השפעת Cistanche Phenylethanol Glycoside מחסום מעיים ומיקרוביוטה של המעי במחלת כבד אלכוהולית
Mar 18, 2024
תַקצִיר:
מַטָרָה:דגם העכבר שלמחלת כבד אלכוהולית(ALD) הוקמה על ידי ליבר-Decarli אלכוהול הזנה נוזלית, וההשפעות שלCistanche phenylethanoid גליקוזידים(CPhGs) על מחסום המעי והרכב המיקרוביוטה של המעיים של עכברי ALD נדונו.
שיטה: 36 עכברי הנקבות C57BL/6N חולקו באופן אקראי בקבוצה נורמלית, קבוצת CPhG רגילה, קבוצת מודל וקבוצות CPhG במינון נמוך, בינוני וגבוה (175 מ"ג·ק"ג-1, 350 מ"ג·ק"ג{{6 }}ו-700 מ"ג·ק"ג-1), עם 6 עכברים. הקמת מודל עכבר ALD באמצעות הזנה נוזלית של ליבר-דקרלי. לקבוצת המינון של CPhGs ולקבוצה הרגילה של CPhGs ניתנו מתן CPhGsby נתון מדי יום במינונים המתאימים. מנתח ביוכימי אוטומטי זיהה רמות ALT, AST, TG ו-TC בסרום. SerumTNF-, IL-1, LPS, LBP, D-LA, DAO ו-LBP של הכבד זוהו על ידי ELISA. הרמות של TG ו-TC בדגימות הומוגניות בכבד זוהו על ידי קולורימטריה. רקמת הכבד הוכתמה בצבע אדום שמן O ו- HE. רקמות המעיים נצבעו בצביעה של HE ו-AB-PAS ובאימונוהיסטוכימיה של Muc2. תוכן המעי של הקבוצה הרגילה, קבוצת ה-CPhGs רגילה, קבוצת המודל וקבוצת ה-CPhGs במינון גבוה נאספו, ורצף המיקרוביוטה של המעי.
תוצאה: מודל ALD הוקם בהצלחה. בהשוואה לקבוצה הרגילה, רמות ה-ALT, AST ו-TG בסרום ורמות ה-TG ו-TC בכבד בקבוצת המודל עלו באופן משמעותי (P<0.05). Histopathology showed that compared with the normal group, the liver cells in the model group showed obvious steatosis. Compared with the model group, the levels of serum TG liver TG, and TC in the CPhGs dose group decreased significantly (P<0.05). The serum ALT, AST, TNF-α, IL-1β, LPS, and LBP in the CPhGs high dose group were also significantly decreased (P<0.05). Compared with the model group, the number of fatty liver cells in the CPhGs high dose group was significantly reduced, the microvilli structure of jejunum epithelial cells was intact, and the expression of Muc2 was reduced in the colon.Compared with the model group, the flora of the CPhGs high dose group changed significantly (P<0.05). Compared with the normal group, the Allobaculum was significantly up-regulated in the model group (P<0.05). Compared with the model group, the abundance of Akkermansia in the CPhGs high dose group was significantly increased (P<0.01). Akkermansia was negatively correlated with Allobaculum (r = -0.701, P<0.01).
סיכום: CPhGs יכולים להפחית את הפגיעה במחסום המעי הנגרמת על ידי ALD, שעלוללשחק תפקיד מגן על ידי ויסות השפע והמבנה של Akkermansia ו-Allobaculum, ומשפיע על הומאוסטזיס שכבת הריר של מחסום רירית המעי.
