בידול, כליות, נפרוגנזה, אבות נפרון,

איש קשר:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

תַקצִיר

הענקת נפרון, המוגדרת במהלך תקופת העובר, מכתיבה בריאות הכלייתית והקרדיווסקולרית הקשורה לאורך החיים. אנו מראים כאן את זה, למרות ההשפעות השליליות שלו עלצמיחת כליות, העלייה הגנטית של GDNF מאריכה את התוכנית הנפרוגנית מעבר להפסקה הרגילה שלה. ניתוח מכניסטי רב-שלבי גילה שעודף GDNF שומר על אבות נפרוגנזה ונפרוגנזה באמצעות ביטוי מוגבר של המטרות המופרשות שלו ואיתות WNT מוגבר, מה שמוביל להשפעה דו-חלקית על תחזוקת אבות נפרון. GDNF גבוה באופן חריג in כליות עובריות מעלה ויסותהמטרות המוכרות שלו, אך גם Wnt9b ו-Axin2, עם האטה נלווית של התפשטות אבות נפרון. הירידה ברמות ה-GDNF לאחר לידההכליות מתנרמלותניצן השופכן ויוצר סביבה מתירנית להמשך התוכנית הנפרוגנית, כפי שמודגם על ידי התחדשות ובידול עצמית של נפרון לאחר לידה נורמליים מבחינה מורפולוגית ומולקולרית. תוצאות אלו קובעות שלעודף GDNF יש השפעה דו-פאזית על אבות נפרון בעכברים, שיכולים להגיב נאמנה למניפולציה של מינון GDNF במהלך התקופה העוברית ולאחר הלידה. התוצאות שלנו מצביעות על כך שחישת רמת פעילות האיתות היא מנגנון חשוב שדרכו GDNF ומולקולות אחרות תורמות למפרט תוחלת החיים של אבות נפרון.

תוסף cistanche tubulosa לעומת deserticolaלהזנת כליות

מבוא

כליית היונקים היא איבר מסנן דם שאינו מתחדש עם פונקציות חיוניות של ניקוי רעלים ואיזון אלקטרוליטים.

הנפרונים המבצעים פונקציות אלו נולדים במהלך תקופת העובר, מכיוון שהכליה הבוגרת מציגה יכולת תיקון מוגבלת בלבד או הגדלה גלומרולרית מפצה (היפרטרופיה) (Chawla and Kimmel, 2012; Rinkevich et al., 2014; Romagnani et al., 2013). מסת נפרון מולדת נמוכה היא גורם סיכון מקובל ליתר לחץ דם, פרוטאינוריה, גלומרולוסקלרוזיס ומחלת כליות סופנית (Bertram et al., 2011; Hoy et al., 2008) ובכך משפיע רבות על בריאות הכליות לאורך החיים. התוכנית הנפרוגנית מסתיימת בין שבועות ההריון 35-37 בבני אדם לבין יום לאחר הלידה (P) 3 בעכבר (Hartman et al., 2007; Hinchliffe et al., 1991; Ryan et al., 2018), אך המנגנונים התורמים להפסקה לא מובנים. הונחה כי מעורבים שינויים ספציפיים לשלב בדפוסי גדילה (Cebrián et al., 2004) ומנגנוני חישת גיל פנימיים של התא (Chen et al., 2015a). מבחינה מולקולרית, איתות SMAD המושרה על ידי חלבון עצם (BMP) (Brown et al., 2015), Hamartin (Tsc1) (Volovelsky et al., 2018) וויסות מיקרו-RNA (Yermalovich et al., 2019) משתתפים בקביעת ה-nephrogenic משך התוכנית. עם זאת, הפלסטיות של התוכנית הנפרוגנית לא נחקרה במלואה. נפרונים מבדילים ממאגר אבות נפרון (NP), הידוע גם כ-metanephric או cap mesenchyme. NPs המבטאים רפרטואר ייחודי של סמנים כולל SIX2, גורם נוירוטרופי (GDNF) ו-CITED1, נוכחים רק בכליה העוברית, שם הם מקיפים כל קצה של ניצן השופכן (UB) מאז הקמתו (Boyle et al., 2008; Self et al., 2006). תהליך הנפרוגנזה מסונכרן עם הסתעפות UB, אשר שומרת בו זמנית על התחדשות עצמית באוכלוסיית ה-NP הבלתי מובחנת וגורמת לתת-קבוצה של NPs לעבור מעבר הדרגתי בין מזנכיים לאפיתל דרך שלבי מבשר מוגדרים היטב (אגרגטים פרה-טבולריים, PA; שלפוחית ​​כליה; , RV; גופים בצורת פסיק, CSB; גופים בצורת S, SSB), שמתבדלים בסופו של דבר לנפרונים פונקציונליים (Kobayashi et al., 2008; Lindström et al., 2018). האיזון בהתחדשות עצמית לעומת בידול בתוך אוכלוסיית ה-NP תלוי באותות המתווכים את אינטראקציות רקמות אינדוקטיביות הדדיות המתרחשות בין ה-UB לבין המזנכיה השכנה. Mesenchyme Metanephric ואותות שמקורם ב-NP, כגון GDNF ו-Fibroblast growth factors (FGFs), מווסתים את המורפוגנזה של UB, שבאמצעותה הכליה העוברית גדלה בגודלה, משיגה את צורתה ומבססת את מערכת צינורות האיסוף (Costantini and Kopan, 2010). איתות RET המופעל על ידי GDNF בקצות ה-UB מסדיר פרופיל שעתוק שאחראי לבקרה של איסוף אבות צינור ומורפוגנזה של UB (Kurtzeborn et al., 2018; Li et al., 2019; Lu et al., 2009; Ola et al. , 2011; Riccio et al., 2016). תעתיקים מווסתים על ידי GDNF כוללים גם חלבונים מופרשים, כגון WNT11 ו-CRLF1, עם פוטנציאל מוכח לוויסות התוכנית הנפרוגנית (O'Brien et al., 2018; Schmidt-Ott et al., 2005). מווסתים אחרים של נפרוגנזה שמקורם ב-UB הם WNT9b ו-FGF-ליגנדים המשפיעים על תחזוקה ובידול של NP (Barak et al., 2012; Carroll et al., 2005; Kiefer et al., 2012). דיווחנו בעבר שהפרעה גנטית של האזור הבלתי מתורגם Gdnf 3' גורמת לביטוי מוגבר של 3- פי 6- של GDNF אנדוגני ומביאה להיפופלזיה כלייתית עקב הפגם המסועף ב-UB (Kumar et al., 2015). בניגוד לקטלניות של יילודים בנוק-אאוט של Gdnf, עכברי Gdnfhyper/hyper שורדים עד 3 שבועות וחשפו את התפקיד המהותי של GDNF באיסוף חידוש עצמי של אבות הצינור (Costantini, 2012; Kumar et al., 2015; Li et al., 2019). כאן, אנו מדגימים שעודף GDNF, למרות השפעתו השלילית על צמיחת הכליות הכוללת, יכול להרחיב את תוחלת החיים של NP, ובכך לחזק עוד יותר את הפלסטיות שהוכרה לאחרונה של כליות יונקים.

מילות מפתח:דיפרנציאציה, כליה, נפרוגנזה, אבות נפרון, עכבר

תוצאות

התוכנית הנפרוגני העוברית תלויה ב-GDNF

הסידור המרחבי של שישה2- NPs חיוביים בלידה העוברית ואחרי הלידה המוקדמתכליותעוקב אחר דפוס סטריאוטיפי ומתואר היטב, שבו הרקמה הראשונית רב-שכבת-תאים מתדלדלת עם הזמן מבלי להשפיע הרבה על ארגון הנישה הכולל (Short et al., 2014). NPs בכליות Gdnfhyper/hyper הופצו סביב UB רחב בצורה חריגה כשכבה דקה יותר (איור 1A-F; איור S1A,B). כימות של NPs ב-E11.5 גילה עלייה ראשונית, אשר נורמלה זמנית ב-E12.5 אך ירדה באופן חמור ב-E14.5 בכליות Gdnfhyper/hyper (איור 1E-G; איור S1C-F). ניתוח מיטוזיס הראה שגם GDNF מוגבר אנדוגני וגם תוספת אקסוגנית גורם להפחתה משמעותית ב-PHH3 בתוספת NPC (איור 1H; איור S1G). ביחד, הנתונים מראים שעודף GDNF, שמתפקד בעיקר ב-UB, שבו מתבטאים הקולטנים שלו (Pachnis et al., 1993), גורם לירידה מהירה בשגשוג תאי NP במהלך התפתחות כליות מוקדמת.

