קולטנים ייחודיים דמויי אגרה ביטוי גנים ותגובת גליה באזורי מוח שונים של סקרייפי טבעי חלק 1

תַקצִיר:

מחלות פריון הן מחלות ניווניות כרוניות וקטלניות המאופיינות בהצטברות של חלבון פריון ספציפי למחלה (PrPSc), שינויים ספוגיים, אובדן נוירוני וגליוזיס.

מחלת פריון, הידועה גם כמחלת ירידות המקדש, מחלת אכילת שעווה וכו', היא זיהום ויראלי חריף הנגרם על ידי פריונים. המחלה מועברת בעיקר באכילת מזון לא מבושל המכיל פריונים. לאחר הדבקה בפריון, הוא עלול לגרום לדלקת מוחית ולפגיעה במערכת העצבים, ותסמינים כמו כאבי ראש, הקאות וחום עלולים להופיע.

עם זאת, כאשר נתקלים במצב כזה, איננו יכולים לאבד את האמון בזיכרון שלנו בגלל קיומה של מחלת הפריון. רוב האנשים הנגועים יכולים להחלים ולשחזר את הזיכרון שלהם לאחר הטיפול.

כמובן, מנקודת מבט מונעת, אנחנו יכולים לנסות לאכול יותר מזון מבושל כדי למנוע הידבקות בפריון. יחד עם זאת, אם אתם חשים בתסמינים כלשהם, כדאי גם לפנות לרופא בהקדם האפשרי כדי למנוע החמרה של המחלה.

בחיי היומיום, נוכל לנסות אימון זיכרון פשוט, כמו קריאה, עריכת רשימות, ארגון אירועים ומידע וכו' לשיפור הזיכרון שלנו. אימונים אלו אינם דורשים הרבה זמן ואנרגיה, אך הם חשובים מאוד לשמירה על מוח בריא ותפקוד זיכרון יעיל.

בקיצור, כאשר נתקלים במחלות כמו מחלת הפריון, עלינו להתמודד איתה בחיוב, לפנות לטיפול רפואי ואמצעי מניעה מקצועיים ולשים לב לתרגילי זיכרון יומיומיים כדי להבטיח את בריאותנו הפיזית ועבודה יעילה. ניתן לראות שעלינו לשפר את הזיכרון, ו-Cistanche יכולה לשפר משמעותית את הזיכרון מכיוון ש-Cistanche הוא חומר רפואי סיני מסורתי בעל השפעות ייחודיות רבות, אחת מהן היא שיפור הזיכרון. ההשפעה של Cistanche מגיעה מהמרכיבים הפעילים השונים שהוא מכיל, לרבות חומצה טאנית, פוליסכרידים, גליקוזידים פלבנואידים ועוד. מרכיבים אלו יכולים לקדם את בריאות המוח בדרכים שונות.

לחץ על דע דרכים לשיפור תפקוד המוח

עדויות הולכות וגדלות מראות שהתגובה הנוירו-דלקתית היא מרכיב מפתח במחלות פריונדליות ותורמת לניוון עצבי.

קולטנים דמויי אגרה (TLR) הוצעו כמתווכים חשובים של תגובות חיסוניות מולדות המופעלות במערכת העצבים המרכזית במחלות נוירודגנרטיביות אחרות של בני אדם, כולל מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון וטרשת צדדית אמיוטרופית.

עם זאת, מעט ידוע על תפקידם של TLRs במחלות פריון, ומעורבותם בנוירופתולוגיה של סקרופי טבעי לא נחקרה. הערכנו את ביטוי הגנים של TLRs של כבשים בארבעה אזורי מוח שונים מבחינה אנטומית בכבשים טבעיות נגועים בסקרופי והערכנו את המתאמים האפשריים בין ביטוי גנים לסימני ההיכר הפתולוגיים של מחלת פריון.

צפינו בשינויים משמעותיים בביטוי TLR בכבשים נגועים בסקרופי, המתואמים עם מידת הספונגיוזיס, שקיעת PrPSc וגליוזיס בכל אחד מהאזורים שנבדקו.