מילות מפתח:CPhGs; מחלת כבד אלכוהולית; מחסום מעיים; מיקרוביוטה במעיים
תמצית CISTANCHE אורגנית טבעית עם 40% אכינאקוסיד ו-16% אקטוזיד עבור
השירות התומך של Wecistanche - יצואנית ה-cistanche הגדולה בסין:
דוא"ל:wallence.suen@wecistanche.com
ווטסאפ/טלפון:+86 15292862950
קנה לפרטי מפרטים נוספים:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
אלכוהול הפך לאחד מגורמי הסיכון החשובים עבורמחלות כרוניות ברחבי העולם."הדוח הגלובלי על אלכוהול ובריאות 2018" שפורסם על ידי ארגון הבריאות העולמי מראה שכ-3 מיליון בני אדם מתו עקב שימוש מופרז באלכוהול ברחבי העולם בשנת 2016, המהווים 5.3% מהכלל [1]. בארצנו מחלות הכבד הנגרמות כתוצאה מאלכוהול מתגברות משנה לשנה והן הגורם השני בגודלו לשחמת הכבד [2] שהפכה לבעיה חמורה בבריאות הציבור. מנגנוני ההופעה וההתקדמות של מחלת כבד אלכוהולית (ALD) הם מורכבים ורבים, בעיקר מנגנון הנזק לכבד של מטבוליט אתנול אצטלדהיד ומיני חמצן תגובתיים [3]. ביניהם, תפקידו של "ציר המעי-כבד" בהתקדמות של ALD היה. זה משך תשומת לב רבה [4-5]. הכבד הוא האתר העיקרי לחילוף החומרים החמצוני של אלכוהול. שתייה מרובה לאורך זמן עלולה לפגוע ישירות בכבד, מה שמוביל להופעת ALD [6]. סטאטוזיס בכבד היא תגובה מוקדמת לאחר שתיית אלכוהול. מיקרוביוטת המעיים האנושית (GM) מוערכת ב-10 טריליון [7]. מאזן מיקרואקולוגי המורכב מפלורת מעיים, וירוסים, פטריות ומטבוליטים.
איזון, כלומר מיקרו-אקולוגיה של המעיים, קשור קשר הדוק להתקדמות של ALD דרך "ציר המעי-כבד", אך המנגנונים הרלוונטיים עדיין אינם ברורים [8-9]. מחסום המעי והפלורה שולטים ב"ציר המעי-כבד", וחוסר ויסות GM וביטוי יתר של גורמים דלקתיים ממלאים תפקיד חשוב בהתרחשות ובהתפתחות של ALD [10-11].
מחקרים מצאו שחוסר ויסות חמור של GM וביטוי יתר של גורמים דלקתיים מתרחשים במהלך התרחשות והתפתחות של ALD [12]. צריכה כרונית ארוכת טווח או צריכה קצרת טווח של כמויות גדולות של אלכוהול תשנה את חדירות המעיים, תגרום ל-LPS של המעי להיכנס למחזור הדם הפורטלי, יגרום לתגובה דלקתית והחמרת נזק לכבד [12-13].
Cistanche, כחומר מרפא סיני אופייני בשינג'יאנג, תועד ב-Materia Medica של וו-פו משושלות ווי וג'ין, "קומפנדיום של Materia Medica" של שושלת סונג ו-"Compendium of Materia Medica" של שושלת מינג [14] ]. מחקר פרמקולוגי מודרני מצא ש-Cistanche phenylethanoid glycosides (CPhGs) ממלאים תפקיד חשוב באנטי דלקתיות ובפיברוזיס אנטי-כבדי [15-16]. עם זאת, יש כיום חוסר במחקר על האם CPhGs יכולים לווסת את תפקוד מחסום המעי או פלורת המעיים ב-ALD ולהפעיל אפקט מגן על הכבד.
מחקר זה השתמש במזון נוזלי אלכוהול של ליבר-דקרלי כדי להקים את המכון הלאומי להתעללות באלכוהול (NIAAA) [17] מודל קצר טווח של פגיעה בכבד אלכוהולית כדי לחקור את ההשפעה של CPhGs על המיקרו-אקולוגיה של המעיים של ALD. לְהַשְׁפִּיעַ. תשומת לב מיוחדת ניתנה להשפעות של CPhGs על תפקוד מחסום מעיים והומיאוסטזיס של מיקרוביוטה במעיים בעכברי מודל ALD. זה עוזר לחשוף את מנגנון ההגנה על הכבד של CPhGs מנקודת המבט של מיקרו-אקולוגיה של המעיים ומספק התייחסות ניסויית לפיתוח תרופות.
