קביעת תוכן של חמש תרכובות בזרע Rehmanniae וביסוס טביעת האצבע של HPLC

טבלה 3 תוצאות של בדיקת שחזור (n=6)

2.4 קביעת מדגם

שש המנות של Rehmannia שנאספו הוכנו לפי השיטה ב-"2.2.2" ונדגמו ונקבעו לפי התנאים הכרומטוגרפיים ב-"2.1". התוצאות של קביעת התוכן מוצגות בטבלה 4. התוצאות מראות שבין חמשת המרכיבים, התוכן של rehmannia glycoside D הוא הגבוה ביותר, נע בין 0.460% ל-{{1 0}}.730%; תכולת הגליקוזיד של leonuri היא שניה, נעה בין 0.100% ל-0.270%, ותכולת שני הרכיבים בדגימות מאזורי ייצור שונים אינה שונה באופן משמעותי. בדגימה SX1, למעט echinacoside, התוכן של ארבעת הרכיבים האחרים גבוה משמעותית מאלה של קבוצות אחרות של דגימות; התוכן של echinacoside, cistancheside A ו-verbascoside ב-Rehmannia glutinosa מאזורי ייצור שונים שונה למדי ואינו סדיר.

CISTANCHE עשב עםעקביות באיכות טובה

2.5 ביסוס והערכת דמיון של טביעת אצבע HPLC של Rehmannia glutinosa

הכרומטוגרמות והנתונים של קביעת התוכן מרובה הרכיבים ב-Rehmannia glutinosa יובאו לתוכנה "מערכת הערכת דומה טביעות אצבע כרומטוגרפית של רפואת הצמחים הסינית (2012 Edition)", ונבחרה הכרומטוגרמה של מדגם הבדיקה SX1 כספקטרום הייחוס. רוחב חלון הזמן הוגדר ל-0.10 דק', והשיטה החציונית שימשה ליצירת ספקטרום וספקטרום התייחסות. בסך הכל זוהו 23 פסגות נפוצות (ראה איור 3). הדמיון בין טביעות האצבע של דגימת Rehmannia glutinosa וההתייחסות היה 0.904~0.950, מה שמצביע על כך שהדגימות של Rehmannia glutinosa מאזורי ייצור שונים ובין Rehmannia glutinosa הגולמית ל-Rehmannia glutinosa המבושלת היו דומות ובעלות עקביות באיכות טובה.

טבלה 4 תוצאות קביעת תוכן של 5 רכיבים ב-Semen Rehmanniae/%

13. rehmannioside D; 17. ליאונוריד; 19. echinacoside; 20. קסטנוזיד A; 21. אקטאוזיד

איור 3 שכבת-על של כרומטוגרמות HPLC של 6 קבוצות של זרע Rehmanniae (SX1-SX4, HN1, HN2) והפניה (R)

3 דיון

3.1 בחירת תנאים כרומטוגרפיים

במחקר זה נחקרו ארבע מערכות פאזות ניידות, אצטוניטריל-מים, אצטוניטריל-0.1% תמיסת חומצה בורית, מתנול-מים ותמיסת מתנול-0.1% חומצה פורמית. התוצאות הראו שלחמשת הרכיבים היו השפעות הפרדה טובות במערכת האצטוניטריל; בהשוואה למערכת הפאזות הניידות של acetonitrile-water, השיאים של rehmannia glutinosa ו-motherwort glycosides ב-acetonitrile-0.1% פאזה ניידת של תמיסת חומצה פורמית היו צרים יותר והיו בעלי סימטריית שיא טובה. יחד עם זאת, בשל הספיגה האולטרה סגולה השונה של חמשת המרכיבים, תכולת הרכיבים משתנה מאוד. על מנת לקבוע בצורה מדויקת יותר את התוכן של כל רכיב ולהבטיח שעוצמת הספיגה של חמשת הרכיבים תתפזר שווה באותה כרומטוגרמה, הספיגה האולטרה סגולה שלrehmannia glycoside D, נותחו את הגליקוזיד של ה-Motherwort, Echinacoside, cistancheside A ו-verbascoside, ונבחרה קביעת אורך גל משתנה, כלומר, 0-24 דקות, הגליקוזיד של rehmannia המופרד הראשון נקבע ב-203 ננומטר ו-24-40 דקות, האכינאקוסיד המופרד, ה-cistancheside A וה-verbascoside נקבעו ב-330 ננומטר. בנוסף, מחקר זה חקר גם את השפעות המיצוי של מתנול, תמיסת מתנול 70%, תמיסת מתנול 50% ו-50% תמיסת אצטוניטריל כממסי מיצוי. התוצאות הראו שתמיסת מתנול של 70% כממס המיצוי יכולה להמיס טוב יותר את הרכיבים שייבדקו, ובדגימה המופקת יש פחות זיהומים. לכן, מחקר זה בחר ב-70% מתנול כממס המיצוי, acetonitrile-0.1% תמיסת חומצה פורמית כמערכת הפאזות הניידות, והשתמש באורך גל משתנה כדי לקבוע את התוכן של חמשת הרכיבים ב-Rehmannia.

