דיסקציה של תגובות נוגדנים של נבדקים מחוסנים נגד Gam-COVID-Vac מציעה מעורבות של אפיטופים מחוץ ל-RBD בניטרול SARS-CoV-2
Oct 16, 2023
תַקצִיר: מיליוני אנשים חוסנו עם Gam-COVID-Vac אך הספציפיות העדינה של נוגדנים המושרים לא נחקרה במלואה. פלזמה מ-12 נאיביים ו-10 נבדקי הבראה ממחלת נגיף הקורונה 2019 (COVID-19) התקבלו לפני ואחרי שני חיסונים עם Gam-COVID-Vac. תגובתיות נוגדנים בדגימות הפלזמה (n=44) נחקרה על פאנל של חלבונים רקומביננטיים מקופלים ופתוחים עם מיקרו-מערכים של תסמונת נשימה חריפה נגיף קורונה 2 (SARS-CoV-2) ו-46 פפטידים המשתרעים על השפיץ חלבון (S) ועל ידי אימונוגלובולין G (IgG) תת-מחלקה אנזימים מקושרים אימונוסורבנט assay (ELISA). היכולת של נוגדנים המושרים על ידי Gam-COVID-Vac לעכב את הקישור של תחום הקולטנים (RBD) לאנזים הממיר את הקולטן אנגיוטנסין שלו (ACE2) נחקרה במבחן אינטראקציה מולקולרית (MIA). יכולת נטרול הווירוסים של נוגדנים נחקרה על ידי מבחן נטרול וירוסים מסוג פסאודו (pVNT) עבור Wuhan-Hu-1 ו- Omicron. מצאנו שחיסון Gam-COVID-Vac גרם לעליות משמעותיות של IgG1 אך לא של תת-מחלקות IgG אחרות כנגד S מקופל, תת-יחידת חלבון ספייק 1 (S1), תת-יחידת חלבון ספייק 2 (S2) ו-RBD באופן דומה בתת-מחלקה נאיבית והחלמה. נושאים. נטרול נגיפים היה בקורלציה גבוהה עם נוגדנים המושרים על ידי חיסון ספציפיים ל-RBD מקופל ולפפטיד חדש (כלומר, פפטיד 12). פפטיד 12 אותר קרוב ל-RBD בחלק ה-N-טרמינלי של S1 וייתכן שהוא מעורב במעבר של קונפורמציה לפני-לאחר-איחוי של חלבון הספייק. לסיכום, חיסון Gam-COVID-Vac גרם לנוגדני IgG1 ספציפיים ל-S בנבדקים תמימים ומחלימים באופן דומה. מלבד הנוגדנים הספציפיים ל-RBD, הנוגדנים המושרים כנגד פפטיד קרוב לקצה ה-N של RBD היו קשורים גם לנטרול וירוסים.
מילות מפתח: SARS-CoV-2; COVID-19; Gam-COVID-Vac; אפיטופ; נוֹגְדָן; נטרול וירוסים; בדיקת אינטראקציה מולקולרית; Omicron
יתרונות תוסף cistanche - הגברת חסינות
לחץ כאן לצפייה במוצרי Cistanche Enhance Immunity
【בקש עוד】 דוא"ל:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
1. הקדמה
לאחר המקרים הראשונים של הידבקות בתסמונת הנשימה החמורה Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) בסוף 2019 בווהאן, סין, מחלת הקורונה החדשה (COVID-19) התפשטה במהירות בכל רחבי הארץ העולם וגדל למגפה עולמית [1–4]. הפיתוח המהיר של חיסוני COVID-19 והכנסת תוכניות חיסונים גלובליות יחד עם הופעתן של גרסאות SARS-CoV-2 פחות פתוגניות נחשבות לגורמים משמעותיים להפחתת מקרי המוות הקשורים ל-COVID-19- וחומרת המגיפה [1,5]. החיסונים הראשונים שהפכו זמינים היו חיסונים גנטיים המבוססים על העברה בתיווך אדנוווירוס של הגן המקודד לחלבון השטח SARS-CoV-2 S [6-8]. החלבון SARS-CoV-2 S מורכב מתת-יחידת ה-S1 המכילה את תחום קושרת הרצפטורים (RBD) הנצמד לקולטן שלו ACE2 על תאים אנושיים ומתת-יחידת ה-S2 המבטיחה היצמדות הנגיף לממברנת התא המארח על ידי ביקוע פרוטאוליטי של פפטיד היתוך (FP) במהלך ההדבקה בנגיף [9]. גן S המשמש להעברת גנים בחיסונים מסוימים מבוססי אדנוווירוס (למשל, חיסון COVID-19 Janssen) עשוי להשתנות כדי לייצב את החלבון ולהשפיע על ביקועו, אך זה לא המקרה עבור האחרים [10]. תאים אנושיים הנדבקים על ידי אדנו-וירוס המכילים את הגן המקודד S מייצרים כמות משתנה של אנטיגן S אשר משתחרר ומוצג על ידי קומפלקס ההיסטו-תאימות העיקרי (MHC) מחלקה II לתאי T וכתוצאה מכך תאי CD4+ תאי T. לייצור נוגדנים ספציפיים ל-S. חלבון S המתבטא על ידי תאים שעברו טרנספקציה מוצג גם על ידי MHC Class I על פני התא הנגוע ומפעיל את ההפעלה של תאי T ציטוטוקסיים מסוג S-CD8+, שיכולים לזהות תאים מייצרי אנטיגן S ולהרוס אותם. עקרון החיסון, כלומר החדרת מידע גנטי המקודד S לתאי המארח והייצור הבא של אנטיגן S על ידי התאים הנגועים, דומה לחיסוני חומצה ריבונוקלאית שליח (mRNA), אם כי הטכנולוגיה של העברת הגנים שונה מנגיף אדנו. חיסונים מבוססי. לפיכך, "חיסונים גנטיים" מחקים במידה מסוימת זיהום SARS-CoV-2 טבעי. זיהוי האפיטופים המוכרים על ידי נוגדנים מנבדקים מחוסנים המעורבים בניטרול וירוסים חיוני לא רק להבנת מנגנון הפעולה של חיסונים קיימים אלא גם לפיתוח אסטרטגיות חיסון אקטיביות מעודנות ואסטרטגיות חיסון פסיביות נגד COVID-19 [11 ,12]. רוב החיסונים הנוכחיים מתמקדים בהשגת תגובת נוגדן ספציפית ל-S עם תשומת לב מיוחדת לתגובת נוגדנים ספציפיים ל-RBD, מכיוון שנראה כי נוגדנים ספציפיים ל-RBD נמצאים בקורלציה עם פעילות מנטרלת גבוהה כנגד SARS-CoV-2 [ 13–15]. עם זאת, מספר המוטציות הנרכשות על ידי כל וריאנט חדש של דאגה (VOC), מצביע על החשיבות של זיהוי אפיטופים שנשמרו בין VOCs הממוקדים על ידי נטרול נוגדנים הממוקמים לא רק ב-RBD אלא גם מחוץ ל-RBD [16]. למעשה, ישנם מחקרים המצביעים על נוכחות של אפיטופים מנטרלים מחוץ ל-RBD, אשר מזוהים על ידי נוגדנים לאחר חיסון [17-20]. בשנת 2020 החיסון מבוסס הווקטור Gam-COVID-Vac, המכונה