ידוע שהתמיינות NP מוקדמת או מואצת יכולה לגרום לירידה בתאי NP בנישה שלהם (Kobayashi et al., 2008; O'Brien, 2018). כדי להעריך זאת, נפרוגנזה נבדקה על ידי צביעה עם LEF1 ו- cyclin D1, המסמנים את התאים והנפרונים המוקדמים ביותר עם התמיינות שעברו אפיתל מלא, בהתאמה (Lindström et al., 2015). זה הראה ירידה כללית במספר מבשרי נפרון מוקדם והצביע על התמיינות נפרונים מופחתת ב-Gdnfhyper/hyper עובריכליות(איור 2). הערכת צפיפות גלומרולרית תמכה בכך עוד יותר והדגימה צפיפות כללית נמוכה יותר בכליות Gdnfhyper/היפר היפודיספסטיות מאשר בכליות מסוג פראי (WT) (איור S1G). מעניין לציין שניתוח של הגלומרולי הקורטיקליים בתוך השטח הנמדד הכולל, ובמיוחד יחסי הגלומרולי הקורטיקליים לכוללים, גילו מעט גבוהים מיחסי WT ב-Gdnfhyper/hyper (טבלה 1; 17 אחוזים ב-Gdnfhyper/hyper, 12 אחוזים ב-WT). זה מצביע על כך שלמרות ההאטה המוקדמת של החידוש וההתמיינות העצמית של NP, לכליות המתמודדות עם עודף GDNF במהלך אורגנוגנזה יש נפרוגנזה מתמשכת לאחר לידה עם עלייה מינורית בנפרונים שנולדו לאחרונה, הממוקמים ביותר בקליפת המוח (Rumballe et al., 2011; Short. et al., 2014).

עודף GDNF מאריך את תוחלת החיים של מאגר ה-NP לאחר הלידהדגמי עכברים רבים עם מחסור בצמיחת כליות, או בגלל מורפוגנזה של UB ו/או התמיינות נפרונים, מתים מיד לאחר הלידה (Kure and Sariola, 2020). למרות ההיפופלזיה המשמעותית, חריגות במורפולוגיה של UB ושיבושים חמורים בנפרוגנזה עוברית (איור 2), עכברי Gdnfhyper/היפר שורדים עד 3 שבועות לאחר הלידה (Kumar et al., 2015; Li et al., 2019), מה שמספק אפשרות לבדיקת נפרוגנזה לאחר לידה.

כפי שנקבע (O'Brien, 2018), הניתוח שלנו של אוכלוסיות ה-NP ב-P1-P10 גילה אובדן דרמטי בכליות WT ב-P3, שבהן זוהתה בעיקר SIX2-חיוביות ב-

מבדי נפרון מבדילים, ורק 10 אחוזים מהקצוות המנותחים של UB (גומחות) היו מכוסים בתאי אבות נפרוניים (NPCs) (איור 3A, n=2 כליות). עם זאת, שישה 2- NPs חיוביים זוהו ב-59 אחוזים מגומחות Gdnfhyper/hyper ב-P3 (איור 3B, n=2 כליות). באופן דומה, NPs חיוביים של PAX2- זוהו בנישות NP של Gdnfhyper/hyper kidneys ב-P3, אך התאים החיוביים של PAX2- התמקמו באופן בלעדי במבשרי הנפרון המתמיינים ב-WTכליות(איור 3C,D).

נפרוגנזה ב-Gdnfhyper/hyper לאחר לידהכליותהראה שיפור משמעותי מזה בכליות עובריות, כפי שמודגם על ידי דפוסי מבשר דומים של נפרון בכליות WT ו-Gdnfhyper/היפר (איור 3E-H; השוו עם איור 2). סוף כל סוף,

מצאנו ש-18 אחוז מהנישות של ה-NP קיימו שישה2- NPCs חיוביים ב-P4, ו-NPC מחוייבים היו נוכחים ב-Gdnfhyper/hyperכליותעד P6, בעוד NPCs מחויבים זוהו ב-WT

כליותרק עד P4 (איור 4; איור S1H). זה מדגים שתוחלת החיים של NP in vivo אינה קבועה מראש, ומציעה כי אפנון של רמות גורם הגדילה, במיוחד GDNF, תורם לתזמון של גל ההתמיינות הסופי של הנפרונים.

שיערנו ש-NPCs מתמשך בכליות Gdnfhyper/hyper פוסט לידתי עשויות לנבוע ממנגנוני פיצוי כלליים שנגרמו על ידי פגמים מסועפים של UB המובילים להיפופלזיה כלייתית (Kumar et al., 2015; Li et al., 2019) או לחילופין לנבוע מה-GDNF הספציפי. השפעות על אוכלוסיית ה-NP. כדי להבחין בין האפשרויות, NPs לאחר לידה נותחו במודלים אחרים של היפופלזיה כלייתית. Fgf9;20-חסרכליותמראים דילול דומה של שכבות תאי NP עובריים (Barak et al., 2012) כפי שזוהה ב-Gdnfhyper/hyperכליות, אך לא הצלחנו לזהות SIX2- ו/או PAX2-תאים חיוביים בנישות ה-NP לאחר הלידה שלהם (איור S2). כדי להרחיב על כך, ניתחנו בשלב הבא את Hoxb7Cre; Mek1fl/fl; Mek2 plus /− kidneys (Ihermann-Hella et al., 2014) שבהן, בדומה לעכברי Gdnfhyper/hyper, hypoplasia כליות נגרמת על ידי הפרעה בהסתעפות UB. מודל זה חסר גם סימנים של נפרוגנזה ממושכת, כפי שזוהה על ידי נוכחות של תאים חיוביים SIX2- ו/או PAX2- בנישות ה-NP לאחר הלידה שלהם (איור S3), התומכים בדעה שהיפופלזיה כלייתית זה לא מספיק כדי לשמור על נפרוגנזה לאחר לידה.

נתונים שפורסמו גם מוכיחים שהיפופלזיה כלייתית לבדה אינה מסוגלת לתמוך בתחזוקת NP לאחר לידה (Kure and Sariola, 2020), מה שמצביע עוד יותר על תפקיד פעיל ל-GDNF. עם זאת, איננו יכולים לשלול לחלוטין את האפשרות שלעודף גורמי גדילה מלבד GDNF תהיה אותה השפעה.

NPs מתמשכים לאחר לידה שומרים על התוכנית הנפרוגנית מעבר להפסקה הרגילה

NPs מתמשכים לאחר לידה שומרים על התוכנית הנפרוגנית מעבר להפסקה הרגילה

לאחר מכן, פוטנציאל הבידול של NPs מתמשך ב-Gdnfhyper/hyper שלאחר הלידהכליותנבדק. ניתוח Ki67 גילה דפוסי התפשטות לאחר לידה דומים בכליות WT ו-Gdnfhyper/hyper עד P4 (איור 5A,B). מ-P5 ואילך, התאים החיוביים Ki67- ירדו באזור ההתמיינות הקורטיקלית של כליות WT (איור 5C,E,G). ירידה כזו בהתפשטות קליפת המוח לא זוהתה בכליות Gdnfhyper/hyper, אשר הראו תאים מחזוריים פעילים במבנים דמויי מבשר נפרון ב-P7 (איור 5D,F,

H) אך כבר לא ב-P12 (איור S4A,B).

ניתוח התמיינות נפרון לאחר לידה הדגים כמות מוגזמת של מבשרי נפרון ב-Gdnfhyper/hyperכליותעד P7, בעוד שאלו זוהו בכליות WT רק עד P4 (איור 6; איור S4C-F). עם זאת, נפרוגנזה מתמשכת כזו לאחר לידה לא הצליחה להגביר את הצפיפות הגלומרולרית מזו שבשלבים עובריים מאוחרים (איור S5A-C; 6.4±2.1 לעומת 10.2±1.2, בהתאמה; ממוצע±סם). שיעור הגלומרולי הקורטיקלי ב-Gdnfhyper/hyper kidneys ב-P7 (59 אחוזים) גבוה ב-1.5×

איור 1. אבות נפרון מתדלדלים בהיפר/היפר Gdnf עובריכליות. (A,B) סמן אבות נפרון (NP) SIX2 (אדום) מתמקם לקצות ניצני השופכן המכסים מזנכיים (UB) (קלבינדין, ירוק) בכליות WT (A; n=4) ו-Gdnfhyper/hyper (B; n=5 כליות) כליות ב-E11.5. (C,D) E12.5 WT (C) ו-Gdnfhyper/hyper (D) כליות שהותרבו במבחנה במשך 24 שעות וצובעו עבור SIX2 (אדום) כדי להמחיש את אוכלוסיית NP וקלבינדין (ירוק) עבור UB (n{{9} } כליות/טיפול, שלושה ניסויים עצמאיים). (E,F) NPs מצויים בשפע בכליה E14.5 WT (E; 42.6/tip), בעוד שב-Gdnfhyper/hyper kidney NPs מופחתים בבירור (F; חיצים, 29.8/tip) (n=207 עבור WT ו-431 עבור עצות Gdnfhyper/היפר שנותחו בתשע כליות/גנוטיפ).

חיצים לבנים מצביעים על תאי NP (אדומים).

