שילוב עירוי תאי NK מאמצת עם פפטיד משחרר דופמין מפחית תאים מזדקנים בעכברים מבוגרים

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

מבוא

הזדקנות היא אחד מגורמי הסיכון העיקריים למחלות רבות [1], ופיתוח שיטות להתערבות בהזדקנות יפחית משמעותית את הסיכון לסדרה של מחלות הקשורות לגיל כגון מחלות לב וכלי דם ומחלות מוחיות [2, 3], סרטן [4], ומחלת אלצהיימר [5]. תאים מזדקנים (SNCs) מצטברים בהדרגה ברקמות במהלך תהליך ההזדקנות ונחשבים לגורם העיקרי למחלות הקשורות לגיל [6-8]. הוכח שהסרה של SNCs במודלים של עכברים מונעת או מעכבת חוסר תפקוד של רקמות ומאריכה תוחלת חיים בריאה [9, 10]. לעומת זאת, השתלת כמויות קטנות של SNCs גורמת לחוסר תפקוד פיזיולוגי בעכברים צעירים [1]. מחקרים אלו פתחו דלתות לפיתוח שיטות המכוונות להסרת SNCs לשיפור מחלות כרוניות הקשורות לגיל.

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

פינוי מיקוד של SNCs, המכונה "סנוליטיקה" הייתה הכימותרפיה הראשונה שנבדקה בהצלחה במודל פרה-קליני in vivo, וכיום קיימים מספר תרופות סנוליטיות [12]. רבות מהתרופות הללו מכוונות למסלולים אנטי-אפופטוטיים מוסדרים ב-SNCs כדי לנקות באופן סלקטיבי סוגים מסוימים של SNCs והראו את הפוטנציאל להאריך את תוחלת החיים ולשפר את תפקודי הגוף [13, 14].Cistanche Extract Anti Radiationלמרות ההיפוך המוצלח של הפתולוגיה הקשורה לגיל במודלים של בעלי חיים, ייתכנו מכשולים מסוימים לשימוש בתרופות סנוליטיות בבני אדם עקב ההטרוגניות של SNCs והסיכון הגבוה לרעילות [15]. לכן, יש לחקור שיטה חלופית שיכולה לחסל בבטחה מגוון רחב של SNCs בבני אדם.

SNPs ניתן לזהות ולהסיר על ידי מערכת החיסון [16]. מחקרים קודמים הראו ש-SNCs מפעילים תאי רוצח טבעי (NK) על ידי וויסות מעלה של הליגנד המשפעל לשרשרת A ו-B של חלבון A ו-B ב-Histocompatibility העיקריים [17]. עם זאת, עם העלייה בגיל, היעילות של מערכת החיסון פוחתת, מה שעלול להוביל לבריחה חיסונית של SNCs [18]. שיטות להתגבר על בריחה חיסונית הנגרמת על ידי ירידה בתפקוד החיסוני נחקרו בטיפול בסרטן [19]. לאחרונה חלה התקדמות בהעברת תאי NK לאימוץ לחיסול גידולים, מה שהראה יעילות מסוימת [20]; לפיכך, היה סביר להניח שהחליטה המאמצת של תאי NK עשויה לייצר ציטוטוקסיות ב-SNCs.

מערכת העצבים והחיסון הן שתי המערכות האדפטיביות החשובות ביותר של הגוף. מספר מחקרים הראו שדופמין (DA) כמווסת חיסון הוא מפתח לתקשורת נוירואימונית [21]. DA מבצע את תפקידיו הביולוגיים על ידי אינטראקציה והפעלה של קולטני דופמין (DR), המחולקים ל-2 תת-קבוצות, D1-כמו (D1 ו-D5), ו-D2-כמו (D2, D3, ו-D4). מבחינת הפונקציות השונות שלהם, המעורבות של D1-כמו DR מגרה ייצור cAMP, בעוד שהמעורבות של D2-כמו DR מעכבת ייצור cAMP [22]. מחקרים קודמים הראו שגירוי D1-כמו DR משפר את הציטוטוקסיות של תאי NK הן במבחנה [23] והן in vivo [24]. עם זאת, רמות DA יורדות ככל שגיל האדם עולה [25]. לפיכך, שיערנו שתרופות דופמינרגיות יכולות לשפר את הציטוטוקסיות של עירוי מאמצת של תאי NK.

