השוואה בין QPCR ל-RNA-seq חושפת אתגרים של כימות ביטוי HLA חלק 1

תַקצִיר

לוקוסים מסוג אנטיגן לויקוציטים אנושיים (HLA) מסוג I ו-II הם מרכיבים חיוניים של חסינות מולדת ונרכשת. תפקידיהם כוללים הצגת אנטיגן לתאי T המובילה לתגובות חיסוניות תאיות והומורליות, ומודולציה של תאי NK. השפעתם יוצאת הדופן על תוצאות המחלה התבררה כעת על ידי מחקרים הקשורים לגנום. האקסונים המקודדים את החריץ קושר הפפטיד היו המוקד העיקרי לקביעת השפעות HLA על רגישות/פתוגנזה למחלה. עם זאת, רמות ביטוי HLA היו מעורבות גם בתוצאות המחלה, והוסיפו מימד נוסף למגוון הקיצוני של HLA שמשפיע על השונות בתגובות החיסון בין אנשים.

קיים קשר הדוק בין אנטיגנים לויקוציטים לבין חסינות. אנטיגן לויקוציטים מתייחס למולקולה על פני השטח של תאי דם לבנים אנושיים, שיכולה לזהות ולהבחין בין סוגי תאים ופתוגנים שונים. זהו חלק חשוב ממערכת החיסון האנושית ומווסת חשוב של התגובה החיסונית.

הבדלים באנטיגנים של לויקוציטים עשויים לגרום לתגובות חיסוניות שונות ולרגישות למחלות. לדוגמה, אנטיגנים מסוימים של לויקוציטים קשורים למחלות אוטואימוניות, מחלות זיהומיות וגידולים. הביטוי של אנטיגנים מסוימים של לויקוציטים קשור גם לתפקוד ולכמות של תאי מערכת החיסון.

לכן, הבנת המאפיינים המולקולריים של משטח הלויקוציטים של הפרט היא בעלת משמעות רבה להערכת המצב החיסוני של הפרט והסיכון והפרוגנוזה של המחלה. יחד עם זאת, היא גם תורמת לגיבוש טיפול ואמצעי מניעה בהתאמה אישית. מנקודת מבט זו, עלינו לשפר את החסינות. ל- Cistanche יש השפעה משמעותית על שיפור החסינות. Cistanche עשיר בחומרים נוגדי חמצון שונים, כגון ויטמין C, וקרוטנואידים מרכיבים אלו יכולים לנקות רדיקלים חופשיים, להפחית מתח חמצוני ולשפר את עמידות המערכת החיסונית.

אבקת תמצית לחץ cistanche tubulosa

כדי להעריך את ביטוי HLA, מחקרים אימונוגנטיים מסתמכים באופן מסורתי על PCR כמותי (qPCR). האימוץ של טכנולוגיות אלטרנטיביות עם תפוקה גבוהה כגון RNA-seq נבלם על ידי בעיות טכניות עקב הפולימורפיזם הקיצוני בגנים של HLA. עם זאת, לאחרונה פותחו מספר שיטות ביואינפורמטיות להערכת ביטוי HLA במדויק מנתוני RNA-seq. זה פותח הזדמנות מרגשת לכמת ביטוי HLA במערכי נתונים גדולים, אך גם מעלה שאלות לגבי האם תוצאות RNA-seq דומות לאלו של qPCR. במחקר זה, אנו מנתחים שלוש קבוצות של נתוני ביטוי עבור גנים מסוג HLA I עבור קבוצה מותאמת של פרטים: (א) RNA-seq, (ב) qPCR ו-(ג) ביטוי HLA-C משטח התא. ראינו מתאם מתון בין הערכות ביטוי מ-qPCR ו-RNA-seq עבור HLA-A, -B ו-C ({{10}}.2 פחות או שווה ל-rho פחות מ- או שווה ל-0.53 ). אנו דנים בגורמים טכניים וביולוגיים שיש לתת עליהם את הדעת בעת השוואת כימות עבור פנוטיפים מולקולריים שונים או באמצעות טכניקות שונות.

