השפעת שנקאנג על פיברוזיס כליות והפעלה של פיברובלסטים ביניים כליות דרך מסלול JAK2/STAT3
Feb 27, 2022
רקע כללי
מחלת כליות כרונית (CKD) נובעת ממגוון מחלות שונות הפוגעות בכליה באופן בלתי הפיך וגורמות לסוגים שונים של סיבוכים בחולים [1]. עבור חולים שעוברים דיאליזה, איכות החיים מושפעת מאוד, והעלויות הרפואיות גבוהות מאוד [2]. התהליך הפתולוגי העיקרי שלפגיעה כלייתיתמוביל לנורמליותשֶׁל הַכְּלָיוֹתהרס פרנכימה ויצירת רקמת צלקת מתקדמת, מה שמוביל בסופו של דבר לפיברוזיס. שֶׁל הַכְּלָיוֹתפיברוזיס כולל פיברוזיס אינטרסטיציאלי צינורי וגלומרולוסקלרוזיס [3], המובילים להרס שלrרקמת האנל ואובדן תפקוד.שֶׁל הַכְּלָיוֹתפיברוזיס tubulointerstitial הוא המסלול האופייני להתפתחות מתקדמת של כמעט כל מחלת CKD והבסיס הפתולוגי העיקרי לשלב הסופימחלת כליות,המאופיין בנייוון תאי אפיתל צינורי, חדירת תאים דלקתיים, הפעלה חריגה וצמיחה שלשֶׁל הַכְּלָיוֹתפיברובלסטים והצטברות יתר של מטריקס חוץ-תאי (ECM) [4, 5]. התאים המשפיעים, -אקטין שריר חלק (-SMA)-מיופיברובלסטים חיוביים, מסנתזים ומפרישים ECM. ההפעלה של פיברובלסטים אינטרסטיציאליים לתוך מיופיברובלסטים יכולה לסייע בתיקון רקמה פגומה. עם זאת, כאשר תהליך תיקון זה אינו תקין ומופרש ECM מוגזם, נוצר נזק בלתי הפיך לכליות. בהתאם לכך, מסלול האיתות המתווך הפעלת מיופיברובלסט עשוי להיות מטרה להקלה על תהליךשֶׁל הַכְּלָיוֹתלַיֶפֶת.
CISTANCHE ישפר מחלת כליות/כליות
מסלול Janus kinase/signal ו-activator of transcription (JAK/STAT) הוא מפל איתות פליאוטרופי למספר גורמי גדילה וציטוקינים [6] המתווך מגוון של תפקודים תאיים, כולל הישרדות תאים ושגשוג [7]. STAT3 מופעל על ידי זרחון טירוזין (Tyr) ב-Tyr705 דרך Janus kinase בתגובה למגוון גורמי גדילה וציטוקינים, כולל גורם גדילה מתמר (TGF-) [8]. STAT3 הפוספוריל יוצר דימרים, אשר מועברים לאחר מכן לגרעין, שם הם נקשרים ישירות לרצף ה-DNA ומווסתים את הביטוי של גני מטרה [9]. ההפעלה של STAT3 ו-JAK2 מוגברת בפיברובלסטים ביניים כליתיים פיברוגניים הנגרמת על ידי חסימה חד-צדדית של השופכה (UUO) [10, 11]. עלייה בזרחן STAT3 נצפתה גם בתאי NRK-49F שטופלו ב-TGF- - [12].
טיפולים נוכחיים בשימוש נרחב עבור CKD מלווים לעתים קרובות בתופעות פחות משביעות רצון [13] ותופעות לוואי שכיחות. לפיכך, ישנה משמעות רבה לחקור ולזהות אמצעי טיפול יעילים למניעה ובקרה של התרחשות והתפתחות CKD כדי לשפר את הפרוגנוזה של החולים. Shenkang (SK) היא פורמולת צמחים נפוצה המכילה ריבס (Rheum palmatum L. או R. tanguticum Maxim. ex Balf.), מרווה אדומה (Salvia miltiorrhiza Bunge), חריע (Carthamus tinctorius L.), ואסטרגלוס (Astragalus mongholicus) באנג'). מאז שנות ה-90, נעשה שימוש ב-SK בסין לטיפול ב-CKD ומחלות נלוות, כולל נפרופתיה סוכרתית (DN), כרוניתכשל כלייתי, גלומרולונפריטיס, דלקת כליות כרונית ושֶׁל הַכְּלָיוֹתאִי סְפִיקָה. עם ההשפעות הטיפוליות הברורות שלה ומעט תופעות הלוואי, SK עשויה לעכב את התקדמותשֶׁל הַכְּלָיוֹתתפקוד לקוי ב-CKD. בניסוי קליני של 2200 אנשים, היעילות של SK בהגנה מפני כרונישֶׁל הַכְּלָיוֹתכישלון ותסמינים הקשורים ל-CKD בעקבות טיפול ברפואה סינית מסורתית היו 73.05 ו-98.00 אחוזים, בהתאמה. בנוסף, קצב פינוי הקריאטינין ורמת הקריאטינין בסרום (SCr) נותרו יציבים, מה שמראה כי ל-SK יש יעילות טובה ובטוחה לטיפול ב-CKD [14]. אומת ש-SK מסוגלת להקל על CKD ושֶׁל הַכְּלָיוֹתפיברוזיס על ידי הפחתת פיברוזיס, דלקת [15] ואפופטוזיס [16]. עם זאת, רוב המחקרים הקיימים בנושא לא היו מקיפים מספיק והתמקדו בעיקר במסלולי TGF ובמסלולים קשורים. מודל ה-UUO מוכר כמודל ניסיוני לחקר פיברוזיס בכליות. במחקר הנוכחי, חקרנו את ההשפעות של SK על הפעלת תאי פיברובלסט של NRK-49F ופיברוזיס כליות בעכברי UUO. הוכחנו עוד שייתכן שההשפעות המרפאות הללו של SK הושגו על ידי מיקוד למסלול JAK2/STAT3 בתאי NRK-49F מתורבתים ומודל עכבר UUO.