Cistanche יכול אנטי אייג'ינג

כאן, אנו מציעים שימוש ב-nonapeptide Acein, שקיים אינטראקציה עם אנזים הממיר אנגיוטנסין (ACE I) כדי לגרום להפרשת DA [26], בשילוב עם טיפול תאי NK מערכתי כדי לחסל SNCs. תוצאות במבחנה הראו שתאי NK הסירו SNCs, ללא תלות במשרצי הזדקנות וסוגי תאים.cistanche herbaבמודל עכבר מזדקן, טיפול בתאי NK בשילוב עם Acein הפחית באופן משמעותי את מספר התאים החיוביים הקשורים להזדקנות -גלקטוזידאז (SA- -gal) ברקמות מרובות, הפחית את הביטוי של גנים הקשורים להזדקנות באיברים מרכזיים והקלה על פנוטיפים של הפרשה (SSPs) הקשורים להזדקנות. תוצאות מחקר זה מספקות תובנות לגבי השחזור האפשרי של המעקב החיסוני של SNCs כרוניים באמצעות טיפול בתאי NK בשילוב עם Ace.

תוצאות

עירוי אימוץ של תאי NK מפחית תאי CD3 בתוספת T בדם היקפי

למחקר גויסו 26 מתנדבים שקיבלו עירוי תאי NK. המאפיינים ומאפייני תאי ה-NK של המתנדבים מוצגים בטבלה 1. מרווח הזמן לאיסוף דם לאחר עירוי תאי NK היה כ-37 (25-57) ימים. היחס (איור 1A) והמספר המוחלט (איור 1B) של תאי NK בדם ההיקפי היו ביחס הפוך לגיל המתנדבים. באופן מפתיע, הטוהר של תוצר תאי ה-NK שהוזן מחדש לכל פרט נמצא גם בקורלציה הפוכה לגיל המתנדבים (איור 1C).צמיחת הפין cistancheייתכן שזה נובע מירידה הדרגתית במספר תאי NK עם העלייה בגיל. על מנת לשקף את ההשפעה האנטי-אייג'ינג של מתן תאי NK, זוהו מספר סמנים מזדקנים בדם היקפי CD3 פלוס T, אשר משקפים במידה רבה את הפנוטיפ הקשור לגיל של הגוף [27], לפני ואחרי עירוי תאי NK. בהשוואה לסמני ההזדקנות וגורם SASP של תאי CD3 פלוס T בדם היקפי לפני ואחרי עירוי תאי NK אוטולוגיים, שיעור תאי T חיוביים ל-SA- - ירד באופן משמעותי לאחר עירוי (איור 1D). רמות ה-mRNA של P16, P21 ומעכבי מפעיל פלסמינוגן 1(Pai1) ירדו באופן משמעותי, בעוד השינויים ברמות ה-mRNA של חלבון chemoattractant מונוציטים-1 (MCP-1) ו-IL-6 לא היו משמעותיים (איור 1E). לא היה הבדל משמעותי במדדים הביוכימיים (טבלה משלימה 1) בדם ההיקפי.

תאי NK אנושיים מפחיתים את סמני ההזדקנות של רקמת השומן והפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים

רקמת שומן נאספה משלושה אנשים שמנים, שכן השמנת יתר נוטה לגרום להצטברות של SNCs [28]. בנוסף, רקמת השומן תורבה במדיום מותנה מ-SNCs כדי לגרום עוד יותר להזדקנות רקמת שומן. רקמת שומן שתורבתה במדיום מותנה מ-non-SNCs נחשבה כביקורת. ביטוי Perforin (Fig.2A) ו-CD69 (Fig.2B) בתאי NK היה מווסת משמעותית לאחר דגירה משותפת עם רקמת שומן מזדקנת בהשוואה לדגירה משותפת עם רקמת שומן ביקורתית. הביטוי של סמנים מזדקנים p16 ו-p21 in

רקמת השומן המזדקנת ירדה באופן משמעותי לאחר טיפול בתאי NK (איור 2C, איור משלים 1A, B). מצאנו גם שמרכיב המפתח של SASP במדיום המותנה לאחר דגירה משותפת עם תאי NK בקבוצה המזדקנת ירד באופן משמעותי (איור 2D). תוצאות אלו הצביעו על כך שתאי NK יכולים לחסל SNCs מרקמת שומן ולהפחית את הפנוטיפ של SASP.

