גבוהה, בהתאם להרכב ההידרוליזט ההתחלתי והפעילות הנחקרת [19]. מוצגות מסיסות, תכולת קבוצת אמינו חופשית ותשואה של CHs לאחר ליאופיליזציה (טבלה 1). המסיסות ותכולת קבוצת האמינו החופשית של הביקורת היו 11.95 אחוזים ו-0.79 אחוזים, בהתאמה. לאחר הידרוליזה אנזימטית ואולטרה סינון עם חתך משקל מולקולרי של 3 kDa, המסיסות הגבוהה ביותר (21.17 אחוז) ותכולת קבוצות אמינו חופשיות (14.17 אחוזים) נצפו ב-CH-Alcalase<3 kda.="" however,=""><3 kda="" was="" the="" lowest="" yield="" (12.42%)observed.="" therefore,="" although="" ultrafiltration="" is="" useful="" in="" separating="" chs="" with="" a="" low="" molecular="" weight="" it="" may="" cause="" a="" reduction="" in="">

המשקל המולקולרי הממוצע של הידרוליזטים של חלבונים הוא גורם חשוב שקובע את התכונות הביולוגיות שלהם [19]. בדרך כלל, חלק ממוצע עם MW<3 kda="" represents="" a="" collagen="" hydrolysate;="" an="" average="" fraction="" with="" mw="">50 kDa represents gelatin, and an average fraction with MW>300 kDa מייצג קולגן [20,21]. התפלגות המשקל המולקולרית היחסית של הבקרה (דגימת טיפול מקדים), CH-Alcalase ו-CH-Alcalase<3 kda="" is="" depicted="" in="" figure="" 4.="" the="" molecular="" weight="" distribution="" was="" over="" 20,100="" da="" for="" the="" control,="" which="" did="" not="" include="" the="" collagen="" hydrolysate=""><3 kda).="" this="" could="" not="" be="" numerically="" provided="" in="" this="" study,="" as="" the="" detection="" limit="" of="" the="" index="" detector="" system="" only="" ranged="" from="" 106="" to="" 20,100="" da.="" however,="" ch-alcalase="" showed="" detectable="" values="" in="" a="" higher="" range="" of="" relative="" molecular="" weight="" distribution,="" which="" ranged="" from="" 20,100="" da="" to="" 4270="" da="" (maximum="" peak:12,600="" da).="" in=""><3 kda,="" the="" molecular="" weight="" distribution="" mainly="" showed="" three="" peaks:="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 4270="" da="" (maximum="" peak),="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 424="" da,="" and="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 222="" da="" and="" 102="" da.="" ultrafiltration="" is="" an="" effective="" purification="" method="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight="" peptides="" from="" crude="" hydrolysates.="" results="" indicated="" that="" enzymatic="" hydrolysis="" by="" alcalase="" clearly="" reduced="" the="" high="" mw="" of="" the="" control="" (either="" collagen="" or="" gelatin),="" and="" that="" ultrafiltration="" was="" an="" effective="" purification="" method="" that="" can="" be="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight=""><3 kda)="" from="" crude="" collagen="" hydrolysates.="" reportedly,="" low="" molecular="" weight="" peptides="" (2-20="" amino="" acids)="" are="" more="" biologically="" active="" compared="" to="" their="" parent="" polypeptide/proteins,="" which="" are="" larger="">

