השפעות של טיפול בחומצה פוספונית 2-אמינואינדאן-2- על הצטברות של סאלידרוזיד וארבעה גליקוזידים פנילתנואידים בתרבות תאי מרחף של Cistanche Deserticola

למידע נוסף:ali.ma@wecistanche.com

Gao Sheng Hu, et al

תַקצִיר

2-אמינואינדאן-2-חומצה פוספונית (AIP), מעכב תחרותי ספציפי של פנילאלנין אמוניה-ליאז (PAL) הוחל על תרבית תאי השעיה שלCistanche deserticola. ההשפעות של טיפול AIP על צמיחת תאים, פעילות PAL, תכולה ותשואות של תרכובות פנולי-סך, סלידרוסיד וארבעהפנילתנואידים גליקוזידים(PheGs) נחקרים. התוצאות הראו שלטיפולי AIP {{0}}.5 ו-2.0 lM היו השפעות דומות על מדידות הנושא שנחקרו במחקר זה. טיפול AIP הביא לירידה משמעותית בפעילות ה-PAL, תכולת התרכובות הכוללות, וכן(פנילתנואיד גליקוזידים)תוכן PheGs. ניתוח Linearregression הראה שלפעילות PAL היה מקדם מתאם גבוה עם התוכן הכולל של התרכובת הפנולית וארבעה(פנילתנואיד גליקוזידים)תוכן PheGs. לאזור זמן פעילות PAL הכולל מתחת לעקומה (AUC) היה מקדם מתאם גבוה עם התפוקה הכוללת של תרכובות פנוליות ותפוקות של חמש תרכובות שנבדקו בדגימות תאים לא מטופלות. בתאים שטופלו ב-AIP, ה-AUC הכולל של פעילות PAL בזמן נשמר מתאם גבוה עם תפוקת תרכובות פנוליות הכוללות והתשואות של שלוש תרכובות שנבדקו, echinacoside,acteoside ו-tubuloside A, אך לא salidroside ו-cistanoside A. ההבדל עשוי להיגרם על ידי המקורות הביוסינתטיים השונים של כל אחת מהתרכובות שנבדקו. תוצאות אלו מדגימות את התפקיד החשוב של PAL בביוסינתזה של(פנילתנואיד גליקוזידים)PheGs בתרבית תאי ההשעיה שלCistanche deserticola.

מילות מפתח

Cistanche deserticola, תרבות תאי השעיה,פנילתנואידים גליקוזידים, 2-אמינואינדאן-2-חומצה פוספונית (AIP), פעילות PAL, ביוסינתזה, סאלידרוסיד

לחץ לחילוץ Cistanche הטבות ומוצרי Cistanche

מבוא

Cistanche deserticolaYC Ma, עשב מרפא סיני מסורתי, שימש במשך מאות שנים בסין בשל השפעותיו המזינות. זהו מטרה רב-שנתית וצמח מרפא טפילי השייך לסוג Cistanche במשפחת Orobanchaceae. הצמח גדל באזורים מדבריים של מערב סין והוא טפיל על שורשי Haloxylosammodendrun.

בידוד המרכיבים הכימיים והבהרה מבנית שלCistanche deserticolaהחל בשנות ה-80 (Kobayashi et al. 1984a, b, 1985, 1986; Karasawa et al.1986; Xiong et al. 1996). ההפגנה שלפנילתנואידים גליקוזידים(PheGs) כתרכובות יעילות המגנות על תאי נוירון מפני נזק (Sheng et al. 2002; Puet al. 2003; Geng et al. 2004; Tian and Pu. 2005) שנגרמו על ידי כימיקלים והזדקנות, הניעו את העלייה בביקוש בשוק למזונות בריאות זמינים מסחרית וסמים. עקב קציר יתר, שחיתות של בית גידול וטפילות מורכבת, משאבי הטבע שלCistanche deserticolaנמצאים על סף הכחדה, ובשנת 2003, נרשמו ב-The Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Wild Fauna and Flora (CITES).

