השפעות של לחצי זלוף על אובדן פודוציטים בכליית העכבר המבודדת המבודדת
Mar 13, 2022
תַקצִיר
רקע/מטרות: פודוקיטים הולכים לאיבוד ברוב המחלות הגלומרולריות, מה שמוביל לגלומרולוסקלרוזיס ופרוגרסיבימחלת כליות. ההנחה הכללית היא שפודוציטים חשופים לזרימת הסינון ובכך לכוחות גזירה משמעותיים המניעים את ניתוקם מקרום הבסיס הגלומרולרי (GBM). בהקשר זה, ביטול תהליך כף הרגל הוצע כתגובה אדפטיבית פוטנציאלית להגברת ההידבקות של פודוציטים ל-GBM. שיטות: בדקנו השערות אלה באמצעות ניקוי אופטי וניתוח מורפומטרי 3-ברזולוציה גבוהה בעכבר המבודד המבודדכִּליָה.חקרנו את הדינמיקה של ניתוק פודוציטים בלחצי זלוף שונים (50, 300 ויותר מ-450 מ"מ כספית) בעכברים צעירים או מבוגרים בריאים (גיל 20 לעומת 71 שבועות), או עכברים שהוזרק להם סרום אנטי-GBM כדי לגרום לכף רגל גלובלית מחיקת תהליכים. תוצאות: התוצאות מראות שפודוציטים בריאים בעכברים צעירים מחוברים בחוזקה ל-GBM ואפילו לחצים על-מקסימליים לא גרמו לניתוק משמעותי. בהשוואה לעכברים צעירים, בעכברים מבוגרים ובעכברים עם דלקת נפריטיס נגד GBM וחיסול תהליך כף הרגל, אובדן הדרגתי של פודוציטים התרחש כבר לפני הזילוף. לחצי זלוף גבוהים הביאו לאובדן נוסף קל יחסית של פודוציטים בעכברים מבוגרים. בעכברים עם נפריטיס נגד GBM, אובדן פודוציטים משמעותי נוסף התרחש בנקודת זמן מוקדמת זו כשהעלאת לחצי הזילוף ל-300 מ"מ כספית ומעלה. מסקנה: עבודה זו מספקת את ההוכחה הניסויית הראשונה לכך שפודוציטים עמידים בצורה יוצאת דופן ללחצי זלוף מוגברים בצורה חריפה ב-ex vivo מבודדכִּליָהדגם זלוף. רק במחלה גלומרולרית, מספר משמעותי של פודוציטים פצועים התנתקו בעקבות עלייה חריפה בלחץ הזילוף.
מילות מפתח:יתר לחץ דם גלומרולרי; היפרפילטרציה גלומרולרית; מתח מכני; הִתקַדְמוּת; מחלת כליות כרונית
CISTANCHE ישפר מחלת כליות/כליות
מבוא
יתר לחץ דם גלומרולרי והיפרפילטרציה פוגעים בגלומרולוס המובילים למחלה גלומרולרית מתקדמת. הדעה הרווחת היא כי לחץ זלוף מוגבר חושף את הגוש ללחץ מכני מוגבר המאתגר את היצמדות הפודוציטים לממברנת הבסיס הגלומרולרית (GBM), מה שתורם לניתוקם [1, 2]. פודוציטים הם תאים פוסט-מיטוטיים מובחנים מאוד, חיוניים למחסום סינון גלומרולרי שלם. אובדן פודוציטים הוא ככל הנראה תוצאה של ניתוק של תאים קיימא מה-GBM ולא אפופטוזיס או נמק [3-6] שכן ניתן היה לתרבת פודוקיטים שהתאוששו מהשתן של החולים [4]. ניתוק של פודוקיטים ברי קיימא מה-GBM עלול לנבוע ממנגנוני התקשרות לקויים או כוחות אל-מכאניים. התקשרות לקויה ל-GBM עשויה לנבוע מפגיעה תאית או ביטוי מופחת של מולקולות הידבקות וקשורה בעיקר למחלות גלומרולריות דלקתיות. ביחס לכוחות מכניים הרלוונטיים לפודוציט, ישנם שני גורמים מרכזיים, כלומר לחץ סינון וזרימת סינון [7-9]. לחץ סינון יוצר מתח דופן היקפי ופועל ככוח מתרחב על ה-GBM. שינויים בלחץ ההידרוסטטי הטרנס-מוראלי מתוגמלים ביעילות על ידי היכולת של ה-GBM לפעול כממברנה אלסטית ולהתרחב או להתכווץ בשטח הפנים [8, 10]. מצד שני, זרימת סינון על פני ה-GBM מפעילה כוחות משיקים על פני השטח של פודוציטים, כלומר