מילות מפתח:Shenkang, מחלת כליות כרונית, פיברוזיס בכליות, UUO, הפעלת פיברובלסט בכליות, מסלול JAK2/STAT3
שיטות
כימיקלים וריאגנטים SK נרכשו מחברת Shijishenkang Pharmaceutical Company, Ltd. (שיאן, סין). טבליות אשלגן Losartan נרכשו מ- Merck Sharp & Dohme Pharmaceutical Company, Ltd. (Hangzhou, סין).
תרבית תאים
קו תאי הפיברובלסט של הכליה של חולדה (NRK-49F) הושג מאוסף תאים מסוג American Type (ATCC, מנאסס, VA, ארה"ב). תאי NRK-49F תורבו במדיום שלם, כלומר, מדיום Eagle's שונה של Dulbecco (Invitrogen, CA, ארה"ב) המכיל 5% סרום בקר עוברי, 1% פניצילין וסטרפטומיצין באווירה של 5% CO 2 ו-95 אחוז אוויר ב-37 מעלות. לאחר מכן, התאים טופלו עם או בלי TGF - 1 (10ng/mL) (Novoprotein, שנחאי, סין), חוסם קולטן אנגיוטנסין (ARB) (1 mg/mL) וריכוזי גרדיאנט של SK בעקבות היצמדות, ו הכדאיות התא הוערכה.
מבחני כדאיות התא
הכדאיות של תאי NRK-49F נקבעה באמצעות ערכת ספירת התא-8 (Dojindo, Kyushu, יפן) בהתאם להוראות הערכה. תאי NRK-49F צופו בצפיפות של 5 ×10 4 תאים לבאר בצלחות של 96-בארים. היו 5 חזרות לכל טיפול. לאחר 24 שעות או 48 שעות של תרבית, המדיום בכל באר הוחלף ב-100 μL של מדיום נטול סרום המכיל CCK-8 (10:1), והתאים הודגרו באינקובטור למשך שעתיים נוספות. הספיגה נמדדה באורך גל של 450 ננומטר. השפעת הטיפול חושבה כאחוז התאים החיים ביחס לתאי הבקרה החיים שטופלו ברכב בלבד.
חיות
ההליכים הניסויים שבהם נעשה שימוש במחקר זה אושרו על ידי ועדת הטיפול והאתיקה בבעלי חיים של אוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית מסורתית (מס' BUCM{{{{30}}}},018,{ {39}}60,419-2023) ועומדים בעקרונות המוכרים בעולם של שימוש וטיפול בחיות מעבדה. שלושים ושישה 8-עכברים זכרים בני שבוע C57BL/6 נרכשו מ-Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (SYXK (Jing), 2017–0{ {51}}33). העכברים הונחו במעבדה מיוחדת לבעלי חיים ללא פתוגנים בחדר ממוזג (אור: 12-שעות מחזור אור/חושך; טמפרטורת החדר: 25±1 מעלות; לחות יחסית: 50± 10 אחוז ) ומחולק באופן אקראי לשש הקבוצות הבאות: קבוצת הדמה, קבוצת UUO, קבוצת ARB וקבוצות SK במינון גבוה, בינוני ונמוך. UUO הושרה בעכברים בקבוצת UUO, בקבוצת ARB ובקבוצות SK במינון גבוה, בינוני ונמוך על פי נוהל שנקבע קודם לכן. הרדמה בוצעה עם 2 אחוז איזופלורן ונשמרה עם 1.5 אחוז איזופלורן. בוצע חתך אורך של 1- עד 2- ס"מ בבטן השמאלית, השופכן השמאלי הופרד בצורה בוטה, נקשר בשני מקומות ואז נחתך בין שתי הקשירות. לאחר מכן, חלל הבטן נסגר, ולאחר מכן ניתן משכך כאבים למשך 3 ימים. העכברים בקבוצת הדמה עברו פרוצדורות כירורגיות דומות, כולל הרדמה לפני ואחרי ניתוח, לפרוטומיה והפרדה קהה של השופכן, ללא קשירה וחיתוך השופכן. מהיום השני לאחר החסימה, לוזארטן ניתן תוך קיבה לעכברים בקבוצת ARB במינון של 0.13 מ"ג/10 גרם (0.15 מ"ל/10 גרם). SK במינון גבוה של 0.08 גרם/10 גרם (0.13 מ"ל/10 גרם), מינון מתון של 0.04 גרם/10 גרם (0.13 מ"ל/10 גרם), או מינון נמוך של 0.02 