משולבת פנגנומיקה וטרנסקריפטומיקה חושפת תהליכי ליבה וירולנטיות מיותרת בפתוגן צמחי פטרייתי המתפתח במהירות

תַקצִיר

רקע כללי

חקר השונות הגנומית בפתוגנים המתפתחים במהירות מאפשרת פוטנציאל זיהוי של גנים התומכים ב"ביולוגיית הליבה" שלהם, בהיותם נוכחים, מתפקדים ומתבטאים על ידי כל הזנים או "ביולוגיה גמישה", המשתנים בין הזנים. גנים התומכים בביולוגיה גמישה עשויים להיחשב כ"אביזרים", בעוד שקבוצת הגנים "הליבה" עשויה להיות חשובה עבור מאפיינים נפוצים של ביולוגיה של מין פתוגן, כולל ארסיות בכל הגנוטיפים המארח. הפטרייה הפתוגנית של החיטה Zymoseptoria tritici מייצגת את אחד האיומים המתפתחים במהירות על ביטחון המזון העולמי והייתה מוקד המחקר הזה.

יתרונות cistanche לגברים - מחזקים את המערכת החיסונית

לחץ כאן לצפייה במוצרי Cistanche Enhance Immunity

【בקש עוד】 דוא"ל:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

תוצאות

בנינו פנגנום של 18 בידודי שדה אירופאים, כאשר 12 נתונים גם לפרופיל שעתוק RNAseq במהלך ההדבקה. בשילוב נתונים אלה, חזינו מערך גנים "הליבה" הכולל 9807 רצפים שהיו (1) נוכחים בכל הבידודים, (2) חסרי פולימורפיזמים משביתים ו-(3) באו לידי ביטוי על ידי כל הבידודים. הוגדר גם גנום עזר גדול, המורכב מ-45% מכלל הגנים. סיווגנו פולימורפיזם גנטי וגנומי הן בסולם גנים כרומוזומלי והן בקנה מידה אינדיבידואלי. לחלבונים הדרושים לתפקודים חיוניים, כולל ארסיות, הייתה שונות רצף נמוכה מהממוצע בין גנים הליבה. גם גנום הליבה וגם הגנום הנלווה קידד הרבה חלבוני אפקטור מועמדים קטנים ומופרשים שכנראה מקיימים אינטראקציה עם חסינות הצמח. חולף בתיווך וקטור ויראלי בביטוי-יתר של צמח של 88 מועמדים לא הצליח לזהות מישהו שגרם לנמק עלים האופייני למחלה. עם זאת, השלמה פונקציונלית של מוטנט מחיקה לא פתוגני, חסר חמישה גנים ליבה, הוכיחה כי ארסיות מלאה שוחזרה על ידי החדרה מחדש של הגן היחיד המציג את הפולימורפיזם הנמוך ביותר ברצף ואת הביטוי הגבוה ביותר.

מסקנות

נתונים אלה תומכים בשימוש המשולב של פנגנומיקה וטרנסקריפטומיקה להגדרת גנים המייצגים את הליבה, והחולשות הניתנות לניצול, בפתוגנים המתפתחים במהירות.

מילות מפתח

וירוס פסיפס זנב שועל, Septoria tritici, אפקטור נקרוטרופי, גנים חיוניים, כרומוזומים נלווים, Dothideomycetes,אי יציבות כרומוזומים, Mycosphaerella spp

רקע כללי

השליטה בת-קיימא של מחלות זיהומיות המשפיעות על בעלי חיים וצמחים מאותגרת על ידי האבולוציה של המיקרו-אורגניזמים הסיבתיים [1, 2]. המחלות הקשות ביותר לשליטה הן אלו הנגרמות על ידי המינים המתפתחים במהירות הגבוהה ביותר, שיכולים להגיב במהירות ללחצים סלקטיביים, כולל חסינות מארח טבעי, תנאים סביבתיים שליליים ו/או תרופות אנטי-זיהומיות [1, 3]. הפוטנציאל של פתוגנים מיקרוביאליים להתפתח במהירות נקבע על ידי מספר מאפיינים, כולל בין היתר; (1) מחזור חיים מהיר ו-(2) מנגנונים המקדמים רבייה מינית [4]. זה האחרון יכול להוביל לרמות גדולות של שונות גנטית עומדת הקיימת בתוך אוכלוסיות פתוגנים אשר ניתן לקיים ולהגביר מול לחצים סלקטיביים חיצוניים. בעוד שגנים מסוימים עשויים להפגין שינויים טבעיים ברצף הגנטי, המניעים את האבולוציה שלהם, אחרים לא יכולים ללכת לאיבוד (או להשבית על ידי מוטציה) מבלי להשפיע על כושרו של הפתוגנים. עבור פתוגנים אוקריוטיים ופרוקריוטיים של צמחים, הבדל זה ברמות הפולימורפיזם בין הגנים הוביל למימוש של "גנומים דו-מהירות" [5], הכוללים כמה מרכיבים המתפתחים במהירות ונחשבים כמגיבים לגורמים חיצוניים (טווח מארח ו חסינות וכו'), בעוד שהסט המתפתח לאט יותר מכיל גנים עם ניהול משק בית ותפקודים חיוניים אחרים. ניתן להרכיב את החלקים הנלווים והליבה של הגנום הפתוגן ל"פנגנום" שאמור לייצג קרוב לקבוצה השלמה של הגנים הקיימים במין [6]. גודלם של חלקי הליבה והעזר של הפנגנומים משתנים בין מינים של חיידקים, פטריות ואומיציטים [7-13] ועשויים לתת אינדיקציה לפוטנציאל של אוכלוסיות חיידקים להתפתח במהירות ללחצים סלקטיביים. ניתן להעלות על הדעת שככל שהפנגנום העזר גדול יותר ביחס לליבה, כך אוכלוסיות אלו מסוגלות להתפתח במהירות. הפתוגן הפטרייתי של החיטה, Zymoseptoria tritici, הוא הגורם הסיבתי של Septoria tritici blotch (STB), מחלה חשובה עולמית המאיימת על ביטחון המזון [14]. הפתוגן גם נחשב זמן רב כמערכת מודל למחקרים על ביולוגיה ואבולוציה של האוכלוסייה [15-18]. הסיבה לכך היא ש-Z. tritici הוא בעל שיעור גבוה של ריקומבינציה מינית אשר מקיים כמויות גדולות של מגוון גנטי עומד בתוך האוכלוסיות שלו ומאפשר הסתגלות מהירה בקנה מידה גלובלי ומקומי כאחד [17, 19-24]. כתוצאה מכך, גנים עיקריים של חיטה המקנים עמידות ל-Z. tritici מתגברים במהירות [25]. בנוסף, רוב קוטלי הפטריות המסחריים בשימוש נרחב מאבדים את יעילותם עם הזמן [3]. השילוב של שני הגורמים הללו מהווה איום על ייצור החיטה העולמי שיש לטפל בו בדחיפות. Z. tritici גם הופיע לאחרונה כמודל חדש לגנום פתוגן עם הרבה הפניות לגנום באיכות גבוהה הזמינים כעת [26] בנוסף לפנגנומים שנבנו ממספר גדול של גנומים בודדים בודדים [27, 28]. אולי אחת התכונות המעניינות ביותר של הגנום Z. tritici היא הנוכחות של 13 כרומוזומי ליבה (1-13) שנמצאו בכל המבודדים, אך לאחר מכן עד ל-8 כרומוזומי עזר קטנים נוספים (14-21) שמראים הנוכחות/היעדר ופולימורפיזם מבני בין מבודדים [26, 29]. למרבה המזל, אחד מבודדי ההתייחסות הקהילתיים, והראשון שרוצץ לחלוטין, מבודד השדה ההולנדי IPO323 שנאסף בשנות ה-80, נושא 21 כרומוזומים, המספר הגדול ביותר שנצפה עד כה. לכן, IPO323 משמש נקודת אמת מצוינת ללימוד וריאציה בבידודים אחרים וכפיגום לבניית פנגנומים.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

