גילוי וזיהוי של מרכיבים פעילים פוטנציאליים אנטי-מלנוגניים של Bletilla Striata

ali.ma@wecistanche.com

Yiyuan Luo1, Juan Wang1, Shuo Li1, Yue Wu1, Zhirui Wang1, Shaojun Chen1 ו-Hongjiang Chen1,2*

תַקצִיר

רקע כללי:Bletilla striata היא התרופה העיקרית של פורמולות קלאסיות רבות להלבנת עור ברפואה הסינית המסורתית (TCM) והיא נמצאת בשימוש נרחב בתעשיית הקוסמטיקה לאחרונה. עם זאת, החומרים הפעילים שלו עדיין לא ברורים והשורשים הסיביים שלו אינם בשימוש יעיל. מטרת המחקר הנוכחי היא לגלות ולזהות את המרכיבים הפעילים האנטי-מלנוגניים הפוטנציאליים שלו על ידי מודל דג הזברה ועגינה מולקולרית.

שיטות:הנוגד חמצוןהפעילויות הוערכו על ידי 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) פעילות סילוק רדיקלים, 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) ) פעילות ניקוי רדיקלית והפחתת ברזלנוגד חמצוןמבחן כוח (FRAP). הפעילות האנטי-מלנוגנית הוערכה על ידיטירוזינאזמעכבפעילותמעכבי מלנין במבחנה בדג הזברה. הפרופילים הכימיים בוצעו על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בשילוב עם ספקטרומטריית מסה טנדם קוודרופולית בזמן טיסה (UPLC-Q-TOF-MS/MS). בינתיים, המרכיבים הפעילים האנטי-מלנוגניים הפוטנציאליים זוהו זמנית על ידי עגינה מולקולרית.

תוצאות:תמצית האתנול של 95 אחוזים של שורשי סיבי B. striata (EFB) החזיקה בפעילות מעכבת DPPH, ABTS, FRAP ו-tyrosinase החזקות ביותר, עם IC50 5.94 mg/L, 11.69 mg/L, 6.92 mmol FeSO4/g, ו-58.92 מ"ג/ליטר, בהתאמה. בנוסף, EFB ותמצית אתנול של 95 אחוזים של פקעת B. striata (ETB) הפחיתו משמעותית את סינתזת המלנין של דגי זברה באופן תלוי מינון. 39 קומפוזיציות כימיות, כולל 24 סטילבנואידים זוהו באופן טנטטיבי מ-EFB ו-ETB. עגינה מולקולרית הצביעה על כך שהיו 83 (כולל 60 סטילבנואידים) ו-85 (כולל 70 סטילבנואידים) תרכובות שהפגינו זיקות קשירה חזקה יותר כלפי טירוזינאז ואדנילט ציקלאז.

סיכום:הממצאים הנוכחיים תמכו ברציונל לשימוש ב-EFB ו-ETB כחומרים טבעיים להלבנת עור בתעשיות התרופות והקוסמטיקה.

מילות מפתח: Bletilla striata, נוגד חמצון, פעילות אנטי-מלנוגנית, UPLC-Q-TOF-MS/MS, דג זברה, עגינה מולקולרית

לחץ כדי לראות תופעות לוואי ויתרונות עבור נוגד חמצון

רקע כללי

Bletilla striata (Thunb.) Reichb. ו. הוא צמח רב שנתי עשבוני המופץ באופן נרחב באסיה, כמו סין, קוריאה ויפן [1]. הפקעת המיובשת של B. striata, הידועה גם בשם Baiji, מתועדת לראשונה ב-Shennong Classic of Materia Medica, נמצאת בשימוש נרחב כרפואה סינית מסורתית (TCM) במשך אלפי שנים בסין. פרמקופיות סיניות קובעות כי יש לה יכולת עפיצות לאחר דימום וכאבי כאבים, ולכן נעשה בו שימוש נרחב לטיפול בהמטמזיס, המופטיזיס, דימום טראומטי, כיבים, נפיחות ועור סדוק [2, 3]. מחקרים פרמקולוגיים הוכיחו כי ל-B. striata קשת רחבה של פעילויות ביולוגיות, כגון ריפוי פצעים [4, 5], אנטי-אולקוס [6, 7], המוסטטי [8],אַנְטִי-דַלֶקֶת[9], נוגד חמצון[10], אנטיבקטריאלי [11], ויראלי אנטי שפעת [12], ואנטי-הזדקנות [13]. במקביל, B. striata מכיל סוגים שונים של הרכבים כימיים, כוללפוליסכרידים[14], בי-בנזילים, פננתרנים, אנתרקינונים,פלבנואידיםו-2-איזובוטימלטים [3, 15] וכו'.

B. striata היא התרופה העיקרית של פורמולות קלאסיות רבות להלבנת עור ב-TCM [16] והיא נמצאת בשימוש נרחב בתעשיית הקוסמטיקה לאחרונה [17]. עם זאת, החומרים הפעילים שלו עדיין לא ברורים ואפילו חלק מתוצאות המחקר היו מנוגדות. לדוגמה, תוצאות המחקר שניתנו על ידי Chenet al. הצביעו על כך של-95% תמצית אתנול של B. striata הייתה בעלת פעילות מעכבת טירוזינאז גבוהה יותר מאלה של תמצית המים שלה עם שיעור עיכוב של 68.36% במבחנה[18], בעוד שהתוצאה של Huang et al. הראה כי הפעילות המעכבת של תמצית מים B. striata על טירוזינאז הייתה חזקה יותר מזו של תמצית אתנול של 95 אחוז בשיעור עיכוב של 62 אחוז במבחנה [19]. תוצאות המחקר מאת Luetal.[20]ו-Linghuetal.[21]הוכיחו שגם מים וגם תמצית אתנול של 95 אחוזים של B. striata, במיוחד חלוקת הכלורופורם שלו, יכולים לעכב את צמיחת תאי B16 ולגרום לאפופטוזיס שלו באופן תלוי ריכוז.