מילות מפתח

HLA · ביטוי · PCR · RNA-seq.

מבוא

ביטוי גנים מספק פנוטיפ מולקולרי שנמצא במיקום ביניים בין שונות גנטית לפנוטיפים מורכבים, כגון מצב מחלה. הבנת הבסיס הגנטי של ביטוי גנים יכולה להיות אסטרטגית ליצירת קשרים בין שונות גנטית לפנוטיפים מורכבים (GTEx Consortium 2013; Lappalainen et al. 2013), כולל רגישות למחלות אוטואימוניות וזיהומיות. למרות שחקר השונות הגנטית בלוקוסים של אנטיגן לויקוציטים אנושיים (HLA), ובתוך אזור תסביך ההיסטו-תאימות העיקרי (MHC) באופן כללי, שימש לנתח את הבסיס הגנטי של מספר מחלות מורכבות (Trowsdale and Knight 2013; Dendrou et al. . 2018), הכללת פנוטיפים מולקולריים, במיוחד אלה הקשורים לביטוי גנים, היא עדכנית יחסית (Apps et al. 2015; Vince et al. 2016; Ramsuran et al. 2018; Johansson et al. 2022).

אזור ה-MHC האנושי בכרומוזום 6p21 מציג צפיפות גנים גבוהה, עם דפוסים ייחודיים של חוסר שיווי משקל (LD) ופולימורפיזם קיצוני (de Bakker et al. 2006; Radwan et al. 2020). אזור MHC מכיל את הלוקוסים מסוג HLA I ו-II המקודדים למולקולות המעורבות בהפעלה ומווסת התגובה החיסונית. מולקולות HLA class I מבוטאות על ידי רוב התאים בעלי גרעין ובדרך כלל מציגות פפטידים תוך תאיים לתאי CD8 פלוס T. לעומת זאת, מולקולות HLA class II מתבטאות בעיקר על ידי תאים המציגים אנטיגן מקצועיים, ומציגות לתאי CD4 פלוס T אנטיגנים אקסוגניים שהופנמו על ידי אנדוציטוזיס. מולקולות Class I מזוהות גם על ידי קולטנים על תאי רוצח טבעי (NK), הקולטנים דמויי אימונוגלובולינים (KIRs), אשר משפיעים הן על החינוך והן על ההפעלה של תאי NK (Colonna ו-Samaridis 1995; Goodson-Gregg et al. 2020). הזיווג של אלוטיפים שונים מסוג HLA I ומולקולות KIR ספציפיות משפיע על פעילות תאי NK (ותת-קבוצה של תאי CD8 פלוס T), וכתוצאה מכך סיכונים דיפרנציאליים לסרטן, מחלות זיהומיות ואוטואימוניות (נסקרה ב-Kulkarni et al. 2008).

קשרי מחלות HLA יוחסו בעיקר להבדלים ספציפיים לאללים בהצגת אנטיגן, בשל הפולימורפיזם הנרחב בחריץ קושר הפפטיד. עם זאת, רמות ביטוי HLA תורמות לחלק מהקשרים שנצפו בין פולימורפיזם של HLA ותוצאות מחלה. רמת ביטוי HLA היא משנה חשובה של אוטואימוניות ולחוזק התגובה החיסונית המתווכת HLA לסרטן וזיהומים (נסקרה ב-René et al. 2016).

ישנן דוגמאות מרובות לקשר בין רמות ביטוי HLA ותוצאות זיהום ויראלי. מתועד היטב, למשל, שרמות ביטוי גבוהות יותר של HLA-C, הן ברמת mRNA והן ברמת החלבון על פני התא, קשורות לשליטה טובה יותר ב-HIV-1 (Thomas et al. 2009; Kulkarni et al. al. 2011; Apps et al. 2013; Parolini et al. 2018; Bachtel et al. 2018), בעוד שהביטוי המוגבר של HLA-A קשור לפגיעה בשליטה ב-HIV (Ramsuran et al. 2018). זיהום ב-SARS-CoV-2 מווסת את ביטוי הגנים של HLA-C (Loi et al. 2022) וביטוי HLA class I על פני התא (Zhang וחב' 2021; Arshad et al. 2023), כמו גם מחלקת HLA ביטוי גנים II, כולל HLA-DPA1, -DPB1, -DRA ו-DRB1 (Wilk et al. 2020).