1. חומרים
1.1 בעלי חיים
עכברי נקבה מסוג SPF C57BL/6N, 17~20 גרם, נרכשו מ-Beijing Vitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., מספר תעודה SCXK (בייג'ינג) 2021-0006. בעלי חיים גידלו וניסויים נערכו בסביבת SPF של מרכז הניסויים בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של שינג'יאנג (SYXK (חדש) 2022-0003). קַפְּדָנִי
ציית לדרישות רווחת בעלי החיים והאתיות של ועדת האתיקה של בעלי חיים ניסויים של האוניברסיטה הרפואית של שינג'יאנג (IACUC-20220127-4).
1.2 ריאגנטים
אתנול מוחלט, אלכוהול איזופרופיל (Tianjin Damao Chemical Reagent Factory, מספרי אצווה 20230201 ו-20190103 בהתאמה); ליבר-דקרלי בקרה נוזלי מזון, ליבר-דקרלי אלכוהול מזון נוזלי (דייץ ביוטכנולוגיה (וושי) ושות', בע"מ, מספרי אצווה בהתאמה עבור 710027 ו-710260);
מקבע פרפורמלדהיד, מקבע מקבע ומיקרוסקופ אלקטרוני של קרנוי (Wuhan Sevier Biotechnology Co., Ltd., מספרי אצווה CR2208028, CR2305094 ו-CR2210001 בהתאמה); ערכת בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים LBP (ELISA), ערכת TNF-ELISA, IL-1
ערכת ELISA, ערכת D-LA ELISA, ערכת DAO ELISA, ערכת בדיקה קולורימטרית TG וערכת בדיקה קולורימטרית TC (Wuhan Yilerite Biotechnology Co., Ltd., מספרי אצווה הם CV072V649815, CV112VX05028, CV106T8F3303, GY4, 3L4, GY){82}
GY010XN08244, GY03P04Z5104 ו-GY02DHB82603); ערכת LPS ELISA (Wuhan Fein Biotechnology Co., Ltd., מספר אצווה U3126I069T); ערכת בדיקת ALT, ערכת בדיקת AST, ערכת בדיקת TG וערכת בדיקת TC (Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd. Co., Ltd., מספרי אצווה הם 140122014, 140223002, 141722001 ו-141622017); תמיסת צביעה HE, תמיסת צביעה רוויה Oil Red O, תמיסת צביעה AB-PAS; נוגדן ראשוני Muc2, נוגדן משני עז נגד עכבר (Wuhan Sevier Biotechnology Co., Ltd., מספרי האצווה הם G1005, G1015, G1049, GB11344 ו-GB23301 בהתאמה).
1.3 סמים
תמצית Cistanche נרכשה מXinjiang Hotan Dichen Pharmaceutical and Biological Co., Ltd. (echinaceaside גדול מ-40% או שווה ל-40%, verbascoside גדול מ-16% או שווה ל-16%, phenylethanoid glycoside גדול או שווה ל-85%, מספר אצווה 20230103).
1.4 מכשירים
מנתח ביוכימי אוטומטי של BS-240VET (Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd.); מיקרוסקופ אלקטרונים שידור HT7800 (Hitachi Manufacturing Co., Ltd., יפן).