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

הרכב חומצות אמינו ב-CHs מוצג (טבלה 2). ל-CHS על ידי פרוטאזות שונות היו הרכבים שונים של חומצות אמינו ותכונות נוגדות חמצון [23]. הרכב חומצות האמינו של הקולגן היה עשיר בגליצין (Gly), פרולין (פרו) וחומצה גלוטמית (Glu). תכולת חומצות האמינו של CHs(CH-Alcalase ו-CH-Alcalase<3 kda)="" increased="" more="" than="" that="" of="" the="" control,="" following="" enzymatic="" hydrolysis="" with="" or="" without="" ultrafiltration.="" in="" particular,="" the="" content="" of="" gly,="" pro,="" and="" glu="" was="" much="" higher="" in=""><3 kda(gly="" 218="" mg/g,="" pro="" 152="" mg/g,="" and="" glu="" 120="" mg/g)="" than="" ch-alcalase(gly149="" mg/g,="" pro="" 95="" mg/g,="" and="" glu78="" mg/g).="" an="" increase="" in="" the="" content="" of="" these="" amino="" acids="" is="" strongly="" related="" to="" enhanced="" antioxidant="" capabilities="" [16,20].="" gly="" and="" pro="" contain="" hydrophobic="" amino="" acid="" groups,="" and="" glu="" contains="" negatively="" charged="" amino="" acid="" groups.="">גזע cistancheחומצות אמינו אלו דווחו כמגבירות פעילות נוגדת חמצון בגלל המסיסות המוגברת שלהן בשומנים או באמצעות תגובות של רדיקלים חופשיים [1,24].

2.3. פעילויות נוגדות חמצון ואנטי אייג'ינג של קולגן הידרוליזטים

פעילות נוגדת החמצון של ה-CHs נמדדה באמצעות 2,2'-ו-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) בדיקת פעילות שומרת רדיקלים ובדיקת עוצמה הפחתת. פעילות ניקוי הרדיקלים של ABTS של השליטה (תרחיף קולגן), CH-Alcalase ו-CH-Alcalase<3 kda="" at="" different="" concentrations="" is="" shown="" (figure="" 5a).abts="" radical="" scavenging="" activity="" of="" peptides="" assay="" is="" important="" to="" exclusively="" measure="" the="" ability="" of="" an="" antioxidant="" peptide="" to="" induce="" a="" hydrogen="" atom="" transfer="" [25].="" abts="" radical-scavenging="" effects="" of="" all="" treatments="" increased="" in="" a="" concentration-dependent="" manner=""><0.05). ch-alcalase="" and=""><3 kda="" showed="" much="" higher="" abts="" radical-scavenging="" activity="" values,="" with="" 41.4%-88.2%="" compared="" to="" the=""><8.5%. both="" ch-alcalase="" and=""><3 kda="" had="" high="" abtsradical-scavenging="" abilities="" of="" ~60%="" when="" concentrations="" were="" greater="" than="" 2.5="" mg/ml.=""><3 kda="" showed="" a="" significantly="" higher="" abts="" radical-scavenging="" activity="" value="" than="" ch-alcalase.="">תמצית סלסה cistancheבאופן כללי, פעילות נוגדת החמצון של פפטידים עשויה להיות מושפעת מרצפי חומצות האמינו שלהם, מספר חומצות האמינו החופשיות הקיימות, מידת ההידרוליזה והמשקל המולקולרי של הפפטידים [26,27]. במיוחד, להידרוליזטים במשקל מולקולרי נמוך היו תכונות נוגדות חמצון חזקות יותר בהשוואה להידרוליזטים במשקל מולקולרי גבוה [2,26].

איור 5. פעילויות נוגדות חמצון של קולגן הידרוליזטים (CH) ב-2,2'-וביס-(3-אתיל-בנזותיאזולין-6-חומצה סולפונית)(ABTS) ניקוי רדיקלים (A) והפחתת כוח (B) מבחני. נתונים המסומנים באותיות שונות (ac) מראים הבדלים מובהקים סטטיסטית בהתאם לטיפולים שונים (עמ'<0.05).>יתרונות ותופעות לוואי של cistanche tubulosaנתונים המסומנים באותיות שונות (AD) מראים הבדלים מובהקים סטטיסטית בהתאם לריכוז (p < 0.05).