(ז) ניתוח של SIX2-כמות NP חיובית ב-WT ו-Gdnfhyper/hyperכליותמציג בריכות NP ראשוניות דומות ב-E12.5. הנתונים מוצגים ככמות ממוצעת של SIX2- NPs±sem חיוביים בהשוואה לאלו של חברי המלטה ל-WT, המוגדרים ל-100 אחוז ומשקפים את התוצאות שהתקבלו מארבע המלטות עצמאיות (WT: 100±15.61 אחוז, n{{ 7}}; Gdnfhyper/hyper: 124.74±33.89 אחוז, n=5; P=0.533, מבחן t דו-זנב ב-SPSS). (ח) שיעור ההתרבות של SIX2- NP חיובי בכליות Gdnfhyper/hyper kidneys ב-E12.5 מראה ירידה משמעותית בהשוואה לכליית WT. הנתונים מוצגים כשיעור ממוצע של שגשוג של SIX2- NPs±sem חיוביים בהשוואה לאלו של חברי המלטה ל-WT, המוגדרים ל-100 אחוז ומשקפים את התוצאות שהתקבלו משלוש המלטות עצמאיות (WT: 100±9.04 אחוז, n{{ 25}}; Gdnfhyper/hyper: 56.94±12.67 אחוז , n=5;

*P=0.024, מבחן t דו-זנב ב-SPSS). פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר.

מאשר ב-WTכליות(39 אחוזים) (טבלה 1) תומכת בדעה שמאגר ה-NP שלאחר הלידה המתמשך בכליות Gdnfhyper/hyper גורם לנפרונים חדשים לאחר הפסקת הנפרוגנזה הרגילה.

עכברי Gdnfhyper/hyper עם נפרוגנזה ממושכת בכליות היפודיספלסטיות חמורות לא מראים סימנים של ניאופלזיה או גידולים במהלך תוחלת חייהם הקצרה (Kumar et al., 2015; Turconi et al., 2020).

כליות Gdnfwt/hyper מראות ירידה עוברית קלה יותר של NPCs מאשר Gdnfhyper/hyperכליות. עכברים אלה חיים תוחלת חיים רגילה ואינם מראים גידוליםכִּליָהs ואיברים אחרים (Turconi et al., 2020) (איור S6A-D, n=62). העלייה הכפולה של GDNF במהלך העובר, לא מצליחה לשמור על אוכלוסיית ה-NP בכליות Gdnfwt/היפר לידה לאחר לידה (איור S6E,F), מה שמרמז על הדוק

איור 2. השפעת עודף GDNF על נפרוגנזה עוברית. (א) LEF1 (אדום), סמן של אגרגטים פרטיבולריים, שלפוחיות כליה דיסטליות וגופים בצורת S, בכליה WT E14.5. (ב) E14.5 Gdnfhyper/hyper kidney מראה מעט מאוד מבשרי נפרון מבדלים חיוביים של LEF1- ושפע טיפוסי של אפיתל של ניצן שופכן (UB) כפי שזוהה על ידי צביעת קלבינדין (ירוק).

(ג) Cyclin D1 (אדום) צובע את כל המבשרים של נפרונים מבדילים (כוכביות מסמנות אגרגטים פרה-בולריים וגופים בצורת פסיק, חיצים מצביעים על גופים בצורת S), אותם ניתן לראות בשפע ליד אפיתל UB (ירוק) ב-E14.5 WTכִּליָה.

(ד) פחות מבשרי נפרון מבדלים באופן משמעותי מזוהים ב-E14.5 Gdnfhyper/hyperכִּליָה. (E,F) Cyclin D1 (אדום) לוקליזציה ב-E16.5 WT (E) ו

Gdnfhyper/hyper (F) כליות. קלבינדין (ירוק)

צביעה מדמיינת אפיתל UB בכל התמונות. עבור כל צביעה בשלב נתון n=3 כליות/גנוטיפ. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר.

טבלה 1. כימות של צפיפות גלומרולרית בכליות Gdnfhyper/היפר ב-E18.5 ו-P7

הנתונים הם כמות ממוצעת של נפרון ל-mm±sem מעוקב (n=4 כליות/גנוטיפ, ממוצע של שמונה שקופיות מנותחות עבור כל כליה במרווחים של 125 מיקרומטר כדי למנוע ספירת איטרציות של אותו גלומרולי). שיעור הגלומרולי הקורטיקלי בכליות WT ב-E18.5 הוא 12 אחוז, בעוד שב-Gdnfhyper/hyper kidneys הוא 17 אחוז. ב-P7, שיעור הגלומרולי בקורטקס גדל עוד יותר ב-Gdnfhyper/hyperכליות,מה שמצביע על כך שנפרונים עדיין מתבדלים באופן פעיל.

גבול סף ליכולת של GDNF לווסת את התוכנית הנפרוגנית.

נפרוגנזה מתמשכת לאחר לידה תלויה בשינויים באיתות המושרה על ידי GDNF

ביטוי Gdnf אובד מכליות WT על ידי P2 (www.gudmap.org), בעוד שה-mRNA והחלבון שלו עדיין נמצאים ב-Gdnfhyper/hyper

נפרוגנזה מתמשכת לאחר לידה תלויה בשינויים באיתות המושרה על ידי GDNF

ביטוי Gdnf אבד מ-WTכליותעל ידי P2 (www.gudmap.org), בעוד שה-mRNA והחלבון שלו עדיין נמצאים ב-Gdnfhyper/hyper

כליותעד P7 (איור 7A-D). קומפלקס הקולטן השמרני של GDNF מתבטא רק בקצות UB האפיתל (Costantini, 2012;

Golden et al., 1999). בשל לוקליזציה של הקולטן ברקמה הסמוכה לאוכלוסיית ה-NPC, חשדנו שההשפעות של GDNF אנדוגני מוגבר על נפרוגנזה חייבות להיות מתווך.

באמצעות מולקולות תלויות GDNF שמקורן ב-UB (http://www.signalpeptide.de/index.php) (Lu et al., 2009; Ola et al., 2011; Schmidt-Ott et al., 2005) (טבלה 2), או מולקולות אחרות, שביטוין עשוי להשתנות עקב UB גדול מדי.

ניתוח הביטוי של יעדי GDNF המופרשים מ-UB, גילה הרמה משמעותית של Crlf1, Srgn ו-Wnt11 בכליות Gdnfhyper/hyper ב-E14.5 (איור 7E). כמו כן, ביטוי Wnt9b גדל באופן משמעותי (איור 7E). ניתוח נוסף של יעדי האיתות של WNT/ - קטנין (Clevers and Nusse, 2012) בבקרת E14.5 וכליות Gdnfhyper/hyper הדגימו שיפור ויסות משמעותי של יעד קנוני Axin2 (P=0.003371), בעוד ש-NP הביע WNT יעדים (Karner et al., 2011) הראו מגמה של ירידה ברגולציה, ככל הנראה משקפת את המספר הכולל המופחת של NPCs (איור S7A). יחד, אלה מצביעים על כך שלא רק איתות מוגבר המושרה על ידי GDNF אלא גם איתות מוגבר של Wnt9- ו-Wnt11-עם פונקציות ידועות ברגולציית NPC משתתפים בתיווך תקשורת הדדית מ-UB המוטנטי למאגר ה-NP הסמוך ב- E14.5 (Karner et al., 2011; Kiefer et al., 2012; Nagy et al., 2016; O'Brien et al., 2018).

איור 3. התמיינות נפרונים בהפסקת המורפוגנזה הכלייתית. (א) כליה P3 WT איבדה SIX 2-אבי נפרון חיוביים בקליפת המוח (NP) כפי שמוצג על ידי אובדן תאים במזנכימה ה-cap (חץ). במקום זאת, SIX2 מתמקם למזנכימה לרוחב ומבשרי נפרון מוקדמים (ראשי חץ).

כימות של 48 נישות NP (מספרי טיפים מנותחים) גילה רק חמש נישות עם NPs. (ב) Cap mesenchyme חיובי עבור SIX2 עדיין קיים ב-Gdnfhyper/hyper kidney ב-P3 (חצים). כימות של 107 נישות NP (מספרי טיפים מנותחים) גילה 63 נישות עם תאי NP. (C,D) PAX2 (אדום) וצביעת קלבינדין (ירוק) ב-WT (C) ו-Gdnfhyper/hyper

(ד) כליות ב-P3. החצים מצביעים על המיקום שבו תאי NP נשמרים ב-Gdnfhyper/hyperכליות.

(E,F) כמות דומה של מבשרי נפרון חיוביים (אדומים) לציקלין D1- ב-P3 WT (E) וב-Gdnfhyper/hyper

(ו) כליות. (G,H) הדמיה של מבשרי נפרון חיוביים ל-LEF1-(אדום) ואפיתל השופכן (ירוק) חושפת נפרוגנזה מתמשכת דומה ב-WT

(G) ו-Gdnfhyper/hyper (H) כליות. לכל צביעה

n=3 כליות/גנוטיפ. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר.