מחזור הזיהום הא-מיני של Z. tritici אופייני לפתוגנים צמחיים קשורים רבים המשפיעים על גידולי מזון רבים [30]. פטריות אלו, השייכות למשפחת Mycosphaerellaceae של הסדר Dothideomycetes, פולשות בדרך כלל לרקמות הצמחים דרך הסטומטה [30, 31]. לאחר מכן מגיעה תקופה של צמיחה אסימפטומטית ארוכה בין תאי צמחים, הנמשכת לפחות 8 ימים, אשר מסתיימת בפתאומיות עם היווצרות של נגעי עלים נמקיים, מצב אשר עבור Z. tritici, נראה מתרחש כתוצאה מ"היפראקטיבציה" של הצמח. חסינות [32–34]. מוות תאי הצמח קשור לאחר מכן להיווצרות של מבני נבגים חדשים, pycnidia, בחללים תת-סטומאטליים ולאחר מכן שחול והתפשטות של pycnidiospores שזה עתה נוצרו בתקופות של גשם מתיז. פטריות אחרות של Dothideomycetes הוכחו כמעוררות היפראקטיבציה של חסינות הצמח באמצעות הפרשת "משפיענים" חלבוניים המוכרים בצמחים רגישים, וכתוצאה מכך למוות של תאים ורקמות (נמק או מוות תאי מתוכנת). פטריות נקרוטרופיות אלו מרוויחות מתגובה זו וחלבוני האפקטור המעורבים מכונים כעת כאפקטורים נקרוטרופיים [35, 36]. למרות שישנן כמה ראיות ראשוניות לכך ש-Z. tritici עשוי לפרוס גם אפקטורים נקרוטרופיים במעבר לצמיחה סימפטומטית [37], תוך שימוש בנגעי עלים, השערה זו לא נבדקה בצורה חזקה עד כה. שני הדרכים הלא בלעדיות הדדית להגנה על ייצור חיטה עתידי מהשפעת STB הם (1) חיזוק עמידות טבעית למחלות צמחים ו- (2) זיהוי מטרות מולקולריות חדשות שעשויות להיות מנוצלות לשליטה במחלות. באופן אידיאלי, אלה יאפשרו שליטה סלקטיבית של הפתוגן תוך הגבלת השפעות סביבתיות ואקולוגיות אחרות למינימום. גנומיקת פתוגנים ובפרט פנגנומיקה מציעים פוטנציאל להגביר את שתי האסטרטגיות. בעוד שחלבונים המקודדים על ידי האביזר, חלק המתפתח במהירות מהפנגנום עשוי להכיל גנים רבים המקיימים אינטראקציה עם חסינות צמחית (למשל אפקטורים), הגנום הליבה עשוי להציג מטרות המשתנות פחות בקלות עקב מתן עונשים שליליים לכושר (וארסיות). מסיבה זו, קוטלי פטריות חקלאיים מכוונים בדרך כלל לתהליכי ליבה, אשר ככל הנראה נחשבים פחות משתנים. עם זאת, כפי שהוזכר קודם לכן, אפילו מטרות אלו יכולות להתפתח במידה מסוימת כדי להתחמק מעיכוב כימי, כפי שתואר עבור חלבוני יעד רבים כיום של קוטלי פטריות [3, 14]. רוב קוטלי הפטריות ששימשו עד כה כוונו לקבוצה די מצומצמת של תהליכים מולקולריים (למשל, ביוסינתזה של סטרולים, נשימה וכו') [3]. ישנן יעדים רבים אחרים שיכולים לשמש לשליטה סלקטיבית בפתוגנים פטרייתיים שאמורים לנבוע משילוב וניתוח של מערכי נתונים מרובים של אומיקס. הפוטנציאל הגבוה לגילוי מודגש על ידי העובדה שבדרך כלל עד 40% מכל הגנים המזוהים ברצפי הגנום של פטריות פתוגניות (ופטריות בכלל) הם עדיין בעלי תפקוד לא ידוע. אלה שנמצאים ואולי נשמרים בגנום הליבה של פטריות פתוגניות עשויות להיות רלוונטיות במיוחד.

Pangenomics of rapidly evolving pathogens could be used to identify core, potentially specific gene sets, which could be exploited in future disease control [11]. The premise is that genes which are not evolving, in an otherwise rapidly evolving species, are most likely to be essential for either life or important for key virulence processes of the pathogen. Pangenomes themselves have, to date, largely been defined by sequencing genomic DNA from multiple members of a species. Whilst this is a critical and indispensable step in ascertaining the full potential of a species' genomics, gene expression support is perhaps overlooked for refinement of core and accessory gene calls, particularly in relation to biological processes such as pathogenicity/virulence. For example, if a core gene, predicted through genomic DNA sequence analysis, is not expressed by a successful pathogenic strain/ isolate during infection, it might be more appropriately considered accessory. Pangenome analyses on fungi and yeasts have recently emerged and have highlighted some major differences in the size of core and accessory gene components. For example, one recent study which analyzed the animal pathogenic yeasts, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, the free-living yeast, Saccharomyces cerevisiae, and the animal filamentous fungal pathogen Aspergillus fumigatus, predicted each to have >80% גנים מסומנים בתור ליבה [10]. עם זאת, ניתוחים אחרים על פטריות לוהטות הקשורות לצמח חזו רכיבי גן עזר גדולים יותר, כולל ~38% עבור הפתוגנים Claviceps purpurea [38] ו-~44% ב- ​​Pyrenophora tritici-repentis [39]. מחקרים פאן-גנומיים מקיפים קודמים על Z. tritici השתמשו באוכלוסיות גלובליות והיסטוריות הכוללות מספרי מבודדים גדולים, אשר רצפו בקנה מידה של גנום מקוטע ומלא [27, 28]. מחקרים אלו זיהו מערך גנים עזר גדול (~40% מכלל הגנים) למין זה. בנוסף, זה היה בקורלציה עם נוכחות/היעדרות נרחבת ופולימורפיזמים מבניים כרומוזומליים, המעורבים גם על אלמנטים חוזרים דינמיים (כולל אלמנטים הניתנים להעברה). ניתוח נוסף העלה גם כי גנים נלווים רבים מתבטאים גם הם נמוך יותר (בממוצע) מאשר גנים הליבה. מחקרים אלו מייצגים את "תקן הזהב" למבנה הפנגנום מסוג Z. tritici והמקיף ביותר עד כה עבור כל פטרייה חוטית. עם זאת, נותרה השאלה לגבי זה, ולמינים אחרים, באיזו מידה ניתן להשתמש ב-pangenomics כדי לזהות גנים ותהליכים של ארסיות ליבה. ובתוך מערכי הליבה של הגנים, האם רמות של פולימורפיזמים כלל-אוכלוסייתיים המשפיעים על שינויים בחומצות אמינו, כמו גם רמות ביטוי גנים, מסגירות את זהותם של גנים קשים של פתוגן מפתח?