בנוסף, ישנם קשרים בין רמות הביטוי HLA-DPA1 (Ou et al. 2019) ו-HLA-DPB1 (Thomas et al. 2012; Ou et al. 2021) עם פינוי HBV; ביטוי HLA-DRA עם רגישות לזיהום על ידי נגיפי שפעת עטלף A בקווי תאים אנושיים (Karakus et al. 2019); וקשרים נרחבים בין וריאנטים רגולטוריים ורמות ביטוי בגנים מסוג HLA Class II, כולל HLA-DQA1, -DQB1, -DQB2, -DRB1 ו-DRB5 עם תגובת נוגדנים כנגד נגיפים מרובים נפוצים (Kachuri et al. 2020).

רמות הביטוי של לוקוסי HLA קשורות גם לאימוניות (ראה Johansson et al. 2022 לסקירה). רמות ביטוי HLA-C על פני התא (Apps et al. 2013; Kulkarni et al. 2013), כמו גם רמות HLA-G על פני התא ובפלזמה (da Costa Ferreira וחב' 2021), נקשרו עם סיכון למחלות מעי דלקתיות. ביטוי מוגבר של HLA-B27 על פני התא נצפה בקרב חולי אנקילוזינג ספונדיליטיס (Cauli et al. 2002), וכך גם ביטוי כולל של HLA class I בקרב חולי מחלת Graves (Weider et al. 2021). רמות ביטוי HLA Class II משפיעות גם על הסיכון למצבים אוטואימוניים.

ביטוי וביטוי הגנים HLA-DQA1 ו-DRB1 של מולקולות DQ ו-DR על פני התא מוגברים במונוציטים בדם היקפי של חולי ויטיליגו (Cavalli et al. 2016); וריאנטים רגולטוריים הקשורים לביטוי גבוה יותר של גנים HLA-DQA1, -DQB1 ו-DRB1 וביטוי DQ ו-DR על פני התא קשורות לסיכון לזאבת אדמנתית מערכתית (Raj et al. 2016); ביטוי הגנים HLA-DRB5 גבוה יותר בחולי סקלרודרמה עם מחלת ריאות אינטרסטיציאלית (Odani et al. 2012); אללים ספציפיים של HLA-DRB1 באים לידי ביטוי גבוה בחולי דלקת מפרקים שגרונית (Houtman et al. 2021); וביטוי גבוה יותר של DRB1*15:01 קשור לסיכון לטרשת נפוצה (Alcina et al. 2012). לכן, הבנת השונות של ביטוי HLA בין אנשים והמנגנונים המסדירים את רמות הביטוי HLA תהיה המפתח לחשיפת הבסיס הגנטי של פנוטיפים של מחלות.

באופן מסורתי, ביטוי HLA נאמד על ידי טכניקות מבוססות נוגדנים לרמות ביטוי על פני התא (Thomas et al. 2012; Apps et al. 2013) או על ידי PCR כמותי (qPCR או RT-PCR) עבור רמות שעתוק mRNA (Bettens et al. al. 2014; Ramsuran et al. 2015, 2017). זה מאתגר להשוות תוצאות בין מחקרים או אפילו להשוות לוקוסים שונים של HLA בתוך אותו מחקר, שכן נעשה שימוש בהליכים ניסויים שונים עבור כל ניתוח ולכל לוקוס של HLA, מה שיכול לגרום ליעילות הגברה שונה ב-qPCR או בזיקה של נוגדנים ב-flow cytometry.

