השוואה בין שני מבחני אבחון לזיהוי נוגדן מנטרל סרום לנגיף שלשול מגפת חזירים

תַקצִיר:

חסינות לקטוגני חשובה להגנה על חזרזירים מפני פתוגנים רבים, כולל נגיף השלשולים של מגפת חזירים. זרימת רמות נוגדנים מנטרלים בסרת זריעה עשויה לעזור לקבוע אם תגובה חיסונית הניתנת לזיהוי יכולה להעניק הגנה לחזרזירים. ניתן לזהות נוגדנים מנטרלים באמצעות מבחני אבחון שונים. מחקר זה העריך את המאפיינים האבחוניים של שני מבחני נוגדנים מנטרלים עבור נוגדנים המנטרלים נגיף של מגפת חזירים של מגפת חזירים בסרום של זיבים מאוגרים. ארבע קבוצות טיפול, ביקורת, לא מחוסנות, מחוסנות לפני התגרות ומחוסנות בעקבות התגרות, היו מורכבות מ-20 זבים. דגימות סרום נאספו מכל מוזהב לפני ואחרי האתגר עם נגיף השלשול של מגפת החזירים. דגימות הוערכו לגבי נוכחותם של נוגדנים מנטרלים באמצעות מבחן נטרול מיקוד פלואורסצנטי ומבחן נטרול תפוקה גבוהה. רגישות אבחון וסגוליות עבור מבחני נטרול מיקוד ניאון ומבחני נטרול תפוקה גבוהה עבור מחקר זה בוצעו אופטימיזציה בחתך של דילול של 80 ו-80% הפחתת פלורסנט בהתאמה והדגימו הסכמה מתונה בהתבסס על סטטיסטיקת קאפה. ניתן להשתמש במבחני נטרול פלורסנט המיקוד ובמבחני נטרול תפוקה גבוהה כדי לנטר את המצב של נטרול נוגדנים בתוך בעלי חיים או אוכלוסיית בעלי חיים. למבחן התפוקה הגבוהה יש יתרונות על פני מבחן הפלורסנט המיקוד בכך שיש לו סגוליות גבוהה יותר בחתך המצוין ואופי התוצאות מאפשר הבחנה רבה יותר בין תוצאות בודדות.

תוסף תוסף cistanche-הגברת חסינות

מילות מפתח: PEDV; נוגדן מנטרל; בדיקת אבחון

1. הקדמה

וירוס מגפת חזירים (PEDV) הוא נגיף אלפאקורונה שהפך אנדמי ביבשת אמריקה בעקבות הופעתו בארצות הברית בשנת 2013 [1-3]. אמצעי אבטחה ביולוגית מתמקדים בהרחקת פתוגנים כגון PEDV מעדרי החזירים כדי למתן את השפעת המחלה [4]. בדיקות סרולוגיה הן כלי שימושי כדי לקבוע אם חזירים נחשפו בעבר ונדבקו בפתוגן. חשיפה יכולה להתרחש באופן טבעי (לדוגמה, בליעה של חומר עמוס בווירוסים) או בכוונה (למשל, שילוב עם חיות זרעים נשפכות, חיסון אוראלי-אף או שטיפת קיבה). למטרות מחקר זה, החשיפה הושגה על ידי אתגר מכוון עם הומוגנית רקמה חיובית ל-PEDV מהתפרצות קלינית מאושרת של PEDV. שיר ועוד. [5] הוכיח כי טיטרי נוגדנים מנטרלים בסרום לא היו שונים בין זרלות שקיבלו חיסון PEDV DR13 מוחלש דרך תאי Vero או תוך-שרירי. מחקר זה גם הראה שלשורות מחוסנות דרך הפה הייתה תמותה נמוכה יותר של חזרזירים בהשוואה לחיסון תוך שרירי. בנוסף, de Arriba et al. [6] הוכיח מתאם בין תאים מפרישי נוגדנים מסוג IgA ו-IgG (ASC) בדם וברקמת הלימפה הקשורה למעי. השליה המפוזרת, האפיתליוצ'ורית של זרולים מונעת העברת תאי חיסון ונוגדנים לחזרזירים ברחם מה שהופך את החזירים לאגממגלובלינמיים בלידה [7]. חסינות אימהית מועברת מזורים לחזרזירים שלהן באמצעות הפרשות חלב וממלאת תפקיד קריטי בהגנה מפני פתוגנים אנטריים כגון PEDV, TGEV, ו-rotavirus. לכן, חזרזירים מסתמכים על נוגדני קולוסטרום וחלב להגנה מפני פתוגנים אלה. אימונוגלובולינים בסרום הם תורם גדול לקולוסטרום ואילו אימונוגלובולינים בחלב מיוצרים בתוך בלוטת החלב [8]. לפיכך, מבחני נוגדנים מנטרלים עשויים לעזור לקבוע אם תגובה חיסונית הניתנת לזיהוי בסרת זריעה לפני לידה יכולה להעניק הגנה לחזרזירים. המנגנונים של נטרול נוגדנים כוללים צבירה, עיכוב כניסה ויראלית של תא המטרה ועיכוב שכפול ויראלי בתוך תא המטרה [9]. מבחני אבחון פותחו כדי לזהות נוגדנים מנטרלים ל-PEDV כולל נטרול וירוסים (VN), נטרול מיקוד ניאון (FFN) ובדיקת נטרול תפוקה גבוהה (HTNT) [2,10-13]. כפי שתואר על ידי Sarmento et al. [2], מבחן FFN הוא שיפור בהשוואה למבחן VN שכן המבחן רגיש יותר מכיוון שהמבחן מבוסס על זיהוי אנטיגנים נגיפיים המתבטאים על פני השטח של תאי Vero נגועים בעוד מבחן VN מבוסס על ההשפעה הציטופטית הנגרמת על ידי הנגיף. בנוסף, ניתן להשיג תוצאות FFN מהר יותר מאשר תוצאות VN מכיוון שלוקח יותר זמן לראות את ההשפעה הציטופטית בהשוואה להתקשרות ויראלית עם FFN. מבחן HTNT הוא שיפור נוסף על מבחן FFN שכן מבחן HTNT מסתמך על ציטומטריית תמונה דיגיטלית ולא על פרשנות טכנאי כדי להשיג את התוצאות. לפיכך, מתן אפשרות לקריאה של צלחת שלמה תוך פחות מ-3 דקות, הפקת מדידה כמותית בעוצמת ניאון, ואפשרות לאחסן תמונות לסקירה. לפיכך, נראה שה-HTNT מתאים לשימוש בעדרי חזירים מסחריים. המחקר הנוכחי השווה את המאפיינים האבחוניים (רגישות וסגוליות) וערכים ניבויים חיוביים ושליליים, של שני מבחני נוגדנים מנטרלים עבור מבחני PEDV, FFN ו-HTNT. זה מתבסס על עבודתם של סרמנטו וחב'. [2] על ידי בדיקת בעלי חיים תמימים, נגועים ומחוסנים כדי לעזור לאמת את המבחן לשימוש במעבדת אבחון בעלת תפוקה גבוהה. בהתבסס על התוצאות של Sarmento et al. [2], השערת האפס שלנו היא שאין הבדל במאפיינים האבחוניים של שני המבחנים לזיהוי נוגדני PEDV מנטרלים בנסיוב של זבים מאוגרים ב-PEDV.