גרם/10 גרם (0.13 מ"ל/10 גרם) עכברים בקבוצת SK דרך וריד הזנב למשך 14 ימים לאחר קשירת השופכה. תמיסת מלח (0.13 מ"ל/10 גרם) ניתנה דרך וריד הזנב לעכברים בקבוצות הדמה, UUO ו-ARB, ותמיסת מלח (0.15 מ"ל/10 גרם) ניתנה באמצעות מתן לעכברים בקבוצות הדמה, UUO ו-SK כדי להפחית הֲטָיָה. לאחר MRI, דם נאסף מהעכברים על ידי ניקור לב לאחר הקרבה בהרדמה עמוקה (מושרה ומתוחזק עם 2 אחוז איזופלורן) ביום ה-14, ורקמות הכליה נאספו. סרום התקבל מדם מלא על ידי צנטריפוגה ב-1000 (× גרם) (4 מעלות) למשך 10 דקות. רמות חנקן אוריאה בדם בדם (BUN), SCr וציסטטין C (Cys-C) נמדדו בשיטה הקולורימטרית. צביעת המטוקסילין ואאוזין (HE) וצביעת סיריוס אדום בוצעו לזיהוי היסטופתולוגיה וקולגן במבנים סטרומליים של הכליה הפגועה, בהתאמה. עבור צביעת HE, הפרוסות הושרו במים מזוקקים לאחר הסרת שעווה, הושרו בתמיסת צביעה המטוקסילין (Solarbio Science & Technology, סין) ואחריה תמיסת אלכוהול חומצה הידרוכלורית 1 אחוז להפרדת צבעים, נשטפו במי ברז, הכחולו והוכתמו עם צבע אאוזין. הפרוסות המוכתמות נשטפו במים מזוקקים, התייבשו, נוקו ונאטמו במסטיק ניטרלי. עבור צביעת סיריוס אדום, הפרוסות עברו שחרור שעווה, נצבעו בהמטוקסילין האריס, נשטפו, נצבעו באדום סיריוס (Solarbio Science & Technology, סין), הופרדו ישירות והתייבשו עם אתנול מוחלט, נוקו בקסילן ונאטמו. חמישה שדות חזותיים שלשֶׁל הַכְּלָיוֹתקליפת המוח ואזור הצינורית הפרוקסימלית נבחרו באופן אקראי עבור כל עכבר. תוכנת ImageJ שימשה לחישוב השטח האדום, והשטח האדום הממוצע חושב כדי לקבוע את השטח המוכתם באדום של סיריוס.
MRI in vivo להערכת מידת הפיברוזיס בכליותעכברים עברו MRI ביום ה-13 לאחר מתן SK עם מערכת MRI 7T של בעלי חיים קטנים (Agilent 7T MRI system) וסליל גוף. הרדמה בוצעה עם 2 אחוז איזופלורן ונשמרה עם 1.5 אחוז איזופלורן. העכברים הונחו במצב שכיבה כשהבטן שלהם ממוקדת ביחס למרכז סליל תדר הרדיו וחוברו לחיישן נשימה כדי לנטר את הנשימה. מערכת RAPID Rat Head שימשה לעירור בתדר רדיו וזיהוי אותות. כל הסריקות בוצעו בנשימה חופשית. התמונות נרכשו באמצעות רצפי דיפוזיה טנסורית (DTI), והפרמטרים היו כדלקמן: כיוונים=30 (b=1004.7s/mm 2) פלוס null (b=0s/mm 2), Δ=4ms ו-δ=16ms. הפרמטרים של רכישת התמונה היו כדלקמן: TR/TE=3000ms/50.73ms, =60 מעלות, מטריצה=128×128, FOV=2×2 ס"מ ועובי פרוסת הדמיה =1מ"מ. משך הזמן הכולל להכנת הדיפוזיה היה 4ms. השהיית סריקה של 16ms הוחל בין סריקות, ושתי סריקות b=0s/mm 2 שולבו כדי להגביל את ההשפעות של הרפיית T1. זמן הסריקה הכולל היה כשעה. עקב הידרונפרוזיסכליות sחריגות מבנה שנגרמו מחסימת השופכה, רק הקורטקס החיצוני והמדולה החיצונית של רקמת כליית חולדה הוערכו לצורך ניתוח הדמיה. מפות אנזוטרופיה חלקית (FA) הושגו וחושבו באמצעות תוכנת VNMRJ4.0. כדי למדוד במדויק את עוצמת אות ה-MRI ולקבוע את מידת הפיברוזיס בין קבוצות שונות, נבחרו חמישה מטוסי סריקה עבור כל דגימת כליה, ושלושה אזורים קטנים של עניין נבחרו באקראי עבור כל מישור סריקה.