Cistanche יכול אנטי אייג'ינג

כוחות ההפחתה של הבקרה, CH-Alcalase ו-CH-Alcalase<3 kda="" are="" shown="" (figure="" 5b).="" the="" reducing="" power="" of="" peptides="" may="" also="" serve="" as="" a="" significant="" indicator="" of="" their="" antioxidant="" potential="" [28,29].="" the="" reducing="" power="" of="" chs="" ranged="" from="" 0.074="" to="" 0.424="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.05). the="" control="" group="" had="" the="" lowest="" reducing="" power,="" which="" did="" not="" change="" significantly="" with="" increasing="" concentrations="" of="" the="" control.="" in="" contrast="" to="" abts="" radical-scavenging="" activity,="" the="" reducing="" power="" of="" ch-alcalase="" was="" higher="" than="" that="" of=""><3 kda.="">תמצית cistanche tubulosaתצפיות דומות העלו כי הידרוליז של קולגן גולמי עשוי להיות יעיל יותר בהפחתת כוח מאשר פפטידי קולגן מסוננים אולטרה [30].

עיכוב פעילות טירוזינאז, קולגנאז ואלסטאז שימש כדי לאמת את ההשפעות האנטי-אייג'ינג שלהם במבחנה [20]. התוצאות של עיכוב פעילות טירוזינאז, קולגנאז ואלסטאז של הבקרה, CH-Alcalase ו-CH-Alcalase<3 kda="" are="" summarized="" (table="" 3).="" tyrosinase,="" collagenase,="" and="" elastase="" inhibitors="" have="" been="" used="" as="" important="" ingredients="" of="" cosmetics="" for="" skin="" whitening,="" anti-aging,="" and="" anti-wrinkling,="" respectively.="" collagenase="" and="" elastase,="" especially,="" are="" known="" to="" be="" major="" enzymes="" responsible="" for="" dehydration="" and="" wrinkle="" formation="" on="" the="" skin="" surface[31].="" the="" results="" indicated="" that="" the="" tyrosinase="" inhibition="" effect="" of="" vitamin="" c(95.50%,1="" mg/ml,="" positive="" control)="" was="" higher="" than="" that="" of="" the="" other="" treatments(table="" 4).="" tyrosinase="" inhibition="" effects="" of="" control,="" ch-alcalase,="" and=""><3 kda="" groups="" were="" 28.21%,="" 15.44%,="" and="" 30.20%,="" respectively.="" thus,="" the="" chs="" did="" not="" show="" a="" better="" skin="" whitening="" effect="" compared="" to="" the="" control.="" collagenase="" inhibition="" by="" the="" control,="" ch-alcalase,="" and=""><3 kda="" groups="" were="" 6.45%,54.37%,="" and="" 61.90%,="" respectively.="" in="" addition,="" ch-alcalase="" and=""><3 kda="" inhibition="" of="" collagenase="" corresponded="" to="" that="" of="" vitamin="" cat="" 1="" mg/ml.="" thus,="" chs="" obtained="" from="" this="" study="" may="" be="" effective="" collagenase="" inhibitors="" that="" may="" possibly="" play="" an="" important="" role="" in="" anti-aging="" activities.="" however,="" all="" collagen="" samples="" did="" not="" display="" elastase="" inhibition="" effects,="" which="" may="" result="" from="" a="" lack="" of="" skin="" elasticity.="" overall,="" vitamin="" c(1="" mg/ml)="" inhibited="" various="" activities="" of="" the="" enzymes="" in="" the="" following="" order:="" tyrosinase(95.50%)="">collagenase(48.09)> elastase(2/.00%o).CH-Alcalase(5 mg/mL)inhibited various activities of the enzymes in the following order: collagenase (54.37%)> tyrosinase (15.44%)>אלסטאז (ללא פעילות). CH-Alcalase<3 kda="" (5="" mg/ml)="" inhibited="" these="" activities="" in="" the="" following="" order:="" collagenase="" (61.90%)="">tyrosinase (30.20%)>אלסטאז (ללא פעילות). מגמות דומות שדווחו במחקר אחר הצביעו על כך שקולגן הידרוליזטים הראו פוטנציאל לפעול כסוכני אנטי אייג'ינג ומעכבי קולגנאז [20].