תוסף תוסף cistanche-הגברת חסינות

2. חומרים ושיטות

2.1. מקורות ומבחר של חזירים

כפי שתואר בעבר על ידי Brown et al. [14], מחקר זה השתמש ב-4 קבוצות טיפול המכונות בקרה, NV (לא מחוסן), Pre (מחוסן לפני אתגר) ופוסט (מחוסן בעקבות אתגר). כל קבוצה הורכבה בתחילה מ-20 זוהבים מסחריים, הכלואים. בסך הכל 60 זביות נבחרו בנוחות מחוות חזירים מסחרית במרכז איווה שלא הייתה לה היסטוריה של PEDV. 20 הגילטים בקבוצת הביקורת היו בשימוש חוזר עבור קבוצת ה-NV. קבוצת ה-NV הורכבה מ-18 חזירים בלבד, שכן שני זבים הוסרו מהמחקר עקב סיבוכים שאינם קשורים לאתגר PEDV.

כראיה נוספת למצב שלילי של PEDV, נאספו 12 מ"ל של דם באמצעות ניקור ורידי צוואר באמצעות מד 16-, מחט 1.5- אינץ' ומזרק 12 מ"ל. הסרום נאסף מדגימות דם באמצעות צנטריפוגה ב-1.500×g למשך 8 דקות (דקות), פוצל למנות של 1 מ"ל, ואוחסן ב-80 ◦C. דגימות סרום נבדקו עם wv-ELISA במעבדה לאבחון וטרינרי של אוניברסיטת איווה (ISU-VDL, איימס, IA, ארה"ב) [15].

2.2. שיוך של בעלי חיים לקבוצות טיפול

שישים הזביות חולקו באופן שווה ל-3 קבוצות, שכל אחת מהן כללה 20 נקבות מסחריות הכלאות. כדי ליצור ארבע קבוצות טיפול, נעשה שימוש ב-20 ג'ילטים ברצף עבור שתיים מקבוצות הטיפול, CONTROL ו-NV. שימוש חוזר ב-20 הזבים איפשר את הפיתוח והשליטה של ​​קבוצה של גילטים חיוביים ל-PEDV שנחשפו ל-PEDV והפחית את המספר הכולל של בעלי חיים בשימוש במחקר. 40 הגילטים הנותרים כללו את קבוצות ה-PRE וה-POST, עם 20 גולטים בתוך כל קבוצה. ציר הזמן של אירועים לפי קבוצת טיפול מתואר ב-Brown et al. [14]. בקצרה, דגימות דם בודדות נאספו פעם בשבוע בכל קבוצת טיפול לאחר האתגר. הסבר נוסף נדון בסעיפים 2.4 ו-2.5. זבי קבוצת הטיפול "PRE" חוסנו לפני ההגעה למתקן מחוץ לאתר. קבוצת הטיפול "POST" זביות לא חוסנו עד לאחר האתגר.

2.3. שיכון וטיפול בחזירים

עם הגעתם למתקן המחקר, זביות אוכסנו בקבוצה על ידי קבוצה טיפולית: כל 20 הזביות בקבוצת טיפול היו במכלאה אחת עם הזנה אד ליביטום ומים. כל העטים היו באותו חדר. עט אחד הושאר ריק בין קבוצות NV PRE ו-POST כדי למזער את הזיהום. פיקוח על הזנה, מים, טמפרטורת החדר והעליות והנמוכות של הלחות כדי להבטיח עקביות עם תקני הייצור. תצפיות בריאות נערכו ותועדו פעם ביום כדי להעריך תנועות, עייפות, עקביות צואה וסימנים קליניים אחרים של מחלה. תג אוזן (Integra Hog, Allflex, Dallas, TX, ארה"ב) הונח באוזן הימנית של כל מוזהב לזיהוי בעל חיים אינדיבידואלי.

2.4. אתגר בעל פה

לאחר תקופת הסתגלות של 4-יום, כל גולגול ב-CONTROL נחשף דרך הפה ל-PEDV באמצעות הומוגנית רקמה שנאספה מהתפרצות קלינית מאומתת של PEDV בחווה מסחרית. ההומוגנט רושם על ידי המעבדה לאבחון וטרינרי של אוניברסיטת איווה, ונמצא שהוא אב הטיפוס האמריקאי, גנוגרופ G2b. עשרה מיליליטר של ההומוגנית עורבבו עם 590 מ"ל של תמיסת מלח מבוקרת פוספט ו-30 מ"ל מהתערובת ניתנו באופן אירוני לכל מוזהב. החיסון אושר ל-PEDV חיובי על ידי תגובת שרשרת טרנסקריפטאז פולימראז בזמן אמת, עם ערך CT של 19.6 ו-14.23 × 107 עותקים גנומיים למ"ל והתפתחות של שלשולים בזיבים בעקבות אתגר. דגימות דם בודדות נאספו כל 7 ימים לאחר האתגר באמצעות ניקור ורידי צוואר כפי שתואר לעיל עד יום 42 לאחר האתגר. סרום נקצר ואוחסן כמתואר לעיל ודגימות הוגשו ל- ISU VDL לזיהוי של נוגדנים מנטרלים על ידי מבחן נטרול ניאון ממוקד ובדיקת נטרול וירוסים בתפוקה גבוהה. ביום ה-60 לאחר האתגר הראשוני של CONTROL, 40 הזביות הנותרות הובאו למתקן המחקר ו-18 מהזיפים הפכו ל-NV. שני זובים הוסרו מ-CONTROL עקב תנאים שאינם קשורים למחקר. לאחר תקופת הסתגלות של 3-ימים שלאחר ההגעה, 18 זבים אותגרו מחדש (NV) ו-40 זבים (PRE ו-POST) אותגרו, דגימות דם נאספו, סרום נקצר ודגימות הוגשו לבדיקה כמתואר כאן .