CISTANCHE ישפר את תפקוד הכליות/כליות
ניתוח כתם מערביהחלבון הכולל הופק מתאי באמצעות 500μL של חיץ תמוגה של חלבון RIPA (Solarbio, בייג'ינג, סין). לאחר צנטריפוגה ב-10000 (× גרם) למשך 10 דקות, נעשה שימוש בערכת בדיקת חלבון ברדפורד (Applygen, בייג'ין, סין) לכימות חלבון. כמויות שוות של חלבון (40 אג') עברו דנטורציה ב-100 מעלות למשך 10 דקות במאגר טעינה (Applygen, בייג'ין, סין), הופרדו על ידי אלקטרופורזה על 8-10 אחוזים של SDS-PAGE ג'לים בהתאם למשקל מולקולרי יחסי, והועברו באלקטרו ל-0.{{ 10}}מיקרומטר ממברנות פוליווינילידן דיפלואוריד (Millipore, Bedford, MA, ארה"ב). לאחר מכן, הממברנות נחסמו במאגר חוסם (Nacalai Tesque, יפן) ב-25±5 מעלות והודגרו עם נוגדנים ראשוניים, כולל -אקטין (Proteintech Group, ארה"ב, 1:5000), -SMA (Proteintech Group, ארה"ב, 1: 1000), קולגן III (קול I) (Abcam, בריטניה, 1:5000), STAT3 (Proteintech Group, ארה"ב, 1:2000), p-STAT3 (Tyr705) (Cell Signaling Technology, ארה"ב, 1:2000), JAK2 (Cell Signaling Technology, ארה"ב, 1:1000), p-JAK2 (Cell Signaling Technology, ארה"ב, Tyr1007) (1:1000), ו-Peroxiredoxin 5 (Prdx5) (Proteintech Group, ארה"ב, 1:800), ב- 4 מעלות בלילה. לאחר שטיפה ב-TBST, הממברנות הודגרו עם נוגדן משני (Cell Signaling Technology, ארה"ב, 1:10000) למשך שעה בטמפרטורת החדר ולאחר מכן נשטפו שוב עם TBST. לאחר מכן, נעשה שימוש בערכות זיהוי ECL לחשיפה. לאחר מכן, הצפיפות האופטית של פסי החלבון נקראה ונותחה על ידי תוכנת Image Lab™ לניתוח כמותי. הערכים הדנסיטומטריים נורמלו לצפיפות של פס-אקטין.
PCR כמותי בזמן אמתסך RNA הופק מתאי אושֶׁל הַכְּלָיוֹתרקמה באמצעות ערכת Monarch® Total RNA Miniprep לפי הוראות היצרן. לאחר מכן, נעשה שימוש במערכת ה-GoScript Reverse Transcription כדי לסנתז cDNA של גדיל ראשון לפי המדריך. PCR שעתוק הפוך בזמן אמת בוצע בתגובת 20-μL. פריימרים של מיקוד גנטית תוכננו על סמך רצפי mRNA שפורסמו על ידי NCBI והם מפורטים בטבלה 1. שפע ה-mRNA היחסי נקבע על בסיס היחס בין ביטוי mRNA ספציפי לביטוי mRNA -אקטין באותה דגימה, והשינוי בקפל ביחס לזה בעכברים בקבוצת הדמה או בתאים בקבוצת 0ng/mL TGF- 1 חושבו בשיטת 2 -ΔΔCt.
ניתוח סטטיסטיכל הנתונים משלושה ניסויים עצמאיים לפחות מבוטאים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות חבילת התוכנה SPSS 20.0. בוצעו מבחני תקינות ובדיקות הומוגניות לשונות. אם הנתונים היו מבוזרים נורמלית, נעשה שימוש במבחן t של Student כדי להשוות את ההבדלים בין שתי הקבוצות, וניתוח השונות בכיוון אחד (ANOVA) (מבחן LSD לשונות זוגיות ומבחן של דאנט לשונות לא אחידות) שימש להשוואת הבדלים בין קבוצות. אם הנתונים לא היו מופצים בצורה נורמלית, נעשה שימוש במבחן Mann-Whitney U הלא-פרמטרי כדי להשוות את ההבדלים בין שתי קבוצות, ומבחן Kruskal-Wallis הלא-פרמטרי שימש להשוואת ההבדלים בין יותר משתי קבוצות. פ<0.05, p=""><0.01 or="" p="" <="" 0.001="" indicates="" a="" significant="">
תוצאות
השפעת SK על כדאיות תאי NRK-49F לאחר טיפול ב-TGF- 1
TGF- הוא ציטוקין פיברוגנטי מפתח המעורב בפיברוזיס כליות. השתמשנו תחילה במינונים שונים של TGF- 1 (0, 10,20, 40 ו-80ng/mL) כדי לעורר את הצמיחה של תאי NRK- 49F. טיפול ב-TGF- 1 במשך 24 שעות הגביר את כדאיות התא באופן תלוי מינון (איור 1a), מה שעולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים שהתקבלו באמצעות מבחן MTT [17]. ריכוזי שיפוע של SK (1, 2, 4 ו-8 מ"ג/מ"ל) הפחיתו באופן משמעותי את שיפור החיוניות המושרה על ידי 10ng/mL TGF- 1 (איור 1ב), ואת השפעת הטיפול למשך 48 שעות היה ברור יותר מזה של טיפול במשך 24 שעות. תוצאה זו הראתה ש-SK יכול לדכא את צמיחת הפיברובלסט הכלייתי- 1-הנגרמת על ידי TGF ושיפור הכדאיות במבחנה.