כדי לפתור את הבעיות הקשורות למשאבים מוגבלים, בוצעו תרביות תאים ורקמות של צמח מרפא זה בסין. מחקרים אלה חקרו את ההשפעות של גורמים שונים, כולל הלחץ האוסמוטי (Liu ו-Cheng 2008), האכלה מקדים (Ouyang et al. 2005; Liu et al. 2007), האור באורך גל משתנה (Ouyang et al. 2003a), פטריות (Lu ו-2003). ו-Mei 2003; Cheng et al. 2005, 2006), גורמים אנדביוטיים (Ouyang et al. 2003b) על צמיחת תאים והצטברות של(פנילתנואיד גליקוזידים)PheGs. מחקרים אלה סיפקו מידע רב ערך עבור התרבות בקנה מידה גדול שלCistanche deserticolaהאופן שבו תרכובות אלו עוברות סינתזה ביולוגית ב-Cistanchecells עדיין לא ברור ומעט מידע גנטי דווח.

הוכח בניסויים בהאכלה מבשר עם איזוטופים (Ellis 1983; Saimaru and Orihara 2010) שקבוצת הקפאויל של אקטאוזיד נגזרה מ-L-פנילאלנין, בעוד ש-3, 4-דיהידרוקסיל פניל-אתנול-טירוסיד נגזר מ-L-phenylalanine. מסלול ביו-סינתטי היפותטי של(פנילתנואיד גליקוזידים)PheGs פנימהCistanche deserticolaהוצע (איור משלים. 1) בהתבסס על הידע הנוכחי של מסלולים ביוסינתטיים קשורים. האנזים PAL זירז את הצעד הראשון מפנילאלנין לקבוצת הקפאויל. PAL הוכח בעקיפין כאנזים חשוב בביוסינתזה של(פנילתנואיד גליקוזידים)PheGs על ידי מחקר טיפול מעורר בCistanche deserticola(Lu and Mei 2003; Cheng et al. 2005, 2006; Ouyang et al. 2003b), שבו סך הכל(פנילתנואיד גליקוזידים)הצטברות PheGs שופרה יחד עם פעילות מוגברת של PAL. טיפול Elicitor לא רק ישפר את רמת הביטוי של PAL אלא גם ישפר את רמות האנזימים האחרים המעורבים במסלול הביוסינתזה של מטבוליטים משניים. בשל הקשיים בהקמת מערכת הטרנספורמציה שלCistanche deserticola, הוכחה ישירה של ביטוי יתר PAL על(פנילתנואיד גליקוזידים)הצטברות PheG לא דווחה. במפעלים אחרים המייצרים(פנילתנואיד גליקוזידים)PheGs, כגון צמחים מסוג Echinacea, הניסוי גם לא נערך. כאן אנו מדווחים על ההשפעות של הטיפול בחומצה פוספונית של המעכב הספציפי PAL 2-aminoindan-2-על צמיחת התאים, סך התרכובות הפנוליות, פעילות PAL והצטברות של(פנילתנואיד גליקוזידים)PheGs בתרבות תאי ההשעיה שלCistanche deserticola, במאמץ להעריך את התפקיד הפונקציונלי של PAL בביוסינתזה של PheGs. כדי ללמוד את המסלול הביוסינתטי של(פנילתנואיד גליקוזידים)PheGs ברמה מולקולרית, שיבטנו ואפייננו את הגן CdPAL1 מהקלוס שלCistanche deserticola(Hu et al. 2010). אנו מנסים לבסס את מערכת הטרנספורמציה של צמחי אכינצאה בתיווך Agrobacterium rhizogenes ולהכניס את הגן לשורש השעיר של אכינצאה כדי לחקור את ההשפעות הישירות של ביטוי יתר של גן זה על הצטברות PheGs. חוץ מזה, שיבטנו כמה גנים המעורבים במסלול הביוסינתטי של PheGs מCistanche deserticolaקאלוס באמצעות הקרנת ספריית cDNA ו-RACE PCR, כגון Tyrosinase, Cinnamyl alcoholdehydrogenase, Tyrosine decarboxylase, Cinnamate-3-hydroxylase, Coumarate-4-hydroxylase; UDP-glucosyltransferase, ו- Hydroxylcinnamyl transferase. נבצע ניסויים נוספים הכוללים אפיון מולקולרי, ניתוח ביטוי, קווי ביטוי יתר של שורש אכינצאה כדי להבהיר את המסלול הביוסינתטי של PheGson ברמה מולקולרית.

