השפעות של גליאוזידים של ציסטאנצ'י על לימוד קוגניציה וגמישות סינפטית בחולדות מודל מניעת שינה

תַקצִיר

המטרה: 'לחקור אם הגליקוזידים של cistancheיכול לשפר אתלמידה ותפקוד קוגניטיבי של חוסר שינהמודל חולדות על ידיויסות פלסטיות סינפטית. שיטות: 50 חולדות Wistar זכרים חולקו באופן אקראי לקבוצת ביקורת ריקה (בקרה), קבוצת ביקורת פלטפורמה (PC), קבוצת מודל (דגם),גליקוזידים של קבוצת cistanche(GCs), וקבוצת estazolam (Est). מודל מניעת השינה של חולדות הוכן בשיטת סביבת מים מרובת פלטפורמות שונה. מבוך המים של מוריס ובדיקת שדה פתוח שימשו לגילוי חולדותתפקוד קוגניטיבי מרחבי אושינויים רגשיים. נעשה שימוש בצביעת Nissl כדי לצפות בשינויים במורפולוגיה וכמות תאי עצבבאזור ההיפוקמפוס CAl של חולדות. Western blot ו-R'T - PCl שימשו לזיהוי רמות הביטוי של synaptophysin(SYN), חומר פוסט-סינפטי צפוף קרום 95 (PSD - 95) וגורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF). תוצאות: תוצאות מבוך המים של מוריס הראו שבהשוואה לקבוצת הביקורת, ה-למידה ויכולת קוגניטיביתשל חולדות בקבוצת המודל ירד באופן משמעותי (P<0. 05 ), and theתפקוד למידה וזיכרון של חולדותהיה טיפול משופר ב-GCs (P<0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05), the resting time increased ( P<0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T' - PCR showed that the protein and gene expression levels of BDNF, SYN, and PSD -95 in the Model group were significantly decreased ( P <0. 05), while after treatment with GCs, the expression levels of BDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05).

מַסְקָנָה: גליקוזידים של cistancheעשוי להשפיע על הפלסטיות הסינפטית על ידי ויסות הביטוי של סמנים הקשורים לסינפטיים, ובכך לשפר את הלמידה והתפקוד הקוגניטיבי של חולדות מודל מניעת שינה.

מילות מפתחגליקוזידים של cistanche; היפוקמפוס; חוסר שינה; למידה וזיכרון; חֲרָדָה; פלסטיות סינפטית

גלוקוזידים של סיטנשה ברמה גבוהה למכירה

הפרעת שינה (SD)הוא אהפרעה תפקודית של שינהנגרמת על ידי סדרה של גורמים מורכבים כגון נדודי שינה, חלומות תכופים והתעוררות קלה. שכיחות ה-SD עלתה בהדרגה בשנים האחרונות. מחקרים קשורים דיווחו ש-SD יכול לגרוםמחלות לב וכלי דם, חוסר תפקוד מטבולי, מחלות חיסוניות, ומחלות ניווניות של מערכת העצבים המרכזית כגון מחלת אלצהיימר [1]. SD יכול לגרום לנזק חמצוני לנוירונים בהיפוקמפוס, לגרום לחוסר תפקוד קוגניטיבי וליצור שינויים במצב הרוח כגון חרדה ודיכאון [2]. Cistanche deserticola הוא חומר מרפא סיני יקר הערך שיכול לשמש כתרופה ומזון. יש לו את ההשפעות של חיטוב הכליה ומילוי צ'י, הלחמת המעיים לקידום יציאות וחיזוק היאנג. התמצית העיקרית של Cistanche deserticola, גליקוזידים של cistanche (GCs), היא בעלת השפעות נוגדות חמצון, אנטי-אפופטוטיות, מגנות על הכבד והשפעות עצביות [3]. המחקר הקודם שלנו מצא ש-GCs יכולים לשפר את הלמידה והתפקוד הקוגניטיבי של עכברי SAMP8 על ידי משחק תפקיד נוגד חמצון ואנטי-אפופטוטי [4]. מחקרים קשורים הראו שחוסר תפקוד קוגניטיבי הנגרם על ידי SD קשור קשר הדוק לפלסטיות סינפטית [5]. עם זאת, ישנם מעט דיווחים על המנגנון שבאמצעותו GCs מווסתים את הפלסטיות הסינפטית ומשפרים את ליקוי הלמידה והזיכרון ואת הירידה הקוגניטיבית בחולדות הנגרמת על ידי חוסר שינה. לכן, מחקר זה נועד לחקור האם GCs משפיעים על הפלסטיות הסינפטית על ידי ויסות הביטוי של סמנים הקשורים סינפטיים, ובכך לשפר את הלמידה והתפקוד הקוגניטיבי של חולדות במודל מניעת שינה, ומתן רעיונות ותוכניות טיפול חדשות לטיפול בלמידה ו פגיעה קוגניטיבית הנגרמת על ידי הפרעות שינה עם GCs.