מכיוון שהבדיקות במבחנה של עיכוב טירוזינאז וקווי מלנומה, לא כללו את התנאים הפיזיולוגיים המורכבים in vivo, ואת הספיגה, חילוף החומרים, ההפצה וההפרשה של דגימת הבדיקה, רבות מהדגימות הראו פעילות מעכבת משמעותית נגד תאי טירוזינאז ומלנומה ב עם זאת, במבחנה, הפגין יעיל חלש או אפילו לא יעיל in vivo [22,23]. הגלברידין הראה פעילות מעכבת טירוזינאז משמעותית עם IC50 0.43μmol/L, שהיה חזק פי 176 מזו של חומצה קוג'ית. עם זאת, זה היה השפעות לא מעכבות על הפיגמנטציה של דג הזברה in vivo [24].

בינתיים, שורשי B. striata fibrous (FB) היו תוצרי הלוואי שנוצרו במהלך העיבוד של B. striatatuber (TB). מחקרים מודרניים הצביעו על כך שה-FB מכיל תרכובות דומות עם שחפת ועם תכולה גבוהה יותר של פנולים [25]. בנוסף, הפעילויות האנטי-בקטריאליות [26], נוגדות החמצון והאנטי-טירוזינאז של תמצית FB היו חזקות יותר מאלו של תמצית שחפת [25]. עם זאת, המשאבים של FB לא נוצלו ביעילות וננטשו בשטח החקלאי, מה שהוביל לבזבוז של משאבי FB וזיהום סביבתי [27].

דג הזברה (Danio rerio), דג מים מתוקים טרופי קטן, הוא מודל חיה מתפתח לפרמקולוגיה

ומחקר טוקסיקולוגיה in vivo, עם יתרונות רבים, כולל עלות נמוכה, מחזור חיים קצר, שקיפות גבוהה, קלה לתחזוקה, פוריות גבוהה ודרוש פחות דגימות בדיקות [28, 29]. בנוסף, לדג הזברה יש פיגמנטים מלנין על פני השטח, המאפשרים תצפית פשוטה על תהליך הפיגמנטציה, והיה בשימוש נרחב במחקר האנטי-מלנוגני [28, 30].

במחקר הנוכחי, השווינו את הפעילויות מעכבות נוגדי החמצון והטירוזינאז של רכיבי פוליסאק גולמי ותמצית אתנול של TB ו-FB במבחנה, ופעילויות אנטי-מלנוגניות במודל של דג זברה. בינתיים, המרכיבים הפעילים האנטי-מלנוגניים הפוטנציאליים זוהו זמניים על ידי עגינה מולקולרית. גילינו שתמצית אתנול של 95 אחוז משחפת (ETB) ו-FB (EFB) היא בעלת פעילויות נוגדות חמצון ואנטי טירוזינאז באופן משמעותי, ויכולה להפחית את סינתזת המלנין של עוברי דג הזברה באופן תלוי מינון. לפיכך, ETB ו-EFB יכולים לשמש כחומרי הלבנת עור טבעיים בתעשיות התרופות והקוסמטיקה.

שיטות

כימיקלים וריאגנטים

טירוזינאז, 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-L-alanine(L-DOPA) ו-arbutin נרכשו מחברת Aladdin reagent (שנחאי, סין).2,2-diphenyl{{8 }}פיקרילהידראזיל (DPPH), 2,2'-אזינו-ביס-(3-אתיל-בנתיאזולין-6-חומצה סולפונית) (ABTS),6-הידרוקסי-2,5,7 ,8-tetramethylchroman-2-חומצה קרבוקסילית (טרולוקס) ו-2,4,6-tris (2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ) נרכשו מ-Sigma-Aldrich (סנט לואיס, MO, ארה"ב). אצטוניטריל ומתנול (דרגת HPLC) נרכשו מטדיה (פיירפילד, OH, ארה"ב). מים מפושטים הוכנו על ידי מערכת המים Milli-Q (18.2 MΩ, Millipore, ארה"ב).

הליך איסוף וחילוץ צמחים

B. striata נאסף מ-Quzhou YiNianTang חקלאות ויערנות טכנולוגיה Co., Ltd (Quzhou, Zhejiang, סין). דגימות שובר הופקדו ב-Herbarium של המכללה לתרופות ג'ג'יאנג (הצטרפות מס' 190615). כל הצמח היה מחולק לפקעות ולשורשים סיביים. לאחר מכן, הם נחתכו לחתיכות קטנות ויובשו על ידי ייבוש בהקפאה בוואקום, בהתאמה.