למרבה הפלא, TLR4 היה הגן היחיד שעבר ויסות בכל האזורים, ללא קשר לחומרת הנוירופתולוגיה. בהיפוקמפוס, צפינו בנוירופתולוגיה מתונה יותר הקשורה לפרופיל ביטוי גנים מובהק של TLR ונוכחות של מורפולוגיה מיקרוגליאלית מוזרה, הנקראת rodmicroglia, המתוארת כאן לראשונה במוח של כבשים נגועים בסקרופי.

ההסכמה של תכונות אלו מעידה על הגנה עצבית חלקית של ההיפוקמפוס. לבסוף, השוואה של הממצאים בכבשים נגועים באופן טבעי לעומת מודל עכבר גדול מדי (עכברי tg338) גילתה דפוסים ברורים של ביטוי TLRgene.

מילות מפתח: פריון; סקרופי; קולטנים דמויי אגרה; דלקת עצבית; מיקרוגליה; אסטרוציטים.

1. הקדמה

אנצפלופתיה ספוגית מועברת (TSEs), או מחלות פריון, הן קבוצה של הפרעות ניוון עצביות קטלניות הכוללות את מחלת קרויצפלד-יעקב (CJD) בבני אדם, סקראפ בכבשים ועיזים, אנצפלופתיה ספוגית בקר (BSE) בבקר, ומחלות פסולת כרונית ב CWD).

TSEs אלה מאופיינים על ידי הפיכת חלבון הפריון המקודד המארח (PrPC) לאיזופורם זיהומיות, PrPSc, המצטבר באופן מועדף במערכת העצבים ובמערכת הלימפוריטית (LRS), ותגובה חיסונית דלקתית במערכת העצבים המרכזית (CNS) [1 ,2]. מחלות פריון, כגון סקרייפי, יכולות להירכש באופן טבעי על ידי חשיפה פומית ל-PrPSc.

לאחר חציית מחסום המעי ועבר שכפול ראשוני ברקמות לימפואידיות, PrPSc מגיע למערכת העצבים המרכזית באמצעות תהליך המכונה פלישה עצבית. הזיהום מתפשט מאתרים במערכת העיכול דרך עצבי הוואגוס והספפנכניים אל גזע המוח וחוט השדרה, בהתאמה [3,4].

בהגיעו ל-CNS, PrPSc מתפשט מהאזורים הטורוסטליים הזנביים, כלומר דרך גזע המוח הרוסטרלי אל המוח הקטן, הדיאנצפלון והפרונטאלקורטקס [5]. ההצטברות הסטריאוטיפית האנטומית של PrPSc מעידה על כך שההתפשטות שלו מתווכת על ידי הקישוריות הנוירונית ו/או הפגיעות הסלקטיבית של אזורי מוח שונים.

גורמי מארח כגון גנוטיפ PrPSc, גזע וגיל בעת ההדבקה תורמים לגודל השקיעה של PrPSc ולהפצה של נגעים ספוגיים.

עם זאת, הבסיס המולקולרי של האינטראקציות המארח-פריון הקובע את המיקוד הסלקטיבי של PrPSc לאזורי מוח ספציפיים נותר לא ידוע ומהווה את אחד ההיבטים המסקרנים ביותר של תופעת זן הפריון.

במקור, ההנחה הייתה שמערכת החיסון לא הגיבה ל-PrPSc עקב סובלנות טבעית, אך מחקרים בטווח הזמן חשפו הפעלה ותפשטות מיידית של מיקרוגליה ואסטרוציטים עוד לפני הופעת הסימנים הקליניים וניוון עצבי [6-8].

נראה כי הפעלה ותפוצה מוקדמת זו של מיקרוגליה ואסטרוציטים ממלאת תפקיד מרכזי בפתוגנזה של הפרעות פריון, אם כי המנגנונים המולקולריים המעורבים בהפעלתן והתפקיד המדויק של שני אסטרוציטים תגובתיים ומיקרוגליות בפתוגנזה של המחלה נותרו לא ברורים [9,10].