1 חומרים ושיטות

1. 1 חיות ניסוי

חולדות Wistar זכרים בגילאי 6 עד 8 שבועות, במשקל 280 עד 300 גרם, נרכשו מבייג'ין סיבייפו, עם רישיון לייצור בעלי חיים [SCXK (בייג'ינג) 2019-0010]. כל החיות הוחזקו במרכז הניסויים בבעלי חיים של המכללה הרפואית באוטו בתנאים הבאים: טמפרטורה (24 ± 1) מעלות, לחות 50% עד 55%, 12 שעות אור ו-12 שעות כהות, וללא הגבלות על מזון ומים. ניסוי זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בית הספר [Baoyi Lunshen 2022 No. (63)].

1. 2 ריאגנטים ומכשירים עיקריים

סך הגליקוזידים של Cistanche deserticola נרכשו מ-Shaanxi Baoji Cosmeceuticals Development Co., Ltd (מספר אצווה: KSM20220609011); טבליות Estazolam נרכשו מ-CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (מספר אצווה: 044220343); חיץ טעינת חלבון (P1015), חיץ תמוגה RIPA (R0010), תמיסה כימילומינסצנטית (PE0010) וכו' נרכשו כולם מבייג'ין סולבאו; נוגדן פוסט-סינפטי בצפיפות 95 (PSD-95) (AB192757), נוגדן סינפטופיסין (SYN) (ab32127), נרכש מ- Abcam, ארה"ב; גורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF) (48503-2), -אקטין (52901), נרכש מ-SAB, ארה"ב; נוגדן IgG משני לעז נגד ארנב (SA00001-20), נרכש מחברת Proteintech, ארה"ב; מלטונין עכברים (MT), ערכת ELISA (MM-0657R1), נרכשה מ-Jiangsu Enzyme Immunity Industry Co., Ltd. פורס פרפין (לייקה, גרמניה); מיקרוסקופ אופטי (לייקה, גרמניה); מבוך המים של מוריס, תיבת בדיקה בשטח פתוח (Shanghai Xinruan); מכשיר אלקטרופורזה אנכית

(חברת בייג'ינג ליוי); שייקר לדה-צבע (בייג'ינג Liuyi Company); מערכת ניתוח הדמיית חלבון (Shanghai Tanon Technology); מכשיר PCR כמותי פלואורסצנטי (שיאן טיאנלונג טכנולוגיה ושות' בע"מ).

1. 3 שיטות ניסוי

1. 3. 1 קיבוץ בעלי חיים ומתן תרופות

50 חולדות Wistar זכרים חולקו באופן אקראי לקבוצת ביקורת ריקה (קבוצת בקרה), קבוצת ביקורת פלטפורמה (בקרת פלטפורמה, קבוצת PC), קבוצת מודל (קבוצת מודל), סך הגליקוזידים של קבוצת Cistanche deserticola (קבוצת GCs , 50 מ"ג/ק"ג), וקבוצת אסטזולה (קבוצת אסט, 0.54 מ"ג/ק"ג), עם 10 חולדות בכל קבוצה. לקבוצת הביקורת ולקבוצת ה-PC ניתנו 0.9% תמיסת מלח במתן מתן. כל הקבוצות ניתנו ב-7 בבוקר בכל יום לאחר תחילת הדוגמנות, והמתן נמשך 21 ימים.