הדגימות המיובשות והאבקות (TB ו-FB) חולצו בריפלוקס עם 95 אחוז אתנול במשך שלוש פעמים (1.5 שעות לכל פעם). התמצית עברה סינון באמצעות נייר סינון What man (מס' 1). התסנין רוכז ליובש במאייד סיבובי (Hei-VAP, Heidolph, גרמניה) ב-50 מעלות ולאחר מכן יובש על ידי מייבש ואקום. מיצוי האתנול של שחפת (ETB) ו-FB (EFB) היו 5.21 ו-6.53 אחוזים, בהתאמה. השתמשו בשפכים כדי לחלץ את הפוליסכריד הגולמי על ידי פיזור במים של 80 מעלות למשך 4 שעות ומשקעים עם אתנול [31]. תשואות הפוליסכרידים של שחפת (PTB) ו-FB (PFB) היו 14.75 ו-6.45 אחוזים, בהתאמה.

תמצית cistanche

ניתוח כימי

הניתוח הכימי בוצע בכרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בשילוב עם ספקטרומטריית מסה טנדם טנדם קוודרופול (UPLC-Q-TOF-MS/MS). ההפרדה הכרומטוגרפית בוצעה על Waters Acquity UPLC tem (Waters Corp., Milford, MA, US) עם עמודת WatersBEH Shield RP C18 (100×2.1mm, 1.7μm) at3{ תואר {43}} . השלב הנייד הורכב מ-0.1 אחוז חומצה פורמיקה במים (A) ואצטוניטריל (B), עם שיפוע ליניארי: 0-3 דקות, 5-16 אחוז B; 3–8 דקות, 16–30 אחוז B; 8–10 דקות, 30–35 אחוז B; 10–15 דקות, 35–55 אחוז B; 15–18 דקות, 55–80 אחוז B; 18–19 דקות, 80–5 אחוז B; 19-20 דקות, 5 אחוזים B. קצב הזרימה היה 0.3 מ"ל/דקה, ונפח ההזרקה היה 2 μL.

ניסויי TOF-MS/MS בוצעו על ידי שימוש בספקטרומטריית מסה משולשת של AB SCEIX TOF 5600 (AB SCIEX, Foster City, קליפורניה, ארה"ב) מצוידת ביינון אנלקטרוספריי (ESI). גילוי הטרשת הנפוצה בוצע בשיטת יינון שלילי. הפרמטרים נקבעו כדלקמן: טמפרטורת מקור וטמפרטורת שחרור היו 100 מעלות ו-450 מעלות בהתאמה; קצב זרימת גז ההמסה היה 900 ליטר/שעה; מתח נימי היה 2kV; מתח החרוט היה 40 וולט; אנרגיית ההתנגשות הייתה 22 eV; והסריקה המלאה הייתה מ-100 עד 2000 דא.

מבחני נוגדי חמצון בוחנים את פעילות הניקוי הרדיקליים של DPPH

פעילות הסרת הרדיקלים של DPPH נקבעה בהתאם ל-Ali et al. עם שינויים קלים [32]. בקצרה, תמיסת דגימת בדיקה של 50 μL מעורבבה עם תמיסת אתנול 150 μLDPPH (0.2mM) בצלחות של 96-בארות ונשמרה בחושך למשך 30 דקות . הספיגה של התערובת ב-517 ננומטר (A1) הוערכה על ידי ספקטרופוטומטר של מיקרו-לוח (Thermo Fisher Scientific, אמריקה). התמיסה הריקה ללא דגימת בדיקה מעורבת עם תמיסת DPPHethanol נקבעה כקבוצה החיובית (A0). התמיסה הריקה ללא DPPH מעורבת עם תמונת הבדיקה נקבעה כקבוצה הריקה (A2). כל הניסויים בוצעו בשלושה עותקים. קצב הסרת הרדיקלים של DPPH חושב באמצעות הנוסחה הבאה:

קצב ניקוי רדיקלי DPPH ( אחוז ) {{0}} [A0-(A1-A2)]/A0 × 100 אחוז .

פעילות ניקוי רדיקלית של ABTS

יכולת ההסרה הרדיקלית של ABTS נמדדה באמצעות השיטה שתוארה על ידי Ali et al. [32]. בקצרה, תמיסה מימית של 7mMABST עורבבה עם 2.45mM אשלגן פרסולפט ביחס של 1:1 (v/v), ודגירה בטמפרטורת החדר בחושך למשך 16 שעות כדי לקבל את תמיסה המניות של ABST פלוס. תמיסת המניות דוללה במי מלח מאוחסנת פוספט (PBS) כדי להתאים את הספיגה של (0.72±0.2) ב-734nm. דגימות בדיקה של 20μL בריכוזים שונים עורבבו ביסודיות עם תמיסה של 180μL ABTS פלוס. התערובות התגובתיות נשמרו בחושך למשך 5 דקות ולאחר מכן מדדו את הספיגה (B1) ב-734 ננומטר. הספיגה של התערובות ללא דגימת בדיקה ו-ABST plus נקבעו כ-B ו-B, בהתאמה. כל הניסויים בוצעו בשלושה עותקים. שיעור סילוק הרדיקלים של ABTS חושב על פי הנוסחה הבאה:

שיעור ניקוי רדיקלי של ABTS ( אחוז ) {{0}} [B0-(B1-B2)]/B0 × 100 אחוז .