SK עיכבה ביטוי המושרה על ידי TGF- - של -SMA ותצהיר של רכיבי ECM בתאי NRK-49Fמיופיברובלסטים הם פיברובלסטים פעילים המאופיינים בביטוי של -SMA ו-ECM. TGF- 1 הוא ציטוקין חשוב המעורב בייצור ECM על ידי מיופיברובלסטים ופיברוזיס [18]. כפי שמוצג באיור 2a ו-b, גם -SMA וגם col. III באו לידי ביטוי גבוה בתאי NRK-49F לאחר טיפול ב-TGF- 1, מה שמצביע על כך שהתאים התרבותיים הומרו למיופיברובלסטים פעילים בעת מתן TGF- 1. כדי לחקור עוד יותר האם SK יכול לדכא את ההפעלה של פיברובלסטים אינטרסטיציאליים כליות, בחנו את ההשפעה של SK על ביטוי -SMA וקולגן III בתאי NRK-49F. מתן SK הפחית באופן ניכר את הביטוי של -SMA (באופן תלוי מינון) (איור 2 ו-3a) וקול. III (איור 2), מה שמציע ש-SK יכול לדכא ישירות הפעלה הנגרמת על ידי TGF- 1- של תאי NRK-49F. הייתה נטייה להשפעה של 4ng/mL SK בהפחתת הביטוי המושרה על ידי TGF- 1- של -SMA ושל שקיעת רכיבי ECM להיות עדיפה על זו של losartan (1 mg/L).
SK עיכב TGF- 1-השראת STAT3, הפעלת JAK2 וביטוי Prdx5 בתאי NRK-49Fכדי לחקור את המנגנונים האפשריים שבאמצעותם SK מעכבת הפעלת פיברובלסט, זיהינו עוד ביטוי גנים ורמות חלבון STAT3 ו-JAK2 בתאי NRK-49F באמצעות RT-qPCR ו-Western blotting, בהתאמה. תאי NRK-49F ביטאו רמות גבוהות יותר של STAT3 ו-JAK2 mRNA לאחר גירוי TGF- 1 מאשר לפני הטיפול. SK עיכבה באופן דרמטי את ביטוי ה-MRNA של STAT3 ו-JAK2 של TGF- 1- ב-24 שעות (איור 3b ו-c). זרחון של STAT3 ב-Tyr705 ו-JAK2 ב-Tyr1007 גדל בנוכחות TGF- 1. SK גם דיכא את הזרחון של שתי מולקולות אלו (איור 2). Prdx5, מווסת מסלולים של JAK2/STAT3, היה מווסת מעלה בנוכחות TGF- 1, וגם ויסות זה התהפך על ידי טיפול SK (איור 2). כמעט כל ההשפעות, פרט לזה על הזרחון של JAK2 והביטוי של col. III, היו חזקים יותר בקבוצת SK במינון גבוה מאשר בקבוצת SK במינון נמוך. כתוצאה מכך, נראה שברור ש-SK עשוי לעכב הפעלה מושרה של TGF- 1- של פיברובלסטים של NRK-49F באמצעות ויסות הפעלת JAK2/STAT3. ב-2ng/mL או 4 ng/mL, ל-SK הייתה השפעה טובה יותר בהשבחת TGF- 1-מושרה של STAT3 ו-JAK2 וביטוי Prdx5 מאשר ללוסארטן.
SK הקל על הפרעה בתפקוד הכלייתי שנגרם כתוצאה מ-UUO ושינויים מורפולוגיים של הכליותמודל עכבר פיברוזיס כלייתי הוקם על ידי השראת UUO. איור 4 a, b, c מציג את מדדי התפקוד הכלייתי של קבוצת הדמה, קבוצת UUO, קבוצת ARB וקבוצות SK במינון גבוה, בינוני ונמוך לאחר 14 ימי טיפול. המינון הגבוה של SK הפחית באופן משמעותי את רמת Cys-C (P פחות או שווה ל-0.05; איור 4א) ואת רמות SCr (P פחות או שווה ל-{{12} }.01; איור 4c), ו-SK הפחיתו באופן ניכר את רמת ה-BUN בכל המינונים (P פחות או שווה ל-0.05 או P פחות או שווה ל-0.01; איור 4b). התוצאות שלעיל הצביעו על כך ש-SK שיפר את הליקוי בתפקוד הכלייתי ופיברוזיס כלייתי ושההשפעות של SK היו דומות לאלו של losartan. צביעת HE כלייתית גילתה כי הצטברות של ECM, חדירת תאי דלקת, התרחבות ו/או ניוון של צינוריות הכליה, ניוון ונמק של תאי אפיתל צינורית כליות ללא שינויים ברורים במבנה הגלומרולרי בקבוצת UUO (איור 4ד). ליקוי בתפקוד הכליות הוקל בדרגות שונות בקבוצות הטיפול השונות בהשוואה לקבוצת UUO; המינון המתון והמינון הגבוה של SK השיגו את ההשפעות הטובות ביותר, אם כי מידת התפקוד הכלייתי בקבוצת הניתוח הדמה לא הושגה באף אחת מקבוצות הטיפול.