גם Sputnik-V, הפך זמין לשימוש בפרקטיקה קלינית וכיום אושר לשימוש ביותר מ-70 מדינות (https://sputnikvaccine.com/about-vaccine / (נגישה ב-17 בינואר 2023)). לפי משאב Our World In Data (OWID), 79 מיליון אנשים ברוסיה קיבלו לפחות זריקה אחת מהחיסון, ו-72 מיליון מחוסנים במלואם (https://ourworldindata.org/ covid-vaccinations?country= RUS (נגישה ב-22 במרץ 2022)). Gam-COVID-Vac מורכב משני סוגי חיסונים, המבוססים על שני וקטורי אדנו-וירוס אנושיים שונים (hAd26 ו-hAd5) הנושאים את הצורה המקורית של חלבון S של זן Wuhan-Hu-1 SARS-CoV{{ 73}}. Sputnik-V כולל שתי הזרקות, אחת עם hAd26 ושנייה עם hAd5 ו- Sputnik light, עם hAd26 בלבד. שני וקטורי האדנו-וירוס השונים משמשים לחיסון הראשון והשני כדי להפחית את האפשרות שנבדקים מחוסנים מייצרים חסינות לחסינות חלבון S נגד האדנו-וירוס. למעשה, נוגדנים ספציפיים לאדנו-וירוס יגבילו את היעילות של חיסוני מאיץ על ידי נטרול של כלי הווקטור של האדנו-וירוס. לכן, ביום ה-21 לאחר מתן המנה הראשונה של חיסון עם rAd26, אספקת אנטיגן חוזרת מתבצעת עם וקטור rAd5 [8,21]. מחקרים מעטים חקרו במידה ניכרת את תגובות נוגדנים ספציפיות ל-S ו-RBD ואת פעילות ניטרול הנגיפים בסרה של מחוסני Gam-COVID-Vac [10,22,23]. דווחו עליות של נוגדני IgG ספציפיים ל-RBD שלושה חודשים לאחר מתן Gam-COVID-Vac והוכח כי נוגדנים מגיבים בצלב עם גרסאות אלפא, בטא, דלתא ואומיקרון המעוררות דאגה [24-26]. Gam-COVID-Vac הושווה גם למספר חיסונים מורשים אחרים נגד SARS-CoV-2, שהראו נטרול וירוסים גבוה ויעילות גבוהה נגד תמותה הקשורה ל-COVID עבור ספוטניק-V, אם כי נחיתות קלה לכמה חיסוני mRNA לגבי נטרול וירוס נמצאו [24]. לבסוף, הוכח שחיסון של מטופלים עם Gam-COVID-Vac עם Gam-COVID-Vac מטופלים בטיפול אנטי-רטרו-ויראלי חיובי (HIV+) עם Gam-COVID-Vac מראה יעילות אפידמיולוגית נגד סוג הבר המקורי ווריאנט הדלתא של SARS-CoV{{ 113}} [27]. עם זאת, עד כה לא בוצע ניתוח מפורט של זיהוי האפיטופים על ידי נוגדנים בנבדקים מחוסני Gam-COVID-Vac ונדרשים נתונים כדי להבין את איזוטיפ האימונוגלובולינים ותת-התגובות של IgG בנבדקים מחוסנים ב-Gam-COVID-Vac. כאן חקרנו שתי קבוצות של נבדקים שחוסנו עם Gam-COVID-Vac, אחת שעברה זיהום קודם ב-SARS-CoV-2 וקבוצה נוספת של נבדקים תמימים ב-SARS-CoV-2. ביצענו ניתוח מדוקדק של הספציפיות האפיתופית של נוגדנים המושרים באמצעות מיקרו-מערך SARS-CoV-2- שמקורו בחלבונים מקופלים ופפטידים ופפטידים המשתרעים על חלבון S השלם, כולל RBD. יתר על כן, נותחו תגובות תת-מחלקת IgG. המחקר שלנו מגלה שנבדקים שחוסנו ב-Gam-COVID-Vac מרכיבים נוגדנים ספציפיים ל-RBD המסוגלים לחסום את האינטראקציה RBD-ACE2. מעניין שמצאנו שניטרול נגיפים קשור גם לנוגדנים המכוונים נגד פפטיד מחוץ ל-RBD, שעשוי להיות מעורב במעבר של קונפורמציה לפני-פוסט-היתוך של חלבון הספייק.
cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית
2. תוצאות
2.1. נבדקים מחוסנים ל-Gam-COVID-Vac כוללים נבדקים נאיביים ונאיביים ל-COVID-19 ונבדקים בהחלמה
נבדקים בהחלמה נדבקו בזן Wuhan-Hu-1 על פי נתוני השכיחות והרצף שלו שהתקבלו בזמן ההדבקה באזור מוסקבה. לנבדקים תמימים לא היו תסמינים של COVID-19 וחסרו להם נוגדנים ספציפיים ל-SARS-CoV-2-בזמן הגיוס. נבדקי המחקר כללו 15 נשים ו-7 גברים בגיל חציוני של 60 (כלומר, 25-70 שנים) (טבלה 1).
טבלה 1. מאפיינים דמוגרפיים, קליניים וסרולוגיים של נבדקים.
דגימת פלזמה התקבלה מכל אחד מהנבדקים בנקודת הזמן 0 (כלומר, קו בסיס) (איור 1A), ואז כל נבדק חוסן עם Sputnik-V עם מרווח של כ-21 יום בין הראשון לשני הזרקה (נקודות זמן 1 ו-2). בנקודת זמן 3 נאספה דגימת פלזמה שנייה כדי לקבוע תגובות נוגדנים הנגרמות על ידי חיסון (איור 1A). נבדקים נצפו במשך 120 ימים נוספים. ביום 110 לאחר החיסון הסופי נבדק אחד (כלומר, נבדק 22) לקה ב-COVID-19 בעוד שהאחרים לא פיתחו תסמינים של COVID-19 (טבלה 1).
איור 1. עיצוב מחקר ותגובות נוגדנים ספציפיות ל-SARS-CoV-2- לפני ואחרי חיסון עם Sputnik-V. (א) עיצוב מחקר. דגימות פלזמה התקבלו מנבדקים נאיביים (n=12) ב-COVID-19- ונבדקים בהחלמה (n=10) בנקודת הזמן 0 (בסיס), ואז הנבדקים קיבלו שני ספוטניק-V חיסונים בנקודות זמן 1 ו-2, בהתאמה, ודגימת פלזמה התקבלה בנקודת זמן 3 (כלומר, יום 80-85 לאחר החיסון הראשון). (ב) רמות נוגדן IgG ספציפיות ל-Nucleocapsid (ציר y: ISU) בנבדקים תמימים והבראה (ציר X) בקו הבסיס. הקו האופקי מציין את החתך לחיוביות. (ג) רמות נוגדני IgG (צירי y: ISU) ספציפיות ל-RBD, S, S1 ו-S2 בנבדקים בנקודת הזמן 0 ו-3 (צירי x). (ד) משמאל לימין רמות נוגדנים IgG1, IgG2, IgG3 ו-IgG4 (צירי y: ערכי OD של צפיפות אופטית) ל-S (חלק עליון) ו-RBD (חלק תחתון) בנקודות הזמן 0 ו-3 ( צירי x). הבדלים משמעותיים בין קבוצות כפי שנקבעו על ידי מבחן Wilcoxon מצוינים: ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, ns - לא מובהק.