במחקר זה, שילבנו רצף גנום וגישות תעתיק מבוססות RNAseq כדי לייצר פנגנום מאוסף אירופאי עדכני של בידודים של Z. tritici. המטרה העיקרית שלנו הייתה לבדוק האם גנים המצויים בתוך הליבה של גנום המקודדים לחלבונים עם שיעור נמוך של פולימורפיזם של חומצות אמינו (כלומר ברצפי קידוד) בין מבודדים, נושאים פונקציות חשובות, כולל תפקידים מרכזיים בתהליכי זיהום הליבה בחיטה. בהסכמה למחקרים הקודמים [27, 28], אנו מדגימים כי ל-Z. tritici יש גנום עזר גדול במיוחד (~45% מכל הגנים) התומך במעמדו המתפתח במהירות. יתרה מזאת, אנו מספקים נתונים ביולוגיים התומכים בבירור בתועלת של השימוש המשולב בשתי שיטות האומיקס לזיהוי גני ליבה ארסיות חדשניים. לעומת זאת, מסכי ביטוי יתר תפקודי של חלבון בתיווך ויראלי לא הצליחו לזהות אף אפקטור נקרוטרופי מועמד שאחראי לעורר נגעי מחלה בעלי חיטה, מהליבה או מהפנגנום הנלווה.

מערכת חיסון מגבירה צמח cistanche

תוצאות

מסכי ארסיות באוסף אירופאי Z. tritici מזהים זנים אגרסיביים דומים ממיקומים לא מקושרים גיאוגרפית

בדקנו 43 מבודדים של Z. tritici לאריסיות על 21 זני חיטת לחם אירופיים בעלי רגישות רחבה כדי לתת סך של 2709 נקודות נתונים (כולל שלוש שכפולים). מידע מבודד (קוד וארץ מקור) מוצג בקובץ נוסף 1: טבלה S1. כל אינטראקציה הוערכה באופן כמותי עבור הפרמטרים הבאים: (1) משך תקופת הדגירה, (2) הזמן שנדרש להגיע לנמק מלא (כאשר התרחש), ו- (3) רמות של נבגים א-מיניים (איור 1A). בהתבסס על ניקוד מחלות חישוביות וחזותיות כאחד (ראה שיטות וקובץ נוסף 2: איור S1), כל המבודדים קובצו לאחר מכן על סמך פרופילי הארסיות שלהם בלוח הזנים שנבדק (איור 1B). מבודד הבקרה החיובית IPO323, המשמש כאסמכתא עולמית [26] עם גנום ברצף מלא, היה פחות אגרסיבי מרוב הבידודים שנבדקו כנגד כמעט כל הזנים. בידוד זה נאסף בשנת 1984~ ומאז נשמר באחסון, עם מעבר חוזר מדי פעם דרך עלי חיטה; לכן, כרגע לא ברור אם תצפית זו יכלה (לפחות בחלקה) לנבוע מאחסון דגימות לאורך זמן. זיהינו שבעה מבודדים שלא הצליחו לייצר תסמיני מחלה על אף אחד מזני החיטה (איור 1B). מכיוון שמקורם של כל המבודדים הללו הוא מספרד או איטליה, שם חיטה טטרפלואידית (דורום/פסטה) (Triticum durum L.) מעובדת בתדירות גבוהה יותר, סביר להניח שהבידודים הללו היו ספציפיים לחיטת דורום [40, 41]. באופן משמעותי, מבודדים עם פרופילי ארסיות דומים לא התקבצו במיקום האיסוף שלהם, כאשר מבודדים שמקורם עד מזרח סלובקיה ועד מערב אירלנד כולם התקבצו יחד (איור 1B). תצפית זו מתיישבת היטב עם רמות גבוהות של שונות גנטית הקיימות בין מבודדים ומחקרים קודמים שהוכיחו שזה גבוה באותה מידה בקנה מידה של נגע עלה חיטה בודד, כמו על פני יבשות [42]. רבים מהמבודדים האגרסיביים יותר עם פרופילי ארסיות מובהקים נבחרו לאחר מכן לרצף גנומי (מודגש עם "#" באיור 1B) וניתוח RNAseq (מודגש עם "+" באיור 1B).

איור 1 הערכות ארסיות של אוסף הבידודים האירופי מול מגוון זני חיטה הקסאפלואידים (לחם). מהלך זמן התקדמות מחלה טיפוסי הממחיש את הפרמטרים המוערכים במסך, כולל הזמן שלוקח עד להופעת התסמינים הראשונים הנראים לעין ועד להופעת נמק מלא של העלים באזור המחוסן. האיור מציג את ההדבקה של זן החיטה Riband על ידי Z. tritici isolate IPO323. B פרופיל ארסיות של הבידודים לעומת לוח הזנים בהתבסס על רמות של נמק עלים וכלורוזיס. המדידות בוצעו הן על ידי הערכות חזותיות והן על ידי שימוש בתוכנת ניתוח התמונה LemnaTec ו- LemnaGrid עם תוצאות סופיות דומות. מבודדים דורגו וקובצו על סמך נתוני ארסיות. מבודדי Z. tritici המודגשים ב-# עברו רצף גנום לבניית פנגנום. בידודים המודגשים על ידי + נותחו גם על ידי RNAseq transcriptomics. זן החיטה Panorama (מודגש ב-X) נקבע כרגיש באופן שווה ומלא לרוב הבידודים ונבחר כגנוטיפ המארח לזיהום העלים RNAseq. שימו לב לנתוני הארסיות הנמוכים עבור קבוצת החוץ של שבעה מבודדים כנגד כל הזנים צפויים לנבוע מכך שהבידודים הללו מותאמים לגרימת מחלות בחיטה טטרפלואידית (דורום או פסטה). כל הנתונים מייצגים שלושה עלים נגועים שניתחו/קימו איתם אינטראקציה משני ניסויי שכפול ביולוגיים (6 עלים בסך הכל). ניתוח C SplitsTree של הפילוגניה המולקולרית של מבודדים שנבחרו לרצף גנומי. ארץ המוצא של הבידודים מוצגת בקיצור (Pl=Poland; GB=בריטניה; Be=Belgium; Cz=Czech Republic; Ge {{8 }} גרמניה; Sw=שבדיה; ו'=צרפת; Sl=סלובקיה; איר=אירלנד). בידוד הייחוס, IPO323 שנאסף ~1984 מהולנד (Ne) מיוצג גם הוא

רצף גנום וניתוח פילוגנטי על שבעה עשר בידודים אירופאים מגלים רמות גבוהות של מגוון גנטי

We used Illumina HiSeq 250 bp paired-end read technology to assemble the gene space of seventeen new isolates (indicated by # in Fig. 1B). BUSCO analysis (core dataset Pezizomycotina) was then performed to assess the completeness of each genome assembly (Table 1). Scores >97% בכל המקרים הצביעו על הרכבה טובה של מרחב הגנים (אזורי קידוד) עבור כל הבידודים. כמה גנים נבחרים של BUSCO היו חסרים בכל המכלולים, מה שמצביע על כך של-Z. tritici אולי אין אורתולוגים של גנים אלה. כדי לקבוע את כמות השונות הגנטית המשפיעה על אזורי קידוד חזויים, לאחר מכן הרצנו ניתוח SNPEf עבור כל זן כנגד פנגנום שנבנה על הגנום המלא של בידוד הייחוס IPO323 (טבלה 2). ניתוח זה הראה שלכל זן חדש יש יותר מ-160,000 SNPs כנגד הפנגנום הנגזר. בין אלה היו יותר מ-65,000 אשר גרמו לאובדן פוטנציאלי של תפקוד חלבון (אפקט גבוה, הסטת מסגרת, התחלה אבודה, קודונים להפסקה מוקדמת) או שגרמו לשינוי חומצות אמינו בחלבונים החזויים (בינוני). נתונים אלה הדגימו את המגוון הגנטי הקיים בין מבודדי Z. tritici.