SK הפחית את ערך ה-FA הקשור לפיברוזיס שזוהה באמצעות DTIכפי שממחיש באיור 5, ערך ה-FA שיש לו קשר ליניארי עם מידת הפיברוזיס ברקמה אמיתית נקבע על ידי DTI in vivo. בהשוואה לזה בקבוצת הדמה, ערך ה-FA בקבוצת UUO עלה באופן משמעותי (P<0.01). the="" increase="" in="" in="" the="" fa="" value="" in="" the="" presence="" of="" ureteral="" obstruction="" conditions="" was="" significantly="" reversed="" in="" the="" arb="" and="" high-,="" moderate-,="" and="" low-dose="" sk="" groups="" compared="" to="" the="" uuo="" group="">< 0.01="" or="" p=""><0.001), with="" moderate-dose="" sk="" having="" the="" most="" significant="" effect="" (p=""><>
SK עיכב הפעלת פיברובלסט ותצהיר של רכיבי ECM בעכברי UUOבנוסף, הערכנו את הביטוי של סמן הפעלת הפיברובלסט -SMA, חלבון ספציפי לפיברובלסט-1 (FSP-1), ורכיבי ECM הקלאסיים fibronectin (FN), col. III וקולגן I (col I) בקבוצות הדמה, UUO ו- SK במינון בינוני באמצעות PCR בזמן אמת. מכיוון שהמינון המתון של SK שווה למינון המומלץ מבחינה קלינית ומכיוון שהשיפור הכולל בקבוצת המינון המתון היה עדיף על זה בקבוצות במינון גבוה ונמוך, נעשה שימוש במינון מתון של SK להערכת ביטוי mRNA. כפי שמוצג באיור 7a ו-b, SK במינון בינוני הקל באופן משמעותי את העליות ב-SMA, FSP, FN, col. ג' וקול. אני רמות. תוצאות אלו תאמו את תוצאות הצביעה של Siriusred, שהראו שהאזור האדום של פיברוזיס בכליה הפגועה בקבוצת ARB ובקבוצות SK במינון בינוני ונמוך היה קטן משמעותית מזה בקבוצה שלא טופלה (P<0.05) (fig.="" 6),="" indicating="" that="" sk="" decreased="" the="" number="" of="" col-="" lagen="" bundles="" in="" the="" affected="">
השפעת SK על רמות STAT3, JAK2 ו-TGF-mRNA והביטוי של מולקולות מווסתות ומדכא חלבוני איתות ציטוקינים (SOCS) SOCS1 ו-SOCS3 בעכברי UUOכפי שמוצג באיור 7c, רמות ה-mRNA של TGF-, JAK2 ו-STAT3 עלו משמעותית בקבוצת UUO בהשוואה לקבוצת הדמה ביום ה-14. בהשוואה לעכברי מדומה, עכברי UUO במינון בינוני של SK הראו ירידה ניכרת ברמות JAK2 ו-TGF-mRNA ביום ה-14 לאחר החסימה, אך SK לא הפחית באופן משמעותי את רמות ה-MRNA STAT3 לאחר UUO. תוצאה זו העלתה כי ההשפעה של SK על פיברוזיס כלייתי והפעלת פיברובלסט בעכברי UUO עשויה להתרחש באמצעות ויסות של הפעלת JAK2 ו-STAT3 ללא שינויים בביטוי הכולל של STAT3 mRNA. גם רמת TGF-, המולקולה במורד הזרם של STAT3, ירדה על ידי SK בהקשר של קשירת השופכה. חלבוני SOCS נחשבים חיוניים לוויסות השלילי של איתות JAK/STAT [19]. בתגובה ל-UUO, רמות SOCS1 ו-SOCS3 עלו באופן משמעותי וירדו באופן משמעותי בקבוצת SK בהשוואה לקבוצת המודל (איור 7ד). תוצאה זו מציעה ש-SK יוכל לדכא את מסלול JAK/STAT כדי להקטין את הביטוי של מולקולות הרגולציה השליליות שלו כמשוב.
CISTANCHE ישפר כאבי כליות/כליות
דִיוּן
פיברוזיס tubulointerstitial כלייתי הוא המסלול השכיח האולטימטיבי של מחלת כליות סופנית. מיופיברובלסטים, שמקורם במגוון תאים, כולל תאי אפיתל, תאי אנדותל ופריציטים, באמצעות טרנסדיפרנציאציה אפיתל-מזנכימלית (EMT) או טרנסדיפרנציאציה אנדותל-מזנכימלית (EndoMT), יכולים לעזור לתקן רקמה פגומה על ידי ייצור ECM ו-SMA ליצור מתח התכווצות [20]. בין סוגי התאים השונים הללו, פיברובלסטים אינטרסטיציאליים פעילים הם המקורות העיקריים למיופיברובלסטים, המהווים 50 אחוז מהתאים הללו [21]. בנוסף ל-SMA, פיברובלסטים מופעלים גם מבטאים ספציפית FSP-1. TGF- מוגדר כמניע עיקרי של פיברוזיס בכליות ונמצא מופעל במודלים שונים של מחלות כליה ותאי כליה. TGF מופעל נקשר לרצפטור TGF ומעורר מולקולות איתות במורד הזרם, כולל מולקולות וגורמי שעתוק הקשורים ל-EMT, EndoMT, הפעלת פיברובלסט, ייצור ECM ועיכוב פירוק ECM, דרך Smad-כולל TGF- [23], STAT3 מופעל על ידי זרחון טיר ב-Tyr705 דרך יאנוס קינאזות. חלבון STAT3 המופעל נכנס לגרעין בצורה של דימר ונקשר לגן המטרה. יתר על כן, STAT3 משרה העברת אותות של מסלול TGF [24]. ואכן, במודל UUO, ההפעלה של STAT3 ב-Tyr705 בפיברובלסטים אינטרסטיציאליים כליות, יחד עם נגעים היסטופתולוגיים והפעלת פיברובלסט, מוגברת מהיום הראשון, מגיעה לשיא לאחר 7 ימים ועולה עד 14 ימים [25]. STAT3 כנראה מעורב בסוגים רבים של מחלות כליה באמצעות ויסות הביטוי של גנים מטרה, במיוחד גורמי התעתוק המעורבים בהתפתחות CKD. במחקר הנוכחי, ביום ה-14 לאחר החסימה, רמות ה-mRNA של -SMA, JAK2 ו-STAT3 עלו באופן משמעותי עם עלייה בדרגת פיברוזיס בכליות.