3. חומרים ושיטות

3.1. טיפול מוקדם לעור חזיר

עור חזיר נרכש מספק מקומי (סיאול, קוריאה), וכל השומן הנראה לעין ורקמות החיבור של עור החזיר הוסרו באמצעות סכין גילוח. עור החזיר בשימוש במחקר זה התקבל מחזיר אחד על מנת למזער את השונות הביולוגית. עור חזיר גזוז נשטף במים ב-90 מעלות למשך דקה אחת ארבע פעמים כדי להסיר שומן וחומרים שאריות. לאחר מכן, העור נחתך למקטעים מרובעים בגודל 1 ס"מ ופורק במים מזוקקים למשך 3 דקות באמצעות בלנדר בעל ארבע כנפיים (CNHR-26, Bosch, הונג קונג, סין). עור החזיר המפורק הומוג במהירות גבוהה (25,000סל"ד) למשך 5 דקות באמצעות Ultra Turrax (T25, IKA Labotechnik, Staufen, גרמניה). כ-100 גרם מתערובת עור החזיר (50 אחוז תוכן מוצק סופי) נארזו בוואקום והוקפאו ב--20 מעלות ואוחסנו לשימוש תוך חודש אחד.

3.2. פרוטאזות וריאגנטים מסחריים

Alcalase, Flavorzyme, Neutrase ו-Protamex נרכשו מ- Novozymes (Bagsvaerd, דנמרק). ברומליין ופפאין נרכשו מ- Daesong Sangsa (סיאול, קוריאה). כל הכימיקלים לבדיקות נוגדי חמצון ואנטי אייג'ינג נרכשו מחברת כימיקלים סיגמא-אלדריץ' (St.Louis, MS, ארה"ב). כל שאר הריאגנטים והממסים ששימשו במחקר זה היו בדרגה אנליטית.

3.3. הידרוליזה של אנזים

הידרוליזה אנזימטית פותחה עבור האנזימים המסחריים בהתאמה למזון המשמשים (בהתבסס על המלצות היצרן; טבלה 4). תערובת עור החזיר שהוכנה דוללה במים מזוקקים לתכולת מוצק סופית של 5 אחוזים. ריכוז זה נבחר כדי להבטיח התנהגות זרימה בגלל הצמיגות הנמוכה שלו. תערובת עור החזיר של 5 אחוזים כונתה תרחיף הקולגן (או השליטה). תרחיף הקולגן עבר הידרוליזה בכורים באמצעות שישה אנזימים מסחריים באיכות מזון ביחס אנזים: מצע של 1:100. מנות דגימה (5 מ"ל) נמשכו ב-1, 3,6, 12 ו-24 שעות של הידרוליזה וחוממו מיד ל-100 מעלות למשך 10 דקות כדי להשבית את האנזים, ולאחר מכן קירור ל-0 מעלות באמצעות מי קרח. במהלך זמן הדגימה, ה-pH נשלט באמצעות 1 M NaOH לפי הצורך. לאחר הקירור, דגימות עברו צנטריפוגה ב-4000×g למשך 15 דקות, והסופרנטנט (קולגן הידרוליזט; CH) נאסף. CH רוכז עוד יותר על ידי סינון אולטרה, באמצעות מערכת AmiconStirred Cells (מספר קטלוגי UFSC 20001, EMD Millipore Corporation, Burlington, MA, ארה"ב) עם גזירה של 3 kDa משקל מולקולרי (MWCO) (UltracelMembrane, EMD Millipore Corporation, Burlington, MA, ארה"ב) בגז חנקן של 60 psi, ב-20 מעלות.ביקורות על cistanche tubulosaה-CH המוכן יובש בהקפאה ונשמר במיכלים אטומים לאוויר ב-20 מעלות עד לניתוח.

3.4. קביעת pH, שחזור חלבון, תוכן קבוצת אמינו ללא מסיסות ותפוקת ייצור ה-pH של הדגימות (בקרה ו-CH) נקבע באמצעות מד pH (דגם S220, Mettler Toledo GmbH, Columbus, OH, ארה"ב). שחזור החלבון או מסיסותו נקבעו על ידי הערכת תכולת החלבון באמצעות בדיקת חלבון חומצה ביצינצ'ונינית (BCA), בהתאם להוראות היצרן (Sigma-Aldrich, St. Louis, MS, USA) עם אלבומין בסרום כסטנדרט. תכולת קבוצת אמינו חופשית נקבעה באמצעות מבחן 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBSA) לפי הוראות היצרן (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב) תוך שימוש ב-L-leucine כסטנדרט. נמדדו משקלים רטובים ויבשים לחישוב שדה הייצור.