בוצע ניתוח עצים מפוצלים על 17 הזנים החדשים ברצף ו-IPO323 כדי לקבוע אם לבדידים עם דפוסי זיהום זן דומים יש קשר פילוגנטי והאם זה קשור לארץ המוצא. פילוגניה נקבעה באמצעות שרשור של שישה רצפים מקודדים ולא מקודדים (ראה שיטות וקובץ נוסף 3: נתונים S1). העץ (איור 1C) ממחיש שוב כי לא היה קשר ברור בין פרופילי ארסיות ומיקום הדגימה עבור הבידודים המקושרים, עם פרופילי ארסיות קרובים (לעומת איור 1B) שנראו עבור מבודדים שנאספו ממדינות אירופה שונות, אשר בכל זאת נראו. קשר הדוק מבחינה פילוגנטית.

בנייה וניתוח של פנגנום מנבאים 9807 גנים "ליבה" ו-8083 גנים "עזר"

בנוסף לרצפי הגנום, בחרנו 12 מבודדים לפרופיל שעתוק מבוסס RNAseq (מסומן ב-+ באיור 1B). כל מבודד קיבל פרופיל בשלושה עותקים במהלך צמיחה אקסנית במרק YPD וגם בשני שלבים בלתי תלויים של זיהום עלים; 6 ימים לאחר החיסון (dpi) המייצגים את השלב האמצעי ללא סימפטומים ו-9 dpi, בשלב המעבר של התפתחות סימפטומים מוקדמת. זן החיטה הרגיש אוניברסלי פנורמה שימש עבור מבחני זיהום, שכל המבודדים הצליחו להדביק באופן מלא בקינטיקה בלתי ניתנת להבחין. באמצעות נתוני תעתיק זה בשילוב עם מכלולי הגנום החדשים, ורצף ההתייחסות המקורי של IPO323 כפיגום, קבענו פנגנום עבור הבידודים האירופיים המשלבים גם רצפים הנמצאים בבידודים אחרים שלא זוהו ב-IPO323. השלבים בבניית הפנגנום והקריטריונים שלנו לסיווג הגנים כ"ליבה" או "עזר" מוצגים באיור 2. חשוב לציין, שיקולי ביטול (אפקט גבוה, אובדן תפקוד-LoF) רצף פולימורפיזם, ונוכחות והעדר, שיקולים היו גם מגובים בעדויות לביטוי גנים. לפיכך גן צריך להיות קיים בצורה פונקציונלית ולהתבטא על ידי כל הבידודים, כדי להיות מוקצה לקטגוריית "הליבה". הגישה הכוללת שלנו (איור 2) הגדירה פגנום כולל של 17,890 גנים כולל 2017 שלא היו נוכחים ב-IPO323. שלבי הסינון שלאחר מכן סיווגו את 9807 למגורים בגנום הליבה, עם מספר קטן יותר בלבד, 8083, בערכת האביזרים. האחרון מייצג ~45% מסך הפנגנום, עלייה קלה ביחס לתואר קודם [28]. למרות שמספרים אלה בדרך כלל מתאימים היטב, הערכות של גנים נלווים סובייקטיביות יותר להטיה עקב השיטות בהן נעשה שימוש (Panseq וכו'), ואין אנו יכולים להניח שניתוח עתידי נוסף עשוי לא להפחית את מספר הגן העזר באמצעות, למשל, מבוסס אורתולוגיה. גישות. כל הפנגנים נותחו עבור תכונות מרובות (ניבויים של הפרשה, שיוך ממברנה, לוקליזציה ותכולת ציסטאין) ותפקודים חזויים (הערות BLAST, GO ו-Interpro). טבלה המספקת את כל המידע הזמין על כל הגנים מסופקת (קובץ נוסף 4: טבלה S2). הטבלה מציגה גם את רמות ביטוי הגנים הממוצעות היחסיות שמקורן ב-RNAseq שנקבעו עבור כל הגנים עבור כל 12 המבודדים בשלושת התנאים שנבדקו. באופן קולקטיבי, בהשוואה גם למחקרים הפאן-גנומיים הקודמים על אורגניזם זה [27, 28], ברור כי ל-Z. tritici יש את אחד המרכיבים הגנטיים הנלווים של פטריות שנחקרו עד כה, מה שכנראה משקף את התפתחותו המהירה. טֶבַע.

טבלה 1 ניתוח BUSCO על גנומים חדשים

טבלה 2 סיכום השפעות השפעת SNP עבור כל גנום חדש לעומת מודלים של גנים התייחסות ל-IPO323

איור 2 סיכום השלבים המשמשים ליצירת שיחות ומספרים של הגנים "הליבה" וה"עזר" עבור ה-Z. tritici pangenome האירופי החדש שנבנה. המספרים מייצגים את מספר הגנים שזוהו בכל שלב בצנרת

מאפיינים מבניים של וריאציה ב-Z. tritici pangenome האירופי

מטרת מחקר זה הייתה לבחון את ההשערה שניתן לנצל פנגנומיקה כדי לזהות גנים חדשים וחשובים, חיוניים לחיים או לארסיות באורגניזמים פתוגניים. שיערנו שאלו יהיו גנים הנמצאים ומתפקדים בכל זן של הפתוגן, ומתבטאים על ידי. השערנו עוד שלגנים אלו יהיו רמות נמוכות יותר של מוטציות SNP בעלות השפעה גבוהה ומתונה המשפיעות על רצפי קידוד (פחות פולימורפיים) ושהם עשויים להתקבץ באזורים בכרומוזומים מסוימים.