מתח גזירה. אנו יודעים ממחקרים חוץ-גופיים שפודוציטים רגישים מאוד למתח גזירה המתנתק מהמצע שלהם כאשר הם נחשפים ללחצי גזירה של יותר מ-0.025 Pa [11] ומאמצים פנוטיפ ביניים שעשוי לעזור להם לסתור כוחות הנובעים מזרימה [12]. האם יתר לחץ דם גלומרולרי משפיע על פודוציטים באמצעות לחץ סינון מוגבר ו/או סינון מוגבר עדיין לא ברור. במחקר זה, אנו מספקים את הניתוח הראשון של יכולתם של פודוציטים להתנגד לכוחות מכניים מוגברים במודל ex vivo. אובדן פודוציטים הוכמת ברזולוציה גבוהה באמצעות ניקוי רקמות ו3-ניתוח מורפומטרי ממדי בעכברים צעירים ובריאים
חומרים ושיטות
כל הניסויים בבעלי חיים נערכו על פי ההנחיות של החוק הגרמני לרווחת בעלי חיים ואושרו על ידי Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (Az 84-02.04. 2015.A469). עכברים אוכסנו במתקן ספציפי ללא פתוגנים עם גישה חופשית למאכל ולמים ומחזור של 12-שעות יום/לילה. גידול וגנוטיפים נעשו על פי נהלים סטנדרטיים. עכברי Pod-rtTA/LC1/R26R/H2BeGFP על רקע גנטי FVB/N תוארו בעבר [13]. כדי להפעיל ביטוי טרנסגן של Pod-rtTA-eGFP, עכברים קיבלו דוקסיציקלין דרך מי השתייה באופן חופשי למשך 7 ימים (2 גרם/ליטר, 5 אחוז סוכרוז, מוגן מאור) ולאחר מכן תקופת הדחה של שבוע אחד לפי דיווחים קודמים. אנטי-GBM נפריטיס הושרה על ידי זריקה תוך צפקית אחת של 5 מ"ג/ג' סרום נפרוטוקסי במשקל גוף כפי שתואר קודם [14].
CISTANCHE ישפר את תפקוד הכליות/כליות
זלוף כליות
המבודדיםכִּליָהמודל זלוף שימש כמתואר במקומות אחרים [15]. בקצרה, העכברים נרקומו עם זריקה תוך-צפקית של קסילזין/קטמין (0,1 מ"ל/10 גרם משקל גוף ip), ולאחר מכן זרפו לכליות תמיסת קרבס-הנסלייט (טבלה 1) שעברה תוספת של 5. אחוז אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-37 מעלות כדי לחקות את הסביבה הפיזיולוגית במהלך הניסוי. הרחבת כלי דם מקסימלית שלכִּליָהכלי הדם הושרה על ידי 1. הזרקה תת עורית של verapamil (50 µl) מיד לאחר השראת הרדמה ו- 2. הוספת Papaverine לתמיסת הזילוף. לאחר זלוף ראשוני במשך 5 דקות ב-50 מ"מ כספית, הוזרק לקטין מסומן פלואורסצנטי (Communis I - RCA120; מעבדות וקטור: RL-1082; 4 ul ב-986 ul של מי מלח) לסימון תאי אנדותל.כליותזלגו במשך 5 דקות נוספות עם תמיסת Krebs-Henseleit המותאמת עם 5 אחוזי BSA. אחרי זה השמאלכִּליָהששימש כבקרה זוגית בכל ניסוי הוסר לאחר קשירה קפדנית של שמאלשֶׁל הַכְּלָיוֹתכלים, חתוכים לפרוסות, וטבול ישירות ב-3 אחוז פרפורמלדהיד (PFA) בתמיסת מלח מחוסרת פוספט (PBS). הנכוןכִּליָה was perfused either for additional 5 minutes at 300 mmHg or with supramaximal pressure (>>300 מ"מ כספית, לחצי הסינון הוערכו בהרבה מעל 400 מ"מ כספית), מיושמים באופן ידני, נפח כולל של תמיסת זלוף של 50 מ"ל. הכליותחולפו בלחץ קבוע של 50 מ"מ כספית או 300 מ"מ כספית על ידי שימוש במשאבה מבוקרת לחץ (Universal Perfusion Systems UP-100, Hugo-Sachs Electronics, גרמניה). ואז הימיןכִּליָההוסר, חתך לפרוסות של 2 מ"מ, וטבול ב-3 אחוז פרפורמלדהיד (PFA) בתמיסת מלח מחוסרת פוספט (PBS).