2.5. חיסון של גילטס

40 מוזהבים נשארו בחוות המוצא והובאו למתקן המחקר 8.5 שבועות לאחר הגעתו של CONTROL. 20 זבים חוסנו 5 ו-2 שבועות לפני האתגר, כפי שהומלץ על ידי החברה המייצרת את החיסון, עם חיסון PEDV מומת זמין מסחרית, גנוגרופ G2b, (Porcine Epidemic Diarrhea Vaccine, Zoetis, Inc., Florham Park, NJ , ארה"ב) הכוללת את קבוצת PRE. עשרים הנותרים חוסנו באותו חיסון, 1 ו-3 שבועות לאחר אתגר PEDV הכולל את קבוצת POST. 18 מתוך עשרים הגהבים המקוריים של CONTROL נשארו במחקר והיוו את קבוצת ה-NV ולא קיבלו את החיסון ל-PEDV

מערכת חיסון מגבירה צמח cistanche

2.6. מבחני נוגדנים מנטרלים

2.6.1. נוהל נטרול מיקוד פלואורסצנטי (FFN).

ה-FFN בוצע על ידי המעבדה לאבחון וטרינרי של אוניברסיטת איווה, נוהל הפעלה סטנדרטי 9.5324 [16]. בקצרה, תאי Vero 76 הוכנו על ידי שטיפה ודגירה עם חומצה טריפסין-אתילן-דיאמין-טטרה-אצטית (EDTA) למשך 5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. בוצע דילול 1:20 של תאים ומדיום התפשטות תאים ו-200 μL הוספו לכל באר של 96-צלחת באר והודגרו במשך 48 שעות. צלחות הושלכו ונשטפו עם מדיום חיסון וירוסים. דגימות סרום הושבתו בחום באמבט מים ב-56 ◦C למשך 30 דקות ולאחר מכן דוללו בדילול סדרתי פי 2- החל מ-1:10 בצלחת. נגיף המאגר היה מדולל ל-100-200 יחידות יוצרות מוקדים לכל 100 μL ו-100 μL הוספו לכל באר והודגרו למשך 60 דקות ב-37 ◦C עם 5% פחמן דו חמצני (CO2). צלחת הבדיקה הושלכה, נשטפה ו-150 μL של תערובת סרום/וירוס הוספה לבארות המתאימות והודגרה למשך 60 דקות ב-37 ◦C. תערובות סרום/וירוס הושלכו והבארות נשטפו עם מדיום חיסון וירוס. 150 μL של מדיום חיסון וירוס נוספו לכל באר והודגרו במשך 24 שעות ב-37 ◦C ו-5% CO2. המדיה הוסרה מהצלחת והתאים תוקנו על ידי הוספת 80% אצטון, שצונן באמבט קרח, למשך 15 דקות. אצטון הושלך והצלחת יובשה באוויר. הוכן דילול של 1:100 של נוגדן חד שבטי מצומד ל-FITC PEDV NP מדולל ב-PBS (pH 7.2) ונוספו 50 μL לכל הבארות והודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. הצלחת נשטפה עם PBS ולאחר מכן קראה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (Olympus BX51, אובייקטיבי 10X, מסנן FITC). בארות חיוביות אינן מציגות לוחות פלואורסצ'ים ושליליים מראים פלאקים ירוקים. טיטר נוגדנים מנטרלים באו לידי ביטוי כדילול הסרום הגבוה ביותר עם הפחתה של 90% של שכפול הנגיף בהשוואה לבקרת הנגיף. דגימות עם טיטר גדול מ-20 או שווה ל-20 סווגו כחיוביות לנוגדנים מנטרלים PEDV. טיטר גבוה יותר מצביע על ריכוז גבוה יותר של נוגדנים מנטרלים בדגימה. דוגמה לדגימות סרה חיוביות ושליליות זמינות בחומרים המשלימים.

2.6.2. נוהל בדיקת ניטרול פלואורסצנטי עם תפוקה גבוהה (HTNT).