אפיון מולקולרי של P5 Gdnfhyper/hyperכליותהראה וויסות עלייה מתמשך של Crlf1, Etv4, Etv5, Cited1 ו-Uncx4.1 (הידוע גם בשם Uncx), אך גם חשף ביטוי מוגבר של גורם נישה פוטנציאלי Lama1 (Rayagiri et al., 2018), משרה התמיינות נפרונים Wnt4 (Stark et al. , 1994) ו-WNT איתות אגוניסט R-spondin 1 (Rspo1) (איור 7F; איור S7B). פרופיל שעתוק כזה מרמז על השפעה מוגברת שמקורה ב-UB על NPs, שנראה כי הם עוברים גל בידול המבוסס על ירידה בביטוי Fgf9 ו-Fgf20 ולוקליזציה מוסטת של תאי SIX2 פלוס (איורים 4C,D ו-7F). בדקנו באופן פונקציונלי האם הביטויים המוגברים ביותר של Crfl1, Wnt11 ו-Wnt9b משפיעים על התוכנית הנפרוגנית בעכבר. CRLF1, במתחם עם ציטוקין דמוי קרדיוטרופין הליגנד הפיזיולוגי שלו, משרה התמיינות בתרביות מזנכימים של כליות מבודדות (Schmidt-Ott et al., 2005). אפיון של כליות נוק-אאוט של Crfl1- גילה גודל כליות ונפרוגנזה דומים לאלו של כליות WT (איור S6C-F), מה שמרמז על פונקציות CRLF1 הניתנות לביטול in vivo. בהמשך נבדקה התרומה של איתות WNT קנוני מוגבר לפנוטיפים הנגרמים על ידי עודף GDNF. IWR1 מעכב טנקיראזות 1 ו-2, הנחוצות להתפתחות תקינה של כליות (Chen et al., 2009; Huang et al., 2009; Karner et al., 2010). הטיפול ב-IWR1 הקל על מספרי העצות והמורפולוגיה של UB בנוכחות עודף GDNF (איור S8). לבסוף, שאלנו האם ביטוי Wnt11 מוגבר באופן משמעותי בכליות Gdnfhyper/היפר תורם לתוכנית הנפרוגנית הממושכת בעכברי Gdnfhyper/היפר על ידי חציית אלל נוקאאוט Wnt11 לרקע Gdnfhyper. זה לא הצליח ליצור הומוזיגוטה כפולה

איור 4. אבות נפרון מתקיימים באופן מתמשך בכליות Gdnfhyper/היפר שלאחר הלידה. (A,B) לוקליזציה של סמן אבות נפרון (NP) SIX2 (אדום) ב-WT ב-P4 (A) ו-P6 (B) מראה אובדן של NPs בכליות WT שבהן SIX2 נמצא רק בשלפוחית ​​כליה חיובית חלשה (כוכביות) . (ג) ב-Gdnfhyper/hyper kidneys ב-P4 SIX2 מתמקם גם ל-NPs המכסים את ניצני השופכן (ירוקים) (חצים) (n=315 עצות ב-WT ו-245 ב-Gdnfhyper/hyper מנותחים בארבע כליות/גנוטיפ). (ד) לוקליזציה של SIX2 (אדום) וקלבינדין (ירוק) בכליות P6 Gdnfhyper/היפר חושפת את התמשכותם של תאי NP מחויבים (13; * מציין נפרונים מתמיינים) בכליה המוטנטית (n=3 כליות/גנוטיפ) . כימות של נישות תאי NP הראה מעט מאוד טיפים, שלא היו להם שישה2- NPs חיוביים בכליות WT, בעוד ש-81 אחוז מהגומחות ב-Gdnfhyper/hyper kidneys (n=2, 16 נישות) לוו עם SIX2-חיוביות במבשרי נפרון מחויבים ומבדילים. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר.

Gdnfhyper/hyper;Wnt11−/− צאצאים (טבלה 3; n=95; P=0.005 Gdnfwt//hyper;Wnt11 plus /− רבייה). תוצאות אלו מצביעות על קטלניות עוברית עבור מוטציות Gdnfhyper/hyper;Wnt11−/− ואילצו אותנו למקד את הניתוח בכליות Gdnfhyper/hyper;Wnt11 plus /−. הסרה של אלל Wnt11 אחד ברקע Gdnfhyper/היפר שיפרה מעט את מורפולוגיה של UB והקטינה את גודל הכליה יותר מזה שבכליות Gdnfhyper/hyper, מה שמשקף ככל הנראה היווצרות מופחתת של ציסטות צינור איסוף עם ירידה במינון Wnt11 (איור S9A-C). עם זאת, אוכלוסיית NP חיובית של SIX2- גדלה (29.8 NPC/tip לעומת 40.7 NPC/tip ב-E14.5 ו-20.3 NPC/tip לעומת 30.9 ב-P0) והנפרוגנזה השתפרה באזור ההבחנה הקורטיקלית של Gdnfhyper/hyper ;Wnt1 plus /− כליות (איור 8; איור S9D-F; השווה גם עם איור 1F). לפיכך, תוצאות אלו מצביעות על כך שרמות GDNF מוגברות מגדילות מספר יעדי GDNF/Ret שמקורם בניצנים, אשר, לא לבד אלא בשילוב זה עם זה ויחד עם איתות WNT קנוני מוגבר, מווסתים NPCs בכליות עובריות.

דיון ספירת הנפרונים מוגדרת במהלך חיי העובר ויכולה להשתנות מאוד בין אנשים. התרחבות NP ותוחלת חיים משפיעים מאוד על ההענקה הסופית של הנפרון, ולכן חשוב לזהות מנגנוני רגולציה השולטים בחידוש העצמי של NP. כאן, אנו מראים כי הגורם הנוירוטרופי GDNF, הידוע כמניע את התפתחות הכליות ומווסת את המורפוגנזה של UB (Costantini, 2010; Kurtzeborn et al., 2018; Li et al., 2019), מסוגל, למרות השפעותיו השליליות על צמיחת הכליות. של הארכת התוכנית הנפרוגנית מעבר להפסקה הרגילה. התוצאות שלנו מראות שלעודף GDNF יש השפעה דו-פאזית על חידוש ותחזוקה עצמית של NP. בהתבסס על הניתוח שלנו, אנו מציעים מודל של האופן שבו עודף GDNF ב-Gdnfhyper/היפר כליות מתפקד

באמצעות מנגנונים הכוללים שינויים בהתקדמות מחזור התא וביכולת לחוש את רמות גורמי הגדילה. בתחילה בכליות עובריות, רמות GDNF גבוהות גורמות לירידה מהירה במספרי NP לכל נישה, שאופיינית לדגמי עכברים רבים עם מחסור ראשוני ב-UB (Carroll and Das, 2013; Chen et al., 2015b; Costantini and Kopan, 2010; Liu et al., 2018). הירידה המוקדמת ב-NP שנראתה במודלים שפורסמו בעבר נגרמת בדרך כלל מההתמיינות המוקדמת שלהם, מה שלא קורה ב-Gdnfhyper/hyper kidneys. במקום זאת, עודף GDNF מסוגל לשמור על מחזור תאים פעיל בקליפת הכליה לאחר הלידה זמן רב יותר באופן משמעותי ממה שנראה בכליות WT. התפשטות מתרחשת בתאי NP, אשר נשמרים זמן רב יותר מאשר בכליות WT, והם ממשיכים לייצר נפרונים חדשים. בעתיד, יהיה מעניין לראות האם ניתן יהיה לתת עודף GDNF בצורה חיובית להמשך נפרוגנזה לאחר לידה מבלי להשפיע קשות על מורפוגנזה של UB כדי לעוות את צמיחת האיברים הכוללת. הנתונים שלנו מראים כי הירידה המוקדמת ב-NPs עובריים של Gdnfhyper/hyper kidneys נובעת מירידה בשגשוג תאים ולא בהתמיינות מוקדמת מוגברת. מנגנון תאי זה נתמך על ידי שינויים מולקולריים שהתגלו ביעדי GDNF ידועים (Crlf1, Wnt11 ו-Srgn) (Lu et al., 2009; Ola et al., 2011) ובווסתים חשובים של איתות תחזוקה של תאי NP (Wnt9b, Wnt11 ושלהם מטרות תעתיק) (Karner et al., 2011; Kiefer et al., 2012; O'Brien et al., 2018). בדיקה קודמת של אורך חיים וחוסן של תאי NP על ידי ביטול אוכלוסיית NP עם רעלן דיפטריה A, או על ידי הפרעה בהפעלת MAPK/ERK, אשר שניהם הביאו לירידה מהירה בתאי NP ללא השפעה חיובית על תוחלת חייהם (Cebrián et al., 2014 ; Ihermann-Hella et al., 2018), יחד עם התוצאות שלנו מצביעים על כך ששגשוג תאי NP ממלא מטבעו תפקיד מרכזי בהגדרת משך חייהם הכולל. בהסכמה, תאי NP בכליות עובריות מאוחרות מראים שיעורי שגשוג מופחתים באופן משמעותי והתמיינות מואצת, בעוד שהשתלת תאי NP ישנים לתוך כליות בשלב מוקדם יותר מאריכה את תוחלת חייהם (Chen et al., 2015a). בהתבסס על התוצאות שלנו, אנו מציעים כי GDNF תורם למנגנון שבאמצעותו תאי NP חשים את גילם ההתפתחותי ובסופו של דבר את תוחלת חייהם. בכליה תקינה, ביטוי GDNF גבוה בתחילת מורפוגנזה של הכליה ובמהלך שלב הצמיחה הפעילה, בעוד שירידה ברורה ברמות ה-GDNF מתרחשת בכליות עובריות מאוחרות, וכתוצאה מכך אובדן ביטוי בשלב מוקדם לאחר הלידה (איורים 7 ו-9) . רמות GDNF בכליות Gdnfhyper/היפר מוקדמות גבוהות באופן חריג, מה שנראה מעכב את התפשטות תאי NP, ככל הנראה בשל השינויים התאיים והמולקולריים שזוהו בתוך המוטנטי UB כגון מסלול WNT שונה