יתרה מכך, מקובל על כך שההפצה והפנוטיפ של המיקרוגליה והאסטרוגליות משתנים בין אזורי מוח ומינים [11-14], ומייחסים לכל אזור מאפיינים מהותיים המשפיעים על הפגיעות לניוון עצבי [10,15,16].

תופעה זו בולטת במיוחד בשלב הפרה-קליני, במהלכו הן המיקרוגליות והן האסטרוגליות מגיבות לזיהום פריון באופן ספציפי לאזור.

עם זאת, ככל שהמחלה מתקדמת, תגובה נוירו-דלקתית שכיחה יותר מתחילה לשלוט, המדללת את רוב המאפיינים האזוריים [17,18]. במהלך השנים האחרונות, דווח על תפקידם של קולטנים דמויי Toll (TLR) בתגובתיות מיקרוגליאלית ואסטרוגליאלית. במספר הפרעות ניווניות, המדגישות את השפעתן על התקדמות מחלות אלו [19-21].

עם זאת, נתונים על התפקיד של מחלות פריון TLRsin הם נדירים. תפקיד מגן חלקי של TLRs תואר פתולוגיה אינפריונית. באופן ספציפי, דווח כי אובדן TLR2 [22] ו-TLR4 [23] מאיץ פתוגנזה של פריונים, בעוד שגירוי TLR9 מאט את התקדמות המחלה במודלים של עכברים [24,25].

עד כה, רוב המחקרים של TLRs במחלות פריון בוצעו במבחנה או באמצעות מודלים של עכברים [8,22,26-29], ותפקידם בבעלי חיים ובבני אדם שנדבקו באופן טבעי נותר לא ברור. למיטב ידיעתנו, מחקר אחד בוצע בכבשים שזה עתה נולדו שחוסנו דרך הפה בסקרפי (כלומר, באמצעות מארח טבעי, אך לא נגוע באופן טבעי) ודיווח על ביטוי יתר של TLR2 ו-TLR4 בדם בשלבי מחלה קלינית [30].

שני מחקרים דיווחו על שינוי בביטוי הגנים של TLR בבני אדם עם CJD ספורדי (sCJD) [31,32]. חוסר הוויסות של הגנים המעורבים בתגובה החיסונית כלל ביטוי יתר של TLR4 ו-TLR7 mRNA במוח הקטן ובקורטקס הקדמי של חולי sCJD MM1 ושל TLR7 במוח הקטן של חולי sCJD VV2.

יתר על כן, Areskeviciuteet al. [32] כללה TLR4 ב-40 הרגולטורים המובילים במעלה הזרם שצפויה להראות ביטוי דיפרנציאלי בדגימות מוח ב-sCJD לעומת דגימות מוח בקרה. בדקנו כיצד זיהום טבעי של סקרופי משפיע על רמות השעתוק של OvineTLRs וכמה ציטוקינים בארבעה אזורי מוח עם דרגות שונות של רגישות לפריון, בהתבסס על תוצאות קודמות [18].

ניתוח PCR כמותי (qPCR) חשף שינויים בביטוי הגנים בקבוצה הנגועה בסקרופי לעומת קבוצת הביקורת ותגובה תלויה באזור המוח.

באופן מעניין, ההיפוקמפוס הראה את פרופיל הנגע המובהק ביותר, עם מורפולוגיה ספציפית של מיקרוגליה תגובתית ודפוס שעתוק TLR. בהתחשב במחסור בנתונים ניסיוניים על ביטוי גנים של TLR בעכברים שמביעים יתר על המידה כבשה PrP, ביצענו גם ניסויים באמצעות עכברי tg338 שחוסנו תוך-מוחי עם סקרפי.

התוצאות שלנו חושפות כמה קווי דמיון עם מחקרים קודמים המשתמשים בעכברים מסוג בר, אך הבדלים משמעותיים לגבי הממצאים בסקרופי טבעי.

2. תוצאות

2.1. נוירופתולוגיה של כבשים נגועות באופן טבעי

לראשונה אישרנו את הנוירופתולוגיה של סקרופי בכבשים הנגועים באופן טבעי שנכללו במחקר זה, כפי שתואר בעבר [33-36]. ספונגיוזיס, שקיעת PrPSc ו-reactiveglia נבדקו בארבעה אזורים של מוחות הכבשים הנגועים והבקרה: ה-medullaoblongata (Mo), thalamus (Th), hippocampus (Hc) וקורטקס קדמי (Fc).