ה-HTNT בוצע על ידי המעבדה לאבחון וטרינרי של אוניברסיטת איווה, נוהל הפעלה סטנדרטי 9.5324 גרסה 2 [17]. דגימות סרום הושבתו בחום באמבט מים ב-56 ◦C למשך 30 דקות. מלאי הנגיפים מדולל פי 10- סדרתי במדיום חיסון נגיפים (DMEM עם 2 מיקרוגרם/מ"ל טריפסין-TPCK), הועבר לתאי Vero 81 (ATTC® CCL-81™), והודגר ב-37 ◦C עם 5% CO2 למשך 5 ימים. הדילול האחרון שבו נצפתה אפקט ציטופטי שימש לקביעת המינון החציוני של תרבית רקמה זיהומית (TCID50) בשיטת Spearman and Karber [18]. מאה מיקרוליטר של תמיסת תאים (תאי התפשטות תאים, תאי טריפסין-EDTA ו-Vero 81), הודללו ב-100 μL של מדיום ריבוי תאים (DMEM עם 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין) כדי ליצור דילול של 1:1 . נעשה שימוש בהמוציטומטר כדי לספור ולחשב את הדילול כדי ליצור 5 × 104 תאים/באר והוסיפו לכל באר של צלחת באר 96- שחורה תחתית שקופה (Coring 96 well CellBind microplate, Sigma) והודגרה במשך 48 שעות בשעה 37 ◦C עם 5% CO2 להפיכת התא מתכנס (100% מתכנס). לכל צלחת היו בקרה חיובית, בקרה שלילית ובארות בקרת וירוסים. לאחר מכן, חמישה מיקרוליטר של בדיקות ודגימות שהושבתו בחום הונחו בארות כפולות כדי ליצור דילול של 1:40 ב-1:20 תחילה על ידי הוספת 95 μL של מדיום חיסון נגיף, ולאחר מכן 100 μL של וירוס PEDV בדילול 1:10 (3.16 × 105 TCID50/mL). תערובת הסרום/וירוס הודגרה למשך שעה אחת ב-37 ◦C עם 5% CO2. כל בארות התאים של צלחת הבדיקה נשטפו 3 פעמים עם 150 μL של מדיום שטיפת תאים (DMEM עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין), ו-150 μL של תערובת סרום/וירוס ובקרות וירוס הועברו לצלחת הבדיקה והודגרו במשך 90 דקות ב-37 ◦C. תערובת הסרום/וירוס נזרקה והצלחות נשטפו פעם אחת עם מדיום לשטיפת תאים, כמתואר לעיל, ולאחר מכן פעם אחת עם מדיום חיסון נגד וירוס. מדיום חיסון נגיפים (150 μL) הוסף לכל באר והודגר במשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. מדיום חיסון הנגיף הושלך והצלחת נשטפה עם PBS pH 7.4. תאים נקבעו על ידי הוספת 4 ◦C, 80% אצטון לכל באר והודגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן הוסר אצטון והצלחת יובשה באוויר למשך 30 דקות. כל באר נשטפה עם PBS pH 7.4. 50 μL של נוגדן חד שבטי PEDV NP מצומד FITC (שיבוט SD6-29, Medgene Labs) מדולל 1:100 ב-PBS pH 7.4 נוספו לכל באר והודגרו למשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הצלחת נשטפה ארבע פעמים עם PBS pH 7.4, השארת השטיפה האחרונה בצלחת למשך 5 דקות ואז נזרקה והוחלפה ב-100 μL של PBS pH 7.4. לאחר מכן נקראו לוחות עם SpectraMax i3× באמצעות SoftMax Pro 6.5 (התקנים מולקולריים, סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב) תוך שימוש בזמן חשיפה של 30 אלפיות השנייה והתאמות מוקד של 20 אום עבור 541 אורכי גל. דגימות עם הפחתת פלואורסצנציה כוללת (%FR) גדולה או שווה ל-85% סווגו כחיוביות לנטרול נוגדנים [2]. הפחתת הקרינה הכוללת חושבה כ- 100 - ([עוצמת הקרינה הממוצעת הכוללת של הדגימה/עוצמת הקרינה הממוצעת הממוצעת השלילית הכוללת עוצמת הקרינה]) × 100). הפחתת הקרינה הכוללת גבוהה יותר מצביעה על ריכוזי נוגדנים מנטרלים גבוהים יותר בתוך הדגימות. דוגמה לדגימות סרה חיוביות ושליליות זמינות בחומרים המשלימים.

2.7. מאפיינים אבחוניים: רגישות וסגוליות וערכים חיזויים חיוביים ושליליים

רגישות וסגוליות אבחנתיות חושבו עבור ה-HTNT תוך שימוש ב-%FR cutoff של 70, 75, 80, 85 ו-90 ו-FFN באמצעות חיתוכים של דילול דגימה של 20, 40, 80 ו-160 כדי לקבוע את החיתוך האופטימלי. אופטימיזציה הוגדרה כנקודת החיתוך שבה הספציפיות האבחנתית ממקסמת עם אובדן מינימלי של הספציפיות האבחנתית. תת-קבוצה של שבעים ושש דגימות ידועות שליליות ל-PEDV נבחרה משתי נקודות הדגימה הראשונות עבור קבוצות CONTROL ו-POST. 36 דגימות ידועות PEDV חיוביות נבחרו משתי נקודות הדגימה האחרונות עבור קבוצת NV. חיתוך של יותר מ-85 שימש להגדרת דגימות חיוביות, בהתאם לנוהל ההפעלה הסטנדרטי של ISU VDL עבור המבחן [17]. רגישות אבחון נאמדה על ידי חלוקת מספר הדגימות החיוביות הידועות שנבדקו חיוביות בסך הדגימות החיוביות הידועות. הספציפיות האבחנתית נאמדה על ידי חלוקת מספר הדגימות השליליות הידועות שנבדקו שליליות במספר הדגימות השליליות הידועות. החתך שמיטב את הספציפיות והרגישות האבחנתיות נבחר להשוואת מבחני. למטרות מחקר זה, הספציפיות האבחונית (DSp) והרגישות (DSe) הוגדלו, כאשר הערך המוחלט של ההבדל בין ערכי רגישות וסגוליות הוא הקטן ביותר. ערך ניבוי חיובי (PPV) נאמד על ידי חלוקת מספר הדגימות החיוביות הידועות שנבדקו חיוביות (TP) בסה"כ הדגימות החיוביות לבדיקה (TP פלוס חיובי שגוי [FP]). ערך ניבוי שלילי (NPV) נאמד על ידי חלוקת מספר הדגימות השליליות הידועות (TN) שנבדקו שליליות בסה"כ הדגימות השליליות של הבדיקה (TN פלוס False negative [FN]).

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

לחץ כאן לצפייה במוצרי Cistanche Enhance Immunity

【בקש עוד】 דוא"ל:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.8. ניתוח סטטיסטי

לא היו תוצאות בלתי מוגדרות או נתונים חסרים במחקר זה. כל הנתונים נותחו באמצעות SAS גרסה 9.4 (SAS Instit. Cary NC). נעשה שימוש ב-609 תצפיות מ-6{{10}} חזירים השייכים לאחת מ-4 קבוצות. שני ערכי חיתוך אפשריים (40 ו-80) עבור מבחן FFN נבחנו והשוו לחתוך של 85 עבור HTNT. עבור כל אחד מהם, מודל השפעות מעורבות ליניאריות התאים להסביר את השפעת הקבוצה על ההסכמה של מבחני FFN ו-HTNT, עם אפקט אקראי ספציפי לחזיר. כל ניתוחי ההשוואה הזוגית של הקבוצות בוצעו. יתרה מכך, עבור שניים מתוך שלושת ערכי החתך המשמשים למבחן FFN, מקדם קאפה של כהן חושב כדי לקבוע את ההסכמה הכוללת של מבחני FFN ו-HTNT. מקדמי קאפה פורשו כך: פחות מ-0.0, הסכם "דל"; בין 0.0 לבין 0.20, הסכמה "קלה"; בין 0.21 ל-{{30}}.40, הסכם "הוגן"; בין 0.41 ל-0.60, הסכמה "מתונה"; בין 0.61 ל-0.80, הסכם "מהותי"; ובין 0.81 ל-1.0, הסכם "כמעט מושלם" [19]. המובהקות נקבעה ל-p פחות או שווה ל-0.05. חלקות קופסאות ושפם פותחו תוך שימוש בתוכנת R.