חומרים ושיטות

תרבית תאי השעיה של C. deserticola

תרבית תאי השעיה שלCistanche deserticolaנשמר במדיה נוזלית B5 (Gamborg et al. 1968) בתוספת 30 גרם סוכרוז-l-1, 0.5 מ"ג 6-BA-l-1 , ו-2.0 mgNAA l-1 ב-25 ± 1 מעלות עם ניעור (180 סל"ד). תקופת האור הייתה 16 (L)/8 (D) ותרבות תאי ההשעיה תורבה משנה כל 28 ימים. במהלך תת-תרבות, תרבית תאי ההשעיה סוננה תחילה בספסל נקי באמצעות בד Mira מאוטוקלאב ולאחר מכן נשקללה גלולת התאים הטריים וחוסנה למדיה חדשה בריכוז של 2 גרם FW-50 ml-1.

חקירת צמיחה

צמיחת תאים נמדדה בעיקר לפי משקל טרי של תאים (FW) ומשקל יבש (DW). תרביות תאים נדגמו ביום השני, הרביעי, ה-8, ה-12, ה-17, ה-22 וה-28 והסוננו עם סינון ואקום באמצעות בד Mira עד שלא ירד נוזל נוסף מהמשפך. גלולת התא נשקללה ונרשמה כ-FW. מחצית מהתאים הטריים שנאספו אוחסנו ב--78 צלזיוס לצורך בדיקת פעילות והחצי השני יובש ב-60 צלזיוס למשך 24 שעות עד שנצפה משקל קבוע. התאים המיובשים צוננו בטמפרטורת החדר בטמפרטורת החדר ולאחר מכן נשקלו. משקל זה הוכפל בשניים ונרשם כ-DW. דגימות התאים המיובשות נטחנו לאבקה דקה (מסיבת 80 עד 100 אחוז), הונחו בצינורות חומים, אטמו, ואוחסנו ב--20 מעלות לניסויים עתידיים.

מיצוי וקביעת תכולה של תרכובות טוטאליות

30 מיליגרם של אבקת תאים מיובשים מכל דגימה חולצו באמצעות 400 ll של 80 אחוז מתנול ב-37 C למשך שעה עם מהירות ניעור של 200 סל"ד ולאחר מכן צנטריפוגה. הסופרנטנט הועבר לצינור חדש והפסולת חולצה פעמיים נוספות באותו הליך. הסופרנטנט אוחד, סונן ונוצל לקביעת תכולת התרכובת הפנולית הכוללת וניתוח HPLC (Hu 2007).

התוכן של סך התרכובות הפנוליות נותחו בשיטת Folin-Ciocalteu שונה (Singletonet al. 1999). מגיב Folin-Ciocalteu היה מדולל בנפח 1 של מים מזוקקים. התמצית שהתקבלה דוללה פעמים והשתמשו ב-10 ליטר מהתמצית בכל מבחן תוכן. עשרה מיקרוליטר מכל תמצית מדוללת נוספו לתמיסת 200 ליטר שהוכנה טריה של 2 אחוז נתרן פחמתי. התערובת עורבבה במרץ ולאחר מכן צנטריפוגה קצרה. התערובת הודגרה ב-RT למשך 5 דקות ולאחר מכן ערבבה עם 10 ll מגיב פולין מדולל. התערובת הסופית עורבבה במרץ והודגרה ב-RT למשך 30 דקות. OD750 נמדד בספקטרופוטומטר UV/Vis ונרשם עבור חישוב סך התרכובות הפנוליות. התמיסה הטורית של חומצה כלורוגנית שימשה כתרכובת הסטנדרטית והוכנה עקומה סטנדרטית בין כמות החומצה הכלורוגנית ל-OD750 כדי לחשב את התוכן המייצג של תרכובות טוטאליות כחומצה כלורוגנית. באמצעות תכולת התרכובת הפנולית הכוללת ונתוני הצמיחה של דגימות, חישבנו את התשואה של התרכובת הפנולית הכוללת בכל דגימה וביטאנו כמה מיליגרם מכלל התרכובת הפנולית נוצרת במלטה אחת (מג L-1).

טיפול AIP

תמיסת מניות AIP הוכנה באמצעות מים מזוקקים כדי להגיע לריכוז סופי של 4 מ"מ. נפח מתאים של תמיסה נוספה ל-50 מ"ל של המדיה כדי להשיג ריכוזים סופיים של 0.5 ו-2.0 lM. אמצעי התקשורת עברו חיטוי וחיסנו בתאים שנאספו זה עתה. צלוחיות משולשות חוסנו בתאים שנאספו מאותו בקבוק ושימשו בכל הקבוצות כדי למזער את השגיאה השיטתית.