כל בעלי החיים שנדבקו באופן טבעי היו בשלב הקליני של המחלה. עם זאת, המצב הקליני, המבוסס על תדירות וחומרת הסימנים הקליניים, השתנה בין הכבשים, החל משלבים קליניים מתחילים ועד לשלבים קליניים מתקדמים (טבלה 1).

איור 1 מציג צילומי מיקרו מייצגים להערכת vacuolation and immunostaining עבור PrPSc, GFAP ו-Iba1, שצולמו בכל אחד מהאזורים שנבחרו בבעלי חיים נגועים ובקרה.

כצפוי, לא זוהה עדות ל-vacuolation או שקיעת PrPSc בחתכי רקמה מכבשת הביקורת. לעומת זאת, בכבשים הנגועים בסקרופי, אזורים נוירואנאטומיים הראו ספונגיוזיס, שקיעת PrPSc וגליה תגובתית (p < 0.05).

עוצמת ה-vacuolation, שקיעת PrPSc וגליוזיס פחתה מהמדולה אולונגאטה לקורטקס הקדמי. באופן מעניין, למרות הקרבה של התלמוס וההיפוקמפוס, נצפו הבדלים משמעותיים בציונים עבור כל הסמנים הפתולוגיים.

הדרגה הגדולה ביותר של ספונגיוזיס נצפתה ב-medulla oblongata וב-thethalamus, בניגוד ל-vacuolation המאוד מפוזר שנמצא בהיפוקמפוס ובקורטקס הפרונטלי.

איור תוך-עצבי היה בשפע בגרעיני המדולה אולונגאטה, כפי שמוצג בגרעין המוטורי הגבי של עצב הוואגוס, בעוד שנוירופיל ספונגיוזיס שלט בתלמוס ובקורטקס הקדמי (איור 1A). מעט מאוד ואקוולים נמצאו בנוירופיל של ההיפוקמפוס.

איור 1. הערכה נוירופתולוגיה מייצגת והערכה אימונוהיסטוכימית של ספונגיוזיס, PrPScdeposition, מיקרוגליוזיס ואסטרוגליוזיס ב-CNS של כבשים נגועים בסקרופי ב-themedulla oblongata (Mo), thalamus (Th), hippocampus (Hc) וקורטקס קדמי (Fc) .

גרפים מתארים ערכי הערכה כמותיים למחצה עבור כל פרמטר מנותח. (א) צביעת המטוקסילין-אאוזין הראתה שינויים בספונגיוזיס במערכת העצבים המרכזית של כבשים נגועים בסקרופי, והיעדר כבשים לא בקרה של ספונגיוזיס. (ב) זיהוי של PrPSc עם נוגדן L42 באזורי מוח כבשים נגועים בסקרופי.

בקבוצת הביקורת זוהה תווית נו-אימונית. (ג) צביעה חיסונית של מולקולת מתאם קושרת סידן מיונן-1(Iba1) הראתה תגובתיות מוגברת של מיקרוגליה בכבשים נגועים בסקרופי לעומת כבשים בקרה.

(ד) צביעה חיסונית של חלבון פיברילרי גליאלי (GFAP) המציג כבשים נגועים בסקרופי אסטרוגליוסין תגובתי מוגברת בהשוואה לכבשים בקרה. (ה) השוואות סטטיסטיות של ספונגיוזיס, PrPScdeposition, Iba1 ועוצמת GFAP בין אזורי מוח.

הציונים נעים בין 0 (שלילי) ל-5 (עוצמה מרבית). הבדלים משמעותיים בספונגיוזיס, PrPSc, Iba1 ו-GFAP נקבעו באמצעות מבחן t של Student או מבחן Mann–Whitney U עבור נתונים מבוזרים נורמליים ולא נורמאליים, בהתאמה.