3. תוצאות

טבלה 1 מציגה את רגישות האבחון והספציפיות עבור מבחני FFN ו-HTNT בחתכים שנבחרו. רגישות אבחון וסגוליות עבור שני המבחנים עבור מחקר זה בוצעו אופטימיזציה בחתך של דילול של 80 ו-80% FR בהתאמה.

טבלה 1. רגישות אבחנתית (DSe), ספציפיות אבחנתית (DSp), ערך ניבוי חיובי (PPV) וערך ניבוי שלילי (NPV) עבור מבחני HTNT ו-FFN באמצעות חתכים שונים המפורטים בשורה השנייה של הטבלה. לדוגמה, עבור בדיקת HTNT בחתך של 70, ה-DSe=0.97 (97%), ה-DSP=0.91 (91%), PPV=0.83 ( 83%), ו-NPV=0.95 (95%). U=לא מוגדר.

איור 1 מציג עלילות קופסאות ושפם של תוצאות HTNT לפי ימים שלאחר האתגר לפי קבוצת טיפול במחקר. דגימות מקבוצות CONTROL ו-POST (n=76) סווגו כשליליות בימים −4, 0 ו-7 כצפוי עקב המצב הקודם של החזירים. קבוצת NV פיתחה תגובה אנמנסטית בעקבות האתגר. ירידה בשונות התרחשה בין תוצאות ה-HTNT כפי שמוצג על ידי ירידה בטווח הערכים בשתי הקבוצות המחוסנות (PRE ו-POST) בעקבות האתגר עם PEDV. ניתן לראות את השונות המופחתת הזו באיור 1 כאשר השפם והחריגים של עלילות POST ו-PRE הופכים קצרים יותר 14 ימים לאחר האתגר. איור 2 מציג תיבות ושפם של תוצאות FFN טבעיות שעברו טרנספורמציה ביומן לפי ימים שלאחר האתגר לפי קבוצת טיפול, שיש להן תוצאות דומות לבדיקת HTNT. תוצאות HTNT (איור 1) ו-FFN (איור 2) מראות תגובה לאתגר וחיסונים כפי שניתן לראות עם עלייה ב-%FR ובטיטרים משני המבחנים. למרות דומה בגודל, השונות של תוצאות כל בדיקה הופחתה בעקבות אתגר הומולוגי (NV). ירידה בשונות התרחשה גם בעקבות חיסון (PRE ו-POST). וריאציה זו של נטרול ערכי נוגדנים בשבוע שלאחר החשיפה יורדת בעקבות חיסון ואתגר הומולוגי עם PEDV (איורים 1 ו-2). הייתה נטייה דומה בירידה בשונות של נוגדנים מנטרלים שנראתה בשני תוצאות המבחנים של קבוצות טיפול מחוסנות והומולוגיות. האתגר ההומולוגי של PEDV וחיסונים שניים יצר תגובה אנמנסטית שיצרה רמה גבוהה יותר של נוגדנים מנטרלים עם שונות מופחתת בין חזירים בהשוואה לערכי טרום אתגר ואחרי חיסון כפי שנמדדו על ידי שני המבחנים (איור 1). בהתבסס על ניתוח הרגישות והספציפיות של האבחון, החתכים של 80 (טיטר) ו-85 (%FR) נבחרו כדי לנתח את הסכם הבדיקה עבור מבחני FFN ו-HTNT בהתאמה. בדיקת קאפה הדגימה הסכמה "מתונה" של 0.5257 עם רווח בר סמך של 95% של 0.461, 0.5904 מהמבחנים עבור ה-cutoff 80 (טיטר) ו-85 (%FR) עבור מבחני FFN ו-HTNT.

איור 1. עלילות תיבה-ו-שפם של עקומות התגובה של נוגדני HTNT לפי הימים שלאחר האתגר עבור כל קבוצת טיפול. הפס האמצעי מייצג את הערך החציוני של התוצאות לפי שבוע. הצירים (החלק העליון והתחתון של הקופסה) מייצגים את הרבעון הראשון (Q1) והשלישי (Q3). האזור המוצל מייצג את הטווח הבין-רבעוני (IQR). השפם נקבעים באופן הבא: שפם עליון=Q3 + 1.5∗IQR; שפם תחתון=Q1 + 1.5∗IQR. אם אין נקודת נתונים בערך המחושב, נקודת הנתונים הבאה הקרובה ביותר ל-Q1 או Q3 היא הגבול של השפם. עיגולים פתוחים (◦) מציינים חריגים. חתך של 85 מסומן על ידי הקו המקווקו ב-85 על ציר ה-y.

איור 2. מגרשי קופסה ו-whisker של עקומות התגובה של נוגדנים FFN לפי הימים שלאחר האתגר עבור כל קבוצת טיפול. הפס האמצעי מייצג את הערך החציוני של התוצאות לפי שבוע. הצירים (החלק העליון והתחתון של הקופסה) מייצגים את הרבעון הראשון (Q1) והשלישי (Q3). האזור המוצל מייצג את הטווח הבין-רבעוני (IQR). השפם נקבעים באופן הבא: שפם עליון=Q3 + 1.5∗IQR; שפם תחתון=Q1 + 1.5∗IQR. אם אין נקודת נתונים בערך המחושב, נקודת הנתונים הבאה הקרובה ביותר ל-Q1 או Q3 היא הגבול של השפם. עיגולים פתוחים (◦) מציינים חריגים. חתך של 40 מסומן על ידי הקו המקווקו ב-ln(40) בציר ה-y.