2. שיטה
2.1 קיבוץ והקמת מודלים של בעלי חיים
36 עכברים חולקו באופן אקראי לקבוצה רגילה, קבוצת מתן רגילה, קבוצת מודל וקבוצות CPhGs במינון נמוך, בינוני וגבוה (175 מ"ג·ק"ג-1, 350mg·kg-1 ו-700 mg·kg{{ 6}}), כל קבוצה של 6. כל העכברים קיבלו תחילה הזנה נוזלית של ליבר-דקרלי והותאמו להאכלה למשך 3 ימים. נוֹרמָלִי
קבוצת הביקורת וקבוצת המינון הרגיל קיבלו מזון נוזלי ביקורת של ליבר-דקרלי; קבוצת המודלים וקבוצות ה-CPhGs במינון נמוך, בינוני וגבוה קיבלו מזון נוזלי מ-LiberDecarli. החל מהיום הרביעי של הניסוי, קבוצת המודל וקבוצות ה-CPhGs במינון נמוך, בינוני וגבוה הגדילו בהדרגה את ריכוז האלכוהול של הזנת האלכוהול מ-0% ל-5%, ושמרו על הזנת 5% אלכוהול עד סוף הניסוי, ולחוץ 9 שעות לפני איסוף החומרים. 0.2 מ"ל·10 גרם-1 ניתנו לקיבה עם 30% אתנול.
כל העדכונים מוכנים ומשמשים כעת, והזנה טרייה מוחלף כל יום מ-17:00 עד 19:00. התבוננו בכל יום באכילת העכברים, בפעילותם ובמצבם הנפשי. כאשר העכברים בקבוצת המודלים מופיעים במצב שיכור כגון חוסר תחושה, פעילות מופחתת וצריכת מזון מופחתת, זה מצביע על כך שהדוגמנות מוצלחת [17]. כאשר קבוצות ה-CPhGs במינונים נמוכים, בינוניים וגבוהים וקבוצת הניהול הרגילה החלו להאכיל מזון אלכוהולי, תמיסת CPhGs בריכוז תואם נלקחה מדי יום במשך 14 ימים בסך הכל, ותמיסת מלח רגילה נותנתה לשאר.
2.2 תצפית כללית
אכילת העכברים, פעילותם, מצבם הנפשי והפרשת העכברים נצפו מדי יום; במהלך הדוגמנות ומתן התרופה, תועדו מצב המוות ומשקל העכברים. מקדם איברים=מסת איבר/(מסת גוף/100)×100%.
2.3 בחירת חיות ניסוי
לאחר שנמנעו מהם מזון ומים במשך 12 שעות, העכברים הורדמו, גלגלי העיניים שלהם הוסרו, ודם נאסף לפני הקרבתם. רקמת הכבד מהאונה הגדולה ביותר הייתה מקובעת בתמיסת פרפורמלדהיד. הרקמה הג'ג'ונלית הופרדו במהירות על קרח וקבועה במקבע מיקרוסקופ אלקטרוני; 3 ס"מ של רקמת ג'ג'ונלי ומעי הגס (ללא שטיפת התוכן) הופרדו וקבועים בקיבוע של קרנוי. עוד 3 ס"מ מרקמת הג'חנון והמעי הגס (תכולה שטופה במי מלח פיזיולוגי) נקבעו בתמיסת פרפורמלדהיד. התוכן של כל מקטעי המעי נאסף לתוך קריובילים סטריליים נטולי אנזים, הוקפא במהירות בחנקן נוזלי, ולאחר מכן הועבר למקרר ב--80 מעלות לאחסון.
2.4 ELISA וזיהוי קולורימטרי של אינדיקטורים להומוגגת רקמת כבד בסרום וברקמת הכבד
המכשיר הביוכימי האוטומטי שימש לזיהוי רמות ALT, AST, TG ו-TC בסרום; שיטת ELISA שימשה לזיהוי רמות TNF-, IL-1, LPS, LBP, DAO ו-D-LA בסרום ורמות LBP בכבד. פעל לפי ההוראות. כדי להומוג את רקמת הכבד, קח 0.05~1.00 גרם רקמת כבד טרייה, הוסף איזופרופיל אלכוהול ב-2~8 מעלות בהתאם ליחס המשקל (g): נפח (mL) { {9}}:9, טוחנים להומוגנית, וצנטריפוגה ב-20000g·min-1 15 דקות, קח את הסופרנטנט והנח אותו על קרח לבדיקה, ופעל לפי ההוראות. זיהוי קולורימטרי של רמות TG ו-TC בדגימות הומוגניות של רקמת כבד.