השתמשנו בנתוני וריאציה של SNP (גבוהה, בינונית ומשנה-ראה קובץ נוסף 4: טבלה S2), כמו גם נתוני ביטוי ממוצעים עבור כל הגנים, כדי לחקור רמות ממוצעות של פולימורפיזם וביטוי מקודדים על בסיס כרומוזומלי, תוך שימוש ב-21 הכרומוזומים של IPO323 כפיגום. SNPs משנה מייצגים שינויים נוקלאוטידים שאינם גורמים לשינוי חומצת אמינו. איור 3A מדגים שלא הייתה הטיה מסוימת לתדירות המוטציות כאשר SNP מצטברים גבוהים, מתונים ומשנים הובאו כתכונה של אורך חלבון ממוצע לכל כרומוזום שלם. עם זאת, כאשר מוטציות משנה, כלומר אלו שאינן גורמות לשינוי חומצת אמינו, הושמטו, היה ברור של-8 הכרומוזומים הקטנים ביותר יש גנים עם מספר גבוה יותר של מוטציות SNP גבוהות ומתונות (איור 3B). השפעה זו הודגשה עוד יותר כאשר נותחו רק SNP בעלי השפעה גבוהה (איור 3C). בניגוד לרמות הנראות בכרומוזומי הליבה 1-13 (~20%), עד 90% מהגנים השוכנים בשמונת הכרומוזומים הקטנים ביותר 14-21 היו נתונים להשפעה גבוהה, סבירות לאובדן תפקוד מוטציות לפחות באחד לבודד (איור 3C). נתוני התעתוק המצטברים מכל 12 הבידודים החדשים הדגימו גם ביטוי ממוצע נמוך יחסית של גנים הקיימים בכרומוזומים 14-21 (איור 3D), כפי שנצפה בעבר עבור IPO323 [32, 43, 44]. ביחד, נתונים אלה מצביעים על מידור גנומי ברור, כאשר שמונת הכרומוזומים הנלווים הקטנים ביותר מכילים רצפים שהם פולימורפיים מאוד, נלווים ובאופן כללי מתבטאים בצורה גרועה.

השוואת כל הגנים בגנום הליבה או הנלווה גילתה ש-60% מכל הגנים בגנום האחרון נמצאו לפחות בזן אחד עם מוטציה גבוהה (אובדן תפקוד (LoF)) וכי 47% נעדרו גם בשעה לפחות זן אחד (קובץ נוסף 4: טבלה S2). בדומה לניתוח על הכרומוזומים הנלווים, גם גנים נלווים בודדים באו לידי ביטוי בצורה גרועה מאוד בכל המבודדים שנבדקו (קובץ נוסף 4: טבלה S2) והיה להם מספר גבוה בהרבה של רצפים עם פונקציות לא ידועות (כ-80%). תצפיות אלו משתווים היטב למחקרים פאן גנומיים קודמים שבוצעו על אוספים גלובליים של Z. tritici שנאספו בהפרש של עשרות שנים [27, 28].

ביצענו גם ניתוח של נוכחות והעדר גנים (PAV) עבור כל הגנים החזויים במבודד הייחוס IPO323, עבור 17 הבידודים האחרים ברצף. נתוני נוכחות/היעדרות אלו נרשמו במיקום עבור כל גן על פני כל אחד מ-21 הכרומוזומים הקיימים ב-IPO323. איור 3E ו-F מציגים נתונים מכרומוזומי ליבה מייצגים (1 ו-7), בעוד שאיור 3G ו-H מציגים נתונים עבור כרומוזומי עזר מייצגים (13 ו-14). נתונים עבור הכרומוזומים הנותרים מוצגים בקובץ נוסף 2: איור S2. ניתוח זה זיהה גנים רבים הקיימים ב-IPO323 שחסרים במספר מבודדים ברצף מחדש ומראה בבירור את ההבדל בנוכחות/היעדרות הגנים הכוללת בין הכרומוזומים "הליבה" של IPO323 (שנמצאים בכל זן Z. tritici) לעומת 8 הכרומוזומים ה"אביזרים" הקטנים ביותר. הנתונים גם מדגישים אזור בכרומוזום 7 בפרט, בין 1.7 מגה-ביט ל-2.5 מגה-ביט, המציג תדירות גבוהה של היעדר גנים במבודדים החדשים (איור 3F). מעניין לציין שאזור זה תואם בדיוק למיקום הגנום שנראה בעבר כבעל ביטוי גנים מינימלי או ללא ביטוי גנים ב-IPO323, במהלך הגידול בתרבית או במהלך כל שלב של זיהום בצמח [32, 43]. אזור זה תואם גם למחיקה כרומוזומלית, שנצפתה בבידוד תימני במחקר פנגנום קודם [28]. יחד, נתונים אלה מחזקים את הרעיון ש-Z. tritici מייצג אורגניזם המתפתח במהירות עם רמות גבוהות, וסוגים שונים, של מגוון גנטי וגנומי באוכלוסייתו.

תחזיות לוקליזציה של חלבון חושפות גנים בפנגנום העזר שעשויים לתפקד בהסתגלות לסביבות משתנות

תחזיות לוקליזציה של חלבון WolfPsort הופעלו על כל החלבונים המקודדים על ידי הפנגנום. לאחר מכן חישבנו את האחוז היחסי של חלבונים שצפוי להתמקם לכל אזור תת-תאי כתכונה של המספר הכולל של חלבונים עבור הליבה או הפנגנום הנלווה (איור 4). מספר קטגוריות לוקליזציה הועשרו בגנום הליבה כולל "ציטופלזמה", "חוץ תאית" ו"ממברנה פלזמה", שהאחרונה מכילה פונקציות תחבורה מרכזיות רבות (איור 4). להיפך, המיקומים "גרעין" ו"מיטוכונדריה" היו קשורים לאחוז גבוה יותר של גנים בגנום העזר (איור 4). הגנום הנלווה הועשר עבור תחומים ספציפיים קושרי אבץ אשר עשויים לספק גמישות תעתיק. ההעשרה של קטגוריה זו דווחה גם במחקר פנגנום קודם שהדגיש שהצינור הכולל שלנו הניב תוצאות דומות [27, 28]. ההעשרה ה"מיטוכונדריאלית" מעניינת מכיוון שקיימים פסאודוגנים ופרלוגים של חלבונים מיטוכונדריאליים בתום לב אשר ממוקדים בכימיה אנטי-פטרייתית. דוגמה מובהקת אחת בפנגנום העזר היא פרלוג של תת-יחידת succinate dehydrogenase C (SDHC3) אשר הוכחה כמתווך עמידות בעמידה כלפי תת-סיווג של קוטלי פטריות SDHI (סuccinate dehydrogenase inhibitor) ב-Z. tritici [45]. זיהינו רצפים שלמים של גן זה רק בשלושה מתוך שבעה עשר הבידודים ברצף, וזיהינו רמה גבוהה של ביטוי גנים רק באחד מתוך 12 שנחקרו לאחר מכן על ידי RNAseq (איור 5B). אף על פי כן, המחקר הקודם, והניתוח הנוכחי שלנו, מדגישים שאכן ישנן פונקציות חשובות בגנום העזר אבל שאלו כנראה חשובות יותר להסתגלות לסביבות משתנות מאשר לאורח החיים המרכזי.