(איור 7E,F; איור S7A,B), בעל השפעות ידועות על ביולוגיה של NPC (Karner et al., 2011; Kiefer et al., 2012; Nagy et al., 2016; O'Brien et al., 2018). בדומה לכליות WT, רמות החלבון Gdnf mRNA ו-GDNF יורדות בכליות Gdnfhyper/היפר לאחר הלידה שבהן ה-Gdnf עובר מניפולציה ברמה שלאחר התעתוק המאפשרת ויסות זמני אנדוגני של הביטוי (Kumar et al., 2015). סביר להניח, זה מקטין את ביטוי GDNF לרמה המתירנית לחידוש עצמי והתמיינות של תאי NP, המתגלים כתוכנית נפרוגנית מתמשכת בכליות לאחר הלידה (איור 9). פלסטיות תלויה בגורמי גדילה שהוכרה לאחרונה בהתמיינות כלייתית נושאת תקווה לשימוש שלה למטרות התחדשות בעתיד. הרמזים הראשונים לאפשרות להאריך את תקופת ההתמיינות הנפרונים הגיעו מניסויים המעכבים BMP/

איור 5. שגשוג קליפת המוח מתמשך בכליות Gdnfhyper/hyper פוסט לידתי. (A,B) צביעת Ki67 בכליות P4 WT (A) ו- Gdnfhyper/hyper (B) מראה דפוס דומה של תאים שגשוג בכליות הקורטיקליות (חצים אדומים) של שני הגנוטיפים. (C,D) בכליות P5 WT (C) החיוביות של Ki67- מופחתת באופן משמעותי בקליפת המוח (חץ אדום), בעוד ש-Gdnfhyper/hyper kidneys (D) עדיין מציגות שגשוג גבוה מאוד מבחינה מוקדית (חצים אדומים). (E,F) התפשטות בכליה קליפת המוח WT (E) פוחתת עוד יותר ב-P6, בעוד שהיא נשארת פעילה מאוד בכליות Gdnfhyper/hyper kidneys (F). (G,H) קי67-תאי שגשוג חיוביים מתמקמים לצינוריות הכליה המדולרית (חץ שחור) בכליות P7 WT (G) אך שגשוג פעיל עדיין מזוהה במבני נפרונים מבדילים בקליפת המוח (חצים אדומים) של Gdnfhyper/hyper kidneys (ח). עבור כל שלב לאחר לידה, n=3 כליות/גנוטיפ. סרגל קנה מידה: 1 מ"מ.

P7 רק ב-Gdnfhyper/hyper kidneys. (A,B) סמן מבשר של Nephron LEF1 (אדום) בכליות WT (A) ו- Gdnfhyper/hyper (B) ב-P4 מדגים נפרוגנזה מתמשכת בשני הגנוטיפים (חצים) (n=2 כליות/גנוטיפ). (C,D) P5 WT כליות (C) מציגות מעט מאוד תאים חיוביים ל-LEF1- בקליפת המוח, ואילו נפרוגנזה בשפע מתגלה בכליות Gdnfhyper/היפר (D; חצים; n=4 כליות/גנוטיפ) . (E,F) LEF1 אינו קיים עוד בקליפת המוח של כליות WT ב-P6 (E), בעוד שהרבה מבשרי נפרון עדיין מזוהים בכליות Gdnfhyper/hyper kidneys (F) (n=3 כליות/גנוטיפ). (G) Cyclin D1 (לבן) ו-JAG1 (אדום) מתמקמים לאבוביות דיסטליות של נפרון (חץ צהוב וראש חץ) בכליות P7 WT (n=3). (H) ב-P7 Gdnfhyper/hyper kidneys cyclin D1 ו-JAG1 מתמקמים לגופים בצורת פסיק (ראש חץ) וצורת S (חץ) של מבשרי נפרון באזור ההתמיינות הקורטיקלית, ובכך מראים נפרוגנזה מתמשכת בשלב מאוחר זה שלאחר הלידה (n{ {יט}} כליות). פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר.

איתות SMAD1/5, שהוביל לכליות מעט גדולות יותר עם יותר נפרונים מאשר בכליות שטופלו ברכב (Brown et al., 2015). מינון מופחת של Tsc1, המקודד מעכב mTOR, שומר על תאי NP למשך יום נוסף, ללא השפעות מדווחות על מספר תאי NP עובריים (Volovelsky et al., 2018). נפרוגנזה ממושכת נצפתה גם בעכברים עם ביטוי יתר של Lin28, Lin28b או Let-7 לא פעיל (Let-7a1; Let-7d; Let-7f1) (Urbach et al. ., 2014; Yermalovich et al., 2019), אשר גם מראים גידול ישיר או הפעלה של מוקדי Igf2 או H19h הקשורים לגידול סרטן הכליות בילדים של Wilms (Chen et al., 2018; Ogawa et al., 1993). הערה, לא זוהו שינויים בלקליזציה או רמות pSMAD1/5 בכליות Gdnfhyper/hyper, שהן היפודיספלסטיות ותואמות לחיים למשך שלושה שבועות.

המחקר הנוכחי מתמקד באפיון תפקוד ה-GDNF בנפרוגנזה, אשר נבדק בעבר על ידי הפחתת מינון ה-Gdnf האנדוגני ומביא להפחתת הקניית נפרון (Cullen-McEwen et al., 2001, 2003). קומפלקס הקולטן הקנוני ל-GDNF נוצר על ידי RET טירוזין קינאז והקולטן המשותף שלו GFRa1, אשר מתבטאים באופן בלעדי רק באפיתל UB (Costantini, 2012; Golden et al., 1999; Pachnis et al., 1993) . GDNF הוא גורם נישה מרכזי עבור תאי UB tip (Chi et al., 2009; Riccio et al., 2016; Shakya et al., 2005). הראינו בעבר שעודף GDNF מרחיב את מאגר אבות צינור איסוף על חשבון התארכות גזע השופכן, וכתוצאה מכך פנוטיפ מורחבת של קצה וגזע קצר עקב פגמים בתנועת האבות וקיצור אורך מחזור התא (Li et al., 2019). במהלך השלבים העובריים ההשפעה המשולבת של חריגה

איור 7. ניתוח ביטוי של הרגולטורים החיוניים להתפתחות הכליות. (א) בדיקת הכלאה באתרו של Gdnf ב-P4 אינה מסוגלת לזהות כל תעתיקים בכליות WT (n=3 כליות). (ב) ביטוי Gdnf נשמר ב-P4 Gdnfhyper/hyper kidney ומתמקם לאזור התמיינות קליפת המוח בו נשמרים אבות נפרון (חצים אדומים) בגלל עודף GDNF (n=3 כליות). (ג) ניתוח qRT-PCR של תעתיקי Gdnf ב-Gdnfwt/ko, WT, Gdnfwt/hyper ו-Gdnfhyper/hyper kidneys ב-P7 (n=3 כליות/גנוטיפ). ביטוי Gdnf ב-Gdnfhyper/hyper kidneys גבוה משמעותית מאשר ב-WT (P=0.036) וב-Gdnfwt/ko (P=0.038) (ממוצע±sem, מבחן t דו-זנב ב-SPSS ). (ד) ניתוח ELISA של רמות חלבון GDNF בכליות P7 (n=5 כליות/גנוטיפ) (ממוצע±sem). (E,F) כימות מבוסס qRT-PCR של רמות הביטוי היחסיות של הגנים שנבחרו ב-E14 (E) וב-P5 (F) (n=3 כליות/גנוטיפ בשלב נתון). יעדי ה-GDNF המופרשים מ-UB רשומים מעל הקו המקווקו, בעוד שמווסתים ידועים אחרים של נפרוגנזה מוצגים מתחת לקו. Gdnfhyper/hyper kidneys מציגים וויסות עלייה משמעותי של Crlf1 (*P=0.019), Srgn (*P=0.021), Wnt11 (**P=0.001) ו-Wnt9b ( **P=0.01) ב-E14, בעוד שב-P5, ביטויי גנים מוגברים באופן משמעותי כוללים Crlf1 (**P=0.009), Etv4 (**P=0.{{ 39}}), Etv5 (*P=0.03), Lama1 (*P=0.014) ו-Wnt4 (*P=0.026). לעומת זאת, התעתיק של Sostdc1 (**P=0.000), Fgf9 (**P=0.001) ו-Fgf20 (**P=0.001 ) ירד באופן משמעותי ב-Gdnfhyper/hyper kidneys ב-P5. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר.