מבחן כוח נוגד חמצון מפחית ברזל (FRAP)

פעילות הפחתת הברזל הברזל נקבעה לפי הנהלים על ידי Kosakowska et al. [33]. 300mM אצטט חיץ, 10mM TPTZ (2,4,{5}}tris (2-pyridyl)-s-triazine) ו-20mM FeCl3 היו מעורבבים ב-(v/v/v) יחס של 10:1:1 להכנת מגיב העבודה. 100μL מכל תמיסה של דגימת בדיקה עורבבו עם מגיב עבודה של 100μL TPTZ, הודגרה ב-37 מעלות למשך 20 דקות והספיגה נקבעה ב-593 ננומטר. בינתיים, סדרה של תמיסות סטנדרטיות FeSO4 בטווחי ריכוז של 0-1000ug/mL שימשו להכנת עקומת הכיול. יכולת הפחתת הברזל חושבה בהיווצרות של קומפלקס כחול Fe2 בתוספת -TPTZ אינטנסיבי. התוצאות התבטאו כ-Fe2 בתוספת קיבולת נוגדת חמצון (ממול FeSO4/g של מיצוי).

פעילות מעכבת טירוזינאז

פעילויות מעכבות טירוזינאז נקבעו בשיטה ספקטרופוטומטרית תוך שימוש ב-L-DOPA כמצע [34]. בקצרה, תמיסות דגימה של 50μL בריכוזים שונים עורבבו עם 50 μL טירוזינאז (200 יחידות/מ"ל, מומס ב-pH 6.8 phosphate buffer}) במאגר {{7} צלחות ודגירה למשך 15 דקות ב-25 מעלות. התגובה התחילה לאחר מכן עם תוספת של L-DOPA (50 μL). לאחר דגירה של 30 דקות ב-25 מעלות, הספיגה ב-490 ננומטר (Aa) נקבעה באמצעות ספקטרופוטומטר שמיים מיקרו-פלטי (ThermoFisher Scientific, אמריקה). באופן דומה, הספיגה של בארות הדגימה ללא טירוזינאז (Ab) ובארות הביקורת עם אנזים אך ללא דגימה (Ab) זוהתה באותו זמן. הפעילות המעכבת טירוזינאז חושבה על ידי המשוואה להלן:

שיעור מעכב טירוזינאז ( אחוז )=[1− (Aa − Ab)/Ac] × 100 אחוז .

ה-IC50 חושב באמצעות משוואת GraphPad Prism כדלקמן:

Y=min plus (max - min)/1 plus 10(x−logIC50)×שיפוע גבעה

X מייצג את ריכוז המעכבים; Y ייצג את נתוני העיכוב ( אחוז ) יחד עם הערכים המינימליים (מינימום) והמקסימליים (מקסימום) שלהם; שיפוע הגבעה הוא גורם השיפוע.

Cistanche מעכב את פעילות טירוזינאז.

מעכב מלנין בדג הזברה

דג בר מסוג AB קו זברה (שסופק על ידי Hunter Bio-technology, Inc., Hangzhou, Provincie Zhejiang) אוחסנו במי דגים (0.2 אחוז מלח אוקיינוס ​​מיידי במים דה-יונים, pH 6.9-7.2, מוליכות 48{ {18}}–510 mS/cm, וקשיות 53.7–71.6mg/L CaCO3) בתקופת צילום של 14/10 שעות אור/חושך בטמפרטורה קבועה של 28±0.5 מעלות, והאכילו שרימפס מלח חיים פעמיים ביום. דגי הזברה הושגו מהשרצה טבעית ונאספו תוך 30 דקות. בדיקת דג הזברה הוסמכה על ידי האגודה להערכה והסמכה לטיפול בחיות מעבדה (AAALAC). המחקר הנוכחי אושר על ידי IACUC (הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים) ב- Hunter Biotechnology, Inc. ומספר האישור של IACUC היה 001458.

עוברים בשלב 6 שעות לאחר ההפריה (hpf) טופלו בכל תמצית בשישה ריכוזים (10, 30, 62.5,125, 250 ו-500 מ"ג/ליטר) במשך 72 שעות כדי להעריך את הריכוז המקסימלי שאינו קטלני (MNLC) ). כתוצאה מכך, ה-MNLCs של כל התמצית היו יותר מ-62.50 מ"ג/ליטר.10 עוברים הונחו בבאר 6- ונחשפו לדגימות מנוסחות בריכוזים של 10 ו-30 מ"ג/ליטר מ-6 hpf ל-54 hpf (חשיפה של 48 שעות). ). DMSO (0.05 אחוז, v/v) andarbutin (10 ו-30mg/L) שימשו כביקורת רגילה וחיובית, בהתאמה.

עוברים מסונכרנים נאספו ונצפו תחת סטריאומיקרוסקופ (SZX7, אולימפוס, יפן) מצויד במצלמה דיגיטלית (VertA1, סין). צבירת מלנין, בקורלציה ישירה לאזורי הפיגמנטציה של דג הזברה, חושבה באמצעות תוכנית המניפולציה של GNUImage (גירסת GIMP 2.10.2) והובאה כאחוז ביחס לבקרה השלילית (צבירת מלנין 100 אחוז) [28, 30].