2.2. חיסון Gam-COVID-Vac גורם לתגובות IgG רחבות ל-S כולל S1, RBD ו-S2
יתרונות תוסף cistanche - הגברת חסינות
ביצענו ניתוח מפורט של תגובות נוגדנים לפאנל גדול של חלבוני SARS-CoV-2 מקופלים ופתוחים במיקרו-מערכים ופפטידים המשתרעים על חלבון S בדגימות פלזמה מנבדקים נאיביים והחלים ב-SARS-CoV-2- לאחר קורס מלא של חיסונים עם Gam-COVID-Vac (איור 1A,B; טבלה 1). כאשר משווים דגימות פלזמה מנקודת זמן 0 ונקודת זמן 3 לאחר החיסון, נמצאה אינדוקציה משמעותית של תגובות IgG כנגד RBD מקופל אך לא פרוש, S, S1 ו-S2 (איור 1C). שלושה חודשים לאחר החיסון הראו נבדקים פי 21-עלייה של נוגדני IgG ספציפיים ל-RBD (p < 0.{{20}}001) ו-{{ עלייה של פי 18} בנוגדני IgG ספציפיים ל-S (כלומר, נקודת זמן 0: חציון 0.291, נקודת זמן 3: חציונית 5.778) (p < 0.0001), בהתאמה. נוגדני IgG ל-S1 עלו פי 3.7-(p=0.0023) ונוגדני IgG ל-S2 עלו פי 2.8- (p=0.0094) (איור 1C ). חיסון עם Gam-COVID-Vac גרם בעיקר לתגובות IgG ל-S, S1 ו-RBD מקופלים באופן דומה בנבדקים תמימים והחלמה (איורים 1C, S2 ו-S3), מה שמצביע על כך שניתן להשתמש בו כדי להגביר את SARS-CoV-2- תגובות נוגדנים ספציפיות גם בנבדקים בהחלמה. חיזוקים משמעותיים של נוגדני IgG ל-RBD, S ו-S1 נצפו בנבדקים תמימים והבראהים (איור S2) ולא היו הבדלים משמעותיים לגבי רמות IgG ל-RBD, S, S1 ו-S2 בנבדקים תמימים והחלמה בנקודת זמן 3 (איור S3).
2.3. חיסון Gam-COVID-Vac גורם בעיקר לתגובת תת-סיווג IgG1 ל-S ו-RBD
דווח כי אימונותרפיה ספציפית לאלרגן (AIT) משרה בעיקר תגובות IgG1 ו-IgG4 ספציפיות לאלרגן, אשר שונות לא רק בנוגע לתפקודי האפקטור שלהן (IgG1 יכול לתווך ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים (ADCC) והפעלת משלים ואילו ל-IgG4 אין את אלה תפקודי אפקטור) אלא גם לגבי הקינטיקה שלהם (IgG1: התחלה מהירה וירידה מוקדמת: IgG4: התחלה איטית אך רמות מתמשכות) [28-30]. לכן חקרנו את התגובות של תת-מחלקת IgG (כלומר, IgG1-IgG4) ל-S ו-RBD בנבדקים שחוסנו בספוטניק-V. איור 1D מראה שהחיסון גרם כמעט אך ורק לתגובה תת-מעמדית של IgG1 ל-S ו-RBD. עליות משמעותיות של רמות IgG1 ספציפיות ל-S ו-RBD (p=0.0002 ו-p=0.0071, בהתאמה) נמצאו לאחר החיסון. עם זאת, לא ניתן היה לזהות תגובות משנה רלוונטיות של IgG2, IgG3 או IgG4 ספציפיות ל-S ו-RBD (איור 1D).
2.4. אינדוקציה של נוגדנים מנטרלים וירוסים ונוגדנים המעכבים את האינטראקציה RBD-ACE2 על ידי חיסון Gam-COVID-Vac
לאיתור נוגדנים מנטרלי וירוסים, השתמשנו בבדיקת pVNT, שבה חלקיקים דמויי וירוס טופלו פסאודו עם S-protein מהזן המקורי Wuhan-Hu-1 ומה-VOC Omicron שתואר לאחרונה. נוגדנים עם פעילות מנטרלת עבור זן Wuhan Hu-1 נמצאו בכל פרט לאחד (כלומר, נושא 22) מתוך 22 הנבדקים (איור 2A, טבלה 2), בעוד שטיטרי נוגדנים מנטרלים עבור Omicron היו נמוכים משמעותית (איור 2B) ו נמצא רק ב-17 מתוך 20 נבדקים (איור 2A, טבלה 2). לא נמצא נטרול רלוונטי עבור נבדקים 6, 7, 10, 11, 15 (איור 2A, טבלה 2). טיטרי נטרול וירוסים עבור Omicron היו נמוכים פי 25 מאשר עבור WT (חציון 141.9 ו-5.7 עבור Wuhan-Hu-1 ואומיקרון, בהתאמה) (איור 2B).
איור 2. פעילות מנטרלת וירוסים בפלזמה 3 חודשים לאחר חיסון Sputnik-V וקשר עם תגובות נוגדני IgG לפפטידים שמקורם ב-RBD ופפטידים. (א) נטרול וירוסים (ID50) (ציר y) נגד זן ווהאן-הו-1 (ירוק) ואומיקרון (כתום) הושג עם פלזמה מתמימות (כחול) והחלמה (אדום) נושאים (צירי x). (ב) השוואה של נטרול וירוסים (ציר y: ID50 שהתקבל עבור פלזמה מהנבדקים, פסים מייצגים חציונים עם טווח בין-רבעוני (IQR) Wuhan Hu-1 (ירוק) ואומיקרון (כתום) הקו האופקי מייצג תוצאות שהתקבלו עם פלזמה מנבדק בקרה בריא ולא נגוע (בקרה בריאה, HC). הבדלים משמעותיים בין זנים נקבעו על ידי מבחן Mann–Witney: ****p < 0. {{30}}001. (ג) לוקליזציה של RBD ופפטידים בקורלציה עם נטרול וירוסים בסכימה של S (S1, S2). (D) מתאמים בין טיטרי נטרול וירוסים עבור Wuhan-Hu{{19 }} (WT) או Omicron (צירי y) ורמות IgG ספציפיות ל-RBD ופפטידים שמקורם בספייק 12, 32 ו-46A (צירי x: ISU). סמלים כחולים ואדומים מציינים נבדקים נאיביים והחלמה, בהתאמה. כוכביות מצביעים על מתאמים מובהקים לפי מבחן Spearman הלא-פרמטרי, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 **** p < 0.0001, ns=לא מובהק.
טבלה 2. השוואה של רמות IgG ספציפיות ל-S, S1, S2 ו-RBD שנמדדו על ידי מיקרו-מערך עם עכבות של קשירת RBD ל-ACE2 וטיטר נטרול וירוס (Wuhan-Hu-1, Omicron) שנקבעו עבור פלזמה מה- נושאים שנחקרו. מיפוי חום בוצע עבור כל פרמטר בנפרד באמצעות אקסל. הרמה הגבוהה ביותר נחשבה לאדום כהה והנמוכה ביותר הייתה לבנה.
העובדה, שבכולם פרט לנבדק אחד (כלומר, נושא 22) נוגדנים מנטרלי וירוס גדלו לאחר החיסון מצביעה על כך שהם נגרמו על ידי חיסון (טבלה 2). נבדק 21 כבר הראה חסימה גבוהה של האינטראקציה RBD-ACE2 ב-MIA וניטרול נגיפים גבוה בקו הבסיס (טבלה 2). יש לציין כי לדגימות פלזמה של נבדקים בהחלמה מחוסני Gam-COVID-Vac שסבלו ממחלה בינונית (#1, 2, 17, 18, 21) היו רמות נטרול נגיפים גבוהות יותר מאלו של נבדקים בהבראה עם מחלה קלה (#22) או ללא תסמינים. (#4, 5, 7, 9) (טבלאות 1 ו-2). עם זאת, ממצא מרכזי היה שעיכוב של קישור RBD ל-ACE2 וניטרול וירוס לא תמיד קשורים. עיכוב של יותר מ-25% בקשירה של RBD Wuhan Hu-1 ל-ACE2 התרחש רק עבור 6 נבדקים שהראו גם עיכוב בבדיקת נטרול הנגיף עקב חיסון (כלומר, נבדקים 1, 2, 3, 17, 18 , ו-19) (טבלה 2). מעניין לציין, פעילות מנטרלת וירוסים (50% מינון זיהומיות (ID50) > 100) נצפתה עבור 6 נבדקים למרות שהם לא הראו עיכוב לקוי של RBD ל-ACE2 (טבלה 2: נבדקים 6, 10, 12, 13, 16, 20) .