איור 3 מאפיינים מבניים של Pangenome ופולימורפיזם של נוכחות/העדר על פני 21 הכרומוזומים של מבודד ייחוס IPO323. מספר כולל של מוטציות SNP מצטברות המעניקות שינויים בהשפעה מתונה, בינונית (M) וגבוהה (H-אובדן תפקוד-LoF) המתבטאים כמאפיין של אורך החלבון הממוצע (aa) לכל כרומוזום. B מספר כולל של מוטציות SNP מצטברות המעניקות שינויים בעלי השפעה בינונית וגבוהה המתבטאים כמאפיין של אורך החלבון הממוצע לכרומוזום. C מספר כולל של מוטציות SNP מצטברות המעניקות שינויים בעלי השפעה גבוהה המתבטאים כתכונה של אורך החלבון הממוצע לכרומוזום. D ממוצע ביטוי ממוצע של כל הגנים הקיימים בכל אחד מ-21 הכרומוזומים בכל הבידודים. E פולימורפיזם של נוכחות והעדר (PaV) של הגנים החזויים על כרומוזום 1 של הבידוד IPO323 ב-17 הבידודים החדשים. F PaV לגנים בכרומוזום הליבה 7. G PaV לגנים בכרומוזום עזר 15. G-F PaV לגנים בכרומוזום נלווה 15. הנתונים מדגישים שונות אזורית נרחבת ומציינים הבחנה ברורה בין רמות הפולימורפיזם הכולל של הרצף ונוכחות/ היעדר ניכר על הליבה והכרומוזומים הנלווים

איור 4 לוקליזציה חזויה של חלבונים המקודדים על ידי גנים הליבה והעזר. סיכום של אחוז לוקליזציות חלבון חזויות שנקבעו על ידי WolfPsort עבור קטגוריות המצוינות ביחס לסך החלבונים הקיימים בליבה ובפנגנום העזר

חלבוני אפקטור בגנום הנלווה מציגים יותר שונות בין זנים בביטוי מאשר אלו בליבה

למעלה משמונה אחוזים מהגנים בגנום הליבה מקודדים לחלבונים מופרשים משוערים, מספר גבוה מזה של הגנום העזר (~5%). עם זאת, גנים בגנום העזר המקודדים לחלבון המופרש היו בתדירות גבוהה יותר בתפקוד לא ידוע, חסרי תחומים או אזורים קטליטיים שניתן לזהותם. חלבונים אלה בעלי תפקוד לא ידוע הסתכמו בכ-75% מסך הפרשת העזר ביחס ל-42% עבור הפרשת הליבה. רבים מהאפקטורים המועמדים (ובמקרים מסוימים מאומתים) הקיימים בגנום הליבה באו לידי ביטוי בדפוסים דומים, וברמות דומות, בכל שנים עשר הבידודים שנותחו על ידי RNASeq. לדוגמה, שלושת האפקטורים המכילים תחום LysM (Lysin), 3LysM, 1LysM ו-xLysM, באו לידי ביטוי ברמות דומות מאוד, ובדפוסים זהים, על ידי כל זן (איור 5C-E). ה-Te 3LysM אפקטור נשאר הקובע הארסיות העיקרי המופרש היחיד של Z. tritici, כאשר חלבון זה משמש לדיכוי חסינות הצמח המופעלת על ידי צ'יטין במהלך זיהום מוקדם [46, 47]. עם זאת, ידוע שכל שלושת אפקטורי LysM פועלים יחד לשם כך [48]. לכן ראוי לציין שהייתה שונות ביטוי מועטה מאוד עבור גנים אלה בין בידודים, מה שמגביר מחדש את ההצעות שדיכוי ההגנה הזה הוא מרכיב מרכזי בזיהום. לעומת זאת, אפקטורים מועמדים שנמצאו בגנום הנלווה הציגו גם שונות בנוכחות וגם בהיעדר וביטוי משתנה מאוד בין מבודדים (איור 5F-H). לדוגמה, AvrStb6, גורם האווירולנציה הראשון שזוהה ב-Z. tritici, [49, 50] מציג שונות ביטוי ניכרת (איור 5F), למרות היותו קיים בכל הבידודים. משתנה רצף זה, חלבון קטן ומופרש, מזוהה על ידי זני חיטה המכילים אללים פונקציונליים של קינאז דמוי קולטן Stb6 [25, 51]. הכרה זו מספקת עמידות למחלה כנגד כל הבידודים המאוחסנים אלל מסוים של אפקטור זה. הייתה וריאציה משמעותית של ביטוי של AvrStb6 בין מבודדים וזיהינו מבודד אחד (Zt118) שבו לא הצלחנו לזהות ביטוי כלשהו, ​​בכל אחד משלושת התנאים שנבדקו. מסיבה זו, בצינור החיזוי שלנו, AvrStb6 סווג לגנום העזר. אפקטורים מועמדים רבים אחרים של פונקציות לא ידועות כרגע הציגו נוכחות/היעדר ו/או ביטוי משמעותי בגנום הנלווה (איור 5G ו-H).

איור 5 וריאציה של ביטוי של גנים בליבה ובפנגנום העזר והקמת מערכת ביטוי יתר ויראלית חולפת שנפרסה עבור מסכי אפקטור נקרוטרופיים. מפתח לפירוש נתונים מוצג באיורים. B נוכחות/היעדר ווריאציה של ביטוי גנים עבור הפרלוג של תת-יחידת Succinate dehydrogenase C הקיים בגנום העזר. פרופילי ביטוי C-E של האפקטורים ZtLysM, 3LysM, 1LysM ו-xLysM, כולם נמצאים בפנגנום הליבה. F פרופיל ביטוי של אפקטור האווירולנציה AvrStb6. היעדר ביטוי כלשהו בבידוד 118 מסווג את האפקטור לפנגנום העזר. G ו-H מייצגים דוגמאות של אפקטורים מועמדים נוספים בפנגנום העזר.

מסכים פונקציונליים אינם מספקים עדות לפעילות אפקטור נקרוטרופית לא בליבה או בפנגנום העזר

אימצנו מערכת ביטוי חולפת של חלבון בתיווך וקטור ויראלי עבור חיטה (וגידולי דגנים ולא דגנים אחרים) שפותחה לאחרונה, תוך שימוש בנגיף Foxtail Mosaic (FoMV), לביצוע בדיקת תפוקה בינונית עד גבוהה של אפectors Z. tritici המועמדים. מהפנגנום. מטרתנו ספציפית הייתה לבדוק האם לאחד מהם יש את היכולת לגרום לנמק על פאנל קטן של זני חיטה, מה שעשוי לרמוז על תפקודם במעבר לתסמיני מחלה כ"משפיעים נקרוטרופיים" [36, 52]. עבור מחקר זה, ביצענו כמה שינויים במערכת שפורסמה בעבר [53]. כדי להניע הפרשת חלבון חוץ-תאי בחיטה, השתמשנו ברצף פפטיד האותות של חלבון 1 (TaPR1) הקשור לפתוגנזה של חיטה, שעבר אופטימיזציה לקודון ל-Arabidopsis thaliana, אשר לאחר מכן התמזג בתוך המסגרת עם כל רצף אפקטור פטרייתי מועמד על ידי סינתזת גנים (איור. 5I). היעילות של פפטיד האות TaPR1 להפריש חלבונים חוץ-תאיים פונקציונליים של Z. tritici התבססה על ידי יכולתו לגרום לנמק עלים בטבק כאשר הוא מונח מול חלבון Z. tritici ו-Ethylene inducing-like (ZtNLP), המתפקד רק כאשר הוא מכוון להפרשה חוץ-תאית (איור 5 Jl) [54]. לאחר מכן אישרנו שהווקטור יכול לבטא חלבונים בצורה שווה באותה מידה על פני מגוון זני חיטה על ידי הדמיית ביטוי מקומי ומערכתי של החלבון הפלורסנטי הירוק (GFP) לאורך העלים של זני חיטה שונים (קובץ נוסף 2: איור S3). לבסוף, לאחר מכן בדקנו את יכולתו של האפקטור הנקרוטרופי המאופיין היטב SnToxA, מפתוגן החיטה הקשור Parastagonospora nodorum, לגרום לנמק בעלי חיטה של ​​גנוטיפים בעלי גן הרגישות Tsn1 [55]. כצפוי, ביטוי יתר של SnToxA בתיווך FoMV, עם פפטיד האות TaPR1, גרם לנמק רק על זן החיטה בעל Tsn1 (cv Halberd באיור 5K) ללא תסמינים שנצפו בזנים חסרי גן רגישות זה (cv 5K Riband באיור. ). נתונים אלה אישרו שמערכת ביטוי היתר בתיווך וקטור ויראלי מתאימה לסריקה בקנה מידה גדול יותר של אפקטורים מסוג Z. tritici כדי לזהות כל אחד עם פעילות אפקטור נקרוטרופית. סך של 88 מועמדים נבחרו ונבדקו מול חמישה זני חיטה (קובץ נוסף 5: טבלה S3). אלה הקיפו 66 חלבונים השוכנים בפנגנום הליבה ו-22 מהאביזר. הגנים שנבחרו (קובץ נוסף 5: טבלה S3) נעו בין גנים ליבה ללא פולימורפיזמים ספציפיים לזן (מונומורפי) ובעלי ביטוי גבוה של צמח, לאלו בגנום העזר המפגינים נוכחות/היעדר ו/או פולימורפיזם ביטוי משמעותי. בכל הניסויים, בוצעו בקרות טכניות מקבילות של ToxA לעומת cv Halberd ו-cv Riband, ואלה תמיד הניבו את התוצאות הצפויות. לעומת זאת, אף אחד מ-88 החלבונים של Z. tritici שנבדקו לא הביאו לידי ביטוי יתר גרם לנמק כלשהו של עלים על כל זן חיטה. לסיכום, תוצאות אלו לא סיפקו כל ראיה לאפקטורים נקרוטרופיים, ולפיכך, אין תמיכה באף אחד מהמועמדים שנבדקו בהשראת המעבר לצמיחה נקרוטרופית במהלך זיהום.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

