השפעות של גליקוזידים של Cistanche על גמישות מורפולוגית סינפטית בעכברים המואצים בהזדקנות
Mar 11, 2022
איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com
LIAN Juanqi1, WANG Lu2, ZHAO Fujun3, LIN Shuai3, YAN Xusheng4, JIA Jianxin4, CAI Zhiping4
(1. כיתה 2014 של בית הספר לתואר שני של Baotou Medical College, Baotou 014060, סין)
(2. כיתה 12 של כיתה 2015 רפואה קלינית במכללה הרפואית באוטו)
(3. כיתה 1 של רפואה משפטית בכיתה 2013 במכללה הרפואית באוטו)
(4. המחלקה לאנטומיה האנושית של המכללה הרפואית באוטו)
תַקצִיר
מַטָרָה: כדי לחקור את ההשפעה שלגליקוזידים שלcistanche (GCs) על הפלסטיות הסינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בעכברים מואצים בהזדקנות המועדים 8 (SAMP8).שיטות: 40 עכברים חולקו באופן אקראי לקבוצת ביקורת, קבוצת כלי רכב, קבוצה במינון נמוך (ניתן GCs 2.5 מ"ג/ק"ג ·ד), קבוצה במינון בינוני (ניתן GCs 5.0 מ"ג/ק"ג ? ד) וקבוצת מינון גבוה (ניתן GCs 10. 0 מ"ג / ק"ג · ד). לעכברים בקבוצת הביקורת לא ניתנה כל התערבות; אלו בקבוצות שניתנו וקבוצת הרכב עברו מתן תוך צפקי (GCs / מלוחים) או מלוחים במשך 30 ד'. מספר הנוירונים הפירמידליים הנורמליים באזור ההיפוקמפוס CA1 נספר על ידי צביעת Nissl; מספר הקוצים הדנדריטים בסינפסות נספר על ידי צביעה של גולגי, וביטוי החלבון של PSD-95 כמת על ידי אימונוהיסטוכימיה.תוצאות: בהשוואה לאלו בקבוצת הביקורת, GCs העלו משמעותית את מספר הנוירונים הפירמידליים הנורמליים באזור ההיפוקמפוס CA1 (P<0.05) and="" increased="" the="" number="" of="" dendritic="" spines="" in="" synapses="" (p=""><0.05). the="" expression="" levels="" of="" psd-95="" in="" administered="" groups="" were="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.05), and="" the="" effect="" in="" the="" middle="" dose="" group="" was="" the="" most="" significant.="">סיכום: GCs יכולים לשפר את שיעור ההישרדות של תאי פירמידה בהיפוקמפוס ולשפר את הפלסטיות הסינפטית.
מילות מפתח: גליקוזידים של cistanche (GCs); הזדקנות מואצת עכבר; עמוד שדרה דנדריטי; PSD–95
עם ההזדקנות של האוכלוסייה החברתית החמורה יותר ויותר, השכיחות שלמחלת אלצהיימר(AD) גדל בהדרגה, מה שהביא לנטל כבד על משפחות החולים והחברה
[1]. הביטויים הקליניים העיקריים של AD הם פגיעה קוגניטיבית ופגיעה בזיכרון, ומאפייני המקרה העיקריים הם פלאקים סניליים הנוצרים על ידי משקעי עמילואיד חוץ-תאיים וסבך נוירו-פיברילרי תוך-תאי[2]. הפתוגנזה של AD עדיין אינה חד משמעית. השינויים הפתולוגיים של סינפסות נחשבים לבסיס הנוירוביולוגי של זיכרון AD ושל תפקוד קוגניטיבי. שינויים חריגים בסינפסות עשויים להיות החוליה המרכזית בפתוגנזה של AD. עכבר הזדקנות מואץ (SAM) הוא עכבר מזדקן מזן. תת-הקו P8 שלו הוא בעל מאפייני הזדקנות אחידים ויציבים, המתבטאים בירידה מתקדמת בלמידה ובזיכרון והכרה עם עליית החודשים. חוסר תפקוד ידוע וביטויים פתולוגיים דומים לחולי AD, ולכן עכברי SAMP8 הם מודל חיה אידיאלי לחקר המנגנון של למידה הקשורה להזדקנות והפרעות זיכרון.