ניתוח HPLC

תמציות שהתקבלו ב'חילוץ וקביעת תוכן של סך התרכובות הפנוליות' סוננו באמצעות מסנן 0.5 lm לפני ניתוח HPLC. ניתוח HPLC בוצע באמצעות Hitachi HPLC (משאבת L-2130, גלאי UV/Vis L-2420 ודגימה אוטומטית של L-2200 עם עמודה C18 (150 9 4.6 מ"מ, 5 lm, Waters), פאזה ניידת (גלידת שיפוע MeOH/H2O), ואורך גל זיהוי של 330 ו-220 ננומטר לזיהוי של(פנילתנואיד גליקוזידים)PheGs ו-salidroside, בהתאמה. עשרה מיקרוליטר מכל תרכובת סטנדרטית ותמצית דגימה הוזרקו לתוך העמודה. קביעות תכולה של אכינאקוסיד, אקטאוזיד, ציסטנוסיד A, טובולוזיד A וסלידרוזיד בוצעו תוך שימוש בעקומת התקן של כל תרכובת ייחוס. סלידרוסיד ואכינאקוסיד נרכשו מהמכון הלאומי עבור השליטה במוצרים פרמצבטיים וביולוגיים (בייג'ינג, סין) וד"ר Nobuhisa Ezaki מחברת Yomeishu Seizo סיפקו את תרכובות ההתייחסות האחרות. הטוהר של כל התרכובות הסטנדרטיות גבוה מ-95 אחוז. מידע מבני עבור חמש התרכובות שנבדקו מופיע בטבלה 1.

בדיקת פעילות PAL

חלבון גולמי הופץ מדגימות המאוחסנות בדרגה של {{0}}. דגימה של 0.1 גרם נטחנה לאבקה דקה עם חנקן נוזלי ו-600 ליטרים של חיץ מיצוי חלבון הוסיפו לשפופרת המכילה את אבקת התא ולאחר מכן מערבולת נמרצת עבור 5 דקות ב-4תוֹאַר. התערובת עברה צנטריפוגה ב-13,000 סל"ד ב-4 מעלות למשך 10 דקות. הסופרנטנט הוגדר כתמצית חלבון גולמי. עשרה מיקרוליטר של תמצית החלבון הגולמי נוספו למאגר Tris-HCl (pH 8.5) המכיל 10 ll של 5 mM פנילאלנין על קרח. התערובת הודגרה ב-55תוֹאַרבמשך 20 דקות ומרווה על ידי תוספת של 50 ll של 2 M HCl. שינויים OD270 נרשמו כדי לחשב את הייצור של חומצה קינמית על סמך העקומה הסטנדרטית של חומצה טרנס-קינמית. שטח הזמן הכולל של PALactivity מתחת לעקומה (AUC) חושב על סמך נתוני צמיחת התאים ונתוני מבחן פעילות PAL.

ניתוח סטטיסטי

כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת Microsoft Excel, כולל שגיאות סטנדרטיות וניתוח רגרסיה ליניארי

תוצאות ודיון

השפעות של טיפול AIP על צמיחת תאים שלCistanche deserticolaתרבית תאי השעיה

כפי שמוצג באיור 1, לטיפול ב-AIP בשני הריכוזים לא היו השפעות מעכבות על צמיחת תאים כפי שצוין על ידי FW ו-DW.

השפעות של טיפול AIP על פעילות PAL

כפי שמוצג באיור 2, טיפול ב-AIP בשני הריכוזים לא הביא לירידה בפעילות ה-PAL ביום השני, אך פעילות ה-PAL ירדה משמעותית בימים 4 עד ה-28. באותם ימים, פעילות ה-PAL של התאים שטופלו 0.5 lMAIP הייתה 80.3, 73.2, 82.7, 68.5, 62.3 ו-42.4 אחוזים מהתאים הלא מטופלים, ותחת 2 lM AIP.