ניתן להפעיל תאי NK של עכברים נגד SNCs ולהפעיל ציטוטוקסיות

תחילה גרמנו את ההזדקנות של תאי אבות שומניים של עכברים על ידי הקרנה או אדריאמיצין כפי שתואר קודם [29]. כדי לקבוע אם תאי NK הופעלו באופן ספציפי על ידי SNCs, תאי בקרה לא מוקרנים או SNCs מוקרנים הודגרו יחד עם תאי NK למשך 24 שעות. ציטומטריית זרימה הראתה שרמות הביטוי של CD69 (איור 3A) ו-IFN-y (איור 3B) בתאי NK היו מווסתות באופן משמעותי בתאי יעד SNC בהשוואה לתאי מטרה בקרה. בינתיים, לאחר דגירה משותפת עם תאי NK, הרמה האפופטוטית של SNCs הייתה גבוהה משמעותית מזו של תאי בקרה (איור 3C). לאחר מכן, זיהינו את הביטוי של ליגנדים המפעילים ומעכבים תאי NK ב-SNCs. תוצאות ה-qPCR הראו כי רמת הביטוי של ליגנדים מפעילים בתאי NK הייתה מווסתת באופן משמעותי בהשוואה לתאי בקרה, ורמת הביטוי של כמה ליגנים מעכבים, כגון בטא 2 מיקרוגלובולין (2m), הייתה מווסתת בהשוואה לתאי בקרה (איור .3D). בדקנו גם את היכולת של תאי NK לחסל SNCs in vivo.יתרונות cistanche סלסהתאי בקרה עם תווית DiR ו-SNC עם תווית DiR הושתלו בחלל הבטן של עכברים, ותאי NK ניתנו דרך וריד הזנב. תוצאות הדמיה in vivo הראו כי עוצמת הקרינה בעכברים שהושתלו עם SNCs לאחר טיפול בתאי NK הייתה חלשה משמעותית מזו בעכברים שהושתלו עם תאי בקרה (איור 3E). זה הצביע על כך שהיכולת של תאי NK להרוג SNCs הייתה גבוהה משמעותית מזו של SNCs in vivo. לאחר מכן, קבענו אם הציטוטוקסיות של תאי NK כנגד SNCs תלויה במינון וספציפית לתא. במקביל, השתמשנו גם בהזדקנות המושרה על ידי דוקסורוביצין כדי לקבוע אם הציטוטוקסיות של תאי NK נגד SNCs מוגבלת להשראת קרינה. התוצאות הראו כי לתאי NK הייתה פעילות ציטוטוקסית משמעותית כנגד SNCs באופן תלוי מינון, אך ציטוטוקסיות מועטה כנגד תאי בקרה. לשיטות גירוי הזדקנות שונות לא הייתה השפעה על היכולת של תאי NK להרוג SNCs (איור 3F). תוצאות אלו הצביעו על כך שתאי NK יכולים להיות מופעלים באופן ספציפי על ידי SNCs ולייצר ציטוטוקסיות משמעותית כנגד SNCs במבחנה ובאינבו.

DA משפר את הציטוטוקסיות של תאי NK של עכברים כנגד SNCs באמצעות קולטנים דמויי D1-

לאור פונקציית התקשורת הנוירואימונית החשובה של DA [30], הערכנו האם DA יכול לשפר את הציטוטוקסיות של תאי NK של עכברים כנגד SNCs. תאי NK הודגרו יחד עם SNCs הנגרמות על ידי קרינה, וריכוזים שונים של DA נוספו למדיום. התוצאות הראו כי DA יכול לשפר את הציטוטוקסיות של תאי NK נגד SNCs (איור 4A, B). כדי לאפיין את מסלול האיתות שבאמצעותו DA הגביר את השפעת ההרג של תאי NK על SNCs, הוערכו השינויים בביטוי DR, תכולת cAMP וזרחון cAMP element-binding protein(CREB) בתאי NK. בתאי NK שהודגרו יחד עם SNCs יחד עם DA, התוכן של cAMP (איור 4C) ורמת הזרחון של CREB (איור 4D, איור משלים 2A) עלו באופן משמעותי, בהשוואה לתאי NK ודגירה משותפת של SNC ללא DA. על מנת להבהיר מדוע DA משפר את פעילות ההרג של תאי NK נגד SNCs, השווינו את השינויים של DR בתאי NK לאחר שתאי NK הודגרו יחד עם SNCs או תאי בקרה. התוצאות הראו שרמת הביטוי D1 ו-D5 DR הווסרה באופן משמעותי לאחר שתאי NK הודגרו יחד עם SNCs בהשוואה לתאי ביקורת (איור 4E). לאחר מכן, DA ו-D1-אוהבים אנטגוניסטים לקולטן או D2-אוהבים

אנטגוניסטים לקולטן נוספו יחד במערכת הדגירה המשותפת של תאי NK ו-SNCs. בהשוואה לתוספת של DA בלבד, רמת האפופטוזיס של SNCs ירדה עם הוספת DA בתוספת SCH-23300(D1-כמו אנטגוניסט לקולטן) (איור 4F, G). בינתיים, תכולת ה-cAMP (איור 4H) ורמת הזרחון של CREB (איור 41, איור משלים 2B) בתאי NK הוגדרו. לעומת זאת, תוספת של DA בתוספת haloperidol (אנטגוניסט לקולטן D2) לא שינתה באופן משמעותי את רמת האפופטוזיס של SNCs, את תכולת cAMP ואת זרחון CREB בתאי NK, בהשוואה לתוספת של DA בלבד. תוצאות אלו הוכיחו ש-DA הגביר את פעילות ההרג של תאי NK של עכברים נגד SNCs באמצעות D1-כמו Drs.