הבדלים סטטיסטיים בין אזורי מוח נקבעו באמצעות אנליזה חד-כיוונית של שונות (ANOVA) או מבחן Kruskal-Wallis עבור נתונים בחלוקה נורמלית ולא נורמלית, בהתאמה. * p < 0.05, ** p < 0.01. סרגל קנה מידה=200 מיקרומטר.

כל הכבשים הנגועים בסקרופי הראו הצטברות PrPSc נרחבת בארבעת אזורי CNS שנותחו, למעט שלוש כבשים שהראו סימנים קליניים מתחילים והיו שליליות ל-PrPSc על ידי אימונוהיסטוכימיה (IHC) וממצאי Western blot (WB) בקליפת המוח הקדמית (טבלה 1).

עוצמת הצביעה החיסונית של PrPSc חשפה ירידה זבת ל-rostral, דומה לזו שנצפתה עבור ספונגיוזיס, עם עוצמה מקסימלית ב-medullaoblongata וב-thalamus, שני האזורים עם דרגת הריקון הגבוהה ביותר, ועוצמה נמוכה יותר בהיפוקמפוס ובקורטקס הקדמי (איור 1B).

בהיפוקמפוס, צביעת PrPScimmunostain הראתה התפלגות מוקדית ולא אחידה, בניגוד לתבנית הנקודתית ההומוגנית והמפוזרת שנצפה בחלקי הקורטקס הקדמי.

צפינו בארבעה דפוסים מורפולוגיים עיקריים של שקיעת PrPSc, כפי שתואר בעבר [36]: שני דפוסים תוך-תאיים, שכללו שקיעה תוך-עצבית ואינטרגליאלית (כולל תוך-אסטרוציטית ואינטר-מיקרוגליאלית), ושני דפוסי קרום/חוץ-תאיים של תאים, שכללו תאי גליה הקשורים לנוירופיל ותאים גליים- שקיעה קשורה (איור S1).

הדפוסים התוך-עצביים והנוירופילים הקשורים ברווחה בכל אזורי המוח. באופן מדהים, דפוסי האינטאליה והגליה הופחתו באופן דרסטי או אפילו נעדרו בקורטקס הקדמי ובהיפוקמפוס בהשוואה ל-medulla oblongata והתלמוס. במקביל ל-IHC, ניתחנו את נוכחותם של פריונים עמידים לפרוטאזות (PrPres) על ידי WB.

דגימות המוח של כבשים נגועים בסקרופי הציגו את דפוס PrPres בעל שלושת הפסים הקלאסי הקשור לסקרופי קלאסי, עם מסה מולקולרית של שבר לא מסולק של כ-19 kDa (איור 2).

למרות מידה מסוימת של שונות, האות PrPres גדל עם חומרת הסימנים הקליניים בכל אזורי המוח והיה נפוץ יותר באזורי המוח הזנבים.

ה-WB עבור PrPres היה חיובי ב-medulla oblongata ובתלמוס בכל הכבשים הנגועים בסקרופי. לעומת זאת, דגימות ההיפוקמפוס והקורטקס הקדמי לא היו חיוביות ל-PrPres בכל החיות הנגועות.

למרות שה-IHC היה חיובי עבור PrPres בהיפוקמפוס של כל הכבשים הנגועים, 4/13 היו שליליים על ידי WB. בקורטקס הפרונטלי, 3/13 מהכבשים היו שליליות ל-PrPres על ידי IHC, ו-4/13 היו שליליות ל-PrPres על ידי WB.

בנוסף ל-vacuolation ותצהיר PrPSc, ההפעלה של תאי גלייה תועדה בהרחבה כאירוע מוקדם בפתוגנזה של מחלות מתקפלות שגויה של חלבון.

כדי לאפיין את ה-glia התגובתי, כל אזורי המוח עברו IHC באמצעות נוגדנים נגד GFAP לאיתור אסטרוציטים ונוגדנים נגד Iba1 לזיהוי מיקרוגליה.

צביעה חיסונית של Iba1, המזהה גם מיקרוגליה במנוחה וגם פעילה [37], גדלה באופן מובהק בכל אזורי המוח בכבשים נגועים בסקרופי לעומת כבשים בקרה וחשפה הבדלים ניכרים במורפולוגיה המיקרוגליה בין אזורי המוח בבעלי חיים נגועים (איור 1C).