מאמר זה מתכוון לנתח את שיעור ההישרדות של התא, למדוד את צפיפות עמוד השדרה הדנדריטי ולזהות קומפקטים פוסט-סינפטיים כדי לחקור את המנגנון האפשרי של GCs(גליקוזידים שלcistanche)משפיע על הפלסטיות המורפולוגית הסינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בעכברים מזדקנים במהירות, במטרה לטפל הקשורים ל-ADcistancheגליקוזידים(GCs) הלמידה המרחבית והליקוי בזיכרון מספקים בסיס תיאורטי וניסיוני.
1 חומר ושיטות
1.1 חיות ניסוי וקיבוץ 40 עכברי SAMP8 בני 10- חודשים (נרכשו מאוניברסיטת טיאנג'ין לרפואה סינית מסורתית), שגודלו בסביבה נקייה, טמפרטורת סביבה (24.0 ± 1.0) מעלות, לחות (50.0 ± 5.0) אחוזים, מזון ומים חינם. החיות גודלו לגיל 11 חודשים כדי להתחיל בניסוי. החיות חולקו באופן אקראי ל-5 קבוצות (8 בעלי חיים/קבוצה): קבוצת ביקורת ריקה (ביקורת), קבוצת בקרת ממס (רכב),cistanche סך גליקוזידים(GCs) קבוצת מינון נמוך [2.5 מ"ג / (ק"ג · ד)], קבוצת מינון בינוני [5. 0 מ"ג / (ק"ג · ד)], קבוצת מינון גבוה [10.0 מ"ג / (ק"ג · ד)]. בעלי חיים בקבוצת הביקורת לא קיבלו כל התערבות. החיות בקבוצת המינון הנמוך קיבלו GCs 2.5 מ"ג / (ק"ג · ד), החיות בקבוצת המינון האמצעי קיבלו GCs 5. 0 מ"ג / (ק"ג · ד), ובעלי החיים ב לקבוצה במינון גבוה ניתנו GCs. 0 מ"ג / (ק"ג · ד), בעלי חיים בקבוצת הרכב קיבלו אותה כמות של תמיסת מלח רגילה. הזרקה תוך צפקית מתמשכת של תרופות או מי מלח פיזיולוגי למשך 30 יום, 0.5 מ"ל ליום.
1.2 הכנת דגימה ועיבוד החיות הוקרבו 24 שעות לאחר המתן האחרון, הורדמו והצוואר הוקרב. חתכו את חלל בית החזה כדי לחשוף את הלב, חתכו את תוספת הפרוזדור הימני כדי לשחרר את הדם, והכנסו את מחט הזילוף לחדר השמאלי. לאחר החדרת 100 מ"ל של תמיסת מלח רגילה, המשיכו להחדיר 4 אחוז פרפורמלדהיד עד שהגפיים של העכברים היו נוקשות. קח את המוח והנח אותו ב-4 אחוז פרפורמלדהיד למשך יותר מ-24 שעות.
1.3 תרופות וריאגנטים GCs(גליקוזידים שלcistanche) נרכשו מהאקדמיה של סין לרפואה סינית מסורתית, צפיפות פוסט-סינפטית －95, PSD －95 נרכשו מ-Epitomic, ערכת Coomassie Brilliant Blue CBBG 250 נרכשה מ- Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd. בייג'ינג Zhongshan Jinqiao Biotechnology Company.
1.4 צביעת Nissl וספירת תאים קיבוע פרפורמלדהיד של 4 אחוזים של רקמת המוח למשך יותר מ-24 שעות, חיתוך והתייבשות עם אלכוהול שיפוע, קסילן שקוף, טבילת שעווה, הטבעת פרפין קונבנציונלית, חתך סדרתי בעובי 5 מיקרומטר. לחתוך פרוסות ולשחרר שעווה למים, לצבוע עם 1 אחוז טולואידין כחול ב-37 מעלות למשך 60 דקות, לשטוף 5 דקות × 3 פעמים, להבדיל עם 95 אחוז אלכוהול, 100 אחוז אלכוהול. להתייבש, קסילן שקוף, להרכיב עם מסטיק ניטרלי, להתבונן מתחת מִיקרוֹסקוֹפּ. אזור CA1 של אותו קטע ההיפוקמפוס של כל קבוצה נבחר באקראי מתוך 3 שדות תצפית (×100), מספר התאים הפירמידליים הנורמליים בטווח של 1 מ"מ נספר, והממוצע נלקח לניתוח.