מחקר עגינה מולקולרית

158 תרכובות שבודדו מ-B. striata בספרות[2], כולל 19 גליקוזידים, 28 בי-בנזילים, 19 פנון-תרנים, 18 ביפנתרנים, 23 דיהידרופאנתרנים, 5 אנתוציאנינים, 11 סטרואידים, 8 טריטרפנואידים, 5-12-חומצה, 5-12-חומצה. ו-10 תרכובות אחרות, שימשו בתור הליגנדים. המבנים התלת-ממדיים צוירו על ידי ChemBio3D ועברו אופטימיזציה באמצעות MM2 ו-Autodock Tools. מבנה הגביש התלת-ממדי של טירוזינאז (PDBID:5M8N) ו-adenylate cyclase (PDB ID:5IV3) אוחזרו מ-RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org/pdb/home/home.do). כל מולקולות המים ואטומי ההטרו הוסרו ממבני הגביש באמצעות כלי כימרה ו-MGL. לבסוף, Autodock

וינה שימשה לעגינה של החלבון הקולטן עם הליגנדים הקטנים של מולקולה. הפרמטרים של אתר העגינה של הרצפטור פרו-טאין נקבעו כ-36.700, 7.034, 19.104 ו-17.467, 22.807, 2.786, בהתאמה, לפי המימוזין הליגנד המקורי ו-LRE1 [35]. על מנת להשיג דיוק חישובי גבוה יותר, נוצרו 20 פרמטרים ממצים עבור כל קולטן, והקונפורמציה בעלת הזיקה הגבוהה ביותר נבחרה כקונפורמציה הסופי של העגינה והוצגה ב- Pymol2.3. בינתיים, הליגנדים המקוריים מימוזין ו-LRE1 נלקחו כביקורת חיובית [36].

תחזית ADMET בסיליקו

שלושת הלהיטים המובילים מ-B. striata היו בעלי זיקה קשירה טובה יותר ל-tyrosinase ו-adenylate cyclase, היו נתונים לניתוח ADMET. QikProp ב-Schrodingersuite שימש כדי לחשב את התכונות הפיזיקליות והמאפיינים הקשורים לתרופות, כולל משקל מולקולרי (MW), מקדם חלוקת אוקטנול/מים חזוי (QPlogPo/w), מסיסות מימית חזויה (QPlogS), תא Caco-2 חזוי. חדירות למחסום מעי-דם (QPPCaco), מקדם חלוקת מוח/דם חזוי (QPlogBB), חזיות של חדירות עור (QPlogKp), חזו IC50 לחסימת תעלות HERGK פלוס (QPlog HERG) וחזוי ספיגה דרך הפה של האדם. המאפיינים הוערכו בהתבסס על כלל החמישה של Lipin-ski וספרות [37, 38].

הדמיית דינמיקה מולקולרית

על מנת לבחון את היציבות והתנודות הדינמיות של קומפלקס הליגנד-חלבון בסביבה ביולוגית מדומה, ולאמת עוד יותר את תוצאות העגינה, התרכובות blestrin D (75) נבחרו כליגנד למחקר הדמיית דינמיקה מולקולרית (MD), בהתבסס על תוצאת עגינה מולקולרית. הקומפלקס של בלסטרין D עם טירוזינאז וציקלאס אדנילט בוצעו סימולציות MD והופעלו במשך 100ns, תוך שימוש במצב מים TIP3P. ערכי הסטייה הריבועית הממוצעת (RMSD) של אטומי עמוד השדרה של חלבון ביחס למבנה הראשוני חושבו כדי לבחון את יציבות החלבון במהלך תקופת הסימולציה [39].

תוצאות

תרכובת כימית

כרומטוגרמות כרומטוגרמת שיא הבסיס של ETB ו-EFB הוצגו באיור 1. תוכנת PeakView שימשה לזיהוי המרכיבים. הנוסחה המולקולרית הוקצתה במדויק בתוך שגיאת מסה של 10ppm. המשקל המולקולרי המדויק והפרגמנטים שימשו לזיהוי הרכיבים בהתאם לספרות ולבסיס הנתונים של המבנה הכימי החופשי, כגון ChemSpider ומאסבנק. כתוצאה מכך, 39 קומפוזיציות כימיות, כולל 24 סטילבנואידים (ביבנזילים, פנותרנים ונגזרותיהם), 6 גליקוזידים, 4 חומצות פנוליות, 3 כינונים, 1 סטרואיד ועוד תרכובת אחת זוהו בהיסוס מ-EFB ו-ETB. במקביל, הכימות למחצה היחסי שלהם בוצע על ידי מדידת שטחי שיא של כל תרכובת במצב MS תוך שימוש בכרומטוגרמות היונים המופקות [40]. המידע המפורט של הזיהוי והתכולה היחסית שלהם (הדגשות מפת חום, ככל שהצבע כהה יותר, כך גבוה יותר ריכוז) סוכמו בטבלה 1.