הדמיה תלת מימדית וניתוח חישובי שקוע ב-PFAכִּליָהפרוסות הודגרו על שייקר מכני למשך 5 ימים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגימות קבועות נשטפו ב-1x PBS והונחו בשייקר מכני למשך הלילה בטמפרטורת החדר.כִּליָהלאחר מכן הונחו פרוסות באתנול 100 אחוז ברמה גבוהה (Merck; 100983) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין (לפחות שינוי אחד לאתנול טרי), ולאחר מכן טבילה ישירה באתיל קינמט (ECi) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 112372) והושארו למשך הלילה בשייקר עדין בטמפרטורת החדר תחת הגנה קלה. שקיפות הרקמות הושגה תוך פחות משעה. עבור מיקרוסקופים זקופים, השתמשנו בתאים חד פעמיים שנבנו בבית כפי שתואר קודם [16]. רוב הניסויים בוצעו באמצעות 2-מיקרוסקופ פוטונים (LaVision BioTec TriMScope, "Medizinische Fakultät RWTH Aachen, IZKF Aachen, Core Facilities). תוכנת הדמיה של פיג'י שימשה כדי לעבור דרך ציר ה-Z של כל ערימה של קטעים אופטיים סדרתיים. ולבודד גלומרולים בודדים באמצעות חיתוך תלת מימדי [16]. 40 גלומרולים לכלכִּליָה(20 תת-קורטיקליים ו-20 יוקסטמדולים) נבחרו לניתוח. לפיכך, בסך הכל נותחו 1200 גלומרולים במחקר זה כדי לקבל תוצאות בדיוק מספיק. Podocytes זוהו כתאים eGFP plus. כימות נפח נימי, נפח גלומרולרי וכן מספר גרעינים (נקודות) ונפח בוצע באמצעות תוכנת רינדור וניתוח תלת מימד (Imaris v9.1; Bitplane AG, ציריך, שוויץ) מרחק הפודוציטים מהקוטב של כלי הדם חושב באמצעות Bitplane XTension "הנקודה הקרובה ביותר. מרחק". כימות אוטומטי של פודוציטים בוצע כפי שתואר קודם [17]. ניתוח תמונה בוצע באמצעות Imaris (Biplane AG Zurich, שוויץ). כל גלומרולוס הוגדר על ידי העורק האפרנטי שלו המסומן בלקטין. 20 תת-קורטיקליים ו-20 יוקסטאמדולים (מוגדרים לפי המרחק שלהם ממשטח הקורטיקלי).
CISTANCHE ישפר כאבי כליות/כליות
מיקרוסקופ אור ואימונופלואורסצנטי
עבור מיקרוסקופ אור, הפורמלין בחציצה של 4 אחוז מקובעכִּליָהשברים התייבשו, הוטבעו בפרפין והוצבעו בחומצה מחזורית-שיף (PAS). אחוז הגלומרולי הלא תקינים/פגועים חושב על סמך זיהוי של 50 חתכים גלומרולריים מייצגים לכל עכבר שנבחר במהלך הליכה שיטתית על פנישֶׁל הַכְּלָיוֹתקליפת המוח. הפרוטוקול האימונופלואורסצנטי הסטנדרטי שלנו [18] בוצע על קטעים משובצים בפרפין של 2 מיקרון. נעשה שימוש בנוגדנים הבאים: עוף polyclonal anti-GFP (ab13970; Abcam), monoclonal anti-synaptopodin של עכבר (sc-515842; Santa Cruz Biotechnology), ארנב רב שבטי אנטי עכבר p57 (sc-8298; סנטה -Cruz Biotechnology), ארנב polyclonal anti-WT1 (sc-192; Santa-Cruz Biotechnology), Cy2 חמור נגד עוף (703-225-155; Dianova, המבורג, גרמניה), Alexa Fluor546 עז נגד עכבר IgG1 (A-21123; Thermo Fischer), חמור רב-שבטי נגד ארנב AF555 (A31572; Life Technologies, Carlsbad, CA).