1.5 צביעת Golgi שונה שים את רקמת המוח המתוקנת בתמיסת צביעה Golgi-Cox, הגן מפני אור למשך 14 ימים, והחלף את התמיסה כל יומיים; מניחים את רקמת המוח ב-30 אחוז סוכרוז, ומניחים אותה במקרר ב-4 מעלות. ניתן לחתוך את הרקמה לאחר שקיעה לתחתית; מיקרוטום רוטט לחיתוך וצביעה; פתרון מתקן לפיתוח; ייבוש לוחית ההרכבה, תצפית וספירה מתחת למיקרוסקופ. התבונן בשינויים בעמוד השדרה הדנדריטי של הקודקוד הנוירוני של ההיפוקמפוס CA1 ו-CA3 של כל קבוצת עכברים, וחשב את הצפיפות של עמוד השדרה הדנדריטי.
1.6 המקטעים האימונוהיסטוכימיים עברו דה-פראפין למים, הודגרו עם 3% H2O2 למשך 10 דקות כדי לחסל פעילות פרוקסידאז אנדוגנית, נשטפו במים מזוקקים למשך 5 דקות × 3 פעמים, תוקן במיקרוגל בלחץ גבוה, נשטף עם PBS למשך 5 דקות × 3 פעמים, סרום עיזים נחסם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, נוגדן ראשוני נגד עכברים של ארנבת PSD-95 נוסף טיפה, לילה ב-4 מעלות, נשטף עם PBS למשך 5 דקות × 3 פעמים, נוגדן משני מסומן ביוטין הוסף טיפה, הודגרה ב-37 מעלות למשך שעתיים, נשטף עם PBS במשך 5 דקות × 3 פעמים, שחרר את הסטרפטאבידין שסומן חזרת פרוקסידאז, שטף עם PBS במשך 5 דקות × 3 פעמים, שטף עם DAB למשך 2 דקות, כתם נגד עם המטוקסילין, מיובש עם אלכוהול שיפוע, שקוף עם קסילן, והר. 1.7 עיבוד תמונה וניתוח סטטיסטי. אותם חתכים בהיפוקמפוס של כל קבוצה נבחרו לתצפית. שלושה שדות ראייה (×100) נבחרו באקראי באזור CA1 כדי לספור את מספר התאים הפירמידליים הנורמליים בטווח של 1 מ"מ, והממוצע נותח. תוצאות האימונוהיסטוכימיה נמדדו על ידי תוכנת ניתוח תמונה IPP 7.0. נתוני הניסוי נותחו על ידי תוכנת SPSS 17.0, ו-ANOVA חד-כיווני שימש להשוואה זוגית של אמצעים מרובי מדגם. פ<0.05 was="" considered="" statistically="">
מחלת אנטי-אלצהיימר
2 תוצאות
2.1 השפעת סך הגליקוזידים שלcistancheעל ספירת תאים פירמידליים תקינים בהיפוקמפוס של עכברי SAMP8 צביעת Nissl התוצאות של צביעת Nissl הראו שמספר הנוירונים באזור CA1 של קבוצת הביקורת ירד, הסידור היה מופרע ורוב התאים היו חריגים במורפולוגיה ותמוגה ונמק. המורפולוגיה של התאים ב-GCs(גליקוזידים שלcistanche)הקבוצה הייתה ברורה ושלמה יחסית, עם מספר רב של בליטות נראות לעין, הגוף של ניסל היה סגול, הגרעינים היו מוכתמים עמוק, ברורים וממורכזים, והגרעינים לא היו מוכתמים. מורפולוגיה של התא של קבוצת הרכב דומה לזו של קבוצת הביקורת. ספירת התאים הראתה שמספר הנוירונים הפירמידליים הנורמליים באזור CA1 של קבוצת הניהול גדל (P<0.05); the="" difference="" between="" the="" medium="" and="" high="" dose="" groups="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05), the number of normal pyramidal neurons To a certain extent, it shows an upward trend with increasing dose. There was no significant difference in the number of normal pyramidal cells between the vehicle group and the control group (P>0.05). ראה טבלה 1.