יכולת נוגדת חמצון

ידוע היטב כי הקרנת אולטרה סגול A (UVA) יכולה לגרום לייצור מיני חמצן תגובתיים (ROS) ולתווך מלנוגנזה מוגזמת בתאי העור. פוליפנול טבעי היה המעכב של יצירת ROS ויכול להיות אחראי לפעילות האנטי-מלנוגנית של תמציות צמחים [41] , 42]. לפיכך, במחקר הנוכחי, קיבולת נוגדי החמצון הוערכה באמצעות DPPH, פעילות סילוק רדיקלים של ABTS ו-FRAPassay. התוצאות (טבלה 2 ואיור 2) הראו כי ל-EFB (IC50=5.94mg/L) יש את הפעילות DPPH-radical scavenging החזקה ביותר במבחנה בהשוואה ל-PTB(IC50=548.24 mg/L) , PFB (IC50=285.81 mg/L), ו-ETB(IC50=65.25mg/L). מגמה דומה נצפתה במבחן ABTS ו-FRAP. לתמציות האתנוליות של 95% של שחפת ו-PB הייתה פעילות נוגדת חמצון חזקה יותר במבחנה מאשר לפוליסכרידים הגולמיים שלהם. בנוסף, EFB מפגין פעילות נוגדת חמצון חזקה יותר מ-ETB, מה שהיה עקבי עם תוצאות המחקר הקודמות [25].

פעילות מעכבת טירוזינאז

טירוזינאז היה האנזים המגביל את קצב המפתח במסלול הביוסינתזה של מלנין והיה בשימוש נרחב לזיהוי הפוטנציאל של מוצרים טבעיים עם אפקט אנטי-מלנוגנזה [43]. התוצאות (איור 3) הראו כי ל-ETB ול-EPB הייתה פעילות מעכבת טירוזינאז חזקה יותר מ-PTB ו-PPB במבחנה, מה שהיה עקבי עם תוצאות מחקר קודמות [25]. EFB הפגין פעילות עיכוב טירוזינאזין חזקה יותר באופן תלוי מינון (בין 20 ל-200 מ"ג/ליטר) עם IC50=58.92mg/L מאשר ETB(IC50=75.44mg/L) והתרכובת החיובית arbutin(IC{ {11}}.02 מ"ג/ליטר).

מעכב מלנין בדג הזברה

Zebrafish are recognized as a highly advantageous vertebrate model system to evaluate anti-melanogenesis activity, as it possesses similar organ systems and gene sequences to human beings [28]. Therefore, zebrafish was used to evaluate the anti-melanogenesis activity. As shown in Fig. 4, a large number of melanin (black spots) deposited in the zebrafish embryo in the control and 0.05% DMSO group. The microscopy images showed there was no significant difference in total melanin content between two groups (p>{{0}}.05), המציין ש-0.05 אחוז DMSO של הרכב לא השפיע על ייצור המלנין בעוברי דג הזברה. עם זאת, לאחר חשיפה לדגימות שנבדקו ולארבוטין במשך 48 שעות, עוברי דג הזברה הראו דרגות שונות של שקיעת מלנין (איורים 3B,4), למעט קבוצת PFB 10 מ"ג/ליטר. ניתן להבחין כי תכולת המלנין היחסית בקבוצות ETB 10mg/L (78.38 אחוז) ו-30 mg/L (64.72 אחוז) הייתה נמוכה משמעותית מזו שבקבוצות PTB 10mg/L (93.06 אחוז) ו-30mg/L (82.02 אחוז) (p<0.01). it="" demonstrated="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activity="" of="" etb="" was="" superior="" to="" that="" of="" ptb,="" which="" was="" consistent="" with="" the="" tyrosinase="" inhibitory="" activity.="" whereafter,="" it="" is="" noteworthy="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activities="" of="" etb="" (81.65,="" 75.61%)="" and="" efb="" (78.38,="" 64.72%)="" were="" stronger="" than="" that="" of="" arbutin="" (93.57,="" 81.48%)="" at="" the="" same="" dose="" of="" 10="" mg/l="" and="" 30="" mg/l="" (p="" <="" 0.01="" or="">

עגינה מולקולרית

טירוזינאז הוא האנזים המגביל את הקצב בביו-סינתזה של מלנין: הידרוקסילציה של טירוזין ל-3,4-דיהידרוקסי-פנילאלנין (DOPA), וחמצון של DOPA todopaquinone. לכן, טירוזינאז נחשב ליעד קריטי לפיתוח מעכבי מלנוגנזה [44]. בנוסף, אדנילטציקלאז הוא אנזים מפתח של מלנוגנזה המושרה על ידי cAMP. הקישור של מלנוטרופין אלפא פוליפפטיד (-MSH) לקולטני MC1R גרמה להפעלת ה-adenylate cyclase, עלייה ברמת cAMP, ביטוי מוגברת של הגן טירוזינאז, ולאחר מכן הגבירה את סינתזת המלנין [45]. לכן, ביצענו מחקר עגינה מולקולרית של 158 התרכובות שבודדו מ-B. striata בעבר [2], withtyrosinase ו-adenylate cyclase. אנרגיות הקישור של הליגנדים שנחקרו עם טירוזינאז ואדנילטציקלאז סוכמו בטבלה S1. היו 83 (כולל 60 סטילבנואידים) ו-85 (כולל 70 סטילבנואידים) תרכובות שהפגינו זיקה חזקה יותר לטירוזינאז ואדנילאט ציקלאז, בהשוואה לאלו של הליגנדים המקוריים מימוזין (- 6.4 קק"ל/מול) ו-LRE 8.51 ק"ל/מול. /מול). 1,8-bis(p-hydroxybenzyl)-4-methoxyphenanthrene-2,7-diol (56), בלסטרין D (75), ו-2,7-דיהידרוקסי -1,6-bis(p-hydroxybenzyl)-4-meth-oxy-9,10-dihydrophenanthrene (93) היו שלושת הליגנדים המובילים לכיוון טירוזינאז, עם אנרגיית קשירה -10.2, 10.0 ו-9.7 קק"ל/מול, בהתאמה. בעוד בלסטרין D(75), בלסטרין B (73) ו-3,3'-דיהידרוקסי-5-מתוקסי-2,5',6-טריס(p-הידרוקסיבנזיל) בי-בנזיל (42) היו שלושת הליגנדים המובילים לכיוון אדנילט ציקלאז, עם אנרגיית חיבור - 12.1, - 11.9 ו- 11.6 קק"ל/מול, בהתאמה. זיקות הקישור התיאורטית שלהם ואינטראקציות ליגנד-חומצות אמינו סוכמו בטבלה 3.