2.5. נטרול וירוסים בנבדקים מחוסנים ב-Gam-COVID-Vac נמצא בקורלציה הדוק עם תגובות IgG ל-RBD ולפפטיד 12 שמקורו ב-S
כפי שצוין קודם לכן, פלזמה ממספר נבדקים שחוסנו Gam-COVID-Vac (למשל, בנבדקים 6, 10, 12, 13, 16, 20; טבלה 2) הראתה פעילות מנטרלת וירוסים אך לא עיכבה את האינטראקציה RBD-ACE2. לכן ניתחנו תגובתיות של נוגדני IgG לפפטידים המשתרעים על חלבון S על ידי ניתוח שבבים מבוסס-מיקרו-מערך [13] (איור S4 ואיור 2C) ותייחסנו תגובות IgG ספציפיות לפפטידים עם נטרול וירוסים של ה-Wuhan-Hu{{19} } זן ואומיקרון (איור 2D). תגובות IgG לשלושה פפטידים (כלומר, פפטידים 12, 32, 46A) כגון תגובות IgG ל-RBD מקופל היו בקורלציה משמעותית עם נטרול של זן Wuhan-Hu-1 (איור 2C, D). פפטיד 12 בלט מכיוון שתגובות נוגדנים לפפטיד 12 לא מקופל (איור S1), אך לא לפפטידים 32 ו-46A שנפרשו, זכו לחיזוק משמעותי על ידי Gam-COVID Vac בנבדקים תמימים (איור 3A) וגם בקורלציה משמעותית עם נטרול של Omicron (איור 2D ). לא נצפתה חיזוק משמעותי עבור נבדקים בהחלמה לפפטידים 12, 32 או 46A (איור 3A). הרצף של פפטיד 12 שמור מאוד בקרב זני SARS-CoV-2 (איור 4) ושוכן ב-S1 קרוב לקצה ה-N של RBD ומכאן מציין אזור שעשוי להיות רלוונטי למעבר של הפרה- לקונפורמציה שלאחר היתוך של חלבון S (איור 3B).
איור 3. רמות נוגדן IgG חציוניות (צירי y: ISU) לפפטידים שמקורם ב-S (P12, P32, P46A) בנבדקים תמימים והבראה מחוסנים בנקודות זמן 0 ו-3 (צירי x) (A) . הבדלים משמעותיים בין קבוצות כפי שנקבעו על ידי מבחן Wilcoxon מצוינים: * p < 0.05, ns=לא מובהק. (ו) (ב) איור 3. רמות נוגדן IgG חציוניות (צירי y: ISU) לפפטידים שמקורם ב-S (P12, P32, P46A) בנבדקים תמימים והחלמה מחוסנים בנקודות זמן 0 ו-3 (x -צירים) (א). הבדלים משמעותיים בין קבוצות כפי שנקבעו על ידי מבחן Wilcoxon מצוינים: * p < 0.05, ns=לא מובהק. (ב) הדמיה של פפטידים 12, 32 ו-46A בייצוג פני השטח של טרימר החלבון של SARS-CoV-2 (מבט צד, קונפורמציה לפני היתוך) שנוצר עם PyMOL. פפטיד 12 מודגש במודל S-trimer באדום, פפטיד 32 בכחול ו-46A בכתום. פחמימות מוצגות באפור בהיר.
איור 4. יישור רצף חלבון של Wuhan-Hu-1 (למעלה) ואומיקרון (למטה) של SARS-CoV-2 S-protein. RBD נצבע בצהוב בהיר ופפטידים 12, 22, 25, 32, 33, 46A ו-47 מסומנים בקו תחתון. רצף חלבוני S של ווהאן מתאים ל-WA1 isolate (הצטרפות מס' GeneBank: BCN86353.1), רצף חלבוני S של Omicron Omicron הוא Clade GRA, שושלת B.1.1.529 BA.1 מבוסס על מסד הנתונים GISAID ( https://www.gisaid.org/ (נגישה ב-15 במרץ 2022)). תחליפי חומצות אמינו מקודדים לפי תכונות ההידרופתיה והטעינה שלהם (ורוד=הידרופובי, ירוק=ניטרלי, כחול בהיר=הידרופילי בסיסי ואדום בהיר=חומצי הידרופילי).
3. דיון
החיסון מבוסס הווקטור Gam-COVID-Vac המכונה גם Sputnik-V, היה אחד מהחיסונים הראשונים ל-SARS-CoV-2 שהפך זמין לשימוש בפרקטיקה קלינית. עם זאת, מידע קטן יחסית זמין לגבי הספציפיות העדינה של תגובות נוגדנים בנבדקים שחוסנו עם COVID-19. במחקר זה, ביצענו ניתוח מפורט של תגובות נוגדנים כלפי חלבוני SARS-CoV-2 מקופלים ופפטידים עם מיקרו-מערך המקופלים את חלבון ה-S בדגימות פלזמה מנבדקים נאיביים והבראהים של SARS CoV-2- לאחר קורס מלא של חיסונים עם Gam COVID-Vac. Gam-COVID-Vac גרם בעיקר ל-IgG1, אך לא לתגובות תת-סיווג אחרות של IgG ל-S, S1, S2 ו-RBD מקופלים באופן דומה בנבדקים תמימים והחלמה, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש בו כדי להגביר את SARS-CoV-2- תגובות נוגדנים ספציפיות גם בנבדקים בהחלמה. בדומה לחיסונים גנטיים אחרים, תגובת הנוגדנים המושרה על ידי Gam-COVID-Vac התגוררה בעיקר בתת-המעמד של IgG1 שיש לה זמן מחצית חיים קצר יותר בהשוואה לתגובת תת-מחלקה של IgG4 שהיא בת קיימא יותר. לדוגמה, תגובות תת-סיווג ספציפיות של IgG4 קשורות להגנה ארוכת טווח במהלך אימונותרפיה ספציפית לאלרגן ואילו תגובות ספציפיות של IgG1 מצטברות במהירות אך דוהות לאחר מספר חודשים [28-30]. בהתאם, יהיה צורך בהזרקות דחף תכופות של Gam-COVID-Vac וחיסונים גנטיים אחרים כדי לשמור על נטרול תגובות נוגדנים ברמה גבוהה. חיסון עם Gam-COVID-Vac גורם לתגובת נוגדנים המחקה במידה רבה את זו שנמצאה