אייס בשילוב עם תאי NK של עכבר משפר באופן משמעותי את הפינוי של SNCs in vivo

מחקר קודם הראה כי הדופמין יורד עם הגיל בבני אדם [22]. תחילה מדדנו את רמת הדופמין ההיקפית בעכברים צעירים ומבוגרים. התוצאות הצביעו על כך שרמות הדופמין בפלזמה של העכברים הישנים היו נמוכות מאלה של העכברים הצעירים (איור 5A). לאחר מכן, נחקר שחרור דופמין היקפי לאחר הזרקה תוך פריטונאלית של Acein בעכברים ישנים. מצאנו שרמות הדופמין בפלזמה עלו באופן משמעותי לאחר הזרקת 10 מ"ג/ק"ג של אצאין (איור 5B, איור משלים 3). לאור זאת, ביצענו תאי NK של עכבר בשילוב עם Acein לטיפול בעכברים מבוגרים. זיהינו את מצבם של תאי NK בדם ההיקפי של עכברים לאחר הטיפול ומצאנו שמספר תאי ה-NK בדם ההיקפי של עירוי של תאי NK בלבד או תאי NK בשילוב עם Ace היה גבוה משמעותית מזה של הקבוצה שטופלה באייס. קבוצת PBS, בעוד שמספר תאי NK לא היה שונה באופן משמעותי בין הקבוצה שטופלה בתאי NK לבין תאי NK בשילוב עם הקבוצה שטופלה באסין (איור 5C, D).מינון cistanche tubulosa redditגילוי נוסף של רמת ההפעלה של תאי NK הראה כי רמת הביטוי של CD69 בתאי NK בדם היקפי בקבוצה המטופלת המשולבת הייתה מווסתת משמעותית בהשוואה לקבוצה שטופלה בתאי NK (איור 5E). לאחר מכן, הערכנו את ה-SNCs ברקמה. מצאנו שעירוי של תאי NK לבדו הפחית את הביטוי של כמה סמנים מזדקנים בהשוואה לקבוצת PBS ולקבוצה שטופלה באסין, בעוד עירוי של תאי NK בשילוב עם Acein הפחית באופן משמעותי את התאים החיוביים ל-SA- - (איור 5F) ) וכן רמות הביטוי של P16 ו-P21 (איור 5G, איור משלים 4A, B) ברקמת השומן, בהשוואה לטיפול בתאי NK בלבד. מספר Ki67BrdUcells ברקמת השומן גדל גם הוא באופן משמעותי (איור 5H), מה שמוכיח עוד יותר שתכולת SNCs ברקמת השומן הייתה נמוכה יותר בקבוצה המטופלת המשולבת. צביעת SA- -גל של קטעי כבד, ריאות, כליות ושומן הראו גם את הרמה הנמוכה ביותר של SNCs בקבוצה המטופלת המשולבת (איור משלים.5A-D). תוצאות אלו הראו שתאי NK בשילוב עם טיפול באסין הגבירו את רמת ההפעלה של תאי NK בעכברים, וגרמו לחיסול משמעותי של SNCs in vivo.

אייס בשילוב עם תאי NK מפחית פנוטיפים הקשורים לגיל בעכברים מבוגרים

כדי לאשר עוד יותר פנוטיפים הקשורים לגיל בעכברים, נאספו רקמות הכבד, הריאות, הכליות, השומן והעיניים כדי לזהות מגוון סמנים מזדקנים כולל גורמי P16, P21 ו-SASP. דגימות אלו נבחרו מכיוון שרקמות אלו נוטות יותר לעבור הזדקנות עם הגיל [31]. בכל רקמה, לאחר עירוי תאי NK בלבד, רמות ה-mRNA של גורמי P16, P21 ו-SASP היו נמוכות משמעותית מאלו בקבוצת הביקורת, בעוד שרמות סמני ההזדקנות ברקמות הכבד, השומן והערב בשילוב המטופלים. הקבוצה ירדה עוד יותר בהשוואה לקבוצה שטופלה עם עירוי תאי NK בלבד (איור 6A). באופן דומה, זיהינו גם את גורם ה-SASP העיקרי בסרום של עכברים, והתוצאות היו עקביות עם התוצאות ברקמות (איור 6B). בנוסף, בדקנו גם רמות NAD בכבד וברקמת השומן, הקשורות להזדקנות [32]. מצאנו כי עירוי של תאי NK לבד או בטיפול משולב העלה משמעותית את תכולת ה-NAD בכבד וברקמת השומן, רמת השיפור הייתה גבוהה משמעותית בקבוצת הטיפול המשולב (איור 6C). כמה אינדקסים ביוכימיים בסרום כולל ALT, AST, CREA, UA, CHOL ו-BUN קשורים לרמות ההזדקנות [33]. מצאנו שרק UA הופחת משמעותית בסרום של עכברים בקבוצה שטופלה בשילוב, בעוד שהמדדים הביוכימיים העיקריים האחרים לא עשו זאת.