נראה כי GDNF גבוה, מורפולוגיה חריגה של קצה UB שנגרמו לשינויים ביו-פיזיקליים ושינויים מולקולריים הקשורים ביעדי GDNF ובמסלול ה-WNT דוחפים במשותף תאי NP לעבר התפשטות מופחתת. אנו מראים כאן שהמורפולוגיה המורחבת של קצה ה-UB משתפרת עם הזמן אך נמשכת בצורות קלות עד P4 בכליות Gdnfhyper/היפר לאחר הלידה (איור 5). תאי קצה של UB עדיין קיימים מבחינה מולקולרית בכליות P5 Gdnfhyper/היפר, המבטאים רמות גבוהות של סמני קצה מווסתים GDNF Crlf1, Etv4, Etv5 ו-Lama1, יעדי WNT קנוניים המבוטאים ב-NPC Cited1 ו-Uncx4.1, וכן WNT אגוניסט R -spondin1 (איור 7E,F; איור S7A,B) (Karner et al., 2011; Lu et al., 2009; Vidal et al., 2020). שינויים מולקולריים כאלה ב-UB שלאחר הלידה מספקים ככל הנראה סביבה נוחה להתחדשות עצמית מתמשכת של NP מעבר ל-P2/P3. זיהינו את CRLF1 ו-WNT11 המופרשים מ-UB כמטרות GDNF שיחד עם WNT קנוני מוגבר

איתות, המוגבר בנוסף על ידי ביטוי מוגבר של Wnt9b, מתווך את השפעותיו על ויסות NP. הנתונים שלנו גם מצביעים על כך שתפקוד CRLF1 מיותר עם ציטוקינים אחרים מכיוון שההשבתה שלו אינה משפיעה על ההתמיינות הכלייתית. גם WNT9b וגם WNT11 מסדירים היבטים רבים של NPCs ושל נפרוגנזה (Carroll et al., 2005; Karner et al., 2011; Majumdar et al., 2003; Nagy et al., 2016; O'Brien et al., 2018). וויסות עלייה של Wnt9b המובע UB, הידוע כמווסת היבטים רבים של נפרוגנזה, בכליות Gdnfhyper/היפר עשויה לחקות את הביטוי הכפוי שלו ב-NPs, מה שמשבש את שיווי המשקל שלהם לעומת דיפרנציאציה (Kiefer et al., 2012), ובכך תורם באופן מכניסטי. לחידוש עצמי של NP לא מאוזן ב-Gdnfhyper/hyper nephrogenesis. זה נתמך על ידי מורפולוגיה משופרת של העצות על עיכוב WNT קנוני על ידי IWR1 בכליות שלמות העומדות בפני עודף GDNF.

טבלה 2. גנים מופרשים של GDNF עם פוטנציאל להשפיע על תוכנית נפרוגני

התוצאות שלנו מראות כי לעיכוב IWR1 עצמו יש השפעה גדולה על NPCs, אשר מפוזרים ונצמדים באופן רופף לעצות UB. עיכוב WNT קנוני ב-NPCs עצמם תורם ככל הנראה לאי הגדלת הפנוטיפ שלהם בנוכחות עודף GDNF. זה נתמך על ידי הניסויים הגנטיים שלנו שבהם הורדת ביטוי Wnt11 המובע על ידי UB ברקע Gdnfhyper/היפר שיפרה את התחזוקה וההתמיינות של NP, אך לא הצליחה להציל את ההיפופלזיה הכלייתית הנגרמת על ידי עודף GDNF. זה יכול להיות לפחות חלקית בגלל הכישלון בהשבתת שני האללים של Wnt11 ברקע Gdnfhyper/היפר עקב הקטלניות העוברית של Wnt11-/- (Nagy et al., 2016). לפיכך, אלל Wnt11 שנותר אחד עשוי אפילו להגדיל את מפל ה-GDNF כפי שהוצע קודם לכן (Majumdar et al., 2003) ובכך לאסור בחלקו הצלה מלאה של נפרוגנזה. המחקר הנוכחי שלנו לא יכול לשלול את האפשרות שחלק מההשפעות של GDNF על NPs נובעות מאותות GDNF לא קנוני, שכן קולטני האיתות החלופיים הפוטנציאליים שלו מתבטאים על ידי ה-NPs (Brodbeck et al., 2004; Enomoto et al., 2004; Keefe Davis et al., 2013; Paratcha et al., 2003). עם זאת, גם מחיקה של NCAM וגם ביטוי של Gfra1 ב-UB בלבד (על ידי הנחתו תחת שליטת ה-Ret promoter) שומרים על פנוטיפ כליות תקין (Cremer et al., 1994; Heuckeroth et al., 1999; Keefe Davis et al., 2013; Rossi et al., 1999; Sariola and Saarma, 2003). זה מצביע על כך שלפחות כשלעצמם, לא NCAM ולא GFRa1 חיוניים לתוכנית הנפרוגנית. לסיכום, הניסויים שלנו מצביעים על כך ש-GDNF, שהיה, וכיום נמצא, בניסויים קליניים למחלת פרקינסון (Kirkeby and Barker, 2019), עשוי לשאת פוטנציאל לשמש אמצעי פרוספקטיבי לשיפור הקניית נפרון בעתיד. יש צורך בניסויים נוספים כדי לזהות אמצעים אפשריים להפעלה מוגזמת של איתות GDNF ללא השפעות מזיקות על צמיחת הכליות

חומרים ושיטות

חיות

פרוטוקולי טיפול ומחקר בבעלי חיים בוצעו בהתאם לקוד ההתנהגות האתי לניסויים בבעלי חיים וכן להנחיות האיחוד האירופי (הנחיה 2010/EU/63), ואושרו על ידי המועצה הלאומית לניסויים בבעלי חיים של פינלנד. עכברים שוכנו בכלובים מאווררים בנפרד עם מזון ומים באופן חופשי. לחות וחימום מיטביים סופקו ללא הרף במרכז החיות המעבדתי המוסמך של אוניברסיטת הלסינקי. היצירה והגנוטיפ של דגמי העכברים Gdnfhyper (Kumar et al., 2015) ו-Fgf9;20 (Barak et al., 2012) תוארו בעבר. Gdnfhyper; גורים Wnt11− הם מהצלבות של C57BL6 Wnt11−

טבלה 3. סיכום הגנוטיפים של צאצאים מ-Gdnfwt//hyper;Wnt11 plus /− צלבים

(Nagy et al., 2016) ו-Gdnfhyper lines, ועברו גנוטיפ כפי שתואר קודם לכן (Kumar et al., 2015; Nagy et al., 2016 ). כל קווי העכבר ששימשו במחקרים נשמרו על רקע מעורב 129Ola/ICR/C57bl6. הדור של עכברי נוקאאוט Crlf תואר בעבר (Alexander et al., 1999). גנוטייפ PCR בוצע באמצעות ערכת פריימרים ספציפית ל-Neo (5'-AGAGGCTATTCGGCTATGACTG-3' ו-5'-CCTGATCGACAAGACCGGCTTC-3') יחד עם ערכות פריימרים ספציפיות לגנים עבור Crlf1 (5{10}-GCCGTTAATAGG 18}}′ ו-5'-GACCCTATCTGCGTTTTCCA-3′). איסוף רקמות עוברים בוצעו על פי הקריטריונים של Theiler (1989) כפי שתואר קודם לכן (Kuure et al., 2005) ונאספו לאחר פריקה צווארית של נקבות בהריון בהרדמה עמוקה עם CO2. גורים עובריים מאוחרים ואחרי לידה הוקרבו באמצעות עריפת ראש. רקמה נותחה במדיום של Dulbecco בתוספת של 0.2 אחוז אלבומין בסרום בקר (BSA) ולאחר מכן קיבוע עם 4 אחוז פרפורמלדהיד (PFA) או תרבית איברים. תרבית איברים כליות שבודדו מעוברי עכברים E11.5 ו-E12.5 הונחו בממשק אוויר-נוזל הנתמך על ידי מערכת ממברנות פוליאסטר Transwell® (Costar) ותופחו ב-37 מעלות באווירת לחות של 5 אחוז CO2 עם מדיום תרבית כליות [F12 :DMEM (1:1) בתוספת Glutamax (Gibco)] בתוספת של 10 אחוז סרום בקר עוברי ופניצילין-סטרפטומיצין (Ihermann-Hella and Kuure, 2019). עבור תרבית חוץ-גופית עם GDNF אקסוגני של 100 ng/ml (ProSpec Ltd) (Sainio et al., 1997) שמטרתה כימות NPC, כל בלוק אורוגניטלי המכיל metanephros, הבסיס הכליות הסופי, צומצם בחצי לאורך linea mediana ventralis. מחצית מכל דגימה תורבת עם GDNF אקסוגני ואילו המחצית השנייה שימשה כביקורת. ניסויי עיכוב WNT נבדקו לראשונה עם 50-100 ng/ml GDNF ו-50-100 µM IWR1 (I0131-25, Sigma-Aldrich). בהתבסס על ניסויי תלות במינון אלו הריכוזים האופטימליים היו 50 ננוגרם/מ"ל GDNF ו-75 מיקרומטר IWR1. היסטולוגיה וצביעה חיסונית עבור מחקרים שחקרו את סמן העניין בחתכי פרפין, נותחו כליות מהעוברים או הגורים בשלבים המצוינים, ולאחר מכן עיבוד רקמות וחיתוך כפי שתואר קודם לכן (Li et al., 2019). בכל ניתוח נעשה שימוש במינימום חמישה מקטעים מכל כליה ושלוש עד חמש כליות שונות לכל גנוטיפ. מספרי המדגם המדויקים מסופקים באגדות הדמויות. המטוקסילין ו-Eosin (H&E) ואימונוהיסטוכימיה שבוצעו על קטעי פרפין הושלמו כפי שתואר קודם לכן (Li et al., 2019). בקצרה, הרקמה המנותחת תוקנה בן לילה עם 4 אחוזי PFA (pH 7.4), ולאחר מכן התייבשות ופראפיניזציה עם מעבד רקמות אוטומטי (Leica ASP 200). קטעים בעובי של 5 מיקרון הוכנו והוסרו מהשעווה ב-Xylene ולאחר מכן נטילת הידרדרות לפני צביעה ב-Harris H&E או שעברו אחזור אנטיגן המושרה בחום במאגר לשחזור אנטיגן (10 mM Citrate; pH 6.0). לצביעה חיסונית, 3 אחוזי BSA שימשו לחסימה (שעה בטמפרטורת החדר) ואחריו 30 דקות טיפול במי חמצן של 0.5 אחוז לצביעה כרומוגנית. מקטעים הודגרו עם נוגדנים ראשוניים למשך הלילה ב-4 מעלות פלוס ולאחר מכן דגירת נוגדנים משניים ספציפיים למין למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. זיהוי כרומוגני יושם עם ערכת EnVision Detection System-HRP (DAB) (Dako).