טכנולוגיות תפוקה גבוהה כגון RNA-seq מספקות הערכות ביטוי עבור כל הגנים בגנום, כולל גנים של HLA, ובכך מאפשרות הערכת ביטוי HLA בהקשר רחב הגנום. עם זאת, טכנולוגיות אלו מביאות לאתגרים רבים כאשר משתמשים בהן להערכת רמות הביטוי של גנים HLA. בנוסף להטיות מתועדות היטב הקשורות למבחני RNA-seq (למשל, השפעות אצווה, הכנת ספרייה, תוכן GC ('t Hoen et al. 2013), הקושי באומדן רמות ביטוי עבור גנים של HLA נובע מהעובדה שהכימות כולל יישור של קריאות קצרות לגנום התייחסות, שאינו מספק ייצוג מלא של המגוון האללי של HLA.

לכן, ייתכן שחלק מהקריאות לא יצליחו להתיישר בגלל מספר רב של הבדלים הנוגעים לגנום הייחוס (Brandt et al. 2015). בנוסף, הגנים של HLA הם חלק ממשפחת גנים שנוצרה לאחר סבבים עוקבים של כפילות ולעיתים מכילים מקטעים הדומים מאוד בין הפרלוגים, ובכך מביאים ליישורים צולבים בין גנים ולכימות מוטה של ​​רמות הביטוי. קשיים אלו הניעו את הפיתוח של צינורות חישוביים (ראה Johansson et al. 2022 לסקירה) אשר מסבירים את מגוון ה-HLA הידוע בשלב היישור והוכחו כמספקים רמות ביטוי מדויקות לגנים של HLA (Boegel et al. 2012; Lee et al. al. 2018; Aguiar et al. 2019; Gutierrez-Arcelus et al. 2020; Darby et al. 2020).

בעוד שגם גישות RNA-seq וגם qPCR מעריכות את ביטוי HLA על ידי כימות של שפע התמלילים, השיטות כוללות תהליכי עיבוד ניסויים וביואינפורמטיים שונים. למיטב ידיעתנו, השוואה כמותית של תוצאות מ-RNA-seq לאלו שנגזרות מ-qPCR עבור גנים של HLA לא בוצעה. במחקר זה, ביקשנו להשוות טכניקות שונות ופנוטיפים מולקולריים לכימות של ביטוי HLA class I, תוך התחשבות ששום טכניקה לא יכולה להיחשב כסטנדרט זהב. כדי להפחית את ההשפעה של שונות טכנית וביולוגית בהשוואה של מחקרים שונים, ביצענו בדיקת RNA-seq על קבוצה של 96 אנשים שעבורם היו אומדני ביטוי qPCR זמינים (עבור HLA-A, -B, -C), ו עבור תת-קבוצה שלה היה זמין גם ביטוי משטח תאים מבוסס נוגדנים HLA-C. כימות RNA-seq בוצע עם צנרת מותאמת ל-HLA המאפשרת הערכת ביטוי מדויקת, תוך מזעור ההטיה של גישות סטנדרטיות הנשענות על גנום ייחוס יחיד.

חומרים ושיטות

דגימות

דגימות דם התקבלו מ-96 תורמי דם בריאים שנרשמו לתכנית התורמים מרצון במעבדה הלאומית של פרדריק לחקר הסרטן (FNLCR). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל הנבדקים והדגימות הועברו אנונימיות על ידי נהלים מאושרים של IRB של המכון הלאומי לסרטן. RNA הופק מתאי דם היקפיים מונו-גרעיניים מבודדים טריים (PBMC) באמצעות ערכת RNeasy Universal (Qiagen). RNA טופל עם DNAse נטול RNAse להסרה של DNA גנומי. סך ה-RNA שהופק מ-PBMCs היה כמותי באמצעות HT RNA Lab Chip (Caliper, Life Sciences). כל הדגימות שהראו ציון איכות RNA גבוה מ-8 שימשו בניתוחי ביטוי הגנים.