חומר ושיטות עירוי של תאי NK אנושיים

עירוי תאי NK אוטולוגי בוצע על ידי בית החולים לסרטן שנחאי מנגצ'או (שנחאי, סין), וכל הפרוטוקולים אושרו על ידי ועדת האתיקה שלהם (מספר 05,2020, ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים לסרטן שנחאי מנגצ'או). כל המתנדבים סיפקו הסכמה מדעת חתומה לקבלת דם היקפי. בקצרה, 50 מ"ל דם היקפי הופק מכל אדם, ולאחר מכן בודדו תאי דם היקפיים מונו-גרעיניים (PBMCs) והועברו לבקבוק T75 עם ExCellerate" Human NK Cell Expansion Media (R&D Systems, ארה"ב) המכילה 1×Cloudz CD2/NKp46 , רקומביננטי אנושי IL-2(27ng/mL), Human Recombinant L-12 (10 ng/mL), Human Recombinant IL-18 (10 ng/mL, ו- Human Recombinant L{{ 13}}(10 ng/mL)(R&D Systems, ארה"ב) למשך 48 שעות, ולאחר מכן הוחלף במדיום מופעל (270 ng/mL Human IL רקומביננטי-2, 20 ng/mL Human IL רקומביננטי-12 , 20 ng/mL Human IL רקומביננטי-18 ו-20 ng/mL Human Recombinant IL-21) לתרבית נוספת. צפיפות התאים נשמרה ב-1×10 מעלות תאים/mL. ביום 28 של התרבית , מספר קטן של תאי NK אוטולוגיים נאספו לצורך בקרת איכות והוזרקו תוך ורידי יחד עם תאי NK אוטולוגיים בצפיפות של 4.15×10 מעלות (3.76-5.87×10), עם זמן עירוי של 30 דקות תהליך הניסוי בוצע באקורדה עם השיטות הקליניות הטובות. מרווח הזמן לאיסוף הדם השני היה כ-37 (25-57) ימים.

בידוד תאי T ותאי NK מדם היקפי אנושיים דם טרי הושג ממתנדבים בריאים לאחר מתן הסכמה מדעת, והפרוטוקול אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת סין פרמצבטיקה (מספר היתר: SYXK2016-0011). Lymphoprep (STEMCELL Technologies, קנדה) שימש לבידוד PBMCs אנושיים. תאי CD3 פלוס T אנושיים התקבלו מ-PBMCs באמצעות חרוזים מגנטיים ממיינים של תאי CD3 T אנושיים (Miltenyi Biotec, גרמניה) בהתאם לפרוטוקול היצרן. תאי NK בודדו מדם היקפי באמצעות RosetteSep" Cocktail Human NK Cell Enrichment (STEMCELL Technologies) לפי פרוטוקול היצרן

הפרדה והרחבה של תאי NK עכברים במבחנה

תאי NK בטחול עכברים בודדו באמצעות ערכת בידוד תאי NK (Miltenyi Biotec) לפי הוראות היצרן. בקצרה, התקבלו טחול עכברים, תאי טחול סוננו באמצעות מסנן תאים בגודל 70 מיקרומטר, ולימפוציטים מטחול הושגו באמצעות צנטריפוגה של שיפוע צפיפות באמצעות ערכת הפרדת לימפוציטים בטחול עכבר (Solarbio, סין). הלימפוציטים בטחול נאספו כדי להשיג תאי NK בטוהר גבוה באמצעות חרוזים מגנטיים להפרדת תאי NK של עכברים. תאי NK הטחול המבודדים תורבו במדיום תחזוקה RPMI-1640 בתוספת של 10 אחוז נסיוב בקר עוברי (FBS), 1 אחוז L-גלוטמין, 1 אחוז פניצילין/סטרפטומיצין, 1 אחוז בינוני חיוני מינימלי (MEM) שאינו חומצת אמינו חיונית, חומצת נתרן פירובאט 1 אחוז ו-50 uM מרקפטואתנול (כולם מ-Life Technologies, ארה"ב). בנוסף, נוספו 200 IU/mL אינטרלוקין רקומביננטי 2 (RL-2)(PeproTech, ארה"ב) ו-10 ng/mL עכבר I-15(ml-15)(PeproTech) בינוני. לאחר מכן נאספו תאי NK של 10 מעלות ולימפוציטים בטחול מוקרנים ב-10 מעלות, ומדיום הגברה של 5 מ"ל (מדיום תחזוקה בתוספת של 1000 IU/mL rlL-2,10ng/mL ml-15 ו-30ng/mL anti -NKp46 נוגדן (PA5-46986,Invitrogen,USA)) היה