לאחר זיהום טבעי ב-SARS-CoV-2 [13]. בנוסף, תגובות נוגדנים לאחר זיהום טבעי שייכות בעיקר לתת-המעמד של IgG1 ומכוונות נגד S, S1, S2 ו-RBD מקופלים [13]. הממצא החדש והמעניין של המחקר שלנו היה שפלזמה ממספר נבדקים מחוסנים Gam-COVID-Vac (למשל, בנבדקים 6, 10, 12, 13, 16, 20; טבלה 2) הראתה פעילות מנטרלת וירוסים אך לא עיכבה את אינטראקציה RBD-ACE2. לכן ניתחנו תגובתיות של נוגדני IgG לפפטידים המשתרעים על חלבון S השלם על ידי ניתוח שבבים מבוסס מיקרו-מערך [13] (איורים 2D ו-S4) ותייחסנו תגובות IgG ספציפיות לפפטידים עם נטרול וירוסים של ה-Wuhan-Hu{{62} } זן ו-Omicron BA.1 (איור 2D). תגובות IgG לשלושה פפטידים (כלומר, פפטידים 12, 32, 46A) כגון תגובות IgG ל-RBD נמצאו בקורלציה משמעותית עם נטרול של זן Wuhan-Hu-1 (איור 2C, D). עם זאת, פפטיד 12 היה ייחודי מכיוון שתגובות נוגדנים רק לפפטיד 12, אך לא לפפטידים 32 ו-46A, קיבלו חיזוק משמעותי על ידי חיסון (איור 3A) וגם בקורלציה משמעותית עם נטרול של Omicron (איור 2D). גודל החיזוק הנגרמת על ידי חיסון של תגובות IgG לפפטיד 12 היה צנוע אך משמעותי בנבדקים תמימים ודי דומה להגברת נוגדני IgG המכוונים ל-S ו-S1. עם זאת, נוגדני IgG נגד הפפטיד המבודד הנפוש (איור S1) עשויים לייצג רק חלק מהנוגדנים המכוונים נגד פפטיד 12 בחלבון המקופל. יתר על כן, לא רק הרמות אלא גם התלהבות של הנוגדנים חשובים. רצף הפפטידים 12 נשמר מאוד בקרב זן Wuhan-Hu-1 ו-BA.1 Omicron VOC (איור 4) והוא נגזר מאזור שעשוי להיות רלוונטי למעבר של הקדם לאיחוי שלאחר ההיתוך קונפורמציה של חלבון S (איור 3B). יתרה מכך, ההשוואה של גרסאות מוטנטיות חדשות של Omicron (BA.1, BA.2, BA.4/5, BA.2.12.1, BA.2.75, BQ.1), מראה שפפטיד 12 (284-313 aa. ) נשאר ללא שינוי מבחינת רצף חומצות האמינו, בניגוד למשל לפפטיד 32 (https://covariants.org/shared-mutations, (נגיש ב-28 בנובמבר 2022)). יש לציין כי תוארו נוגדנים חד שבטיים בעלי יכולת נטרול וירוסים המכוונים לאזור ה-N-terminal domain (NTD) שפפטיד 12 הוא חלק ממנו [31], ודווח כי גם חיסונים אחרים יכולים לגרום לתגובת נוגדנים המכוונת נגד אזור זה. [18-20,32], המצביע על כך שהאזור המוגדר על ידי פפטיד 12 עשוי להיות חשוב להשראת נוגדנים מנטרלים. לכן אפשר להניח שנוגדנים המושרים על ידי חיסון Gam-COVID-Vac יכולים לנטרל את SARS-CoV-2 על ידי שני מנגנונים, אחד פשוט על ידי עיכוב האינטראקציה RBD-ACE2 ואחר על ידי מיקוד לאזור המכיל פפטיד 12 של S- חלבון שעשוי להיות מעורב בשינויים מבניים (כלומר, מעבר של ה-pre-fusion לתוך קונפורמציה היתוך של S). למחקר שלנו יש מגבלות. לדוגמה, השתמשנו במבחן נטרול המבוסס על נגי-לנטי בסוג פסאודו, אך מבחנים אלה נמצאים בשימוש נרחב ואמינות [33]. זוהי גם מגבלה של המחקר שלנו שפפטידים על המיקרו-מערך שלנו נפרשו ולכן ייתכן שזיהו רק חלק מנוגדנים מנטרלים שזיהו את הפפטידים שנפרשו בעוד שחלק גדול עוד יותר של נוגדנים עשוי להיות קשור לאפיטופים קונפורמטיביים בזיהויים. אזור. יתר על כן, זו מגבלה של המחקר שלנו שניתחנו רק מספר קטן של נבדקים. עם זאת, המחקר שלנו מצביע בבירור על כך שנוגדנים בעלי סגוליות אפיטופים שונה עשויים לתרום להשפעה המגנה של חיסון Gam COVID-Vac. בנוסף, המחקר מראה תגובה לפפטיד פוטנציאלי שמור שניתן להשתמש בו ליצירת נוגדנים מנטרלים באופן נרחב.
יתרונות תוסף cistanche-איך לחזק את המערכת החיסונית
4. חומרים ושיטות
4.1. מחקר הצהרת אוכלוסין ואתיקה
נבדקים בריאים עם (n {0}}) או בלי (n=12) זיהומים קודמים של SARS-CoV-2 נרשמו למחקר בדצמבר 2020 במכון הלאומי למחקר של אימונולוגיה של הסוכנות הפדרלית לרפואה ביולוגית של רוסיה (מספר אתיקה: #12-1, 29 בדצמבר 2020). כל המשתתפים סיפקו הסכמה מדעת בכתב. זיהום קודם ב-SARS-CoV-2 אושר על ידי בדיקת PCR חיובית לשעבר ותסמינים של COVID-19 או על ידי נוכחות של נוגדנים ספציפיים ל-SARS-CoV-2- המכוונים לאנטיגן נוקלאוקפסיד ו/או אנטיגן RBD ו/או S כמתואר [13]. כל הנבדקים חוסנו תוך שרירית עם שתי מנות של Sputnik-V (Gam-COVID-Vac, Biocard, מוסקבה, רוסיה) במרווח של שלושה שבועות. דגימות דם התקבלו יום אחד לפני החיסון הראשון (T0, איור 1A) ו-80 עד 85 ימים לאחר החיסון הראשון (T3, איור 1A).