על פי מחקרים קודמים, נמצא כי SK ומרכיביו מפחיתים נזק פתולוגי, מעכבים שגשוג תאי אנדותל, מקלים על פרוטאינוריה וגלומרולוסקלרוזיס, מגינים על תפקוד כליות שיורי ומאטים את התקדמות המחלה, ובכך מתערבים בהתקדמות CKD ופיברוזיס כליות; עם זאת, לא היו דיווחים על הפעלת פיברובלסט. לפי מחקרים קודמים ותוצאות ה-CCK-8 שלנו, נעשה שימוש ב-10 ng/mL TGF- 1 להפעלת פיברובלסטים; 1, 2 ו-4 מ"ג/מ"ל נבחרו כמינונים נמוכים, בינוניים וגבוהים של SK; ו-48 שעות נבחרו כזמן ההתערבות במחקר הנוכחי. וויסות עלייה של -SMA ושינויים מורפולוגיים המלווים בשגשוג והפעלה של תאים, שהתבטאו בעלייה בכדאיות התא ובייצור ECM, התרחשו בתאי NRK-49F לאחר גירוי TGF- 1 [26, 27]. במחקר זה, אושר כי TGF- 1 מווסת את ביטוי הגנים של -SMA ו-ECM על ידי הפעלת מסלול JAK2/STAT3 במעלה הזרם. הנתונים שלנו הראו ש-SK עיכב ישירות TGF- 1-שגרם להפעלת תאי NRK-49F וייצור ECM במבחנה. יתר על כן, הדגמנו ש-SK יכול להחליש פיברוזיס כלייתי בעכברי UUO in vivo, להפחית את הצטברות ECM בין תאי ביום ה-14 לאחר החסימה. תוצאות אלו הצביעו על כך ש-SK יכול להחליש באופן ניכר את פיברוזיס הכלייתי על ידי עיכוב הפעלת פיברובלסטים אינטרסטיציאליים והפחתת ביטוי -SMA. המנגנון הפוטנציאלי של ההשפעה האנטי-פיברוטית של SK הוא עיכוב של הפעלת פיברובלסט באמצעות ויסות של מסלול האיתות JAK2/STAT3 הן במבחנה והן ב-in vivo. SK במינון מתון גם הפך משמעותית את הרגולציה העליונה של TGF- 1 המושרה על ידי UUO, מה שמצביע על כך שההשפעה של SK קשורה ל-TGF-. מכיוון ש-TGF ו-STAT3 מקיימים אינטראקציה זה עם זה, SK עשויה לעכב STAT3 על ידי מיקוד ל-TGF-, להפחית את ה-TGF- על ידי מיקוד ל-STAT3, או לעכב את שניהם. מחקר פרמקולוגיה מערכתית קודם שלנו חזה את STAT3 כאחת ממולקולות המטרה האפשריות של SK [28], וממצא זה אומת במחקר הנוכחי. אנו משתמשים בלוסארטן, ARB
יכול להחליש באופן משמעותי פיברוזיס בכליות ואפופטוזיס של תאי צינורי כליה על ידי עיכוב זרחון של חלבון האיתות STAT3 במודל חולדה של UUO [29], כתרופה בקרה חיובית. הממצאים הקודמים תואמים לנתונים שלנו. פרוקסירדוקסינים הם משפחה של פרוקסידאזים תלויי מרקפטן שיכולים להפחית מתח חמצוני על ידי זרז הפחתת מי חמצן. רמת Prdx5 בכליית החולד ירדה ביום הראשון לאחר UUO. נצפה שביטוי Prdx5 עולה בהדרגה עד 5 ימים לאחר טיפול ב-TGF. הוכח כי ביטוי יתר של Prdx5 מעכב את הזרחון המושרה על ידי TGF- - של STAT3 ומפחית את ביטוי TGF-SMA ו-FN בתאי NRK-49F, מה שמצביע על כך ש-Prdx5 מווסת לרעה את TGF- - גרם להפעלת STAT3 ופיברוזיס בתאי NRK-49F [12]. המנגנון הרגולטורי העיקרי העומד בבסיס איתות STAT3 אנדוגני כולל את משפחת החלבונים SOCS. לאחר ש-STAT3 מופעל על ידי ציטוקינים, דימר STAT3 מועבר לגנים מטרה במורד הזרם של אינדוקציה גרעינית, כולל SOCS [30]. באופן ספציפי, האזור המעכב קינאז של SOCS1 יכול להיקשר ישירות יכול להחליש באופן משמעותי פיברוזיס כליה ואפופטוזיס של תאי צינורי כליה על ידי עיכוב זרחון של חלבון האיתות STAT3 במודל חולדה של UUO [29], כתרופה בקרה חיובית. הממצאים הקודמים תואמים לנתונים שלנו. פרוקסירדוקסינים הם משפחה של פרוקסידאזים תלויי מרקפטן שיכולים להפחית מתח חמצוני על ידי זרז הפחתת מי חמצן. רמת Prdx5 בכליית החולד ירדה ביום הראשון לאחר UUO. נצפה שביטוי Prdx5 עולה בהדרגה עד 5 ימים לאחר טיפול ב-TGF. הוכח כי ביטוי יתר של Prdx5 מעכב את