איור 8. ירידה גנטית של רמת Wnt11 מצילה חלקית אובדן אבות נפרון בכליות Gdnfhyper/היפר. (א) שישה 2-אבי נפרון חיוביים (NP, אדום) דלילים בכליות E14.5 Gdnfhyper/hyper kidneys (ממוצע של 29.8 NPs/טיפ ב-552 עצות שנותחו בתשע כליות). (ב) Gdnfhyper/hyper;Wnt11 פלוס /− כליות מראות עלייה בשפע הכללי של NPs לכל נישה בהיעדר אלל Wnt11 אחד (ממוצע של 40.7 NPs/טיפ ב-107 עצות שנותחו בארבע כליות ). (C,D) PAX2-תאים חיוביים ב-Gdnfhyper/hyper (C) ו-Gdnfhyper/hyper; כליות Wnt11 plus /− (D) מציגות דפוסים וכמות דומים ב-E14.5. (EH) ב-P0, צביעת SIX2 מדגימה שיפור במספרי NP על ידי הסרת אלל Wnt11 אחד (ממוצע של 20.3 NPs/טיפ ב-610 Gdnfhyper/hyper tips לעומת ממוצע של 30.9 NPs/tip ב-Gdnfhyper/hyper plus /W−n; טיפים מנותחים בשש כליות/גנוטיפ), אשר נתמך על ידי צביעה PAX2. התפלגות של SIX2- NP חיוביים (A′,B′,E′,F′) ו-PAX2- תאים חיוביים (C′,D′,G′,H′) מוצגות ללא קלבינדין ( אות ירוק), המתאר את אפיתל UB בכל הכליות. פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר.

כליות E11.5 ו-E12.5 שהיו נתונות לצביעה אימונופלואורסצנטית שלמה היו מקובעות וחוללו עם 100 אחוז מתנול קר כקרח למשך 10 דקות לפני דגירה לילה עם נוגדנים ראשוניים. דגירה עם הנוגדנים המשניים הספציפיים למין התואמת יושמה ביום השני לאחר שטיפה נמרצת עם PBST (0.1 אחוז Tween 20 ב-PBS). פרטים על הנוגדנים הראשוניים והמשניים המשמשים במחקר הנוכחי מפורטים בטבלה S1. הכלאה באתרו הכלאה באתרו בוצעה כפי שתואר קודם (Ihermann Hella et al., 2014). בקצרה, בדיקה אנטי-חושית של RNA נגד אקסונים של Gdnf הועתקה והכלאה על מקטעים עבים שמקורם בכליות P4 (10-15 מקטעים/כליה, n=3 כליות/גנוטיפ) המוטבעים ב-4% אגרוז נמס נמוך (NuSieve GTG, לונזה). BM Purple שימש לתגובה קולורימטרית

רמות החלבון של ELISA GDNF בכליות P7.5 נמדדו באמצעות ELISA כפי שדווח בעבר (Kumar et al., 2015). GDNF Emax® Immunoassay (Promega) שימש עם טיפול בחומצה בעת ביצוע ה-ELISA. בפירוט, עבור כל גנוטיפ, שלוש כליות נותחו מיד לאחר ניתוח. לאחר מדידת ריכוז החלבון עם DC חלבון Assay (Bio-Rad), 25 מיקרוגרם של חלבון כולל הועמסו לתוך הבאר על צלחת ELISA. כל דגימה נותחה בשני עותקים.

הדמיה צביעה חיסונית והכלאה במקום על קטעים צולמו באמצעות Zeiss AxioImager המצויד במקור האור הקרינה HXP 120V, מצלמה של Hamamatsu Orca Flash 4.0 LT B&W ומצלמת צבע Zeiss AxioCam 105 , או עם Leica DM5000B המצויד במקור אור Leica EL 6000 מתכת הליד ומצלמת Hamamatsu Orca-Flash4.0 V2 sCMOS. צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה בהר צולמה באמצעות Zeiss AxioImager עם יישום Zeiss ApoTome. הדמיה מלאה למדידת גודל כליה שלמה בוצעה באמצעות Leica MZFLIII המצויד במצלמת Leica DFC7000T. ניתוחים כמותיים המבוססים על צביעה חיסונית והדמיה כימות של הצפיפות הגלומרולרית חושבו מהחתכים העוקבים של כליות E18.5 ו-P7. הכליות נחתכו, וחתכים לכימות גלומרולרית נבחרו כל 125 מיקרומטר כדי למנוע ספירת איטרציות של גלומרולי. מספר הגלומרולי בכל מקטע נספר באופן ידני והשטח של כל כליה נמדד עם תוכנת Fiji ImageJ (V1.51) באמצעות התוויה ידנית של קווי המתאר. כדי לחשב את הצפיפות הגלומרולית, המספר הכולל של גלומרולים

איור 9. סכמטי של ההשפעות של עודף GDNF על כליות עכברים מתפתחות. (א) בכליות עובריות העוברות צמיחה פעילה, תאי אבות הנפרון (NPC, אדום) מקבלים אותות הנחיה מופרשים (למשל Wnt11 ו-Wnt9b) מקצות ניצני השופכן (UBT, כחול כהה) כדי לשלוט באיזון של שגשוג NP וחידוש עצמי והתמיינותם לצברים פריטובולריים (PA, צביר תאים ורוד). (ב) בכליות לאחר לידה, זהות הקצה של ה-UB (UB, תכלת) אובדת, כפי שמעידה מולקולרית על ידי הירידה בביטוי של למשל Wnt9b, Wnt11, Crlf1 ו-Etv4/5, המסומנת באותיות אדומות דקות. אובדן הדרגתי של הגורמים המופרשים שמקורם ב-UB (Wnt9b, Wnt11 ו-Crlf1) תורם לדעיכה של התפשטות ה-NP וההתחדשות העצמית. במקביל, רמות GDNF ו-FGF יורדות, מה שחפף עם התמיינות NP מואצת. אלה ביחד מדללים את מאגר ה-NP במהירות וכתוצאה מכך להפסקת הנפרוגנזה. (ג) עודף GDNF בכליות עובריות משרה מורפולוגיה חריגה של UBT ומגביר את הביטוי של מולקולות הרגולציה המופרשות מניצנים (Crlf1, Sign, Wnt11 ו-Wnt9b). לביטוי עודף של מולקולות מופרשות שמקורן בניצנים יש השפעה מעכבת על מחזור תאי ה-NP וכתוצאה מכך הפחתת שגשוג וחידוש עצמי. ירידה במספרי NP הכוללים מאטים את הבידול של PA, כפי שזוהה על ידי ביטוי Wnt4 מופחת. (ד) בכליות שלאחר הלידה, המורפולוגיה של UBT, ובכך הנישה שהיא מספקת ל-NPS, מתנרמלת למרות הביטוי הגבוה מה-WT של מטרות מופרשות שמקורן בניצנים (Crlf1, Etv4/5 ו-Lama1). יחד עם Wnt9b ו-Wnt11 מנורמלים (לא מוצגים), השינויים המולקולריים הללו מסבסדים שגשוג NP נורמלי, התחדשות עצמית והתמיינות, כפי שמעידים על שמירה על אוכלוסיית NP גדולה, ביטוי Wnt4 גבוה יותר וכמות דומה של מבשרי נפרון (צבירים ורודים). של תאים) כמו בכליות עובריות WT. באמצעות מנגנונים כאלה, עודף GDNF מכונן תחת מקדם משלו מאפשר לתוכנית הנפרוגני להמשיך עד P7. טקסט אפור כהה, הבעה ללא שינוי; טקסט אדום, ירידה בביטוי; טקסט ירוק, ביטוי מוגבר.