4.2. זיהוי של SARS-CoV-2-תגובות נוגדנים ספציפיות
תגובת אימונוגלובולינים של נבדקים תמימים ו-COVID{{0}} בהחלמה הוערכה בדגימות פלזמה לפני ואחרי חיסון עם Sputnik-V (איור 1A). IgG ספציפי לפאנל מקיף של חלבוני SARS-CoV-2 ו-46 פפטידים (25-30 מרס) המשתרעים על חלבון S נמדד ב-1:50 דגימות פלזמה מדוללות על ידי טכנולוגיית microarray-chip כמו קודם לכן מתואר [13]. רצפי חומצות האמינו, מספר חומצות האמינו והמשקל המולקולרי של כל הפפטידים הסינתטיים בשבב המיקרו-מערכי מוצגים בטבלה 3. עבור פפטידים 12 ו-32 ו-RBD המתבטאים ב-Escherichia coli (E. coli) (לא מקופל) ובכליה עוברית אנושית 293 (HEK293) מסופקים תאים (מקופלים) דיכרואיזם מעגלי (CD) (איור S1). פפטידים 12 ו-32 לא חשפו מבנה משני ספציפי כפי שנקבע על ידי דיכרואיזם מעגלי (CD) כפי שמוצג באיור S1. בפירוט, שקופיות זכוכית המכילות מיקרו-מערכים מוקפים במסגרת אפוקסי (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-Königshofen, גרמניה) הופעלו עם פולימר אורגני מורכב תגובתי ל-amine, MCP-2 (Lucidant Polymers, Sunnyvale, CA , ארה"ב) על מנת להקל על הקישור של חלבונים ופפטידים. אנטיגנים/פפטידים של SARS-CoV-2 זוהו באמצעות ריכוז של 0.5-1 מ"ג/מ"ל ב-(75 mM Na2HPO4, pH=8.4) בשלושה עותקים באמצעות SciFlexArrayer S12 (Scienion AG, ברלין, גרמניה) [13]. הביטוי והטיהור של חלבונים וסינתזת פפטידים מתוארים ב [13]. תגובתיות נוגדני IgG לאנטיגנים בעלי מיקרו-מערכים נמדדה על ידי שטיפה תחילה של המיקרו-מערכים במשך 5 דקות עם תמיסת מלח מבוקרת פוספט עם 0.5% Tween 20 (PBST) וייבושם באמצעות צנטריפוגה באמצעות צנטריפוגה של Sigma 2-7 ו-MTP-11113 רוטור (שניהם Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz, גרמניה). לאחר מכן נוספו מנות 35 μL של דגימות פלזמה מדוללות 1:50 (מדלל דגימה, Thermofisher, Waltham, MA, ארה"ב) והודגרו במשך שעתיים ב-22 מעלות צלזיוס. לאחר שלב כביסה נוסף, 30 μL של נוגדנים משניים (DyLight 550 (Pierce, Rockford, IL, ארה"ב) שכותרתו IgG אנטי אנושי (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, ארה"ב)) הוחלו והודגרו למשך 30 דקות ב-22 ◦ C RT. לאחר מכן נשטפו השבבים, יובשו ולאחר מכן נסרקו באמצעות סורק לייזר קונפוקאלי (Tecan, Mennedorf, שוויץ). ניתוח תמונה בוצע על ידי תוכנת רכישה וניתוח תמונה של MAPIX microarray (Innopsys, Carbonne, צרפת) והמרת יחידות הקרינה הנמדדות ליחידות סטנדרטיות של ISAC (ISU) בוצעה כמתואר [13]. רמות נוגדנים ספציפיות מתבטאות ביחידות סטנדרטיות של ISAC (ISU). תגובות נוגדנים ל-S ו-RBD ספציפיות ל-IgG1-4 נמדדו בדגימות פלזמה (דילול 1:50) בכפולות על ידי ELISA כפי שתואר קודם לכן [13] עם וריאציה של<5% for their average values.
טבלה 3. פפטידים סינטטיים של SARS-CoV-2 שמקורם בחלבון §.
4.3. Far UV Circular Dichroism (CD) Spectra
עבור פפטידים, P12 ו-P32 וכן RBD המתבטאים בתאי E. coli ו-HEK293 בוצעו ניתוח CD באמצעות ספקטרופולרימטר Jasco J-180 (Japan Spectroscopic Co., טוקיו, יפן) שתואר בעבר [34]. ספקטרום CD של פפטידים וחלבונים (איור S1) נמדדו בריכוז של 0.1 mg/mL ב-10 mM NaH2PO4 (pH 8.0), ששימש לאיתור האנטיגנים.
4.4. מבחן נטרול וירוסים מבוסס פסאודו-וירוס (PVT)
פעילות נטרול וירוסים בדגימות פלזמה נקבעה על ידי מבחן נטרול וירוסים מבוסס פסאודו-וירוס כפי שתואר קודם לכן [35]. כדי לייצר חלקיקים דמויי נגיף SARS-CoV-2 (VLPs), תאי HEK293T הועברו יחד עם 3 פלסמידים: פלסמיד אריזה lentiviral pCMV∆8.2R (Addgene, Teddington, בריטניה), pUCHR-GFP ו- פלסמיד pCAGGS-S∆19 המקודד לחלבון ספייק SARS-CoV-2 מסוג פראי (זהה למבודדי ההתייחסות Wuhan-Hu-1 ו-WA1) או פלסמיד pCAGGS-S∆19-Om קידוד לחלבון SARS-CoV -2 Omicron ספייק (מתנה חביבה מאת אנדריי גורצ'קוב, המעבדה לאימונוגנטיקה, המכון לביולוגיה מולקולרית ותאית, הסניף הסיבירי של האקדמיה הרוסית למדעים, נובוסיבירסק, רוסיה). לפני השימוש ב-pVNT, VLPs עברו טיטרציה על ידי דילול מוגבל והודגרו במשך 4 ימים עם תאי HEK293T שעברו העברת hACE2-. מנה של חלקיקים ויראליים שהעניקה 50% תאים חיוביים לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) נבחרה לשימוש בבדיקה. עבור pVNT, כל דגימות הפלזמה הושבתו בחום למשך 30 דקות ב-56 ◦C לפני השימוש. ביום הרביעי, תאים שלאחר זיהום הושעו מחדש, ואחוז התאים החיוביים ל-GFP נמדד על ידי ציטומטריית זרימה. ערכי ID50 חושבו באמצעות עקומה סיגמואידית (תוכנת GraphPad Prism 9.2.0, Sigmoidal, 4PL), משוחזרת לפי אחוז הניטרול בריכוזי הפלזמה המצוינים השונים.
4.5. מבחן אינטראקציה מולקולרית (MIA)
כדי לזהות את היכולת של דגימות פלזמה של נבדקים מחלימים או תמימים של COVID{{0}} (טבלה 1), לפני ואחרי חיסון Sputnik-V, לעכב את הקישור של 50 ננוגרם/מ"ל של RBD-hu-1 לקולטן ACE2 בוצע בדיקת אינטראקציה מולקולרית (MIA) כמתואר [13,36-39]. בדיקה זו יכולה למדוד את העיכוב של RBD המסומן ל-ELISA ACE2 הקשור לצלחת על ידי נוגדנים או עיכוב תרכובות אחרות של האינטראקציה RBD-ACE2 [38]. בקצרה, ACE רקומביננטי -2 (GenScript, Piscataway, ניו ג'רזי, ארה"ב) היה מצופה (2 מיקרוגרם/מ"ל) למשך הלילה על גבי לוחות NUNC Maxisorb 96 באר (Thermofisher). לאחר מכן, שלושה מחזורי כביסה נערכו עם חיץ כביסה ולאחר מכן צלחות נחסמו למשך 3 שעות ב-RT עם חיץ חוסם. דגימות סרום הודללו 1:2 ב-PBS, 0.05% Tween 20, 1% BSA, והודגרו מראש למשך שעתיים עם 50 ng RBD רקומביננטי עם His-תייג (GenScript). לאחר מכן נוספו דגימות הסרום שהודגרו מראש לצלחות המכילות ACE-2 למשך 3 שעות והצלחות נשטפו והודגרו למשך הלילה עם נוגדן חד שבטי עכבר מדולל אנטי-His (Dianova, המבורג, גרמניה) . לאחר 3 שלבי כביסה, נוספו נוגדן אנטי-עכבר IgG1 בדילול 1:1000 (GE Healthcare, שיקגו, IL, ארה"ב) למשך שעתיים והגילוי בוצע באמצעות ABTS. ערכי צפיפות אופטית ממוצעת (OD) התואמים ל-RBD קשור נמדדו ב-405 ננומטר ו-492 ננומטר (התייחסות) בקורא TECAN Infinite F5 ELISA עם התוכנה המשולבת i-control 2.0 (Tecan Group Ltd., Mennedorf, שוויץ). בקרת המאגר (שכבת על ללא RBD) הופחתה מכל תוצאה. קביעות בוצעו בכפולות והתוצאות מוצגות כערכים ממוצעים עם וריאציה של<5%.
יתרונות תוסף cistanche-איך לחזק את המערכת החיסונית
4.6. הדמיה של פפטידים במבנה חלבון הספייק
ייצוג פני השטח של חלבון ספייק SARS-CoV-2 נוצר ב-PyMOL (PyMOL Molecular Graphics System, גרסה 2.5.0a0, Schrödinger, LLC, ניו יורק, ניו יורק, ארה"ב) מבוסס בערך PDB 6XR8.