אלקטרון מיקרוסקופי
חתיכות קטנות של קליפת המוח נקבעו בתמיסת קרנובסקי והוטמעו באפון (סרווה, היידלברג, גרמניה). קטעים דקים במיוחד נבדקו עם מיקרוסקופ אלקטרוני תמסורת ZEISS Leo 906 ב-60 קילוואט בהגדלה מ-3597-6000x. דגימות נשטפו בפוספט 0.1 M Soerensen's (Merck, Darmstadt, גרמניה), נקשרו לאחר 1% OsO 4 (Roth, Karlsruhe, גרמניה) במאגר סוכרוז של 17% (Merck, Darmstadt, גרמניה) והתייבשו על ידי סדרת אתנול עולה ( 30, 50, 70, 90 ו-100 אחוזים) למשך 10 דקות כל אחד. השלב האחרון חזר על עצמו 3 פעמים. דגימות מיובשות הודגרו בפרופילן אוקסיד (Serva, Heidelberg, גרמניה) למשך 30 דקות, בתערובת של שרף Epon (Serva, Heidelberg, גרמניה) ופרופילן אוקסיד (1:1) למשך שעה אחת ולבסוף ב-Epon טהור למשך שעה. פילמור אפון בוצע ב-90 מעלות למשך שעתיים. קטעים דקים במיוחד (70-100 ננומטר) נחתכו על ידי אולטרה-מיקרוטום (Reichert Ultracut S, Leica עם סכין יהלום (Leica) ונאספו ברשתות Cu/Rh (HR23 Maxtaform, Plano, Wetzlar גרמניה). הניגודיות הוגברה על ידי צביעה עם 0.5 אחוז אורניל אצטט ו-1 אחוז עופרת ציטראט (שניהם EMS, מינכן, גרמניה). דגימות נצפו במתח תאוצה של 60 קילו וולט באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים של Zeiss Leo 906 (Carl Zeiss, Oberkochen, גרמניה).
ניתוח סטטיסטי
ניתוחים סטטיסטיים בוצעו עם תוכנת GraphPad Prism v8. כל הערכים מבוטאים כאמצעים ± SD. לצורך השוואה של 2 קבוצות, נעשה שימוש במבחן t. השוואה בין מספר קבוצות בוצעה באמצעות ניתוח שונות; תיקון Tukey post-hoc שימש להשוואות מרובות. כל המבחנים היו 2-בעלי זנב ומובהקות סטטיסטית הוגדרה כ-P <>
תוצאות
שיטה חצי אוטומטית לקביעת מספר הפודוציטים לכל גלומרולוס נחקרה שלוש קבוצות, כלומר עכברים צעירים ומבוגרים בריאים ועכברים עם אנטי-GBM גלומרולונפריטיס (♂:♀ 1:1). עכברים צעירים ובריאים היו בני 15-21 שבועות, ואילו מבוגרים (בגיל) היו בני 74 שבועות. מחיקה גלובלית של תהליך כף הרגל נגרמה בעכברים בני 14-20 שבועות באמצעות זריקה אחת של סרום אנטי-GBM 3 ימים לפני הקמת המבודדים המבודדים.כִּליָהדגם (איור 1A), כפי שתואר בעבר [19].