4. דיון

אנו משערים ששונות מופחתת ותגובה אנמנסטית קשורים לחסינות עדר הומוגנית והגנה מפני מחלות, למרות שסימנים קליניים עדיין נצפו בקבוצת PRE כפי שתואר קודם [14]. ההשפעה הקלינית וחומרת המחלה בבעלי חיים אלה לא הוערכה למטרות מחקר זה. המחלה מתבטאת באופן שונה בין מבוגרים לילודים עם סימנים קליניים חמורים יותר ומוות בילודים בהשוואה לבעלי חיים בוגרים [1,20]. בעוד שרמות נוגדנים מנטרלים במחזור לבדן אינן מעניקות הגנה [21], הן עשויות לשמש להערכת תגובת נוגדנים בעקבות חשיפה מכוונת או מתן חיסון בעדרים. בעוד שהיעדר וירמיה אופייני ל-PEDV, וירמיה דווחה אצל חזרזירים עד גיל 4 שבועות [22,23]. לפיכך, נוגדנים מנטרלים במחזור יכולים להשפיע על המהלך הקליני של המחלה [21]. עם זאת, חסינות לקטוגנית, במיוחד IgA בהפרשות החלב תהיה מדידה מדויקת יותר להגנה על חזרזירים [21]. המבחנים המתוארים במחקר זה יכולים לשמש לניטור נוגדנים מנטרלי נסיוב לאחר מתן חיסון בקבוצות של זרעות או זביות בנוסף לאיסוף הפרשות חלב לבדיקת IgA לקטוגנית/הפרשה. זה יהיה מועיל אם הנתונים שנוצרו ממבחנים אלה יוכלו לחזות את הכמות והיציבות של חסינות הלקטוגנית שנוצרת בעקבות חיסון. עם זאת, זה לא נותח במחקר הנוכחי. הוכח כי תגובת נוגדני IgG בסרום לאחר חיסון מנבאת תגובת IgG קולוסטרלי, אך לא היה מתאם בין נוגדנים מנטרלים סרום לאלו של הפרשות חלב [15]. בעוד שלא היה מתאם בין נוגדנים מנטרלים סרום לאלו של הפרשות חלב, הוכח כי חיות מחוסנות הן בעלות נוגדנים מנטרלים גבוהים יותר בהפרשות החלב בהשוואה לחיות ביקורת [15]. לכן, כפי שנתמך על ידי, Bjustrom-Kraft, et al. [15], אם נוגדנים מנטרלי סרום גבוהים, אזי ייתכן שגם IgG ו-IgA בהפרשות החלב יהיו מוגברות. לפיכך, איסוף דגימות נסיוב לפני תנועת הנקבות לבית הגידול ימזער את הלחץ והכאב הנגרמים במהלך איסוף הפרשות הדם והחלב דרך הלידה שעלולים להשפיע לרעה על הזריעה והמלטה [24]. חשוב למשתמשים להבין כיצד ערך החיתוך יכול להשפיע על רגישות האבחון והספציפיות של בדיקה. הגדלת ערך החיתוך תקטין את מספר התוצאות החיוביות השגויות ותגדיל את מספר התוצאות השליליות השגויות. הפוך, הפחתת ערך החיתוך תגדיל את מספר התוצאות החיוביות השגויות ותקטין את מספר התוצאות השליליות השגויות. ידע זה מאפשר למשתמש לבחור באיזה ערך חיתוך להשתמש במצב הספציפי שלו. עבור מחקר זה, בהתבסס על תוצאות מחקר זה ותוצאות קודמות שפורסמו על ידי Sarmento et al. [2], בחרנו 80% FR עבור ה-HTNT ודילול של 80 FFN. בחתכים אלו, הספציפיות האבחונית גבוהה יותר עבור ה-HTNT (97%) בהשוואה ל-FFN (76%) ומספקת ערך ניבוי חיובי גבוה יותר מה-HTNT בהשוואה ל-FFN. כמו כן, יש להבין כי ערכי הניבוי תלויים בשכיחות המחלה [25,26]. במחקר זה, בהתבסס על הדגימות המסווגות, השכיחות הייתה 32.1% (36 דגימות חיוביות ו-76 דגימות שליליות). ככל שהשכיחות תגדל, ה-PPV יעלה גם מכיוון שהחיה שנבדקה (הדגימה) נוטה יותר להיות חיובית; ככל שהשכיחות יורדת, ה- NPV יקטן. איורים 3A ו-B ממחישים זאת עבור מבחני HTNT ו-FFN בחתכים השונים שהוערכו במחקר זה בעקבות שיטות שתוארו על ידי Erb [25]. לכן, כאשר בוחנים תוצאות אבחון, יש לשקול את הרגישות האבחונית והספציפיות של הבדיקה ולהבין את השכיחות בתוך הקבוצה אם משתמשים בערכים מנבאים.

איור 3. (א). ערכי חיזוי חיוביים עבור מבחני HTNT (קווים שחורים) ו-FFN (קווים אפורים) בחתכים שונים. חתך של 90 אינו מיוצג עבור ה-HTNT. (ב). ערכי חיזוי שליליים או מבחני HTNT (קווים שחורים) ו-FFN (קווים אפורים) בחתכים שונים. חתך של 20 אינו מיוצג עבור בדיקת FFN.