הקלדת HLA

אללים של HLA נקבעו על ידי רצף Sanger. בנוסף, הרצנו HLApers (Aguiar et al. 2019) ו-Kourami (Lee and Kingsford 2018) כדי להסיק אללים של HLA ישירות מ-RNAseq ובדקנו אם יש הסכמה עם השיחות המבוססות על רצף Sanger. אם ניקח בחשבון שיחות עקביות בין HLApers ל-Kourami, ראינו רק 10 סתירות עם קריאות Sanger מתוך 288 השוואות (3 לוקוסים × 96 פרטים). רובם (n=5) הראו תמיכה מ-RNA-seq עבור אלל קרוב מאוד לזה שנקבע על ידי רצף Sanger, ולכן בחרנו להשאיר את הקריאות המבוססות על RNA-seq. עבור 3 גנוטיפים, אנו רואים קריאות הומוזיגוטיות מ-RNA-seq ככל הנראה מכיוון שאלל אחד לא בא לידי ביטוי, ושמרנו את הקריאות מרצף Sanger. זה לא משפיע על הערכת הביטוי, מכיוון שאין קריאות מיושרות לאלל שלא זוהה באמצעות RNA-seq. עבור גנוטיפ אחד, ראינו תמיכה טובה בקריאה הטרוזיגוטית ואילו רצף Sanger נקרא הומוזיגוט. במקרה זה, שמרנו על השיחה המבוססת על RNA-seq מכיוון שהיא הסבירה טוב יותר את הקריאות שנצפו. עבור קריאת אלל אחת, שקלנו שגיאה של קריאות מבוססות RNA-seq עקב כיסוי קריאה לא מספיק.

PCR כמותי (qPCR)

רמות שעתוק HLA mRNA עבור HLA-A, -B ו-C נמדדו על ידי qPCR במבחן המבטיח הגברה בלתי מוטה של ​​האללים המשותפים בכל לוקוס תוך הימנעות מהגברה של כל שאר הלוקוסים. הפריימרים בהם נעשה שימוש היו: HLA-A (F, GCTCCCACTCCATGAGGTAT; R, AGTCTG TGACTGGGCCTTCA); HLA-B (F, ACTGAGCTTGTG GAGACCAGA; R, GCAGCCCCTCATGCTGT); HLA-C (F, CTGGCCCTGACCGAGACCTG; R, CGCTTGTAC TTCTGTGTCTCC). שעתוק הפוך בוצע באמצעות ערכת High-Capacity RNA-to-cDNA (Applied Biosystems). הגברה של HLA ושל גן הבית 2 מיקרוגלובולין (B2M) cDNA בוצעה באמצעות Power SYBR green master mix (Applied Biosystems), במכונת ABI 7900HT. רצפי פריימר עבור B2M מתוארים בטבלה S4 של Kulkarni et al. (2013). רמת הביטוי הממוצעת של כל גן HLA נורמלה לזו של B2M וחושבת בשיטת 2-∆∆Ct (כאשר Ct הוא מחזור הסף).

רמות ביטוי ממוצעות ספציפיות לאללים של אללים נפוצים של HLA נאמדו על ידי מודל ליניארי כמתואר ב- Ramsuran וחב'. (2015). באופן ספציפי, דגמנו ביטוי כפונקציה ליניארית של שני האללים הנישאים על ידי כל פרט וחילצנו את ההשפעות של כל אלל על ביטוי גנים. ביצענו את השלב הזה ב-R (ראה סעיף זמינות קוד).

ביטוי פני השטח

ביטוי פני השטח של תא HLA-C נמדד על גבי תאי CD3 פלוס מ-PBMCs טריים מבודדים על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות הנוגדן החד שבטי הספציפי ל-HLA-C DT9 (Apps et al. 2013). עבור ניתוח HLA-A בתת-קבוצה של אנשים הנושאים A*03 ו-A*11, צבענו תאים בנוגדן 0554HA (One Lambda, Inc.).

RNA-seq

הכנת RNA

RNA-seq בוצע על RNA מאוחסן ב-80 מעלות. RNA סך כמתה באמצעות Qubit RNA HS Assay (Thermo Fisher). איכות ה-RNA הוערכה באמצעות מכשיר 2100 Bioanalyzer ו-Agilent 6000 RNA Pico Kit (Agilent Technologies). עבור כל דגימה, 500 ננוגרם כולל של RNA שימש כקלט להכנת ספריות מלאות של rRNA מדוללות. ספרייה קשורה במתאם הוכנה עם ערכת KAPA HyperPrep (KAPA Biosystems, Wilmington, MA) באמצעות מתאמי ברקוד של Bioo Scientific NEXTfex™ DNA (BioScientifc, Austin, TX, ארה"ב) לפי הפרוטוקול שסופק על ידי KAPA.