כדי לקבוע את ההשפעה של לחץ זלוף תוך-כליתי על פודוקיטים,כליותהיו נתונים ללחצי זילוף שונים אצל המבודדיםכִּליָהדגם זלוף. ראשית, שניהםכליותהיו תמיד זלופים ב-50 מ"מ כספית למשך 5 דקות. כדי לבדוק אם תמיסת הזילוף שלנו שימרה את שלמות הגלומרולוס בבלתי מקובע בר-קיימאכליות2 עכברים הוזרמו בלחץ קבוע של 100 מ"מ כספית למשך 90 דקות. זלוף, זרימת השתן (25 µl/min/gr משקל גוף) כמו גם פינוי אינולין (22 µl/min) נשארו יציבים לאורך כל הזמן (איור משלים. 1 - לכל החומר המשלים ראהwww.cellphysiolbiochem.com).בעכברי ניסוי, לאחר זלוף ראשוני ב-50 מ"מ כספית, השמאליכִּליָה was removed and served as a control in all experiments. Next, constant pressure of 300 mmHg or a pressure significantly higher than 300 mmHg (>>300 מ"מ כספית; לחץ סינון על-מקסימלי של כ-450 - 500 מ"מ כספית) הופעל על הימין הנותרכִּליָהלמשך 5 דקות (איור 1B). במבודד מבולבלכליות, פודוציטים זוהו באמצעות תיוג גרעיני עם eGFP-histone בעכברים הטרנסגניים שלנו המבטאים eGFP תחת מקדם פודוקין (עכברי eGFP:Pod-rtTA). מספרי פודוציטים נכמתו באמצעות שילוב של תיוג מטבולי זה in vivo ומורפומטריה תלת-ממדית (איור 1C).
אובדן פודוציטים בעכברים בריאים ומבוגרים
Healthy mice contained 87.46 ± 5.66 (SD) podocytes per glomerulus at baseline (i.e.at physiological perfusion pressure of 50 mmHg) (Fig. 2A). Juxtamedullary glomeruli were larger than those in the outer cortex (Supplementary Fig. 2), but this was not associated with higher podocyte numbers (87.0± 23.65 vs. 90.1 ± 18.49, respectively, Fib 2B). No differences in the number of podocytes related to sex were observed (see below). In young mice, there was no significant loss of podocytes at high (300 mmHg) or maximal (>>300 mmHg) perfusion pressures (85.62 ± 10.83 and 81.98 ± 6.45 podocytes per glomerulus, respectively) (Fig. 1A). On PAS sections, mild histological changwere observed particularly in aged mice (Fig. 2A), which were independent of perfusion pressures. In addition, tubular dilatation and interstitial edema were apparent as a result of perfusion. In humans, older age (53 ± 10 years) has been associated with absolute and relative podocyte depletion [20]. Compared to young mice, our mice aged 72 weeks contained significantly lower numbers of podocytes per glomerulus at baseline (52.81 ± 13.8 SD), indicating that about 40% of the podocytes had been lost. Perfusion at high or maximal pressures resulted in only a very mild reduction of podocyte numbers (48.65 ± 16.8 SD and 41.06 ± 17.7 SD, respectively). Because of the precision of the counting method (absolute podocyte numbers in 40 glomeruli per mouse) [21], the loss of podocytes of 7.9% and 22% after perfusion with 300 or >>300 מ"מ כספית בהתאמה בהשוואה לקו הבסיס מצביע על כך שהעלייה הקלה הזו באובדן פודוציטים עם לחץ גבוה יותר אינה ממצא מקרי. בקטעי PAS, שינויים גלומרולריים קלים נצפו בעכברים מבוגרים בקו הבסיס (התרחבות מסנגיאלית וטרשת מזדמנת, איור 2F). א
אובדן פודוציטים לאחר פציעה חריפה
סרום אנטי-GBM יושם על עכברים בריאים צעירים כדי לגרום לפגיעה משמעותית וספציפית בפודוציטים. בנקודת הזמן המוקדמת מאוד (כלומר 3 ימים) לאחר אינדוקציה של אנטי-GBM glomerulonephritis, מחיקה כללית של תהליך כף הרגל נצפתה בכל הגלומרולי על ידי מיקרוסקופיה אלקטרונית העברה (איור 3A-D). במבודד מבולבלכליותobtained from these mice, at baseline (i.e. perfusion with 50mmHg) podocyte numbers per glomerulus were reduced by 20% compared to controls (69.76 ± 7.07 vs 87.46 ± 5.66, respectively) (Fig. 3E). Perfusion with higher pressures (300 and >>300 mmHg) resulted in significant further reductions of podocyte numbers per glomerulus (50.84 ± 7.82 and 53.18 ± 4.26, respectively), i.e. 27% and 24% additional reduction (Fig. 3E). When analyzing individual glomeruli, the anti-GBM mice, perfusion with >>300 מ"מ כספית גרמו ליותר מ-80 אחוז לאובדן פודוציטים במיעוט מהגלומרולי (איור 3E). זה עולה בקנה אחד עם האופי המוקד של מודל המחלה נגד GBM. בתוך glomeruli juxtamedullary, אובדן podocyte היה בולט יותר בהשוואה ל-subcortical glomeruli (56.66 ± 16.9 ו-47.35 ± 17.07, בהתאמה) (איור 3F)