השפעות של טיפול AIP על הצטברות תרכובות פנוליות הכוללות

איור 3a הראה שטיפול ב-AIP בשני הריכוזים השפיע במידה ניכרת על הביוסינתזה של סך כל התרכובות הפנוליות. בדומה לפעילות ה-PAL, התכולה הכוללת של תרכובות פנוליות לא ירדה ביום השני אלא החלה לרדת ביום הרביעי. ההשפעות המעכבות של AIP ב-0.5 ו-2 lM על סך תכולת התרכובות הפנוליות היו דומות מאוד. שיעור עיכוב התוכן נע בין 91.1 ל-50.1 אחוזים ובין 89.9 ל-41.5 אחוזים מהתאים הלא מטופלים בתאים שטופלו ב-0.5 ו-2 lM AIP, בהתאמה. בהתבסס על קביעת התוכן של סך התרכובות הפנוליות ונתוני גידול התאים, התשואות של סך התרכובות הפנוליות חושבו כפי שמוצג באיור 3b. שינויים משמעותיים בתשואה של תרכובות פנוליות בשלבי גדילה שונים ניכרו בתאים שטופלו ב-AIP של 0.5 ו-2.0 lM בהשוואה לתאים לא מטופלים. כפי שמוצג באיורים. 2 ו-3, לעיכוב פעילות ה-PAL והירידה בסך התרכובות והתשואות הפנוליות היו מגמות דומות.

בוצע ניתוח רגרסיה ליניארי בין פעילות PAL לבין תרכובות פנוליות הכוללות והתוצאות העלו כי בתאים שטופלו ב-AIP, פעילות ה-PAL הייתה קשורה קשר הדוק לתכולת התרכובת הפנולית הכוללת (איור 4א). התשואה של סך התרכובות הפנוליות בדגימה בכל שלב בזמן היא תוצאה של הצטברות; לפיכך, בוצע ניתוח רגרסיה ליניארית בין AUC הכולל של פעילות PAL בזמן ה-AUC לבין התשואה הכוללת של תרכובות פנוליות. איור 2 מראה שפעילות ה-PAL הייתה שונה בכל נקודת זמן; לפיכך, על מנת לחשב את AUC הכולל של פעילות PAL בזמן, אנו מניחים כאן שפעילות PAL בין שתי נקודות זמן השתנתה באופן ליניארי. כפי שמוצג באיור. 4b, ה-AUC תואם היטב עם התשואה הכוללת של התרכובת הפנולית והציג מקדמי מתאם (R2) של 0.9788, {{10}}.8157 ו-0 .6981 עבור התאים הלא מטופלים,0.5 lM AIP ו-2.0 lM AIP, בהתאמה. בהתבסס על תוצאות אלו, הגענו למסקנה שעיכוב PALactivity שנגרם על ידי טיפול AIP הביא לירידה בסך הביוסינתזה והצטברות של תרכובות פנוליות.Cistanche deserticolaתרבית תאי השעיה.

השפעות של טיפול AIP על הצטברות של סלידרוזיד וארבעה(פנילתנואיד גליקוזידים)PheGs

ללמוד את ההשפעות המפורטות של AIP על הביוסינתזה והצטברות של(פנילתנואיד גליקוזידים)PheGs, תמציות של דגימות שונות הוחלו על HPLC והכרומטוגרמה המייצגת של כל דגימה מוצגת באיור 5. הנוסחה הסטנדרטית של תרכובות שנבדקו וזמני השמירה שלהן מפורטים בטבלה 2. כפי שהראה איור 5a, סלידרוזיד וארבעת ה-PheGs האחרים הם קווי בסיס מופרדים תחת המצב האנליטי שלנו. אנו יכולים לראות מאיור 5b-d, שתכולת הסלידרוסיד לא השתנתה באופן משמעותי, ובאיור 5f, g, ששטח הפסגות שזוהה ב-330 ננומטר ירד באופן מובהק וירידה מתמשכת ב-0.5 ו-2 lM AIP שטופלו תמציות תאים בהשוואה לתאים לא מטופלים (איור 5ה).

השינויים בתכולה ובתפוקה של כל תרכובת שנבדקה מוצגים באיור 6 ובטבלה 3. לפי התוצאות שלנו, אכינאקוסיד וציסטנוזיד A הם שני התרכובות העיקריות ותכולתם גבוהה פי עשרה בערך משלושת התרכובות האחרות. עם זאת, היו הבדלים משמעותיים בתכולת כל תרכובת בתגובה לטיפול ב-AIP. במקרה של אכינאקוסיד, התכולה בתאים לא מטופלים החלה לעלות ברציפות מהיום ה-8 עד היום ה-28 (איור 5a), שהייתה שונה למדי מהדפוס של ה-cistanoside A, שהגיע לתכולה הגבוהה ביותר ביום ה-8 וירד מעט ברציפות עד היום ה-28. בתאים שטופלו ב-AIP, התוכן של שתי התרכובות ירד באופן משמעותי באותו דפוס. תכולת האקטאוזיד והטובולוזיד הייתה נמוכה בהרבה מאכינאקוסיד, בעוד שמגמת השינוי הייתה דומה לאכינאקוסיד. ישנה גם ירידה דרמטית בתפוקה של כל תרכובת שנבדקה עבור התאים שטופלו ב-AIP 0.5 ו-2 lM בהשוואה לתאים שלא טופלו. לפי איור 6 וטבלה 3, התפוקה של echinacoside, cistanoside, acteoside, tubuloside A ו-salidroside ירדה לכ-10, 10, 34, 36 ו-25 אחוזים של תאים לא מטופלים, בהתאמה, ביום ה-28 בתאים שטופלו ב-AIP בשניהם. ריכוזים.