הזרחון המושרה על ידי TGF- - של STAT3 ומפחית את ביטוי ה-SMA וה-FN המושרה על ידי TGF- - בתאי NRK-49F, מה שמצביע על כך ש-Prdx5 מווסת לרעה את TGF{{ 38}}עורר הפעלת STAT3 ופיברוזיס בתאי NRK-49F [12]. המנגנון הרגולטורי העיקרי העומד בבסיס איתות STAT3 אנדוגני כולל את משפחת החלבונים SOCS. לאחר ש-STAT3 מופעל על ידי ציטוקינים, דימר STAT3 מועבר לגנים מטרה במורד הזרם של אינדוקציה גרעינית, כולל SOCS [30]. באופן ספציפי, האזור המעכב קינאז של SOCS1 יכול להיקשר ישירות
ל-JAK2 ולעכב זרחון STAT3 [31]. הפעלת JAK/STAT הנגרמת על ידי UUO גורמת לעליית ביטוי SOCS [32]. לאחר גירוי עם 10 ng/mL TGF- 1 במשך 48 שעות, ביטוי חלבון Prdx5 בתאי NRK-49F עלה באופן משמעותי, מה שעולה בקנה אחד עם תוצאות קודמות. SK (4 מ"ג/מ"ל) הפחית משמעותית את רמות החלבון Prdx5 לאחר 48 שעות של התערבות. ביום ה-14 לאחר UUO, רמות ה-mRNA של SOCS1 ו-SOCS3 בכליה הפגועה היו מווסתות באופן משמעותי בקבוצת ה-UUO בהשוואה לקבוצת הביקורת, מה שמצביע על כך שהפעלת איתות STAT3 לאחר UUO גרמה לביטוי של SOCS1 ו-SOCS3 ל לווסת שלילי את אות STAT3 המופעל יתר על המידה. לאחר 14 ימים של התערבות SK, רמות ה-mRNA של SOCS1 ו-SOCS3 ירדו באופן משמעותי. תוצאות אלו הראו שבמקום להעלות ישירות את הרגולטורים השליליים לעיכוב איתות JAK2/STAT3, SK עיכבה את JAK2/STAT3, וכתוצאה מכך הורדה של הרגולטורים השליליים Prdx5, SOCS1 ו-SOCS3. לפיכך, JAK2/STAT3 יכול להיות מטרה טיפולית ישירה של SK לפיברוזיס בכליות.
MRI היא שיטה בטוחה מאוד להערכת שינויים מבניים ופיזיולוגיים בכליה ללא שימוש בחומר ניגוד תוך ורידי [33, 34]. הדמיה משוקלת דיפוזיה (DWI) היא שיטת MRI ידועה המשמשת לצילום תנועה מולקולרית או דיפוזיה המשקפת שינויים במבנה המיקרו של רקמות ביולוגיות [35]. DTI היא טכנולוגיית הדמיה חדשה שפותחה על בסיס הדמיה משוקללת דיפוזיה (DWI) שיכולה לתאר לא רק את מהירות מולקולות המים אלא גם את כיוון התנועה שלהן, כלומר, אניזוטרופיה. בהשוואה ל-DWI, DTI רגיש ומדויק יותר במשקף את השינוי בפיזור המים. DTI יכול גם לספק מידע נוסף על כיוון וכמות הדיפוזיה הנמדדים על בסיס FA. Hueper et al. [36] הראה כי בחולדות DN, FA היה קשור לגלומרולוסקלרוזיס, פיברוזיס אינטרסטיציאלי ופגיעה בצינורית הכלייתית. יאן וחב'. [37] מצא ש-FA עשוי להיות סמן ביולוגי של DN מוקדם. קאימורי וחב'. [38] ראה קשר ליניארי בין ערך FA למידת פיברוזיס רקמות אמיתית במודל UUO של חולדה. במחקר זה, ביצענו אופטימיזציה של הפרמטרים כדי להפחית את זמן הסריקה, זמן ההרדמה וצריכת משאבי הניסוי. תוצאות ה-DTI היו עקביות עם צביעה אדומה של Sirius מבחינת מידת הפיברוזיס בכליות הנגרמת על ידי UUO והיכולת של SK להקל על פיברוזיס כליות. במידה מסוימת, ממצאים אלה חשפו כי ל-SK יש השפעה אמיתית על פיברוזיס בכליות in vivo. במחקר זה, הדגמנו את המנגנון שבאמצעותו SK מווסת פיברוזיס אינטרסטיציאלי בכליות הן in vivo והן במבחנה. במחקרים עתידיים, נדרש שימוש במעכבים או siRNAs לעיכוב JAK2/STAT3 כדי לאמת מנגנון זה.
מסקנות
לסיכום, הנתונים שלנו מצביעים על כך ש-SK עשוי לעכב ביעילות את הפעלת הפיברובלסט הכלייתי ופיברוזיס כלייתי בעכברי UUO על ידי ויסות מסלול האיתות JAK2/STAT3. התוצאות שלנו מספקות הבנה טובה של המנגנון של SK בטיפול במחלת כליות. עם זאת, המנגנונים המולקולריים המפורטים של טיפול SK בפיברוזיס כליות דורשים חקירה נוספת.