3.5. חלוקת משקל מולקולרי

3.5.1. Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)

דפוסי SDS-PAGE של דגימות (ביקורת ו-CHs) נמדדו לפי שיטה שדווחה בעבר [10]. דגימות דוללו ב-8 M אוריאה (ריכוז חלבון סופי, 4 מ"ג/מ"ל). כל דגימה עורבבה עם חלק אחד של חיץ מדגם KTG 020 (10 אחוז של גליצרול, 2 אחוז מ-SDS, 0.003 אחוז של ברומופנול כחול, 5 אחוז מ-mercaptoethanol, ו-63 mM Tris-HCl, pH6.8) מ-KOMA Biotech Inc. ., （סיאול, קוריאה）, והרתיח במשך 2 דקות. תערובת הדגימה （20 μL） הועמסה לתוך EzWayTM PAG ג'לים של 6 אחוז אקרילאמיד (KOMA Biotech Inc., סיאול, קוריאה). לאחר אלקטרופורזה, הג'ל היה מקובע, מוכתם ומוסר. המשקלים המולקולריים נקבעו באמצעות תקני משקל מולקולרי רחב טווח בין 10 ל-210 kDa.

3.5.2. ג'ל פרמיציה כרומטוגרפיה (GPC)

התפלגות המשקל המולקולרית של דגימות נקבעה על פי שיטה שדווחה בעבר [3]. כרומטוגרפיית חדירת ג'ל (GPC) בוצעה באמצעות YL9100 מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC)(YL9100, Youngling Instrument Co., Ltd, Gyeonggi-do, קוריאה) מצוידת בשלוש עמודות Ultrahydrogel TM 120( 7.8×3000 מ"מ) מ-Waters (Milford, MA, ארה"ב). הפאזה הניידת הייתה מזוקקת/דה-יון בקצב זרימה של 1.0 מ"ל/דקה, והתפלגות המשקל המולקולרית של פפטידי הקולגן נוטרו באמצעות גלאי מקדם שבירה YL 9100 ב-40 מעלות. ערכת תקני משקל מולקולרי (106-67,500 Da, Polymer Standards Service, מיינץ, גרמניה) שימשה כתקן.

3.6.הרכב חומצה אמין0

הרכב חומצות האמינו של הדגימות נותח באמצעות נגזרת עם {{0}}פלואורניל אתוקס קרבוניל (FMOC)-כלוריד ו-o-phthalic dialdehyde (OPA) על מערכת Ultimate 3000 HPLC ( Dionex, Idstein, גרמניה) מצויד בשני גלאים (גלאי פלואורסצנטי וגלאי UV) ו-VDSpher 100 C18-E （4.6 מ"מ ×150 מ"מ, גודל חלקיקים של 3.5 מיקרומטר, VDS Optilab, ברלין, גרמניה). נפח ההזרקה היה 1.0 ליטר, והפאזה הניידת הורכבה משני חומרים: תמיסת מתנול של 40 מ"מ נתרן פוספט דו-בסיסי (pH 7) ו-45% (o/v) acetonitrile/45% (v/v). על ידי חיבור גלאי UV וגלאי פלואורסצנטי, זוהו קרניים אולטרה סגולות ב-338 ננומטר, נגזרת OPA זוהתה ב-450 ננומטר של אורך גל פליטה ו-340 ננומטר של אורך גל עירור, נגזרת FMOC זוהתה באורך של 305 ננומטר ו-26 ננומטר. ננומטר של אורך גל עירור. תערובת חומצות אמינו (1.0 nmol mL-I עבור כל חומצת אמינו) שימשה לכיול.