By transmission electron microscopy (TEM), specific changes were observed after high perfusion pressures, in particular focal podocyte detachment from the GBM and denuded basement membrane (Fig. 3D). Cellular debris was present within the capillaries as well as within Bowman's space (>>300 מ"מ כספית); האנדותל לא הראה שינויים משמעותיים. צביעת PAS זיהתה התרחבות צינורית. שלושה ימים לאחר הזרקת סרום אנטי-GBM, עדיין לא התפתחו נגעים סהרניים (איור 3G-I). זכרים הראו רמה גבוהה יותר של אובדן פודוציטים בהשוואה לנקבות (63.71 ± 2.11 לעומת 75.81 ± 3.83 פודוציטים לכל גלומרולוס), מה שעולה בקנה אחד עם התצפית שעכברים מאלים רגישים יותר לאנטי-סרום נגד GBM ויוצרים יותר סהרונים תאיים במהלך המחלה (איור 3J). עם זאת, האובדן הנוסף של פודוציטים לאחר לחצי זלוף גבוהים היה דומה בזכרים ובנקבות (איור 3J).
איור 3. אובדן פודוציטים לאחר פציעה חריפה. (AB) מיקרוסקופ אלקטרונים העברה מבקרהכִּליָה per- fused at a low pressure and after supramaximal pressure (>>300 mmHg) shows normal foot process architecture. (C-D) Transmission electron microscopy reveals the typical finding of foot process effacement after injection of anti-GBM serum at baseline. After perfusion with higher pressure, areas of denuded basement membrane were observed. (E) Total number of podocytes per mouse in anti-GBM mice at baseline and under higher (300 mmHg) or supramaximal pressures (>> 300 mmHg); (each circle represents 1 kidney; n=7 control kidneys with 50mmHg, n=8 anti-GBM kidneys with 50mmHg, n=4 kidneys with 300 mmHg or >> 300mmHg). (F) Total number of podocytes per glomerulus in juxtamedullary and subcortical glomeruli; each circle represents 1 subcortical glomerulus (n= 20 glomeruli pro mouse) and each triangle represents 1 juxtamedullary glomerulus (n= 20 glomeruli pro mouse). (G-I) Histologic staining of anti-GBM mice at baseline identified protein casts, whereas three days after injection of anti-GBM serum no crescentic lesions could be found. After perfusion with higher pressure, tubule-interstitial dilatation and edema were observed. (J) Total podocyte number per mouse between males and females; each circle represents 1 kidney (n=4 control kidneys with 50mmHg, n=4 anti-GBM kidneys with 50mmHg, n=2 kidneys with 300 mmHg or >>300 מ"מ כספית). להשוואות מרובות ANOVA. ****פ<0.0001, ***p ="" <="" 0,0001,=""><0.01,><0.05 and="" ns="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="">
מעקב אחר הפודוציטים האבודים בצינוריות
eGFP פלוס פודוציטים נצפו בקביעות בתוך לומן של הצינוריות הפרוקסימליות, שם נראה שהם נצמדים לגבול המברשת של תאי צינורית פרוקסימליים (איור 4A). פודוציטים אלה לא נשטפו בהיפר-פרפוזיהכִּליָהבמקום זאת, הם נצמדו בצורה הדוקה למדי לגבול המברשת כדי לעמוד בזרימה יוצאת הדופן של השתן הראשוני בלחצי זלוף גבוהים מאוד. כדי לאשר את זהותם, פודוציטים נצבעו יחד עם סמנים ספציפיים לפודוציטים (כלומר, p57, synaptopodin ו-WT-1) בנוסף לסמן המעקב הגנטי eGFP הגרעיני (איור 4B). מספרי הפודוציטים היו נמוכים יותר באופן מובהק באותם גלומרולים עם פודוציטים נצמדים באבובית הפרוקסימלית הקשורה, ונוכחות פודוציטים בצינוריות הייתה בקורלציה הפוכה למספר הפודוציטים לכל גלומרולוס (איור 4C).