דלדול rRNA באמצעות RiboErase

RNA ריבוזומלי התרוקן על ידי דגירת RNA כולל עם בדיקות משלימות לרצפי rRNA. לאחר הכלאה, נעשה שימוש ב-RNase H לפירוק אנזימטי של rRNA. ניקוי ועיכול DNase בוצעו באמצעות Kapa Pure Beads ו-DNase לפי פרוטוקול Kapa.

פרגמנטציה, סינתזת cDNA ובניית ספרייה

דגימות מדוללות rRNA פוצלו ב-85 מעלות למשך 4.5 דקות בנוכחות מגנזיום לפני סינתזת גדיל 1 ו-2 ותגובות A-Tailing. מתאמי ברקוד NEXTfex DNA (1.5 uM) נקשרו ל-cDNA בעל זנב A עם ברקוד ייחודי לכל דגימה. המוצרים טוהרו עם Kapa Pure Beads ובוצעו 8 מחזורים של הגברה של ספרייה. לאחר ההגברה, בוצע ניקוי סופי של הספרייה, וכימות הספרייה וה-QC הוערכו באמצעות Qubit DNA HS Assay (Thermo Fisher) ו-Agilent DNA HS במכשיר 2100 Bioanalyzer.

רצף

ספריות הרצף המרובות שהתקבלו שימשו ביצירת אשכולות על Illumina cBOT (Illumina, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב) ורצף בוצע באמצעות Illumina HiSeq 2500 בעקבות פרוטוקולים שסופקו על ידי Illumina עבור רצף קצה מזווג של 2×126 bp. כל תעתיק רושם לעומק מטרה של 40-50 מיליון קריאות.

RNA-seq על דגימות טריות מ-11 אנשים

כדי לחקור את האפשרות של פירוק דגימה של חומר המאוחסן ב-80 מעלות לפני רצף RNA, מקור פוטנציאלי לחוסר הסכמה עם הערכות qPCR, הוצאת דם מחדש מ-11 תורמים וביצענו RNA-seq על הדגימות החדשות. הניסוי בוצע עם אותה הכנה ושיטות ספרייה כמו קודם, אך בוצע ברצף באמצעות Illumina NextSeq עם קריאות של 2×150 pb.

כימות הביטוי עבור RNA-seq

תעתיק התייחסות

השתמשנו בסלמון (Patro et al. 2017) כדי להעריך את רמות הביטוי עבור כל התמלילים המוערים במסד הנתונים Gencode v37. השתמשנו בכל האפשרויות לתיקון הטיה על סלמון (הטיה GC, הטיית מיקום והטיה ספציפית לרצף).

מותאם אישית

זהה ל-"Ref transcriptome", אבל עם תעתיקי HLA מותאמים אישית לפי הגנוטיפים HLA-A, -B ו-C הנישאים על ידי כל אדם. ההתאמה האישית בוצעה על ידי יישור הרצף עבור אלל HLA של הגנום הייחוס לגנום כדי לקבל את הקואורדינטות. לאחר מכן, על ידי שימוש ביישור רב-רצף של האלל הקיים בגנום הייחוס עם כל שאר האללים (זמין מגרסה 3.43 של IPD-IMGT/HLA.0 (Robinson et al. 2020)), ייחסנו גנומי עמדות לכל אלל HLA. לבסוף, בנינו תמליל מותאם אישית המבוסס על השילוב של מידע על קואורדינטות תמליל ורצף האלל של HLA. הליך זה בוצע ב-R (R Core Team 2020), תוך שימוש בחבילת Biostrings (Pagès et al. 2020) וחבילת meta tidyverse (Wickham et al. 2019).

For more information:1950477648nn@gmail.com