3.2 ניתוח תוצאות קביעת המדגם

מתוצאות הקביעה ניתן לראות כי לאחר האידוי, למעט עלייה קלה בתכולת האכינאקוסיד, פחתה משמעותית תכולת ארבעת הרכיבים האחרים, בעיקר תכולת הליאונוריסיד והציסטנצ'סיד A; התוכן של rehmannia glycoside D ושל cistancheside A ב-Rehmannia glutinosa מאותו אזור ייצור היה שונה במקצת, ותכולת leonuriside, echinacoside ו-verbascoside הייתה שונה באופן משמעותי; תכולת האכינאקוסיד ב-Rehmannia glutinosa מאזור הייצור בהנאן הייתה גבוהה משמעותית מזו של הדגימות מאזור הייצור של Shanxi, והתכולה של ארבעת הרכיבים האחרים הייתה שונה במקצת. יחד עם זאת, על פי טביעת האצבע של HPLC שנקבעה במחקר זה, הדמיון בין 6 הקבוצות של דגימות Rehmannia לבין טביעת האצבע של הבקרה היה 0.904~0.950, מה שמצביע על כך שהכימיקל העיקרי הרכיבים של 6 קבוצות של דגימות Rehmannia לפני ואחרי העיבוד היו עקביים ביותר.

לסיכום, שיטת קביעת התוכן וטביעת האצבע של HPLC שנקבעו במחקר זה מדויקות, אמינות ובעלות ספציפיות טובה. ניתן להשתמש בהם לאפיון השינויים ברכיבים ומידת העיבוד של Rehmannia glutinosa לפני ואחרי העיבוד, ולספק תמיכה טכנית לבקרת האיכות של Rehmannia glutinosa. עם זאת, למחקר זה יש את החסרונות של קבוצות דגימות קטנות וכיסוי לא שלם של אזורי ייצור, מה שמצריך ניתוח ואימות נוספים.

הפניות

[1] ועדת הפרמקופיה הסינית. פרמקופיה של הרפובליקה העממית של סין: כרך 1 [S]. בייג'ינג: China Medical Science and Technology Press, 2020: 129-130.

[2] שו ג'ון, פו ג'טונג. מחקר על האבולוציה ההיסטורית של השמות של Rehmannia glutinosa המעובד וחקר יעילותה [J]. רפואת פטנטים סינית, 2017, 39 (9): 1913-1916.

[3] Zhu Jue, Zhu Xiangmei, Shi Yuhe, et al. התקדמות המחקר על Rehmannia glutinosa וניתוח חיזוי של סמני האיכות שלה [J]. רפואת פטנטים סינית, 2022, 45 (2): 1273-1281.

[4] Chen Jinpeng, Zhang Kexia, Liu Yi, et al. התקדמות המחקר על ההרכב הכימי וההשפעות הפרמקולוגיות של Rehmannia glutinosa [J]. רפואת צמחי מרפא סינית, 2022, 52 (6): 1772-1784.

[5] לי הונגוויי, מנג שיאנגל. התקדמות המחקר על רכיבים כימיים והשפעות פרמקולוגיות של Rehmannia glutinosa［J］.

Drug Evaluation Research, 2015, 38(2): 218-228.

[6] Zhang Boyong, Jiang Zhenzuo, Wang Yuefei, et al. ניתוח רכיבים כימיים של Rehmannia glutinosa טרי, Rehmannia glutinosa גולמי ו-Rehmannia glutinosa מבושל על ידי UPLC/ESI-Q-TOF MS［J］. רפואת פטנטים סינית, 2016, 38(5): 1104-1108.

[7] Zhang Lixian, Wei Yue, Li Feifei, et al. זיהוי דפוסי טביעת אצבע וקביעת תוכן מרובה רכיבים של מוצרי Rehmannia glutinosa מעובדים שונים［J］. Hubei Agricultural Sciences, 2023, 62(9): 135-141.

[8] Chen Jinpeng, Zhang Kexia, Liu Yi, et al. התקדמות המחקר על רכיבים כימיים והשפעות פרמקולוגיות של Rehmannia glutinosa［J］. רפואת צמחי מרפא סינית, 2021, 52(6): 1772-1784.

[9] Tao Yi, Jiang Yanhui, Tang Kejian, ועוד. מחקר השוואתי של רכיבים כימיים של Rehmannia glutinosa לפני ואחרי עיבוד על ידי UHPLC-Q-TOF/MS［J］. New Chinese Medicines and Clinical Pharmacology, 2016, 27(1): 102-106.

［10］ Xu Zhuo, Dai Xinxin, Su Shulan, et al. הצטברות דינמית של רכיבי נוקלאוזיד וחומצות אמינו ב-Rehmannia glutinosa מבוסס על UPLC-TQ-MS［J］. רפואת צמחי מרפא סינית, 2021, 52(23): 7323-7330.

［11］ לי יוג'יאו. מחקר על טכנולוגיית העיבוד והמנגנון של "תשע אידוי ותשע חשיפה" של Rehmannia glutinosa［D］. ג'ינאן: אוניברסיטת שאנדונג, 2023.

［12］ Wang Yue, Zhou Qiao, Zhang Xuelan, et al. HPLC קביעה בו-זמנית של תכולת שמונה רכיבים ב-Rehmannia glutinosa והמוצרים המעובדים השונים שלה על ידי ניתוח טביעות אצבע UPLC וקביעת תכולת רכיבים מרובי אינדקסים [J]. Chinese Medicinal Materials, 2021, 44 (7): 64-68.

[13] Guo Xiaokai, Xue Shujuan, Chen Suiqing. הערכת איכות של Rehmannia glutinosa מבוססת על טביעת אצבע UPLC וקביעת תוכן רכיבים מרובי אינדקס [J]. Chinese Medicinal Materials, 2021, 44 (4): 917-923.