1. 3. 2. הכנת מודל בעלי חיים למניעת שינה

מודל מניעת השינה הוקם באמצעות שיטת סביבת מים מרובת פלטפורמות שונה [6]. ציוד הניסוי היה מיכל מים מלבני שרף פוליאתילן בגודל 130 ס"מ × 50 ס"מ × 45 ס"מ. במיכל המים הונחה במה קטנה בקוטר 5 ס"מ ובגובה 20 ס"מ. לפלטפורמה של קבוצת ה-PC היה קוטר של 10 ס"מ וגובה של 20 ס"מ. מיכל המים התמלא במים עד לעומק של כ-18 ס"מ, וטמפרטורת המים נשמרה על (20 ± 1) מעלות. שבוע לפני תחילת הניסוי, החולדות הוכנסו לקופסת מניעת שינה כל יום למשך 60 דקות כדי להכיר את הסביבה. לאחר הקמת המודל, למעט קבוצת הביקורת, החולדות של כל קבוצה הונחו על הפלטפורמה הקטנה בזמן בין השעות 8:00-20:00 מדי יום למניעת שינה במשך 21 ימים רצופים. כל החולדות הורשו לאכול ולשתות בחופשיות ולנוע בחופשיות על הרציף, עם 12 שעות של אור וחושך לסירוגין בכל יום.

1.3.3 ניסוי מבוך מים של מוריס

מבוך המים של מוריס חולק ל-4 אזורים, מלאים במים, והפלטפורמה הוקמה ברביע הרביעי. פני המים היו כ-2 ס"מ מעל הרציף. למים הוסף מלנין אכיל בדרגת מזון, וטמפרטורת המים נשמרה על (25 ± 1) מעלות. (1) ניסוי ניווט במיקום: מרכז כל אזור נבחר והחולדות הונחו במים בעדינות. הם הורשו לחקור בחופשיות. נרשם הזמן שלקח לחולדות למצוא את פלטפורמת המטרה בתוך 60 שניות. חולדות שלא מצאו את הפלטפורמה הובלו לרציף ונשארו 20 שניות. האימון נמשך במשך 5 ימים. (2) בדיקת חקר מרחבית: ביום השישי הוסר הפלטפורמה והחולדות הונחו למים ממרכז הרביע השני אל הקיר. תועדו מספר הפעמים שהחולדות עברו את הרציף תוך 120 שניות והזמן שבו שהו ברביע הרביעי.

1.3. 4 ניסוי שדה פתוח

נעשה שימוש בקופסת ניסוי בגודל 100 ס"מ × 100 ס"מ × 50 ס"מ, ותחתית הקופסה חולקה ל-9 רשתות. כל קבוצת חולדות הוצבה בחדר הניסוי בשדה הפתוח מראש כדי להסתגל לסביבה הפנימית למשך 60 דקות. בתחילת הניסוי, חולדות הניסוי הונחו בתורן בפינות הקבועות של קופסת הניסוי בשדה הפתוח, ומספר זמני העמידה, מרחק התנועה והזמן הסטטי של החולדות בתוך 5 דקות תועדו באמצעות תוכנת ניתוח התנהגותי. . הסביבה נדרשה להיות שקטה במהלך הניסוי, ומכשיר הניסוי נוגב במים נקיים ובאלכוהול בהתאמה בין שני ניסויים כדי למנוע מהריח של החולדה הקודמת להשפיע על שיפוט ההתנהגות של החולדה הבאה.