טבלה 1 השפעת ציסטאנצ'ה גליקוזידים על צביעת היפוקמפוס של עכבר SAMP8, ספירת תאי פירמידה נורמלית ומספר קוצים דנדריטים (יח')
a מושווה לקבוצת הביקורת t=0.193, P=0.582; b מושווה לקבוצת הביקורת t=13.621, P=0.008; c מושווה לקבוצת הביקורת t=21.798 , P=0.005; d מושווה לקבוצת ביקורת t=18.326, P=0.006; e מושווה לקבוצת ביקורת t=0.244, P=0.463; f מושווה לקבוצת ביקורת בהשוואה ל-t=10.903, P=0.010; g מושווה לקבוצת הביקורת t=21.817, P=0.005; h מושווה לקבוצת הביקורת t=15.572, P=0. 007.
2.2 ההשפעת סך הגליקוזידים שלcistanche על הצפיפות של קוצים דנדריטים בעכברי SAMP8 צביעת Golgi הראתה שמספר הקוצים הדנדריטים בקבוצת הביקורת ירד, והצפיפות ירדה. לאחר מתן GCs לבעלי חיים, המספר והצפיפות של קוצים דנדריטים גדלו, ונראו מספר רב של בליטות (P=0.048). לא היה הבדל מובהק סטטיסטית בין קבוצת המינון הבינוני לקבוצת המינון הגבוה (P=0.853). מספר וצפיפות עמוד השדרה הדנדריטי התואר מראה מגמת עלייה עם עליית המינון. קבוצת הרכב ובקרה
למספר ולצפיפות של קוצים דנדריטים בקבוצה אין מובהקות סטטיסטית (P=0.764). ראה טבלה 1.
2.3 ההשפעה שלCistancheגליקוזידים על ביטוי של PSD-95 בעכברי SAMP8 הזיהוי האימונוהיסטוכימי האיכותי של PSD-95 הראה שלקבוצת הביקורת היה פחות ביטוי של PSD-95, הצביעה של גוף התא הייתה קלה יותר, וה שיעור ביטוי חיובי היה נמוך יותר. לאחר תוספת של GCs in vitro, גוף התא נצבע עמוק יותר, והביטוי והשיעור החיובי של PSD-95 עלו (t=5.751, P<0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" middle-dose="" group="" and="" the="" high-dose="" group="" (t="1.077," p="">0.05). במידה מסוימת, הביטוי של PSD-95 הראה מגמת עלייה עם עלייה במינונים. רכב
There was no statistically significant difference in PSD-95 expression between the control group and the control group (t = 0.585, P>0.05).
3 דיון
PSD-95 הוא המרכיב העיקרי של פוסט-סינפטי וקשור למגוון פונקציות סינפטיות, הכוללות תעלות יונים, פעילות סינפטית, מסלולי העברת אותות תוך-תאיים וכו' [3]. PSD-95 מקבץ חלבונים קשורים במסלול האיתות של קולטן NMDA ליצירת קומפלקס מולקולות מכוונת מולקולות מווסתות של קולטן [4], אשר ממלא תפקיד מפתח במסלול העברת אותות. קולטני NMDA מעורבים באינדוקציה של פוטנציאל ארוך טווח (LTP) באזור CA1 של ההיפוקמפוס ובתהליך הלמידה והזיכרון [5]. PSD-95 ממלא תפקיד רגולטורי מרכזי בתהליך זה, ותכולת החלבון שלו יכולה לשמש כסמן מולקולרי נוסף למדידת פלסטיות סינפטית. במחקרים הקודמים שלנו, הוכחנו ש-GCs(גליקוזידים שלcistanche)יכול לשפר למידה ופגיעה קוגניטיבית בעכברי SAMP8, אך לא הבהרנו את המנגנון המורפולוגי האפשרי של התא. ניסוי זה נועד לחקור את המנגנון המורפולוגי האפשרי של התא.