אובדן מועדף של פודוציטים במיקום perihilar
Finally, we investigated whether podocyte loss driven by an acute increase in perfusion pressures might occur in preferential locations of the glomerulus (i.e. at the vascular pole vs. the tubular pole of the glomerular tuft). To analyze the spatial distribution of podocyte detachment, the vascular pole was marked in each glomerulus (acquired in 3D) based on the lectin signal and the distance of each podocyte from the vascular pole was determined semi-automatically. The individual distances from the vascular pole were separated into quartiles (Fig. 4E). As depicted in Fig. 4E, the majority of podocytes clustered in the 2 middle quartiles (i.e. quartile 2 and 3). Less than 12 % of the podocytes localized to either in the first, i.e. vascular pole, or the fourth quartile, i.e. most distant from the vascular pole. Upon perfusion with pressures >>300 מ"מ כספית, לא נצפו שינויים משמעותיים בהתפלגות המרחבית של פודוציטים בעכברים צעירים ובריאים. בעכברים מבוגרים, מרחקי הפודוציטים מהקוטב של כלי הדם גדלו בדרך כלל, ככל הנראה משקף היפרטרופיה גלומרולרית, בעוד שהפרפוזיה יתרה הובילה לניתוק מועדף של פודוקיטים קרוב לקוטב כלי הדם (הרבעון הראשון ירד מ-11.5 ל-4.9 אחוזים בעכברים מבוגרים, איור 4E ). באופן דומה, ניתוק מועדף של פודוציטים קרוב לקוטב כלי הדם נצפה בפודוציטים שנמחקו (אנטי-GBM, רבעון ראשון מופחת מ-25 ל-5 אחוזים).
דִיוּן
במחקר זה, בחנו את ההשפעות האקוטיות של לחץ סינון וזרימת סינון מוגבר על אובדן פודוציטים בכליה המבודדת של העכבר, תוך שימוש בשיטה המדויקת ביותר כיום לקביעת מספרי פודוציטים. הממצא העיקרי הראשון של המחקר שלנו היה שפודוציטים בריאים אינם רגישים ללחץ גזירה חריף in vivo, כפי שהוצע בעבר על ידי מחקרי תרבית תאים [11]. להפתעתנו, אפילו לחצים על-פיזיולוגיים קיצוניים (יותר מ-450 מ"מ כספית) לא גרמו לניתוק פודוציטים משמעותי. במקום זאת, מיקרוסקופיה אלקטרונית העברה גילתה שכל שלוש השכבות של מחסום הסינון נותרו שמורות יחסית היטב. עכברים מבוגרים יותר הראו מספר פודוקיטים מופחת (כפי שדווח קודם לכן) וזה היה קשור לרגישות מוגברת מוגבלת מאוד ללחצי זלוף גבוהים. הממצא העיקרי השני היה שפציעה קודמת של פודוציטים גרמה לפודוציטים להיות רגישים לניתוק בלחץ זלוף גבוה. עכברי אנטי-GBM הראו התעלמות תהליכים גלובליים בכף הרגל שלושה ימים לאחר הזרקת האנטי-סרום נגד GBM ומספרים משמעותיים התנתקו בלחץ זלוף גבוה. בעכברים מבוגרים, אנו משערים שהפיזיולוגיה של הפודוציטים נשמרת היטב יחסית, מה שהופך אותם פחות רגישים לניתוק. על ידי יישום גישת ספירה אוטומטית למחצה, כל גלומרולוס נותח בנפרד (סה"כ נותחו 1200 גלומרולים). אישרנו שלגלומרולי juxtamedullary יש נפח גבוה יותר מאשר לגלומרולי תת-קורטיקליים. מעניין לציין שמספרי הפודוציטים היו זהים, מה שמראה שצפיפות הפודוציטים מופחתת בגלומרולי juxtamedullary. בנוסף, גלומרולי Juxtamedullary היו גם פגיעים יותר ללחצי סינון מוגברים בהשוואה לגלומרולי תת-קורטיקליים. ממצאים אלו יכולים להסביר חלקית מדוע ניתן לצפות בנגעי FSGS בתדירות גבוהה יותר בגלומרולי כה גדולים [22, 23].