לגנים הליבה המקודדים לחלבונים עם תפקודים חיוניים לחיים או חזויים שהוכחו, או פונקציות ארסיות מפתח, יש רמות כלליות נמוכות יותר של פולימורפיזם של חומצות אמינו

ביצענו חיפוש ספרותי כדי לזהות את כל הגנים של Z. tritici שהיו נתונים לאפיון פונקציונלי, בין אם באריסיות או כגנים חיוניים המתוארכים לשנת 2018. זה יצר רשימה של 28 רצפי חלבונים (קובץ נוסף 6: טבלה S4). באופן דומה, זיהינו רשימה של 26 חלבונים שאופיינו גם הם מבחינה תפקודית אך הוכח כי אינם ממלאים תפקיד מרכזי בארסיות או חיוניים (קובץ נוסף 6: טבלה S4). לאחר מכן חקרנו את הרמות של מוטציות גבוהות ומתונות מיותרות מצטברות בגנים אלה ובטאנו את ערכיהם כמאפיין של כל אורך חלבון ולאחר מכן קבענו את הערכים הממוצעים עבור הסט. איור 6 מדגיש כי לגנים שפורסמו המשפיעים על ארסיות הייתה תדירות נמוכה יותר (p=0.007) של מוטציה (פולימורפיזם) מובהקת סטטיסטית מאלה שהוכחו כמיותרות מבחינה תפקודית.

מחקרים שמטרתם להגדיר גנים חיוניים לחיים (חיוניים) בפטריות חוטיות (למעט שמרים) הם מעטים, ועד היום קיים רק נציג אחד במאגר הגנים החיוניים (DEG), שהוא מפתוגן האדם האופורטוניסטי Aspergillus fumigatus [56–58]. זיהינו את האורתולוג Z. tritici של כל 28 הגנים שהוכחו בניסוי כחיוניים לחיים ב- A. fumigatus ושוב חישבנו את שיעורי המוטציה היחסיים של כל אחד מהם ביחס לאורכי הרצף (קובץ נוסף 7 טבלה S5). שוב, מצאנו הפחתה מובהקת סטטיסטית ברורה (p=0.0148) בתדירות של מוטציות SNP גבוהות ומתונות בגנים חיוניים מועמדים אלה, ולאחר מכן נצפתה לגבי גנים שהוכחו כלא חיוניים לא לאלימות ולא לחיים ( איור 6). לעומת זאת, לא היה הבדל מובהק (p=0.2128) בין שיעורי המוטציה של גנים ארסיים מאומתים בניסוי לבין הגנים החיוניים החזויים (איור 6). הנתונים הללו יחד תומכים בתפיסה לפיה ניתן להשתמש ברמות של פולימורפיזם של חומצות אמינו באוכלוסיות כדי לחזות את החשיבות היחסית של גנים לאורח החיים המרכזי של האורגניזם.

איור 6 ניתוח של קבוצות גנים ליבה של פתוגניות מאומתת בניסוי ו/או גנים חיוניים לחיים מגלה שיעורי מוטציה נמוכים יותר מאשר בגנים לא חיוניים. שיעורי המוטציות הגבוהים והבינוניים הממוצעים (H/M) מתבטאים כתכונה של אורכי חלבון (aa) עבור רשימות גנים המקודדות לחלבונים שהיו; 1- נקבע בניסוי ללא תפקידים (או מינוריים מאוד) באלימות פטרייתית; 2-נחוש בניסוי למלא תפקיד חשוב בארסיות ו; 3-צפוי לקודד גנים חיוניים לכל החיים באמצעות אורתולוגיה לחלבונים המאופיינים באופן ניסיוני ב- Aspergillus fumigatus. סמל הכוכבית (*) מציין הבדל מובהק סטטיסטית בין שיעורי המוטציות בין קבוצות הגנים המצוינות. רשימות גנים ונתוני פולימורפיזם קשורים מוצגים בקובץ נוסף 6: טבלה S4

התועלת של הגישה החזויה המשולבת לחשיפת חולשת פתוגן נתמכת באמצעות מחקרי השלמה גנטית על מוטנט מחיקת גנים של חמש "ליבות"