בניסוי זה, שיפור שיעור ההישרדות של תאים פירמידליים והפלסטיות הסינפטית ב-GCs(גליקוזידים שלcistanche)הקבוצה הייתה טובה יותר מזו של קבוצת הרכב וקבוצת הביקורת. ניתן לראות ש-GCs שיפרו את המורפולוגיה של תאים פירמידליים בצורה משמעותית יותר. תוצאות הניסוי מראות שמינונים גבוהים יותר של GCs יכולים להשפיע טוב יותר. מההשוואה בין קבוצת המינון האמצעי לקבוצת המינון הגבוה, ניתן לראות כי ההשפעה אינה משתנה באופן משמעותי כאשר המינון מגיע לריכוז מסוים. לכן, על מנת למנוע בזבוז ותופעות לוואי של GCs בעת שימוש GCs, יש לבחור את הריכוז המתאים ביותר [6].
מחקרים קודמים הראו כי GCs(גליקוזידים שלcistanche)יכול לשפר את הלמידה והליקוי הקוגניטיבי של עכברי SAMP8 על ידי שיפור שיעור ההישרדות של תאים פירמידליים [7]. ישנם גם נתונים המצביעים על כך ש-GCs עשויים לשפר מחלות נוירודגנרטיביות על ידי קידום התפשטות והתמיינות של תאי גזע עצביים [8-10]. המחבר מאמין כי המנגנון של GCs לשיפור AD עשוי להיות מושגת על ידי שיפור הפלסטיות של המורפולוגיה הסינפטית ושמירה על מספר התאים הפירמידליים, מה שמניח את הבסיס לשימוש האולטימטיבי של GCs במניעה וטיפול של AD קלינית.
הפניות
[1] Chen Juluo, Chen Xingui, Hu Panpan וכו'. חולי מחלת אלצהיימר משתמשים בפונקציות מחקר מקדים [J]. כתב העת הסיני לרפואה התנהגותית ומדעי המוח, 2013, 22 (10): 889-891.
[2] Jin Chunhui, Liu Xiaowei, Yuan Jianmin, et al. מיון קולטן 1 גן נוקלאוזיד יחיד מתאם בין פולימורפיזם חומצה ומחלת אלצהיימר ספוראדית［J］. כתב העת הסיני לרפואה התנהגותית ומדעי המוח, 2014, 23 (5): 427-429.
[3] שליבס R, Arendt T. המשמעות של המערכת הכולינרגית במוח במהלך ההזדקנות ובמחלת אלצהיימר［J］. Neural Transm, 2006, 113 (11): 1625-1644.
[4] סוריאנו FX. מיקוד ספציפי של אותות קולטן NMDA פרו-מוות תוך הסתמכות שונה על ליגנד NR2B PDZ［J］． J Neurosci, 2008, 28 (42): 10696-10710.
[5] Selkoe DJ. אוליגומרים מסיסים של עמילואיד בטא חלבון פוגעים בפלסטיות ובהתנהגות הסינפטית ［J］． Behav Brain Res, 2008, 192 (1): 106 -113.
[6] Huang Zonghui, Chen Guanmin, Zhao Kangtao, et al. מחקר על הרעילות של Cistanche ［J］. China Journal of Hygiene Inspection, 2014, 24 (8): 1098 -1100.
[7] Jia Jianxin, Song Wei, Yan Xusheng, et al. לסך הגליקוזידים של cistanche יש השפעה על עכברי SAMP8. ההשפעה והמנגנון של למידה בין וזיכרון［J］. Journal of Baotou Medical College, 2014, 30 (6): 6-8.
[8] Xiao Q, Yan P, Ma X, et al. שיפור ביוגנזה של ליזוזום אסטרוציטי מקל על פינוי ומחליש פתוגנזה של רובד עמילואיד［J］． J Neurosci, 2014, 34 (29): 9607-9620.
[9] Li QJ, Tang YM, Liu J, et al. טיפול במחלת פרקינסון עם תאי גזע עצביים C172 המבטאים יתר על המידה NURR1 עם אדנוווירוס רפובליקה משולב-גירעון המכיל את הגן NURR1［J］. Synapse, 2007, 61 (12): 971-977.
[10] Qin Wei, Wei Wei, Xu Qian, et al. Cistanche על התפשטות תאי גזע עצביים C172 ההשפעה של [J]. Strait Pharmacy, 2015, 27 (12): 263-265.