ל-HTNT יש רגישות וסגוליות אבחנתיות מעולות בהשוואה ל-FFN. כאשר מנתחים תוצאות נוגדנים, זה אידיאלי כדי למזער את מספר התוצאות החיוביות השגויות ושליליות השגויות. לדוגמה, בעת שימוש ב-cutoff של 80 עבור FFN, ראינו רגישות של 97% וסגוליות של 76%. המשמעות היא שיהיו מעט תוצאות שליליות שגויות, אך יהיו מספר רב של תוצאות חיוביות שגויות. אם התוצאות מסווגות בטעות כחיוביות, אז זה עלול להוביל לפרשנות שגויה שלעדר יש נוגדנים ל-PEDV כשלמעשה אין להם. מכיוון של-HTNT יש אבחון וסגוליות גבוהות יותר על פני חתכים שונים, זהו המבחן המועדף לזיהוי נוגדני PEDV. תוצאות של Sarmento et al. [2] הראה סגוליות אבחנתיות גבוהות בהרבה עבור ה-FFN ורגישויות וסגוליות דומות עבור ה-HTNT. מבחני אבחון אלו הראו הסכמה מתונה על פי נתוני הקאפה (κ). חולשה אחת של κ היא שבדיקה אחת חייבת להיחשב כתקן הזהב. כאשר משווים שני מבחני לא מושלמים, זה יכול להטות את הפרשנות של κ. עבור מחקר זה, הערכנו את ביצועי האבחון של המבחנים בשילוב עם κ כדי לקבוע שהבדיקה מסכימה אך עשויה להיות תועלת שונה. יתרון נוסף של ה-HTNT על פני מבחן FFN הוא שתוצאות ה-HTNT מחושבות מנתונים רציפים בהשוואה לערכים הקטגוריים (טיטרציות) מה-FFN. האופי הרציף של נתוני ה-HTNT מאפשר הבחנה גדולה יותר של תוצאות הדגימות על מנת לתאר את מצב הנוגדנים המנטרלים של שורלות. כפי שדווח על ידי Sarmento et al. [2], ל-HTNT יש זמן קריאה קצר יותר של צלחת עם 96 בארים עד פחות מ-4 דקות, מה שמאפשר תפנית מהירה יותר בתוצאות. נוגדנים מערכתיים במחזור עשויים לתרום להגנה על חזרזירים מפני זיהומי PEDV [21]. עם זאת, אין ספרות על איזו כמות של נוגדן מנטרל במחזור בזרעת תעניק הגנת PEDV לחזרזירים. רמות גבוהות של נוגדנים במחזור מובילות לריכוז גבוה יותר בקולוסטרום ומעניקות הגנה מוגברת. הערכה נוספת מוצדקת כדי לקבוע קשר בין, כאשר במהלך ההיריון לאסוף את הדגימות, לבין הגנה נוגדנים קולוסטרליים מפני זיהום PEDV. לחסינות לקטוגני ורירית יש חשיבות חיונית להישרדותם של חזירים שנחשפו ל-PEDV. נוגדנים נאספים בחלב דרך ציר המעי-MG-sIGA ומועברים לחזרזירים כדי להעניק הגנה. לנגל וחב'. [27] גילה שלזיפים שנחשפו במהלך השליש השני היו רמות גבוהות יותר באופן משמעותי של IgA, IgG ונוגדנים מנטרלים בהשוואה לזובים בטרימסטר הראשון והשלישי. בנוסף, Langel et al. [27] מצא כי לחזרזירים של זבים שנחשפו ל-PEDV בטרימסטר השני היה שיעור הישרדות של 100% לעומת פחות מ-87.2% בשלישים אחרים, דבר המצביע על כך שרמת IgA, IgG ונוגדנים מנטרלים בנסיוב גבוהים קשורים להישרדות חזרזירים. PEDV. למרות שנוגדנים בסרום אינם מעניקים הגנה ל-PEDV, תוצאות המחקר שלנו מצביעות על כך שרמות נוגדנים מנטרלים בסרום קשורות להגנה מפני זיהום PEDV. כפי שדווח בעבר על ידי Brown et al. [14], PEDV נשפך בצואה בעקבות אתגר הומולוגי וחיסון של זבים. המחקר הנוכחי השתמש בדגימות מאותן חיות כמו Brown et al. [14]. עוד עולה כי נוגדנים מנטרלים מוגברים בסרום בעקבות חשיפה לאתגר או חיסון אינם משפיעים על דפוס הנשירה של הנגיף שכן רמות הנוגדנים עלו בעקבות אתגר וחיסון. יש צורך במחקרים נוספים כדי לאשר אם כמות הנגיף שנשפך בצואה קשורה לכמות הנוגדנים המנטרלים הקיימת בסרום [21].

יתרונות cistanche לגברים - מחזקים את המערכת החיסונית

5. מסקנות

השערת האפס של מחקר זה הייתה שלא היה הבדל במאפיינים האבחוניים של שני מבחני נוגדנים מנטרלים PEDV, FFN ו-HTNT. התוצאות מראות שמבחנים אלה מסכימים במידה מתונה בהתבסס על סטטיסטיקת הקאפה בעוד שיש שונות במאפיינים האבחוניים ובערכים החזויים שלהם המבוססים על ה-cutoff עבור המבחן. ניתן להשתמש במבחנים אלה כדי למדוד את תגובת החיסון של עדר. אי דחיית השערת האפס מראה ש-HTNT היא הבדיקה המועדפת לגילוי נוגדנים מנטרלים PEDV בסרום. לאחר חיסון הן בקבוצת PRE והן בקבוצת POST, מחקר זה מצא שרוב התוצאות כחיוביות. בקבוצת PRE, ירידה בשונות בין התוצאות באה גם בעקבות האתגר. תוצאות אלו מצביעות על כך שמתרגלי חזירים יכולים למדוד נוגדנים מנטרלים סרום על מנת לקבוע אם חיסוני PEDV ניתנים כראוי בעדר.

הפניות

1. סייף, ל.; וואנג, ש; ולאסובה, א.; יונג, ק.; Xiao, S. Coronaviruses. במחלות חזירים, מהדורה 11; צימרמן, JJ, Ed.; ווילי בלקוול: הובוקן, ניו ג'רזי, ארה"ב, 2019.

2. סרמנטו, LV; פונסוק, ק.; טיאן, ל.; Mora-Diaz, JC; מיין, ר"ג; באום, ד"ה; צימרמן, JJ; Gimenez-Lirola, LG זיהוי של נוגדן מנטרל וירוס מגפת חזירים באמצעות ציטומטריית הדמיה בתפוקה גבוהה. J. Vet. דיאגן. תחקור. 2020, 32, 324–328. [CrossRef]

3. סטיבנסון, GW; Hoang, H.; שוורץ, KJ; בורו, ארה"ב; שמש, ד.; מדסון, ד.; קופר, VL; פילצקי, א.; גאגר, פ.; שמיט, BJ; et al. הופעת נגיף שלשול מגפת חזירים בארצות הברית: סימנים קליניים, נגעים ורצפים גנומיים ויראליים. J. Vet. דיאגן. תחקור. 2013, 25, 649–654. [CrossRef]

4. קים, י.; יאנג, מ.; גויאל, SM; צ'ירן, ​​MC; Torremorell, M. הערכה של אמצעי אבטחה ביולוגית למניעת העברה עקיפה של נגיף שלשול מגפת חזירים. וטרינר BMC. מילון 2017, 13, 89. [CrossRef]

5. שיר, ד"ש; אה, JS; קאנג, ב"ק; יאנג, JS; ירח, HJ; יו, HS; ג'אנג, י"ש; Park, BK יעילות אוראלית של זן וירוס DR13 של מגיפת חזיר מוחלשת בתאי Vero. מילון וטרינר. Sci. 2007, 82, 134–140. [CrossRef] [PubMed]

6. de Arriba, ML; קרבחאל, א.; פוזו, ג'; Rubio, P. תגובות נוגדנים ספציפיים לרירית ולאיזוטיפ מערכתית בחזירים קונבנציונליים שנחשפו לנגיף שלשול מגפת חזירים ארסי או מוחלש. וטרינר. אימונול. אימונופתול. 2002, 85, 85–97. [CrossRef] [PubMed]

7. Furukawa, S.; קורודה, י.; Sugiyama, A. השוואה של המבנה ההיסטולוגי של השליה בחיות ניסוי. ג'יי טוקסיקול. פאתול. 2014, 27, 11–18. [CrossRef] [PubMed]

8. בורן, FJ; Curtis, J. העברה של אימונוגלובינים IgG, IgA ו-IgM מסרום לקולוסטרום וחלב בחזירה. אימונולוגיה 1973, 24, 157–162. [PubMed]