4.7. ניתוח סטטיסטי
ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות GraphPad Prism (גרסה 9.2.0 GraphPad Software, La Jolla California). מבחן Wilcoxon (איורים 1C, D ו-3A), מבחן Mann-Whitney (איורים 2B ו-S3), ומבחן פרידמן (איור S2) שימשו להשוואה בין שתי קבוצות או קבוצות מרובות. p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. המתאם בין שתי הקבוצות נקבע על ידי מבחן הדרגה של Spearman (איור 2D). רגרסיה לא ליניארית מנורמלת בוצעה באמצעות תוכנת GraphPad Prism (Sigmoidal 4PL). הנתונים מוצגים כחציון ± IQR. כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים בין קבוצות, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, ns-לא משמעותי.
5. מסקנות
לסיכום, המחקר שלנו הוא הראשון לחקור לעומק את הספציפיות של האפיטופ ותת-סיווג ה-IgG של נוגדנים המושרים על ידי Gam-COVID-Vac ולחשוף מנגנונים שונים של נטרול נגיפים המושרה על ידי Gam-COVID-Vac על ידי נוגדנים. בפרט, השגנו ראיות לכך שנוגדנים המכוונים לפפטיד (כלומר, פפטיד 12) הממוקם קרוב אך מחוץ ל-RBD בחלק ה-N-טרמינלי של S1 קשורים לנטרול וירוסים. הפעילות הפוטנציאלית לנטרול וירוסים של נוגדנים ספציפיים לפפטיד 12- עשויה לנבוע מהיכולת שלהם להפריע למעבר של קונפורמציה לפני-לאחר-איחוי של חלבון הספייק. אנו מציעים לשקול את הכללת האזור המוגדר על ידי פפטיד 12 בצורה אימונוגנית בחיסונים כדי לגרום לנוגדנים נגד אזור אפיטופ זה ולבדוק נוגדנים המושרים על ידי חיסונים כאלה לנטרול וירוסים. במקרה שניתן לשפר את נטרול הנגיפים של חיסונים, הכללת אפיטופים של פפטיד אימונוגני 12 עשויה לשפר את היעילות של חיסוני COVID-19. בנוסף, אפשר לשקול לפתח נוגדנים נגד הפפטיד 12-האפיטופ המוגדר עבור חיסון פסיבי. מכיוון שהאפיטופ המוגדר של הפפטיד 12-שמר בגרסאות ה-SARS-CoV-2 המוכרות כיום, חיסונים ונוגדנים המכוונים לפפטיד 12 עשויים להגן על הצד נגד גרסאות SARS-CoV-2. לפיכך, אנו מספקים ידע חדש שעשוי להועיל לפיתוח אסטרטגיות חיסון אקטיביות ופסיביות חדשות ל-COVID-19.
הפניות
1. רודריגז-קוירה, ג'יי; Sokolowska, M. SARS-CoV-2 חיסונים מועמדים - הרכב, מנגנוני פעולה ושלבי התפתחות קלינית. אלרגיה 2021, 76, 1922–1924. [CrossRef] [PubMed]
2. שארמה, א.; אחמד, FI; Lal, SK COVID-19: סקירה על האבולוציה, העברה, זיהוי, בקרה ומניעה של מחלת הקורונה. וירוסים 2021, 13, 202. [CrossRef] [PubMed]
3. ארשד, ב.; איקבל, ט.; Bhatti, KP סקירת-תובנות לגבי אסטרטגיות טיפוליות מחוץ לתווית נגד זיהום קל וחמור ב-COVID-19. פאק. ג'יי פארם. Sci. 2021, 34, 1469–1484. [CrossRef] [PubMed]
4. זמאן, ו.; סקיב, ש; Ullah, F. COVID-19: גישות פילוגנטיות עשויות לסייע במציאת משאבים לריפוי טבעי. פיטוטר. מילון 2020, 34, 2783–2785. [CrossRef]
5. רוביו-קסיאס, א.; Redwan, EM; Uversky, VN SARS-CoV-2 ארסיות לסירוגין כתוצאה מבחירה טבעית. COVID 2022, 2, 1089–1101. [CrossRef]
6. לוגונוב, DY; דולז'יקובה, IV; Zubkova, OV בטיחות ואימונוגניות של חיסון הטרולוגי הטרולוגי prime-boost COVID-19 מבוסס וקטור rAd26 ו-rAd5 בשתי ניסוחים: שני מחקרים פתוחים, לא אקראיים שלב 1/2 מרוסיה. Lancet 2020, 396, 887–897, Correction in Lancet 2021, 397, 98. [CrossRef]
7. Folegatti, ראש הממשלה; Ewer, KJ; Aley, PK בטיחות ואימונוגניות של חיסון ChAdOx1 nCoV-19 נגד SARS-CoV-2: דוח ראשוני של ניסוי מבוקר אקראי, שלב 1/2, חד-סמיות. Lancet 2020, 396, 467–478, Correction in Lancet 2020, 396, 1884. [CrossRef]
8. לוגונוב, DY; דולז'יקובה, IV; Shcheblyakov, DV בטיחות ויעילות של חיסון הטרולוגי הטרולוגי prime-boost COVID-19 מבוסס וקטור rAd26 ו-rAd5: ניתוח ביניים של ניסוי אקראי מבוקר שלב 3 ברוסיה. Lancet 2021, 397, 671–681, Correction in Lancet 2021, 397, 670. [CrossRef]
9. ג'קסון, CB; פרזן, מ.; חן, ב.; Choe, H. מנגנוני כניסת SARS-CoV-2 לתאים. נאט. כומר מול. Cell Biol. 2022, 23, 3–20. [CrossRef]
10. היינץ, FX; Stiasny, K. מאפיינים בולטים של חיסוני COVID-19 נוכחיים: ידועים ולא ידועים של הצגת אנטיגן ואופני פעולה. NPJ Vaccines 2021, 6, 104. [CrossRef]
11. לים, HX; מסומיאן, מ.; חאליד, ק.; קומאר, AU; מקארי, הרשות הפלסטינית; Poh, CL זיהוי של אפיטופים של תאי B ליצירת נוגדנים מנטרלים נגד חלבון הספיקים SARS-CoV-2 באמצעות ביואינפורמטיקה ומיקוד נוגדנים חד-שבטיים. Int. י.מול. Sci. 2022, 23, 4341. [CrossRef]
12. מורוי, ג.; Tuffery, P. Peptide-Based Strategies Against SARS-CoV-2 Attack: An Updated In Silico Perspective. חֲזִית. תְרוּפָה. Discov. 2022, 2, 899477. [CrossRef]
13. גאטינגר, פ.; Niespodziana, K.; Stiasny, K. Neutralization of SARS-CoV-2 מצריך נוגדנים נגד אפיטופים של תחום מחייב קולטן קונפורמטיבי. אלרגיה 2022, 77, 230–242. [CrossRef]
14. ניו, ל.; Wittrock, KN; Clabaugh, GC A Structural Landscape of Neutralizing Antibodies Against SARS-CoV-2 Receptor Binding Domain. חֲזִית. אימונול. 2021, 12, 647934. [CrossRef]
15. שאן, ש.; מוק, סי.קיי; Zhang, S. נוגדן מנטרל אנושי חזק ומגן נגד וריאנטים של SARS-CoV-2. חֲזִית. אימונול. 2021, 12, 766821. [CrossRef]