ראוי לציין כי בלסטרין D (75), תרכובת ביפננתרן, נכנסה לכיס הקישור של טירוזינאז ואדנילט ציקלאז (איור 5), והציגה זיקות קשירה מובהקות כלפי טירוזינאז וגם לציקלאז אדנילט. האינטראקציות של ואן דר וולס תורמות לערך האינטראקציה הכוללת של האנרגיה, בינתיים קבוצת הידרוקסיל מייצרת קשרי מימן עם שאריות חומצות אמינו Glu 451, Arg114 של טירוזינאז ו-Val 167 של adenylate cyclase, בהתאמה (טבלה 3 ואיור S1). תרכובת 93 הראתה גם זיקה משמעותית של קישוריות. לכיוון טירוזינאז באמצעות יצירת 6 קשרי מימן עם שיירי חומצות אמינו Glu232, Glu451, Ser106,Cys113, Lys223 ו-Gln236.

תחזית ADMET בסיליקו

הערכים החזויים של מספר פרמטרים חשובים יחד עם הטווח המקובל שלהם סוכמו בטבלה 4. מלבד ה-QPlogS של 3,3′,5-trimethoxybibenzyl, blestrin B ו-blestrin D, ו-QPlogBBof 3,3′,{{6} }trimethoxybibenzyl, כל שאר המאפיינים המחושבים של ADMET של שלושת הלהיטים המובילים היו בטווחים הצפויים, בינתיים, ה-QPlog HERG של כל שלושת הלהיטים המובילים היה פחות מ-5, מה שמצביע על פוטנציאל סמים לשימוש אנושי. ה-QPlog Kp של שלושת הלהיטים המובילים הן עבור טירוזינאז והן עבור אדנילטציקלאז, למעט 3,3′,5-trimethoxybibenzyl, היו בטווח הטוב, מה שמצביע על כך שהתרכובות הללו יכולות לחדור בקלות לתוך העור.

סימולציה דינמית מולקולרית

עלילת ה-RMSD הראתה שערכי ה-RMSD של קומפלקס החלבון-ליגנד לא השתנו באופן משמעותי לאורך כל תקופת הסימולציה. ערכי ה-RMSD (איור 6A) של בלסטרין D עם טירוזינאז וקומפלקס אד-נילאט ציקלאז נקבעו בטווח שבין 1.5 ל-2.8Å ובין 2.0 ל-3.6Å, בהתאמה. ערך TheRMSF המשקף את הגמישות של כל סימולציית המשך. השאריות עם ערכי RMSF גבוהים יותר גילו שהם היו גמישים יותר (איור 6B). נמצא כי ערכי RMSF של שאריות חומצות האמינו באזורי הלולאה משתנות מאוד. בעוד, שאריות האתר הפעילים שמרו על ערך RMSF קטן (פחות מ-1.0Å), כגון Arg114, Val167, Tyr226, Leu229 ו- Arg230in tyrosinase, ו-Val167, Leu102, Phe45, Lys95 ו-Leu166 ב-, מה שמציין כי כיסי הקשירה נשמרו יציבים. האינטראקציות המולקולריות של בלסטרין D עם טירוזינאז וציקלאז אדנילט הוצגו באיור 7.

האנרגיות החופשיות המחייבות חושבו על ידי שיטת שטח פנים נולד (MM-GBSA) המוכללת במכניקה מולקולרית [39]. אנרגיית הקישור החופשית החזויה של בלסטרין D עם טירוזינאז ואדנילטציקלאז הייתה -96.94 קק"ל/מול ו-139.69 קק"ל/מול, בהתאמה, מה שמרמז על אינטראקציות הקישור היו ספונטניות (טבלה 5). יתר על כן, התרומות שהעדיפו את קשירת הליגנד היו אינטראקציה של פתרון לא קוטבי, ואן דר וואלס ואינטראקציה אלקטרוסטטית.

ראוי לציין שהסוגים והתכולה של הרכיבים הכימיים ב-EFB היו יותר מאשר ב-ETB. שטחי השיא של כל התרכובות שזוהו בEFB היו פי שניים בערך מזה של ETB. Mili-tarine הייתה התרכובות הנפוצות ביותר הן ב-EFB והן ב-ETB, שהחזיקו בפעילות נוגדת חמצון, אנטי דלקתית והגנה עצבית משמעותית, ונבחרה כסמנים כימיים לבקרת האיכות של B. striata במהדורת Pharmacopoeia2020 הסינית [46]. שטח השיא היחסי של מיליטרין ב-EFB (38.39×106) היה מעט גבוה מזה ב-ETB (30.48×106). גסטרודין הוא תרכובת ידועה ברבות מצמחי מרפא סיניים, כגון Gastrodia elata, אשר מציגה השפעות משמעותיות של מעכבי טירוזינאז וסילוק רדיקלים [30]. שטח השיא היחסי של גסטרודין ב-EFB (1.43×106) היה מעט נמוך מזה של inETB (2.17×106).