ניתוח רגרסיה לינארית בין פעילות PAL לבין(פנילתנואיד גליקוזידים)הצטברות PheGs

כדי לקבוע כיצד פעילות ה-PAL והתכולה של כל תרכובת שנבדקה נמצאו בקורלציה בכל קבוצה, בוצעה ניתוח קווי גרסיה (איור 7). התוכן של סלידרוזיד בכל הקבוצות היה בעל מקדם המתאם הנמוך ביותר (R2), החל מ-0.1651 בתא הלא מטופל ל-0.4753 ב-2.0 התאים שטופלו ב-AIP . פרט לסלידרוזיד, לשאר התרכובות שנבדקו היו מקדמי מתאם גבוהים בהרבה וה-R2 שלהן מופיע באיור 7. התוצאות שלנו הוכיחו שפעילות PAL נמצאת בקורלציה גבוהה עם התוכן של echinacoside, acteoside, cistanoside A ו- tubuloside A בכל הקבוצות.

ערכנו גם ניתוח רגרסיה ליניארית בין AUC הכולל של פעילות PAL בזמן AUC לבין כל תשואה שנבדקה בדגימות שנאספו (איור 8). ניתוח הרגרסיה הצביע על כך שהתשואה של כל תרכובת נמצאת בקורלציה שונה ל-AUC. בתאים הלא מטופלים, לכל חמשת התרכובות יש מקדמי מתאם גבוהים עם AUC בזמן פעילות PAL. עם זאת, בתאים שטופלו ב-AIP, רק Echinacoside, Acteoside ו- Tubuloside A שמרו על מקדמי מתאם גבוהים ושתי התרכובות האחרות, ל-Cistanoside A ול- Salidroside היו מקדמי מתאם נמוכים מאוד עם AUC הכולל של פעילות PAL בזמן. תוצאות אלו הצביעו על כך שלפעילות PAL היו השפעות שונות מאוד על הצטברות התרכובות הללו. לפי טבלה 1, לתרכובות echinacoside, acteoside ו-tubuloside A יש קבוצת קפאואיל וקבוצת 3, 4-די-הידרוקסיל פניל ​​אתנול; לציסטנוזיד A יש קבוצת פרולואיל וקבוצת 3-מתוקסי, 4-הידרוקסיל פניל ​​אתנול; ל-andsalidroside יש קבוצת הידרוקסיל פניל ​​אתנול. הסיבה לכך שלתרכובות אלו יש מקדמי מתאם שונים עם AUC הכולל של פעילות PAL בזמן פעילות בתאים שטופלו ב-AIP עשויה להיות קשורה למקורות הביוסינתטיים השונים שלהם.

כפי שמוצג באיור 5, לאחר טיפול AIP, רוב השיאים ירדו באופן רציף ובאופן משמעותי וחמישה זוהו במחקר זה. בין התרכובות שנבדקו, רק לסאלידרוסיד לא הייתה קבוצת קפאואיל. לפני מחקר זה, חשבו שהתכולה של חומרי ביניים חשובים לפני שילוב קבוצות קפאואיל, כגון אסלידרוזיד, תגדל בגלל עיכוב פעילות PAL, אך לא מצאנו שיאים מוגברים באופן משמעותי בתאים שטופלו ב-AIP. תוצאה זו עשויה להתרחש בגלל(פנילתנואיד גליקוזידים)PheGs הם מטבוליטים משניים ב-C. deseriticola והייצור של אלה(פנילתנואיד גליקוזידים)PheGs מווסת על ידי הלחץ הסביבתי של התאים. בניסויים שלנו, התאים שטופלו ב-AIP אינם מטופלים במתח או בלחצים אחרים, ולכן הייצור של PheGs וחומרי הביניים שלהם עוברים באופן לא ביו-סינתזה בתאים שטופלו ב-AIP. כמו כן, דווח כי (Chapple et al. 1986) פעילות טירוזינד-קרבוקסילאז צמחית (TYRDC) יכולה להיות מעוכבת מאוד על ידי La-aminooxy-b-phenylpropionate, מעכב תחרותי ספציפי אחר ל-PAL. TYRDC הוא אנזים מפתח בייצור סלידרוזיד מטירוזין. עם זאת, על פי התוצאות שלנו, תכולת הסלידרוזיד לא הושפעה באופן משמעותי מטיפול AIP, מה שהצביע על כך שפעילות ה-TYRDC לא הושפעה מאוד. נדרש בדיקת פעילות ספציפית באמצעות חלבון מטוהר TYRDC או חלבון רקומביננטי כדי לקבוע את ההשפעות של AIP על פעילותו.