איור 4. איתור פודוציטים בפרוקס הסמוך. אַבּוּבִית. (א) תמונה מייצגת המציגה eGFP בתוספת פודוציטים (ירוק) בצינוריות. (ב) צביעה אימונופלואורסצנטית של פודוקיטים המסומנים במשותף על ידי ההיסטון הטרנסגני eGFP (ירוק), וסמני הפודוציטים האנדוגניים p57 (אדום), wt-1 (אדום) וסינפטופודין (סגול). (ג) קשר של מספר הפודוציטים לכל גלומרולוס עם מספר הפודוציטים שזוהו בצינורית (n=81 glomeruli מעכברי בקרה, n= 41 glomeruli מעכברים מבוגרים ו-n= 81 glomeruli מעכברי אנטי GBM). לצורך השוואות מרובות, נעשה שימוש ב-ANOVA. ****פ<0.0001,>< 0.01="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="" sd;="" in="" the="" graph,="" each="" circle="" represents="" 1="" podocyte;="" (d)="" schematic="" showing="" how="" the="" distance="" of="" podocytes="" from="" vascular="" pole="" was="" calculated.="" (e)="" distances="" of="" individual="" podocytes="" from="" the="" vascular="" pole.="" the="" individual="" distances="" from="" the="" vascular="" pole="" were="" separated="" into="">
מגבלה של מחקר זה היא תקופת התצפית הקצרה, שכן לא ניתן להסיק מסקנות לגבי הסתגלות ארוכת טווח של פודוציטים ללחצי סינון מוגברים. הוצע כי התגובה הראשונה של פודוציטים שנחשפו ללחץ גזירה היא לעבור שינויים מבניים מגנים [8, 24]. שינויים אלו כוללים אובדן חריצי סינון (כלומר FPE) והחלפת דיאפרגמות חריצים על ידי סתימה או צמתים הדוקים. צמתים חוסמים תוארו בעבר במספר מודלים של מחלות גלומרולריות [25-28]. עם זאת, במחקר שלנו, ראינו שפודוציטים עם FPE היו רגישים יותר ללחצי זלוף= גבוהים יותר. לפיכך, התוצאות שלנו הראו ששינויים אדפטיביים אלה לא הספיקו כדי להגן מפני ניתוק או אולי אפילו להיפך, שהם הופכים פודוציטים רגישים יותר לניתוק. לאחר מכן, ניתן לטעון כי המבודדים זלפוכִּליָהאינה מערכת פיזיולוגית וכי הלחצים שהופעלו היו גבוהים בהרבה מאשר בתנאי in vivo. למיטב ידיעתנו, אין מודל אחר המשתמש בתקן שלםכִּליָהקיים שיאפשר לחקור ישירות את ההשפעות של לחצי זלוף מוגברים. על ידי יישום של מרחיבי כלי דם לפני ובמהלך זלוף, הרחבה מקסימלית של כלי פרה-גלומרולרי כפי שהושרה כדי לאפשר זרימה בלתי מוגבלת (היפרפילטרציה) והעברה מקסימלית של לחצי זלוף מוגברים לתוך הגלומרולוס. במחקר הנוכחי נחקרו ההשפעות החריפות של לחצי זלוף גבוהים יותר. השפעות ארוכות טווח של היפרפוזיה פתולוגית עשויות להיות מזיקות יותר, ולהוביל לאובדן פודוציטים אף יותר. עם זאת, המחקר שלנו מצביע על כך שאובדן כרוני זה של פודוציטים אינו מונע על ידי הכוח העצום של זרימת הסינון כשלעצמה, אלא הרבה יותר על ידי השינויים (המסתגלים) בפודוציטים אשר מפחיתים את היצמדותם ל-GBM. חולים עם מחלות גלומרולריות נהנים מטיפול נגד יתר לחץ דם על ידי מניעת שינויים מבניים (לא-אדפטיביים) של פודוציטים.
סיכום
עבודה זו מספקת את ההוכחה הראשונה in vivo לכך שפודוציטים בריאים מחוברים בחוזקה בצורה יוצאת דופן ל-GBM בכליות בריאות של עכברים ויכולים לעמוד אפילו ללחצי זלוף גבוהים מאוד. הזדקנות או פציעת פודוקיטים חריפה אפילו יותר בולטת עם מחיקה גלובלית, הופכת את הפודוציטים לרגישים לניתוק בלחץ זלוף מוגבר.