2.5 צביעת HE ו-Oil Red O לזיהוי פתולוגיה של רקמת הכבד
עבור צביעת המטוקסילין-אאוזין (HE), רקמת הכבד המקובעת הוסרה, נחתכה בפרפין, הוסרה HE, והתייבשה והורכבה. רקמת הכבד המקובעת הוצאה החוצה, נחתכה, נשטפה עם איזופרופיל אלכוהול, נצבעה ב-Oil Red O, אטומה ונצפה במיקרוסקופ אור.
2.6 צביעת HE ו-AB-PSA לזיהוי תצפית פתולוגית של רקמת המעי
רקמת ג'ג'ונלית הוסרה וקבועה בתמיסת פרפורמלדהיד לצביעת HE; רקמת המעי הגס הוסרה וקבועה בקיבוע של קרנוי לצביעה AB-PAS. שלבי אימונוהיסטוכימיה: ייבוש קטעי פרפין, חזרת אנטיגן, חסימת פרוקסידאז אנדוגני, חסימת סרום, הוספת נוגדן ראשוני, הוספת נוגדן משני, צביעת נגד גרעיני תאים לאחר התפתחות צבע, התייבשות והתבססות ותצפית במיקרוסקופ אור. הרקמה הג'ג'ונלית הוסרה, נחתכה לחתיכות קטנות בגודל 1 מ"מ × 1 מ"מ × 1 מ"מ, תוקנה לפני הווסת, קיבוע לאחר מכן, התייבש, הוטבע, פילמר וחתך דק במיוחד. השינויים המיקרו-וויליים של תאי אפיתל ג'ג'ונליים בכל קבוצה נצפו תחת מיקרוסקופ אלקטרוני תמסורת.
2.7 רצף וניתוח של פלורת מעיים בשיטת 16S
תוכן המעי של הקבוצה הרגילה, קבוצת המינון הרגיל, קבוצת המודלים וקבוצת ה-CPhGs במינון גבוה, מבוסס על V3-V4 אזור 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') ו-806R (5'-GGACTACNNNGGGTATCTAAT -3'), תוך שימוש בטכנולוגיית רצף תפוקה גבוהה של 16S rDNA עבור רצף קהילת חיידקים. ניסוי הרצף במחקר זה הושלם על ידי Shenzhen Microtech Technology Group Co., Ltd. נתוני רצף המיקרוביוטה של המעיים במחקר זה הועלו למרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה תחת פרויקט מספר PRJNA1006676.
בהתבסס על תוצאות הניתוח של וריאנטים של רצף אמפליקון (ASVs), מבוצעים גיוון אלפא, ניתוח גיוון בטא, ביאור סיווג מינים וניתוח הבדלים. ביניהם, מדד גיוון אלפא כולל בעיקר את מדד שאנון ואת מדד Chao1, והמבחן הסטטיסטי משתמש במבחן Wilcoxon; PCoA
ניתוח קואורדינטות ראשי (PCoA) בוצע באמצעות Anosim לניתוח הבדלים בין קבוצות; LEfSe שימש לניתוח LEfSe) כדי להשיג מינים עם הבדלים משמעותיים בין הקבוצות. ניתוח ביואינפורמטיקה בוצע באמצעות הכלים של Microtech Alliance Bioincloud Platform (https://www.bioincloud.tech).
2.8 ניתוח סטטיסטי
כל נתוני המדידה מתוארים כ-igh± 𝑠. עבור נתונים המצייתים להתפלגות הנורמלית ועומדים במבחן ההומוגניות של השונות, נעשה שימוש בניתוח שונות של גורם אחד. אחרת, נעשה שימוש במבחן הלא פרמטרי. הנתונים מנותחים סטטיסטית באמצעות SPSS 24.0. פ<0.05 means the difference is statistically significant.