מצב ההפעלה של תאי המיקרוגליה מוגדר על בסיס שלוש מורפולוגיות עיקריות: מסועפת, היפרטרופית ואמבויד [38,39]. לתאי מיקרוגליה במצב "מעקב" או לא פעיל יחסית יש מורפולוגיה מסועפת, המאופיינת בגוף תא קטן עם תהליכים עדינים רבים, כפי שנצפה בחיות השליטה שלנו.

המצב הפעיל מאופיין במורפולוגיה של אמבויד, אשר מקושרת בדרך כלל למצב הפגוציטי [38] ומורכבת מגופי תאים כדוריים שאינם מסועפים. המורפולוגיה ההיפרטרופית מאופיינת במיקרוגליה עם גוף תאים גדול יותר ותהליכים קצרים ועבים יותר, והיא קשורה לייצור ולשחרור של מתווכים דלקתיים [40,41].

המורפולוגיה של ה-ameboid הייתה הנפוצה ביותר ב-medulla oblongata של כבשים נגועים בסקרופי. בתלמוס נצפתה המורפולוגיה של האמבואיד אך לא שלטה: מגוון תהליכים גדולים ודקים מעורבים בתהליכים דלים ועבים הנובעים מגופי תאים מוארכים, התואמים למיקרוגליה היפרטרופית.

המורפולוגיה של המיקרוגליה הפרוליפרטיבית בקליפת המוח הקדמית ובהיפוקמפוס הייתה שונה באופן ניכר מזו של המדולה אולונגאטה והתלמוס. בשני האזורים, היפרטרופיה מיקרוגליה שולטת ומיקרוגליות אמבואידיות נעדרו כמעט.

למרבה הפלא, אזור Cornu Ammonis 3 (CA3) בהיפוקמפוס הראה את ההבדלים הגדולים ביותר במורפולוגיה של מיקרוגליה, שהציג דפוס מיקרוגליאלי המכונה מיקרוגליאטה מוט לא נצפה באף אזור מוח אחר.

הבדלים ניכרים אלו שנצפו בהערכת ההיפוקמפוס הניעו אותנו לבצע בדיקה מפורטת של תת-שדות CA1, 3, 4 והשכבה לאקונוז-מולקולרית (SLM).

איור 2. איתור כתם מערבי של PrPres במערכת העצבים המרכזית של כבשים נגועים בסקרופי שליטה טבעית. כמויות חלבון שוות הועמסו לצורך השוואה נאותה, ובוצעו אימונובלוטים באמצעות נוגדן חד שבטי SHA31 לניתוח דגימות מה-(A) medulla oblongata, (B ) thalamus, (C) hippocampus ו-(D) קליפת מוח קדמית מכבשים נגועים בסקרופי עם סימנים קליניים מתחילים (דגימות 1-5) ועם סימנים קליניים מתקדמים (דגימות 6-13). שורה 14 מציגה את הבקרה השלילית ושורה 15 דגימה של הומוגנית מוח לא נגועה של כבשים שלא הייתה נתונה לעיכול pK.

צביעה חיסונית של GFAP גילתה אסטרוגליוזיס בולטת בכבשים נגועים בסקרופי לעומת כבשים בקרה (איור 1D). מבחינה מורפולוגית, האסטרוציטים מכבשים נגועים הציגו באופן עקבי גופים ותהליכים היפרטרופיים, המאשרים נוכחות של אסטרוגליוזיס תגובתי, בעוד שכבשי בקרה הראו את מורפולוגיית הכוכבים האופיינית למצב שאינו מופעל.

ב-medulla oblongata ובתלמוס, צביעה חיסונית של GFAP הייתה אינטנסיבית יותר, עם הופעת רשתות אסטרוציטים עקב תהליכי חפיפה. בהיפוקמפוס ובקליפת המוח הקדמית, האסטרוציטים היו מפוזרים באופן שווה, עם נוכחות של גופי כוכבים היפרטרופיים מבודדים.

For more information:1950477648nn@gmail.com