לתמציות האתנוליות של 95% של שחפת ו-PB הייתה פעילות נוגדת חמצון חזקה יותר במבחנה מאשר לפולי-סאק-כרידים הגולמיים שלהם. בנוסף, EFB מפגין פעילות נוגדת חמצון חזקה יותר מ-ETB, אשר היה עקבי עם תוצאות המחקר הקודמים [25]. ניתן לייחס תופעה זו לכך שה-EFB מכיל רמות גבוהות יותר של תרכובות נוגדי חמצון, כגון מיליטרין וסטלבנואידים (פוליפנולים טבעיים). לדוגמה, שטח השיא היחסי של 4,8,4',8'-tetramethoxy-[1,1'-biphenanthrene]-2,7,2',7'-tetrol, ביפנתרן עם ארבע קבוצות הידרוקסיל פנוליות, היה 9.15×106 ב-FB, בעוד שהוא היה 0.01×106 inTB.

במחקר הנוכחי, PPB ו-PTB הראו פעילות קלה של עיכוב טירוזינאז באופן תלוי מינון. עם זאת, הוא הוכיח שלא זוהתה פעילות בתמצית המימית של PB (מכיל PPB) [25]. ייתכן שתופעה זו נובעת מהכנת הדגימה השונה. התמצית המימית של PB שימשה להערכת פעילות מעכבת טירוזינאז בניסוי של Jiang [25], בעוד שבמחקר הנוכחי, תמצית מימית הייתה משקעים עם אתנול להשגת הפוליסכריד הגולמי.

לאחרונה, מודל דג הזברה בשימוש נרחב בהערכת אפקט אנטי-מלנוגנזה in vivo [47, 48]. ארבו-טין, תרכובת הידרוקינון גלוקוזיד הקיימת במפעלים שונים, אשר שימשה מסחרית בתעשיית הקוסמטיקה, הוגדרה כביקורת חיובית. הפעילויות האנטי-מלנוגנזה של ETB ו-EFB היו חזקות מזו של ארבוטין, מה שמצביע על כך שניתן ליישם ETB ו-EFB כחומרים להבהרת עור בתעשיית הקוסמטיקה.

שטח השיא היחסי של בלסטרין D ב-EFB(1.91 × 106), הוא בערך פי ארבעה מזה ב-ETB(0.46 × 10). שטח השיא היחסי של מתחם 56 (8.73 × 106) ו-93 (0.64 × 106) ב-EFB הוא גם גבוה משמעותית מזה ב-ETB (פחות מ-0.01×106 ו-0.10 × 106). זו עשויה להיות אחת הסיבות לכך ש-EFB מציגה השפעות אנטי-מלנוגניות חזקות יותר מ-ETB. מעניין לציין ששלושת הליגנדים המובילים כלפי טירוזינאז ואדנילט ציקלאז שייכים כולם לסטילבנואידים (ביבנזילים, פנותרנים ונגזרתם). סטילבנואידים הם הפוליפנולים הטבעיים של הצמח, אשר משך עניין רב בשנים האחרונות בגלל הפעילות הביולוגית המדהימה שלהם כגון פעילות אנטי דלקתית, אנטי מיקרוביאלית ונוגדת חמצון [49]. רזברטרול הוא הסטילבנואיד הנפוץ ביותר. המחקר הקודם הצביע על כך שרזברטרול ונגזרותיו יכולים לעכב באופן משמעותי את הפעילות הקטליטית, את ביטוי הגנים ואת השינויים שלאחר התרגום של טירוזינאז. לפיכך, הם הראו שימושי פוטנציאלי כסוכנים להבהרת עור ואנטי-הזדקנות בקוסמטיקה [41, 50].

Cistanche הראה שימושי פוטנציאלי כחומרי הבהרת העור ותרופות נגד הזדקנות בקוסמטיקה.

למידע נוסף, אנא לחץ על התמונה.

מסקנות

במחקר זה, הפעילות נוגדת החמצון והאנטי-מלנוגניות של הפוליסכריד הגולמי משורשי B. striatatuber (PTB) ושורשי סיבי (FPB), ותמצית אתנול של 95 אחוזים של B. striata tuber (ETB) ושורשים סיביים (EFB) נחקרו באופן שיטתי. . התוצאות הראו כי ל-EFB יש את הפעילות החזקה ביותר של DPPH, ABTS לניקוי רדיקליים ופעילות הפחתת ברזל ברזל. בנוסף, ETB ו-EFB יכולים להפחית משמעותית את פעילות טירוזינאז במבחנה וסינתזת מלנין של עוברי דג הזברה באופן תלוי מינון. עגינה מולקולרית הצביעה על כך שיש מספר רב של תרכובות, רובן שייכות לסטילבנואידים, המציגות זיקה קשירה חזקה יותר ל-tyrosinase andadenylate cyclase, בהשוואה לזיקת הקישור של הליגנד המקורי. הממצאים הנוכחיים תמכו בהיגיון לשימוש ב-ETB ו-EFB כחומרים טבעיים להלבנת עור בתעשיות התרופות והקוסמטיקה.