מסקנות

התוצאות שלנו הוכיחו שלטיפול ב-AIP ב-{{0}}.5 ו-2.0 lM לא היו השפעות ניכרות על צמיחת התאים, אך הביא לעיכוב משמעותי של פעילות PAL, ביוסינתזה והצטברות של תרכובת פנולית כוללת ונבדקה.(פנילתנואיד גליקוזידים)תרבית תאי השעיה PheGsin שלCistanche deserticola. ניתוח קווי גריסה הצביע על כך שלפעילות PAL היו מקדמי מתאם גבוהים עם תכולת התרכובות הפנוליות הכוללות(פנילתנואיד גליקוזידים)תוכן PheGs, מלבד סלידרוזיד בכל קבוצות התאים. לתשואות של סך התרכובות הפנוליות ולחמשת התרכובות שנבדקו היו מקדמי מתאם גבוהים עם AUC הכולל של פעילות PAL בזמן פעילות בתאים לא מטופלים. לגבי תאים שטופלו ב-AIP, רק echinacoside, acteoside ו-tubuloside A שמרו על מקדמי מתאם גבוהים עם AUC בזמן פעילות TotalPAL. מקורות ביוסינתטיים שונים עשויים להיות אחראים להבדל זה. לסיכום, התוצאות שלנו העלו כי לאנזים PAL תפקיד חשוב בשליטה על הביוסינתזה והצטברות של(פנילתנואיד גליקוזידים)PheGs בתרבית תאי ההשעיה שלCistanche deserticola.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר של אוניברסיטת דונג-א. ברצוננו להודות לפרופסור ג'רי זון שעובד במכון לכימיה אורגנית ביוכימיה וביוטכנולוגיה, האוניברסיטה הטכנולוגית של ורוצלב בפולין על כך שהוא מספק לנו AIP. ברצוננו גם להביע את הערכתנו לד"ר נובוהיסה אזקי בחברת Yomeishu Seizo ביפן על שנתנה לנו תרכובות סטנדרטיות cistanoside A, acteoside ו-tubuloside A עבור הניסויים שלנו.

מתוך: 'השפעות של טיפול 2-אמינואינדאן-2- בחומצה פוספונית על הצטברות של סלידרוסיד וארבעה גליקוזידים פנילתנואידים בתרבית תאי תרחיף של Cistanche deserticola' על ידיGao Sheng Hu, et al

---Plant Cell Rep (2011) 30:665–674 DOI 10.1007/s00299-010-0997-3

הפניות

Chapple CCS, Walker MA, Ellis BE (1986) צמח טירוזין דקרבוקסילאז יכול להיות מעוכב חזק על ידי La-aminooxy-b-phenylpropionate. פלנטה 167:101–105