כאשר חומצת אטוטלאמינו הייתה התוכן לאחר הידרוליזה באמצעות 6M HCl (ב-130 מעלות למשך 24 שעות), וחומצת אמינו Afree הייתה התוכן לאחר מסיסות במים מזוקקים.

3.7. הערכת פעילות נוגדת חמצון

3.7.1.2,2'-אזינו-ביס-(3-אתיל-בנזותיאזולין-6-חומצה סולפונית) (ABTS) פעילות שומרת רדיקלים

פעילות סילוק רדיקלים של ABTS של CH נמדדה לפי שיטה שדווחה בעבר [20]. הקטיון ABTSradical נוצר על ידי ערבוב תמיסת מניות ABTS (7.0 mM) עם אשלגן פרסולפט (2.45 mM) ודגירה של התערובת שנוצרה בחושך בטמפרטורת החדר למשך הלילה. התמיסה הרדיקלית של ABTS דוללה ב-5.0 mM מלוחים מלוחים בפוספט (pH7.4) לרמת ספיגה של 0.70±0.02 ב-734 ננומטר. מ"ל אחד של תמיסת ה-ABTS הרדיקלית המדוללת היה מעורבב עם 1 מ"ל מכל דגימה. עשר דקות לאחר מכן, נמדדו ספיגה של דגימה (דגימה, עם דגימה) ובקרה (בקרה ללא דגימה) ב-734 ננומטר. הפעילות לניקוי רדיקליים של ABTS( אחוז) חושבה כך:

3.7.2.הפחתת כוח

כוח ההפחתה של CH נמדד על פי שיטה שדווחה בעבר [20]. מ"ל אחד מכל דגימה מעורבב עם 1 מ"ל של 0.2 M חיץ פוספט (pH6.6) ו-1 מ"ל של 1 אחוז אשלגן ferricyanide. התערובת הודגרה ב-50 מעלות למשך 20 דקות, ולאחר מכן נוספה 1 מ"ל של חומצה טריכלורואצטית 10 אחוז. מנה של 2 מ"ל מתערובת הדגירה הזו עורבבו עם 2 מ"ל מים מזוקקים ו-0.4 מ"ל של 0.1 אחוז כלוריד ברזל. לאחר 10 דקות, הספיגה של התמיסה שהתקבלה נמדדה ב-700 ננומטר בספקטרופוטומטר (OPTIZEN, Mecasys Co., Daejeon, קוריאה) ספיגה מוגברת (ב-700 ננומטר) של תערובת התגובה נחשבה כמצביעה על כוח הפחתת מוגבר.

3.8. הערכת אפקט האנטי אייג'ינג

3.8.1. עיכוב פעילות טירוזינאז

עיכוב טירוזינאז נקבע על ידי שיטה שתוארה בעבר [20]. תמיסה מקדימה המכילה 70 μL של חיץ פוספט 0.1M (pH6.8), 30uLof טירוזינאז פטריות (167U/mL; Sigma-Aldrich, ארה"ב), ו-20 ליטר מהדגימה הודגרו למשך 5 דקות ב-30 מעלות. לאחר מכן נוספו כ-100μL של 3,4-dihydroxy phenyl-L-alanine (L-DOPA) כדי להתחיל את התגובה האנזימטית. ספיגה ב-492 ננומטר נמדדה למשך 20 דקות כדי לעקוב אחר היווצרות L-DOPA. חומצה אסקורבית (1 מ"ג/מ"ל) שימשה כביקורת חיובית, אשר שימשה להשוואה. יחס העיכוב חושב באופן הבא:

כאשר A היה תערובת עם טירוזינאז ללא מדגם; B הייתה תערובת ללא דגימה וטירוזינאז; C הייתה תערובת עם דגימה וטירוזינאז, ו-D הייתה תערובת עם דגימה אך ללא טירוזינאז.