ומספר הגלומרולי בקורטקס נספר בנפרד. לאחר מכן חושבו השטח הכולל הממוצע של הכליות ומספרי הגלומרולים הכוללים והקורטיקליים עבור כל דגימה. הצפיפות הגלומרולרית הממוצעת חושבה על ידי חלוקת המספר הגלומרולרי הממוצע בשטח הנמדד הממוצע. הממוצע של גלומרולי קליפת המוח בתוך כל השטח הממוצע חושב על ידי חלוקת המספר הממוצע של קליפת המוח בשטח הכולל הנמדד הממוצע. רק גלומרולים בעלי צורות שלמות תועדו. כימות של סך ה-SIX2- NPS חיובי ב-E11.5 (n=4 עבור WT, n=5 עבור Gdnfhyper/hyper) ו-E12.5 (n=10 kidneys/ טיפול, שלושה ניסויים בלתי תלויים) התבססו על צביעה אימונופלואורסצנטית שלמה. התמונות צולמו עם היישום של Zeiss ApoTome ולאחר מכן עובדו עם Imaris Software (Bitplane) באמצעות מעקב נקודתי. כל התמונות עובדו עם פרוטוקולי ניתוח זהים. על מנת לנרמל את השונות בין ההמלטה, הכמות הממוצעת של SIX2- NPs חיוביים בכליות WT בתוך כל המלטה נקבעה ל-100 אחוז, והכמות של SIX2- NPs חיוביים ב-Gdnfhyper /hyper kidneys הושוו עם הכמות הממוצעת בכליות WT בתוך המלטה. האינדקס המיטוטי של SIX2- NPS חיובי בכליות E12.5 (n=10 כליות/טיפול, שלושה ניסויים עצמאיים) שתורבתו עם GDNF אקסוגני חושבו בצורה דומה כדי לנרמל את השונות בין ההמלטה.

השיעור הממוצע של שגשוג של SIX{{0}} NPs חיוביים בכליות WT ובכליות שהתרבו ללא GNDF אקסוגני בתוך כל המלטה נקבע ל-100 אחוז והשיעור של SIX מתרבים{{2 }} NPs חיוביים בנוכחות עודף GDNF (Gdnfhyper/hyper kidneys ויישום אקסוגני) מאותה המלטה זוממה באיור לאחר השוואה עם חברי ה-WT. האינדקס המיטוטי של NPS 2-חיובי SIX בכליות E11.5 שהתרביתו עם GDNF אקסוגני נרשמו כנתונים/ערך המקורי. החישוב של SIX2- NPS חיובי הממוצע לכל נישה נפרוגני (E14.5 ו-P0) ונישות נפרוגניות עם אבות (P3-P6) בוצעו על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית בחתכי פרפין. מספר ה-SIX2-NPS החיוביים נספר עם תוכנת Fiji ImageJ (V1.51) בכל חלק שנבחר לניתוח באמצעות ניתוח חלקיקים ומספר העצות נספר באופן ידני בקטעים המתאימים. מספר הדגימות המנותחות ב-E14.5 היה שלוש כליות עבור WT ו-Gdnfhyper/hyper kidneys ושתי כליות עבור Gdnfhyper/hyper; Wnt11 פלוס /−. מספר העצות שנותחו ב-E14.5 היה 207 ב-WT, 431 ב-Gdnfhyper/hyper ו-107 עבור Gdnfhyper/hyper; Wnt11 פלוס /− כליות. מספר הדגימות המנותחות ב-P0 היה שלוש כליות לכל גנוטיפ, ומספר העצות המנותחות, המוצגות באיורים המקבילים, נעים בין 10 ל-315, כשהם הנמוכים ביותר בכליות WT P6, שבהן הקצוות נמצאים רק לעתים רחוקות. מדידות קצה UB בוצעו באמצעות תוכנית LAS X של מערכת ההפעלה מיקרוסקופ Leica לאחר תרבית של 48 שעות בנוכחות כימיקלים שצוינו והדמיה של העצות עם נוגדן E-cadherin (טבלה S1). העצות נמדדו משש כליות בכל מצב של שתי קבוצות בלתי תלויות של ניסויים שבהם מספר העצות שנמדדו היה: 101 עבור GDNF, 131 עבור IWR1 ו-115 עבור 75 מיקרומטר IWR1 בתוספת 50 ננוגרם/מ"ל GDNF. מדידות גודל הכליות בניסויים העריכו את ההשפעה של מחיקת Wnt11 ברקע Gdnfhyper/היפר נערכו עם תוכנת Fiji ImageJ (V1.51) על תמונות שלם באמצעות מעקב ידני של קווי המתאר של הכליה. ניתוח סטטיסטי כל הערכים מוצגים כממוצע ± sem מלבד ניתוח ההשפעות העיקרי של Gdnf ו-Wnt11 על גודל הכליה, אשר מוצג כממוצע ± sd מובהקות סטטיסטית נקבעה ב-P<0.05 for="" all="" the="" analyses.="" independentsamples="" two-tailed="" t-test="" was="" used="" for="" pairwise="" comparisons="" with="" spss="" statistics="" software="" (ibm;="" version="" 25)="" in="" the="" study="" unless="" otherwise="" noted.="" the="" data="" obtained="" via="" in="" vitro="" tissue="" culture="" with="" exogenous="" gdnf="" was="" analyzed="" with="" the="" paired-sample="" t-test="" using="" spss="" statistics="" software.="" the="" impact="" of="" genetically="" modified="" gdnf="" and="" wnt11="" expression="" on="" kidney="" size="" was="" analyzed="" via="" two-way="" anova="" followed="" by="" main="" effects="" test="" with="" spss="" statistics="" software.="" the="" statistical="" significance="" for="" the="" deviation="" of="" gene="" distribution="" from="" mendelian="" ratio="" was="" performed="" using="" the="" χ2="" test="" also="" with="" spss="" statistics="" software.="" the="" data="" obtained="" from="" elisa,="" qrtpcr,="" and="" wnt="" inhibition="" experiments="" were="" analyzed="" with="" one-way="" anova="" followed="" by="" bonferroni="" posthoc="" test="" using="" spss="" statistics="" software.="" reverse="" transcription="" and="" quantitative="" rt-pcr="" (qrt-pcr)="" experiments="" were="" conducted="" as="" previously="" reported="" (kumar="" et="" al.,="" 2015).="" in="" more="" detail,="" 150-500="" ng="" of="" total="" rna="" from="" each="" sample="" (n="3" kidneys/genotype="" at="" the="" given="" stage)="" was="" treated="" with="" rnase-free="" dnase="" i="" (thermo="" fisher="" scientific).="" the="" reverse="" transcription="" reaction="" was="" performed="" with="" random="" hexamer="" primers="" and="" revertaid="" reverse="" transcriptase="" (thermo="" fisher="" scientific)="" immediately="" after="" inactivation="" of="" dnase="" i="" with="" 5="" mm="" edta="" at="" 65°c.="" complementary="" dna="" (cdna)="" was="" diluted="" 10×="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" qrt-pcr.="" for="" qrt-pcr,="" lightcycler="" 480="" sybr="" green="" i="" master="" (roche)="" or="" bio-rad="" c1000="" touch="" thermal="" cycler="" upgraded="" to="" cfx384="" system="" (bio-rad),="" supplied="" with="" sybr="" green="" i="" master="" (roche)="" and="" 250="" pmol="" primers="" were="" loaded="" into="" the="" well="" of="" 384-well="" plates="" with="" a="" total="" volume="" of="" 10="" µl.="" negative="" control="" was="" always="" included="" in="" every="" reaction="" via="" setting="" conditions="" with="" minus-reverse="" transcription="" or="" water.="" a="" combination="" of="" pgk1,="" hprt,="" and="" gapdh="" was="" used="" as="" the="" reference="" genes="" in="" all="" the="" qrt-pcr="" experiments,="" except="" the="" one="" with="" p7.5="" kidneys,="" in="" which="" mouse="" actb="" as="" the="" reference="" gene.="" primer="" sequences="" can="" be="" found="" in="" table="">

תודות אנו מודים לצוות של יחידות הביומדיקום הדמיה ומיקרוסקופיה אור במכון הלסינקי למדעי החיים (HiLIFE) על עזרתם רבת הערך בניתוח תמונות ובטכניקות הקשורות לכימות. עכברי Wnt11 סופקו בחביבות על ידי פרופסור Seppo Vainio (אוניברסיטת אולו, פינלנד) ונשלחו למרכז חיות המעבדה של HiLIFE, אוניברסיטת הלסינקי