1. 3. 5 בדיקת אימונוסורבנטית מקושרת אנזים (ELISA)

זיהוי רמות MT בסרום בחולדות חולדות הורדמו על ידי הזרקה תוך צפקית, ו-5 מ"ל של דם נאספו מאבי העורקים הבטן. לאחר המתנה של 30 דקות בטמפרטורת החדר, הדם עבר צנטריפוגה לקבלת סרום. 40 μL של דילול דגימה נוספו לכל באר, ולאחר מכן נוספו 10 μL מהדגימה שתיבדק. לאחר איטום עם סרט האיטום, דגירה ב-37 מעלות למשך 30 דקות. שטפו 5 פעמים, הוסף 50 μL של תמיסת תיוג אנזים ודגירה ב-37 מעלות למשך 30 דקות לאחר האטימה בסרט האיטום. לשטוף 5 פעמים, ולאחר מכן להוסיף את התמיסה מפתחת הצבע ואת תמיסת הפסקת התגובה בתורן. ערך ה-OD של כל באר נמדד על ידי מכשיר סימון האנזים באורך גל של 450 ננומטר.

１. ３. ６ מכתים Nissl

שלוש חולדות נלקחו מכל קבוצה, ורקמת המוח הוסרה על ידי עריפת ראש. רקמת המוח תוקנה בתמיסת 4% פולימתיל מתאקרילט, והרקמה התייבשה, טבלה בתמיסת שעווה והוטמעה, והרקמה נחתכה בשיטות קונבנציונליות. הפרוסות נשמרו בעובי של 5 מיקרומטר, שטופות ב-PBS, מוכתמות ב-0. 1% טולואידין כחול עבור 0. 5 שעות, מובחן עם 95% אלכוהול, מיובש עם 100% אלכוהול, שקוף עם קסילן, ואטום במסטיק ניטרלי. השינויים במורפולוגיה ובמספר הנוירונים באזור CA1 של ההיפוקמפוס של חולדה נצפו תחת מיקרוסקופ ותמונות נאספו.

１. ３. 7 ניסוי ווסטרן כתם

ארבע חולדות נבחרו מכל קבוצה, וההיפוקמפוס בודד על ידי עריפת ראש. רקמת ההיפוקמפוס עורבבה עם חיץ תמוגה RIP A בסביבת אמבט קרח וצנטריפוגה להשגת הסופרנטנט. ריכוז החלבון זוהה בשיטת BCA. 20 ug חלבון נוספו עם חיץ טעינת חלבון לאלקטרופורזה. לאחר השלמת האלקטרופורזה של החלבון, הממברנה הועברה בזרימה קבועה של 300 mA, נחסמה באבקת חלב רזה של 5%, הנוגדן הראשוני הודגר ב-4 מעלות למשך הלילה, והנוגדן המשני הודגר בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר השימוש בתמיסת פיתוח הצבע, נעשה שימוש במערכת ניתוח הדמיית כימילומינסנציה לניתוח סטטיסטי של להקות חלבון.

1. 3. ניסוי RT-PCR

שלוש חולדות נבחרו מכל קבוצה כדי להכין הומוגנית של רקמת ההיפוקמפוס. ה-RNA הכולל בנוזל הרקמה הופץ בשיטת Trizol ונמדד הריכוז. ערכת סינתזת cDNA בצום שימשה לשעתוק הפוך, ותגובת הגברה כמותית פלואורסצנטית שימשה לזיהוי רמת הביטוי היחסית של mRNA חלבון הקשור לסינפטי באמצעות ערכה כמותית פלואורסצנטית. התוצאות נותחו באמצעות 2-ΔΔCt, ורצפי ה-primer מוצגים בטבלה 1.

1.4 שיטות סטטיסטיות

תוצאות הנתונים שתאמו את ההתפלגות הנורמלית הובעו כממוצע ± סטיית תקן (x ± s), וניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות תוכנת GraphPad Prism 9.5. ניתוח שונות של גורם יחיד שימש להשוואה בין דגימות מרובות, ו-P < 0.05 הצביע על כך שההבדל היה מובהק סטטיסטית.