איור 3 SNCs מפעילים תאי NK ונהרגו על ידי תאי NK. ציטומטריית זרימה לזיהוי הביטוי של (A) CD69 ו-(B) IFN-y בוצעה לאחר דגירה משותפת של 24 שעות עם תאי NK של עכברים ופראדיפוציטים או פראדיפוציטים הנגרמות על ידי קרינה. n =3. הנתונים מוצגים כאמצעים ± SD. הבדלים הוערכו על ידי מבחן ה-t-t-prometric הבלתי-פרמטרי הדו-זנבתי. **עמ'<0.01.c snc="" apoptosis="" was="" detected="" after="" a="" 24-h="" co-incubation="" with="" dir-labeled="" nk="" cells="" by="" flow="" cytometry.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="" test.=""><0.01.d activating="" ligands="" and="" inhibitory="" ligands="" of="" nk="" cells="" on="" preadipocytes,="" doxorubicin-induced="" preadipocytes,="" or="" irradiation-induced="" preadipocytes="" were="" measured="" by="" pcr.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means="" ±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" one-way="" anova="">< 0.05(irradiation="" vs=""><0.05(doxorubicin vs="" con).e="" 1×="" 10°dir-labeled="" control="" preadipocytes="" or="" irradiation-induced="" senescent="" preadipocytes="" were="" implanted="" into="" the="" abdominal="" cavity.="" representative="" images="" showing="" fluorescence="" activity="" in="" mice="" seven="" days="" after="" 5×="" 10°nk="" cell="" treatment.="" quantification="" of="" fluorescence="" activity.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova=""><><0.0001.f quantification="" of="" cytotoxicity="" of="" non-senescent="" and="" senescent="" counterparts="" induced="" by="" irradiation="" or="" adriamycin="" incubated="" with="" increasing="" nk="" cells="" for="" 24="" h.="" n="3.Data" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="">< 0.01,=""><><0.0001. two="" parallel="" samples="" were="" set="" in="" each="" experiment="" and="" three="" independent="" experiments="" were="" performed="" for="" each="" result.="" added="" to="" a="" t25="" flask.="" every="" three="" days,="" 1000="" iu/ml="" rll-2="" was="" added="" and="" a="" fresh="" amplification="" medium="" was="" added="" on="" the="" 9th="" day="" to="" maintain="" the="" cell="" density="" at="" 1×10°cells/ml.="" nk="" cells="" were="" collected="" on="" the="" 20th="" day,="" and="" nk="" cells="" were="" amplified="" 50-fold.="" then="" the="" purity="" of="" the="" nk="" cells="" was="" determined="" by="" flow="">

מיצוי של קדם-אדיפוציטים ותאי לוויין שרירים

הפראדיפוציטים חולצו כמתואר קודם [11]. בקצרה, שומן אנושי או עכבר הוסר בתנאים סטריליים וחתך לחתיכות של 1-2 מ"מ, נשטף פעמיים עם PBS, ועוכל עם קולגנאז ll (Solarbio) ב-37 מעלות למשך שעה. לאחר מכן התאים סוננו עם מסנן תאים של 100 מיקרומטר, עברו צנטריפוגה ב-300 גרם למשך 5 דקות, ונאספו. התאים הדביקים תורבו ב-a-MEM בתוספת 20 אחוז FBS למשך 12 שעות ועוכלו עם טריפסין כדי לאסוף תאים דביקים. תאי לוויין השריר בודדו כפי שתואר קודם [34]. שריר הארבע ראשי נחתך לחתיכות של 1-2 מ"מ, ונוספו 5 מ"ל קולגנאז ll לעיכול ב-37 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות. התערובת עורבבה עם פיפטה, ונוספה מדיום מלא של 5 מ"ל לאחר עיכול נוסף למשך 12 דקות. התאים סוננו באמצעות מסנן תאים בגודל 70 מיקרומטר וצנטריפוגה ב-300 גרם למשך 5 דקות. ואז היו תאים

מתורבת עם 5 מ"ל מדיום מתווסף מדי יום במשך 4 ימים. התאים הנדבקים הועפו עם פיפטה ועברו צנטריפוגה ב-2000×g למשך 5 דקות. לאחר עיכול טריפסין ב-37 מעלות למשך 5 דקות, התאים עברו צנטריפוגה ב-2000×g למשך 5 דקות ונאספו. לאחר מכן נוספו 5 מ"ל F-10 המדיום בתוספת של 20 אחוז FBS ו-4 ננוגרם/מ"ל פיברובלסט בסיסי (PeproTech).