3.8.2.עיכוב פעילות קולגנאז

עיכוב קולגנאז נקבע על ידי שיטה שתוארה בעבר [20]. בקצרה, הוכן 50 מ"מ טריצין חיץ (pH7.5) המכיל 10 מ"מ סידן כלורי ו-400 מ"מ נתרן כלורי. לאחר מכן, 50 מ"ל של תמיסה של 1.0 מ"מ N-[3-(2-furyl) אקרילויל]-Leu-Gly-Pro-Ala ו-0.2 מ"ג/מ"ל קולגנאז (מ-Clostridium histolyticum, סוג IA, 0.{ {19}} FALGPA U/mg solid; Sigma-Aldrich, ארה"ב) נוספו בנוכחות ובהעדר דגימות. התגובה הופסקה על ידי הוספת חומצת לימון (6 אחוזים). תערובת התגובה הופרדה על ידי הוספת אתיל אצטט. הספיגה של הסופרנטנט נמדדה ב-345 ננומטר. חומצה אסקורבית (1 מ"ג/מ"ל) שימשה כביקורת חיובית ושימשה להשוואה. אחוז העיכוב חושב כך:

כאשר A היה תערובת עם קולגנאז ללא דגימה; B הייתה תערובת ללא דגימה וקולגנאז; C הייתה תערובת עם דגימה וקולגנאז, ו-D הייתה תערובת עם דגימה אך ללא קולגנאז.

3.8.3. עיכוב פעילות אלסטאז

עיכוב אלסטאז נקבע על ידי שיטה שתוארה בעבר [20]. N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (Suc-Ala-Ala-Ala-pNA) שימש כמצע, והשחרור של p-nitroaniline נוטר במשך 2{{20}} דקות ב-25 מעלות. חלק (1 ug) של אלסטאז לבלב חזיר מסוג IV (PPE) הומס ב-1 מ"ל של 0.2 M Tris-HCl חיץ (pH 8.0). תערובת התגובה הכילה 0.2 M Tris-HCl חיץ (pH8.0), 1 ppm PPE, 0.8 mM Suc-Ala-Ala-Ala-pNA, הדגימה והמצע שהוזכר לעיל. נמדדה ספיגה ב-214 ננומטר. חומצה אסקורבית (1 מ"ג/מ"ל) שימשה כביקורת חיובית ששימשה להשוואה. יחס העיכוב חושב באופן הבא:

כאשר A היה תערובת עם אלסטאז וללא מדגם; B הייתה תערובת ללא דגימה ואלסטאז; C הייתה תערובת עם דגימה ואלסטאז, ו-D הייתה תערובת עם דגימה אך ללא אלסטאז.

3.9.ניתוח סטטיסטי

הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית התקן (SD). המשמעות של ההבדלים בין הקבוצות הוערכה באמצעות השוואות מרובות וניתוח שונות (ANOVA), ואחריה מבחן Tukey honest significant difference (HSD). הבדלים עם ערכי p של פחות מ-0.05 נחשבו מובהקים סטטיסטית.

4. מסקנות

במחקר זה, הידרוליזטים של קולגן, מרכיב מזון פונקציונלי, הופקו בהצלחה באמצעות הידרוליזה אנזימטית, ולאחר מכן סינון וטיהור אולטרה. פרוטאזות מסחריות שונות נבדקו עבור התועלת הפוטנציאלית שלהם בייצור הידרוליזטים מתאימים של קולגן. CHS שעבר הידרוליזה על ידי Alcalase היה ה-CHs שעבר הידרוליזה בצורה היעילה ביותר, וסינון אולטרה ואחריו טיהור היה יעיל ביצירת פפטידים פעילים בעלי משקל מולקולרי נמוך. התוצאות הראו שה-CHs הציגו פעילות מצוינת של עיכוב נוגדי חמצון וקולגנאז. לכן, CHs שהתקבלו על ידי מחקר זה עשויים לשמש בתעשיות מזון, קוסמטיקה או תרופות כתוסף טבעי, בעל תכונות אנטי-אוקסידטיביות ואנטי-אייג'ינג. מחקרים נוספים הכוללים הערכה in vivo של פעילויות ההזדקנות של פפטידים פעילים בעור אנושי עשויים להתגלות כמועילים.

מאמר זה מופק ממולקולות 2019, 24, 1104; doi:10.3390/molecules24061104 www.mdpi.com/journal/molecules