16. Bajpai, P.; סינג, ו.; Chandele, A. נטרול נרחב של נוגדנים ל-SARS-CoV-2 מספקים תובנות חדשות לגבי הנטרול של גרסאות וקורונה אנושית אחרת. חֲזִית. תָא. לְהַדבִּיק. מיקרוביול. 2022, 12, 928279. [CrossRef]
17. וישוואכרמה, פ.; ידב, נ.; Rizvi, ZA Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Spike מבוסס חלבון אפיטופים חדשניים מעוררים תגובות חיסוניות חזקות in vivo ומעכבים שכפול ויראלי במבחנה. חֲזִית. אימונול. 2021, 12, 613045. [CrossRef]
18. גארט, ME; Galloway, JG; Wolf, C. אפיון מקיף של תגובות הנוגדנים לחלבון SARS-CoV-2 Spike מוצא אפיטופים נוספים הנגרמות על ידי חיסון מעבר לאלו של זיהום קל. eLife 2022, 11, e73490. [CrossRef]
19. פנג, מ.; דו, X.; Zhang, X. אפיטופים אנטיגנים מגנים שנחשפו על ידי חתימות אימונו לאחר שלוש מנות של חיסון SARS-CoV-2 מושבת. חֲזִית. אימונול. 2022, 13, 938378. [Cross Ref]
20. Polvere, I.; פארלה, א.; Zerillo, L. גיוון בתגובה חיסונית הומורלית לחיסוני COVID-19 שונים: השלכות על מדיניות ה"Green Pass". חֲזִית. אימונול. 2022, 13, 833085. [CrossRef]
21. תובתולין, א"י; דולז'יקובה, IV; Shcheblyakov, DV ניסוי פתוח, לא אקראי, שלב 1/2 על הבטיחות, הסבילות והאימונוגניות של חיסון במינון יחיד "Sputnik Light" למניעת הידבקות בקורונה במבוגרים בריאים. Lancet Reg. בריאות יורו. 2021, 11, 100241. [CrossRef] [PubMed]
22. גונזלס, ש.; אולשביצקי, ש.; Salazar, M. יעילות המרכיב הראשון של Gam-COVID-Vac (Sputnik V) על הפחתת SARS-CoV-2 זיהומים, אשפוזים ותמותה במטופלים בגילאי 60-79: מחקר עוקבה רטרוספקטיבי בארגנטינה. EClinicalMedicine 2021, 40, 101126. [CrossRef] [PubMed]
23. גושצ'ין, VA; דולז'יקובה, IV; Shchetinin, AM Neutralizing Activity of Sera מ-Sputnik V-vaccinated People against Variants of Concern (VOC: B.1.1.7, B.1.351, P.1, B.1.617.2, B.1.617.3) ו- Moscow Endemic SARS -CoV-2 גרסאות. Vaccines 2021, 9, 779. [CrossRef] [PubMed]
24. ווקו, ז.; נשיקה, ז; Surjan, G. יעילות ארצית של חמישה חיסוני SARS-CoV-2 בהונגריה - מחקר HUN-VE. קלינ. מיקרוביול. לְהַדבִּיק. 2022, 28, 398–404. [CrossRef] [PubMed]
25. ג'יוואנדרה, ג'; פרננדו, ש.; Pushpakumara, PD תגובות חיסון לאחר המנה הראשונה של Sputnik V (Gam-COVID-Vac). Sci. Rep. 2022, 12, 1727. [Cross Ref]
26. Ikegame, S.; Siddiquey, MNA; נתלה, CT פעילות מנטרלת של סרת חיסון Sputnik V נגד גרסאות SARS-CoV-2. נאט. Commun. 2021, 12, 4598. [CrossRef]
27. גושצ'ין, VA; ציגנובה, EV; Ogarkova, DA Sputnik V הגנה מפני COVID-19 באנשים החיים עם HIV בטיפול אנטי-רטרו-ויראלי. EClinicalMedicine 2022, 46, 101360. [CrossRef]
28. שמג'י, מ"ה; ולנטה, ר.; Jardetzky, T. תפקידם של IgE, IgG ו-IgA ספציפיים לאלרגן במחלה אלרגית. אלרגיה 2021, 76, 3627–3641. [CrossRef]
29. אקל-דורנה, י. וובר, מ.; Stanek, V. שנתיים של טיפול עם החיסון הרקומביננטי לאלרגיה לאבקת דשא BM32 גורם לתגובת IgG4 הספציפית לאלרגן הגדלה באופן מתמשך. EBioMedicine 2019, 50, 421–432. [CrossRef]
30. שמג'י, מ"ה; קאפן, JH; Akdis, M. Biomarkers לניטור היעילות הקלינית של אימונותרפיה אלרגנית עבור דלקת רינו-לחמית אלרגית ואסטמה אלרגית: נייר עמדה של EAACI. אלרגיה 2017, 72, 1156–1173. [CrossRef]
31. Tortorici, MA; בלטרמלו, מ.; Lempp, FA נוגדנים אנושיים אולטרה-פוטנטיים מגנים מפני אתגר SARS-CoV-2 באמצעות מנגנונים מרובים. מדע 2020, 370, 950–957. [CrossRef]
32. Cia, G.; פוצ'י, פ.; Rooman, M. ניתוח של הפעילות המנטרלת של נוגדנים המכוונים לקונפורמציות של חלבון SARS-CoV-2 פתוחות או סגורות. Int. י.מול. Sci. 2022, 23, 2078. [CrossRef]
33. מנג, ב.; דאתיר, ר; Choi, J. SARS-CoV-2 דומיין N-terminal ספייק מווסת TMPRSS2-תלויה של כניסה ויראלית ופיוזגניות. Cell Rep. 2022, 40, 111220. [CrossRef]
34. רש, י.; וגהופר, מ.; Seiberler, S. אפיון מולקולרי של Der p 10: סמן דיאגנוסטי לרגישות רחבה באלרגיה לקרדית אבק הבית. קלינ. Exp. אלרגיה 2011, 41, 1468–1477. [CrossRef]
35. ביזרובה, מ.; יוסובלייבה, ג'; Spiridonova, A. דפוס של מחזור SARS-CoV-2-ספציפי להפרשת נוגדנים ויצירת תאי B בזיכרון בחולים עם COVID חריף-19. קלינ. תרגום אימונול. 2021, 10, e1245. [CrossRef]
36. גאטינגר, פ.; בורוכובה, ק.; Dorofeeva, Y. נוגדנים בסרום של חולים בהחלמה בעקבות COVID קלה-19 לא תמיד מונעים קישור לקולטן לווירוס. אלרגיה 2021, 76, 878–883. [CrossRef]
37. גאטינגר, פ.; Tulaeva, I.; Borochova, K. Omicron: גרסה של SARS-CoV-2 של דאגה אמיתית. אלרגיה 2022, 77, 1616–1620. [CrossRef]
38. גאטינגר, פ.; Ohradanova-Repic, A.; Valenta, R. חשיבות, יישומים ותכונות של מבחני מדידת SARS-CoV-2 נטרול נוגדנים. Int. י.מול. Sci. 2023, 24, 5352. [CrossRef]
39. גאטינגר, פ.; קרצר, ב.; Tulaeva, I.; Niespodziana, K.; Ohradanova-Repic, A.; גבצברגר, ל. בורוכובה, ק.; גארנר-שפיצר, ע.; טראפין, ד; חופר, ג.; et al. חיסון המבוסס על חלבון היתוך של דומיין מקופל לרצפטור עם פוטנציאל לגרום לחסינות עיקור לגרסאות SARS-CoV-2. אלרגיה 2022, 77, 2431–2445. [CrossRef]