ציטוטוקסיות של תאי NK בטחול עכברים ל-SNCs זוהתה על ידי מבחן הלקטט דהידרוגנאז

ה-SNCs נגרמו על ידי 0.2 מיקרומטר Adriamycin (MedChemExpress, ארה"ב) למשך 24 שעות או על ידי המשך תרבית במשך 20 ימים לאחר קרינת רנטגן של 10 Gy. לאחר מכן הונחו 5,000 SNCs לתוך צלחת, ותאי NK בטחול (כדאיות התא: 93.5-97.1 אחוזים) נוספו ביחסי גורם למטרה של 50:1,25:1,12.5:1, 6.25: 1,3.125:1 ו-1.563:1. הסופרנטנטים נאספו לאחר גידול משותף ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, וערכת גילוי ציטוטוקסיות לקטאט דהידרוגנאז (LDH) (Cayman Chemical, ארה"ב) שימשה לגילוי. ציטוטוקסיות חושבה על ידי הנוסחה הבאה: ציטוטוקסיות ( אחוז )=(ניסוי תא תערובת-תא מטרה ספונטני-תא אפקט ספונטני)/(תא יעד מקסימלי- תא יעד ספונטני)× 100.

הדמיה חיה

12 עכברי C57BL/6 בני 10-שבוע נרכשו מ-Changzhou Cavens Laboratory Animal Co, Ltd. (ג'יאנגסו, סין). לאחר מכן 1×10 מעלות 1,1'-אוקטדציל-3,3,3',3'-טטרה-מתיל-אינדוקרבוציאנין יודיד (DiR) (Invitrogen) מסומן

קדם-אדיפוציטים או קדם-אדיפוציטים מזדקנים הנגרמות על ידי קרינה הושעו מחדש ב-200 ul-phosphate-buffered saline (PBS) והוזרקו לחלל הבטן של עכברים עם מחט בגודל 22. לאחר שלושה ימים, הוזרקו תאי NK אלוגניים בגודל 5×10 מעלות (כדאיות התא: 93.6-96.2 אחוזים) ב-100uL PBS דרך וריד הזנב. ביום העשירי, העכברים הורדמו עם איזופלורן. פלואורסצנטי זוהה באמצעות מערכת הדמיה מסדרת MS 100 In Vivo (PerkinElmer, MA, ארה"ב).

ציטומטריית זרימה

כדי לזהות את האפופטוזיס של SNCs שהודגרו יחד עם תאי NK בטחול המסומנים ב-DiR (כדאיות התא: 91.8-93.2 אחוזים), SNCs של 1×10 מעלות עוכלו בדיוק ב-37 מעלות למשך 10 דקות ולאחר מכן נצבעו. עם ערכת צביעה של אנקסין V ו- Propidium iodide (PI) Apoptosis (Multisciences Biotech Co, Ltd., China) לפי פרוטוקול היצרן. SNCs היו סגורים במצב שלילי של DiR. כדי לבדוק את ההפעלה של תאי NK, תאי NK של עכברים נאספו ונצבעו ב-mNK1.1-allophycocyanin (APC)(S17016D) ועם אשכול התמיינות עכבר 69-R-phycoerythrin-cyanine7 (mCD{{ 17}}PE-Cy7)(H1.2F3)(Biolegend, ארה"ב) ב-4 מעלות למשך 30 דקות. לאחר מכן התאים עובדו עם ערכת CytodexCytoperm Plus (BD Biosciences, ארה"ב) והוצבעו בסגול 421 (mlFNy-BV421)(XMG1.2) ב-4 מעלות למשך 30 דקות. צביעת Perforin-APC(S16009A) של תאי NK אנושיים בוצעה תוך שימוש באותו פרוטוקול כמו זה המשמש לצביעה חוץ-תאית (CD56-fluorescein isothiocyanate [FITC](5.1H11), CD69-PE(FN50) ) וצביעה תוך תאית (perforin-APC)(Biolegend).