9. פארן, PW; ברטון, DR הפעילות האנטי-ויראלית של נוגדנים במבחנה ובאינבו. עו"ד אימונול. 2001, 77, 195–262. [CrossRef]

10. ביוסטרום-קראפט, י. Woodard, K.; גימנז-לירולה, ל. רוטולו, מ.; וואנג, סי; שמש, י.; לסלי, פ.; ג'אנג, ג'; באום, ד.; גאגר, פ.; et al. זיהוי וירוס מגפת חזירים (PEDV) ותגובת נוגדנים בחזירים גדלים מסחריים. וטרינר BMC. מילון 2016, 12, 99. [CrossRef]

11. אה, JS; שיר, ד"ש; יאנג, JS; שיר, JY; ירח, HJ; קים, TY; Park, BK השוואה של מבחן אימונוסורבנט המקושר לאנזים עם בדיקת נטרול נסיוב לסרודיאגנוזה של זיהום בנגיף מגפת חזירים. J. Vet. Sci. 2005, 6, 349–352. [CrossRef]

12. אוקדה, פ.; ליו, X.; סינגריי, א. קלמנט, ט.; נלסון, ג'יי; כריסטופר-הנינגס, ג'יי; נלסון, EA; Lawson, S. פיתוח של ELISA עקיף, חסימת ELISA, בדיקת חיסונית מיקרוספירה פלואורסצנטית ומבחן נטרול מיקוד פלואורסצנטי להערכה סרולוגית של חשיפה לזנים צפון אמריקאיים של נגיף ה- Porcine Epidemic Diarrhea Virus. וטרינר BMC. מילון 2015, 11, 180. [CrossRef] [PubMed]

13. חן, ש; לי, ג.; סטסקו, ג'; תומאס, JT; Stensland, WR; פילצקי, AE; Gauger, PC; שוורץ, KJ; מדסון, ד.; Yoon, KJ; et al. בידוד ואפיון של נגיפי שלשול מגפת חזירים הקשורים להתפרצות המחלה ב-2013 בקרב חזירים בארצות הברית. ג'יי קלין. מיקרוביול. 2014, 52, 234–243. [CrossRef]

14. בראון, ג'; רדמאכר, ג; Baker, S. יעילותו של חיסון מסחרי נגד וירוס מגפת חזירים בהפחתת משך הנשירה הנגיפית אצל זבים. JSHAP 2019, 27, 256–264.

15. ביוסטרום-קראפט, י. Woodard, K.; Giménez-Lirola, L. תגובות נוגדנים להפרשת סרום והפרשת חלב בשלשול מגפת חזירים-אימוניות בעקבות חיסון נגד שלשול מגפת חזירים. JSHAP 2018, 26, 34–40.

16. אוניברסיטת איווה סטייט. נוהל לבדיקת נגיף שלשול מגפת חזירים (PEDV) בדיקת ניטרול מיקוד פלואורסצנטי (FFN). סרולוגיה 2017, 1–7.

17. אוניברסיטת איווה סטייט. נוהל עבור בדיקת נטרול וירוס תפוקה גבוהה (HTNT). סרולוגיה 2017, 1–16.

18. הירולצר, JC; קילינגטון, ר"ג; קנגרו, הו; Mahy, BWJ מדריך שיטות וירולוגיה; עיתונות אקדמית: לונדון, בריטניה, 1996; ע. 21.

19. Thrusfield, M. Veterinary Epidemiology, מהדורה 2; Blackwell Science LTD: Hoboken, NJ, ארה"ב, 1995; ע. 479.

20. Lee, C. Porcine epidemic diarrhea virus: נגיף חזירים אפיזוטי מתהווה ומתחדש. וירול. J. 2015, 12, 193. [CrossRef]

21. פונסוק, ק.; Gimenez-Lirola, LG; ג'אנג, ג'; Arruda, P.; חן, ש; Correa da Silva Carrion, L.; מגטוטו, ר.; פיניירו, פ.; סרמנטו, ל. וואנג, סי; et al. האם נוגדנים במחזור משחקים תפקיד בהגנה על חזרזירים מפני נגיף שלשול מגפת חזירים? PLoS ONE 2016, 11, e0153041. [CrossRef]

22. נידרוורדר, MC; ניטפלד, JC; באי, ג'; Peddireddi, L.; Breazeale, B.; אנדרסון, ג'יי; קריגן, MA; אן, ב.; אוברסט, RD; קרופורד, ק.; et al. לוקליזציה של רקמות, נשירה, הובלת וירוסים, תגובת נוגדנים והעברת אירוסול של וירוס שלשול מגפת חזירים בעקבות חיסון של 4-חזירים מאכילים בני שבוע. J. Vet. דיאגן. להשקיע. 2016, 28, 671–678. [CrossRef]

23. מדסון, DM; Arruda, PH; מגשטדט, ד"ר; בורו, ארה"ב; Hoang, H.; שמש, ד.; באוור, LP; בנדארי, מ.; Gauger, PC; סטיבנסון, GW; et al. אפיון של נגיף שלשול מגפת חזיר מבודד זיהום בארה"ב/איווה/18984/2013 ב1-חזרזירים חסרי קולוסטרום שמקורם בניתוח קיסרי. וטרינר. פאתול. 2016, 53, 44–52. [CrossRef]

24. מינאו, ע.; Manteca, X. כאב ואי נוחות הנגרמים עקב לידה בפרות ובשורות. יישום אנים. התנהג. Sci. 2011, 135, 241–251. [CrossRef]

25. Erb, HN הסתברות מוקדמת (הניחוש הטוב ביותר של הבדיקה המוקדמת) משפיעה על ערכי הניבוי של בדיקות אבחון. וטרינר. קלינ. פאתול. 2011, 40, 154–158. [CrossRef] [PubMed]

26. טני, ש.; הופמן, MR שכיחות. ב-StatPearls; הוצאת StatPearls: Treasure Island, פלורידה, ארה"ב, 2022. 27. Langel, SN; Paim, FC; אלהמו, מ.א.; באקלי, א.; ואן גילן, א.; לאגר, קמ; Vlasova, AN; Saif, LJ שלב ההיריון במגפת חזירים שלשולים זיהום בחזירים בהריון משפיע על חסינות האם והגנה חיסונית לקטוגני של חזרזירים יונקים. חֲזִית. אימונול. 2019, 10, 727. [CrossRef] [PubMed]