Cheng XY, Guo B, Zhou HY et al (2005) העלאה חוזרת משפרתפנילתנואידים גליקוזידיםהצטברות בתרביות תאי השעיה שלCistanche deserticola. J Biochem Eng 24:203–207
Cheng XY, Zhou HY, Cui X, et al (2006) שיפור שלפנילתנואידים גליקוזידיםביוסינתזה בCistanche deserticolaתרביות תאי השעיה על ידי elicitor chitosan. J Biotechnol 121(2):253–260
Ellis BE (1983) ייצור של hydroxyphenyl ethanol glycosides בתרביות השעיה של Syringa vulgaris. פיטוכימיה 22(9):1941–1943
Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968) דרישות תזונתיות של תרביות השעיה של תאי שורש סויה. Exp Cell Res 50:151–158
Geng XC, Song LW, Pu XP et al (2004) Neuroprotective Effects ofפנילתנואידים גליקוזידיםמCistanchesסלסה נגד 1-מתיל-4-פניל-1,2,3,6-טטרה-הידרו-פירידין (MPTP) רעילות דופאמינרגית הנגרמת בעכברי C57. ביול פארם בול 27(6):797–801
Hu GS (2007) מחקרים על תרבות תאי ההשעיה והביולוגיה המולקולרית שלCistanche deserticola. עבודת גמר לתואר שני, Shenyang Pharmaceutical University Hu GS, Jia JM, Hur YJ, et al (2010) אפיון מולקולרי של phenylalanine ammonia-lyase מCistanche deserticola.Mol Bio Rep. doi:10.1007/s11033-010-0489-0
Karasawa H, Kobayashi H, Takizawa N et al (1986) מחקרים על המרכיבים של Cistanchis Herba. VIII. Yakugaku Zasshi 106(8):721–724
Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T et al (1984a) מחקרים על המרכיבים של Cistanchis Herba. IV. Chem Pharm Bull 32(10):3880–3885
Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T et al (1984b) מחקרים על המרכיבים של Cistanchis Herba. III. Chem Pharm Bull 32(8):3009–3014
Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T et al (1985) מחקרים על המרכיבים של Cistanchis Herba. V. Chem Pharm Bull 33(4):1452–1457
Kobayashi H, Karasawa H, Takizawa N et al (1986) מחקרים על המרכיבים של Cistanchis Herba. VII. Yakugaku Zasshi 106(7):562–566
Liu CZ, Cheng XY (2008) שיפור שלפנילתנואידים גליקוזידיםביוסינתזה בתרביות תאים שלCistanche deserticolaעל ידי מתח אוסמוטי. Plant Cell Rep 27:357–362
Liu JY, Guo ZG, Zeng ZL (2007) הצטברות משופרת שלפנילתנואיד גליקוזידs על ידי האכלה מקדים לתרבות ההשעיה של סלסה Cistanche. Biochem Eng J 33:88–93
Lu CT, Mei XG (2003) שיפור שלפנילתנואידים גליקוזידיםייצור על ידי גורם פטרייתי בתרבית תאי השעיה שלCistanche deserticola.Biotechnol Lett 25:1437–1439
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, et al (2003a) עוצמת אור ואיכות ספקטרלית המשפיעים על צמיחת הקאלוס שלCistanche deserticolaוביוסינתזה שלפנילתנואידים גליקוזידים. Plant Sci 165:657–661
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, et al (2003b) השפעות של יסודות אדמה נדירים על הצמיחה שלCistanche deserticolaתאים וייצור שלפנילתנואידים גליקוזידים. J Biotechnol 102:129-134
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, et al (2005) ייצור משופר שלפנילתנואידים גליקוזידיםעל ידי הזנת מבשר לתרבית התאים שלCistanche deserticola. Process Biochem 40:3480–3484
Pu XP, Song ZH, Li YY et al (2003) Acteoside מ- Cistanche salsa מעכב אפופטוזיס על ידי 1, 2-מתיל פנילפירידיניום יון בנוירונים של גרגירים במוח הקטן. פלנטה מד 69:652–666
Saimaru H, Orihara Y (2010) ביוסינתזה של אקטאוזיד בתאים מתורבתים של Olea europaea. J Nat Med 64:139–145
Sheng GQ, Pu XP, Lei L, et al (2002) Tubuloside B מ- Cistanche Salsa מציל את תאי העצב PC12 מאפופטוזיס המושרה על ידי מתיל פניל ​​פירידיניום ולחץ חמצוני. פלנטה מד 68:966–970
Singleton VL, Orthofer R, Lamuela-Ravento's RM (1999) ניתוח של סך הפנולים ומצעי חמצון אחרים ונוגדי חמצון באמצעות ריאגנט Folin-Ciocalteu. Method Enzymol 299:152–178
Tian XF, Pu XP (2005)פנילתנואיד גליקוזידs מסלסה Cistanches מעכבים אפופטוזיס המושרה על ידי יון 1-מתיל-4-פנילפירידיניום בנוירונים. J Ethnopharmacol 97:59–63
Xiong Q, Kadota S, Tani T, et al (1996) השפעות נוגדות חמצון של פנילאתנואידים מCistanche deserticola. ביול פארם בול 19(12):1580–1585