כדי לזהות תאי NK בדם היקפיים, נאספו 100uL דם נוגד קרישה. עבור דם היקפי של עכבר נוספו CD3-FITC, NK1.1-APC ו-CD69-PE-Cy7. עבור דם היקפי אנושי, CD3-BV421 (OKT3) ו-CD56-FITC נוספו והודגרו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן נוספו 400 μL 1× lysate אריתרוציטים (BD Biosciences) והודגרו במשך 3 דקות, ולאחר מכן שלוש שטיפות עם PBS. כדי לזהות שגשוג תאים ברקמת השומן, העכברים הוזרקו תוך-צפקית עם 200 μL של 10 מ"ג/מ"ל bromodeoxyuridine (BrdU) 24 ו-72 שעות לפני המתת חסד. לאחר המתת חסד, מחסני השומן המפשעתיים הוסרו וחתכו לשברים, עוכלו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם קולגנאז ll ו-DNase, וסוננו באמצעות מסנן תאים של 100 אום. תאים עובדו עם ערכת Cytofix/Cytoperm Plus והוצבעו עם BrdU-FITC (3D4) ו-Ki67-PE (16A8). ציטומטריית זרימה בוצעה על ציטומטר זרימה CytoFLEX. ערכת כתמי תאים מתים סגולים מתים לתיקון LIVE/DEAD (Thermo Fisher Scientific, ארה"ב) שימשה כדי לא לכלול תאים מתים בכל הניסויים. הנתונים נותחו באמצעות תוכנת FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, OR, ארה"ב).

PCR כמותי שעתוק הפוך

RNA הופץ באמצעות ריאגנט Trizol והופך והועתק ל-cDNA באמצעות Hair 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Yepsen Biotechnology, סין). PCR כמותי (qPCR) בוצע באמצעות תמהיל התגובה של SYBR Green (Yepsen Biotechnology) במערכת ABC QuantStudio 3 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, ארה"ב), כאשר GAPDH משמש כבקרה פנימית. הנתונים נותחו בשיטת 2-△ACt. רשימת רצפי הפריימר מדווחת בחומר משלים (טבלה 2-3).

צביעת גלקטוזידאז הקשורה להזדקנות

לצורך צביעת תאים, התאים נשטפו פעם אחת עם PBS, קבועים בתמיסת -galactosidase(SA- -gal) הקשורה להזדקנות (Cell Signaling Technology, ארה"ב) בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, נשטפו שלוש פעמים עם PBS והודגרו. לילה בתמיסת צביעה של SA- -gal ב-37 מעלות צלזיוס. הצלחת נאטמה בפאראפילם כדי למנוע אידוי של מדיום הצביעה. תאים

נשטפו עם PBS ונצפו במיקרוסקופ. עבור צביעת קטעים קפואים, החתכים יובשו ב-37 מעלות למשך 30דקות ותובעו בטמפרטורת החדר בתמיסת קיבוע SA- -gal למשך 15 דקות. החלקים נשטפו שלוש פעמים עם PBS והודגרו למשך הלילה בתמיסת צביעה של SA- -gal ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הם נצבעו באאוזין למשך דקה אחת ונשטפו במים למשך 2 דקות. נתוני צביעת SA- -gal נותחו באמצעות תוכנת Image-Pro Plus 6.0.

השתלות רקמת שומן אנושית

רקמת שומן משלושה אנשים התקבלה על ידי שאיבת שומן. אחד הנבדקים היה זכר, ושניים היו נקבות. הגיל הממוצע של הנבדקים היה 57.0±7.6 שנים (ממוצע±SD: טווח, 50-65). BMI ממוצע היה 40.5±5.1 ק"ג/מ"ר (ממוצע ± SD; טווח, 36.7-46.2）. ועדת האתיקה של בית החולים לסרטן שנחאי מנגצ'או (מס' 05, 2020, ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים לסרטן שנחאי מנגצ'או) אישרה את ערכת הניסויים. הושגה הסכמה מדעת לכל המתנדבים. רקמת שומן נחתכה לחתיכות קטנות בקוטר של כ-2 מ"מ. חמש חתיכות רקמה הונחו בכל באר של 96-צלחת בארות, ו-200 ul של קדם-אדיפוציטים או מדיום מותנה מ-preadipocytes מזדקנים הנגרמות על ידי קרינה, בתוספת 10 אחוז סרום AB אנושי, 1 אחוז L-גלוטמין, 1 אחוז פניצילין/סטרפטומיצין, 1 אחוז MEM חומצות אמינו לא חיוניות ו-1 אחוז חומצת נתרן פירובאט, נוספו לתרבות המשותפת במשך 24 שעות. לאחר מכן המדיום הוחלף במדיום טרי המכיל תאי NK אוטולוגיים בגודל 5×10 מעלות (כדאיות תאים: 92.3-95.7 אחוז 6) ותופח במשך 48 שעות נוספות, ולאחר מכן נאספו תאי NK לצורך ציטומטריית זרימה. רקמת השומן נשטפה חמש פעמים עם PBS, ואותו המדיום התווסף לתרבית נוספת למשך 48 שעות; הסופרנטנט (100 ul) שימש לזיהוי רב גורמים. קדם-אדיפוציטים או קדם-אדיפוציטים הנגרמות על ידי קרינה נגזרו מרקמת השומן של אותו אדם.

מאמר זה מופק מתוך מוות ומחלות תאי (2022) 13:305