Z. tritici ניתנת להעברת מסכי גנטיקה המבוססים על אינטגרציה אקראית של T-DNA באמצעות טרנספורמציה פטרייתית בתיווך Agrobacterium (AMT). העבודה הקודמת שלנו יצרה מוטנט T-DNA אחד של Z. tritici במיוחד שלא היה מסוגל לגרום למחלה מלאה על עלי חיטה נגועים (איור 7A). המוטנט הזה, שנקרא 23-21 (הסיבוב ה-23 של הטרנספורמציה והמושבה ה-21 שנבחרה), יכול לגדול כרגיל כסוג בר על מדיום אגר עשיר בתזונה (YPD), אך לא הצליח להרחיב רמות דומות של היפאות פטרייתיות כאשר גדל על מדיום חסר חומרים מזינים, כולל אגר מים (איור 7A). השתמשנו בריצוף מחדש מבוסס Illumina של הגנום השלם של 23-21 כדי לחשוף את מיקומו של החדרת ה-T-DNA העלולה להיות סיבתית. ניתוח זה חשף שילוב T-DNA יחיד בין עמדות 899878 ו-912699 בכרומוזום 8, מה שגרם למחיקה/שיבוש של חמישה רצפי קידוד חזויים (איור 7B). ניתוח SNP ו-indel לא גילו מוטציות נוספות לא מתויגות בזן 23-21 ביחס לרצף הגנום הפראי של IPO323. מחיקת ה-T-DNA 23-21 הסירה למעשה חמישה גנים, שכולם נמצאים בגנום הליבה, ועם התחזיות הפונקציונליות הבאות (Interpro); גן 1=Cytochrome P450; גן 2=S-adenosyl methionine methyltransferase; גן 3=אבץ (2) חלבון קושר DNA מסוג C6; הגן 4=Nucleoside diphosphate kinase (NDK) והגן 5=Glycosyl hydrolase 31 (איור 7B). חקרנו את המספר היחסי של מוטציות גבוהות ומתונות בכל חלבון כתכונה של אורך החלבון, מה שחשף שלחלבון 4 (NDK) יש הרבה פחות מוטציות המשפיעות על שינויים ברצף חומצות אמינו מאשר שאר ארבעת הרצפים המנותחים על פני הסט המבודד (איור. 7C וקובץ נוסף 2: איור S4). לאחר מכן חקרנו את הביטוי היחסי הממוצע של כל חמשת הגנים בכל המבודדים שנבדקו. הוא גם גילה שגן 4 (המקודד ל-NDK) התבטא גבוה משמעותית מכל המועמדים האחרים (איור 7D וקובץ נוסף 2: איור S5). לפיכך שיערנו שהאובדן של הגן הכי פחות פולימורפי והכי מבוטא, גן 4, ה-NDK, היה אחראי לאובדן הארסיות, ולפגם הנלווה בהארכת הלהבות ההיפיות. כדי לבדוק זאת, הפכנו כל אחד מחמשת הגנים המועמדים בחזרה בנפרד לזן המוטנטי 23-21 Z. tritici, כל אחד מונע על ידי מקדם אנדוגני משלו. מכל אחד מהם התקבלו טרנספורמנטים מרובים ונבדקו מחדש עבור ארסיות על עלי חיטה ויכולת להאריך את ההיפיות החוטים על אגר מים. זה הוכיח שהחדרה מחדש של הגן NDK לבדו (גן 4) החזירה באופן מלא הן את הארסיות והן את הצמיחה ההיפלית לרמות מסוג פרא (איור 7E וקובץ נוסף 2: איור S6). החזרה של כל אחד מארבעת המועמדים האחרים לא גרמה לשינוי כלשהו בפנוטיפ מהזן המוטנטי המקורי 23-21 (איור 7E). כדי להבטיח שכל הגנים שהוכנסו מחדש יבואו לידי ביטוי בזן המשלים שלהם, בוצע RT-PCR על כל אחד מהטרנספורמנטים והמוטנט המקורי של 23-21. זה אישר את החוסר הצפוי של כל תמלול במוטנט 23-21 והדגים ביטוי נכון של כל גן מטרה בבידודים המשלימים (איור 7F). טוס, החדרה מחדש של הגן הבודד עם הפולימורפיזם הנמוך ביותר ברמת האוכלוסייה מבין חמשת המועמדים, והביטוי היחסי הגבוה ביותר, שיחזר את הפנוטיפים הפגומים בפתוגן החיטה הזה. תצפית ניסויית זו תומכת בתועלת של שילוב פנגנומיקה וטרנסקריפטומיקה לחיזוי גנים בעלי פוטנציאל חשיבות לתכונות חיים תפקודיות מפתח.

איור 7 מבחני השלמה פונקציונליים במוטנט Z. tritici שאינו פתוגני עם מחיקת חמישה גנים תומכים בשימוש המשולב בניתוח קצב מוטציות שמקורו בפנגנום ורמת ביטוי כמנבאים לגנים חשובים של אורח חיים. מאפייני גדילה וזיהום של מוטאנט להחדרת T-DNA אקראית של Z. tritici "23-21". הזן גדל בדרך כלל על אגר תזונתי עשיר אך פגום בגדילה חוטית על אגר מזין דל ונפגע מאוד בפעילות הגורמת למחלות עלי חיטה. פסי קנה מידה מייצגים 1 ס"מ. B ריצוף מחדש של גנום שלם של זן 23-21 חושף מחיקה בתיווך T-DNA של אזור גנומי של 13 קילו-בייטים המשבש או מוחק חמישה גנים חזויים מהפנגנום הליבה. C מציג את אירועי המוטציה הגבוהים והמתונים הממוצעים עבור כל גן (מסומן 1-5) מהפנגנום ביחס לאורך החלבון המקודד (aa)

דִיוּן

ניתן להשתמש בשילוב של פנגנומיקה וטרנסקריפטומיקה כנשק נגד פתוגנים המתפתחים במהירות

Pangenomics analyses have been performed on other fungi and yeasts including Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans var. grubii, and Aspergillus fumigatus [10]. All four species are model organisms in eukaryotic genomics and the latter three can also cause human diseases. Recent pangenome analyses on each of these species revealed that > 80% of all genes detected were core and thus found in every strain [10]. Our current study, and those previously [27, 28], clearly highlight that Z. tritici has a larger (>40% מסך הגנים) גנום עזר ממינים אלה. לא ברור מדוע וכיצד Z. tritici ופטריות פתוגניות אחרות מצמחים אחרים שומרים על רכיב עזר כה גדול. לדוגמה, לשמונת הכרומוזומים הקטנים ביותר שזוהו ב-IPO323 אין כל השפעה עיקרית ברורה על ארסיות, או כל תהליכים אחרים, כאשר רק מחקר אחד מציע כיום לכרומוזומים 14, 16, 18, 19 ו-21 תפקיד עדין בארסיות על זני חיטה מובחרים [59]. עם זאת, שילובים של כרומוזומים קטנים אלה נשמרים באוכלוסיות. הוצע כי הם מספקים אירועי רקומבינציה אשר עשויים לעמוד בבסיס היכולת של הפטרייה להתפתח במהירות כדי להסתגל ללחצים סביבתיים, פוטנציאליים בשילוב עם שיעורי פעילות גבוהים של אלמנטים הניתנים להעברה [60-62]. אפשר לטעון מקרה דומה לגבי הגנום העזר הגדול. תמיכה לכך ניתנת על ידי החשיבות התפקודית של שני רכיבי גנום נלווים הנזכרים במחקר זה, תת-יחידת SDH C paralogue ו-AvrStb6, שלשניהם תפקידי מפתח באינטראקציה עם אלמנטים משתנים של הסביבה החיצונית (יישום קוטלי פטריות וזנים עם התאמה). גנים עמידות למחלות, בהתאמה) [25, 45]. תוארו תהליכים ביולוגיים אחרים שיכולים ללכת לאיבוד גם במבודדי Z. tritici בודדים ללא ליקויי כושר ברורים לרבות שליטה במלניזציה (פיגמנטציה) [63]. המחקר שלנו הדגיש שהגנום העזר המתפתח במהירות של Z. tritici עשוי לשמש נגדו כאשר הפוקוס במקום מושם על מה שלא ניתן לאבד או שיש לו פולימורפיזם מוגבל. מחקר זה ביקש לעשות זאת, על ידי התחשבות בגנים הליבה לא רק נוכחים ומתפקדים בכל הבידודים, אלא גם מתבטאים על ידי כל הבידודים. נקטנו גם בגישה של ניסיון לדרג מערכי גנים בגנום הליבה, בהתבסס על רמות שונות של רצף חומצות אמינו. יש כמובן כמה אזהרות עם השיטות בהן השתמשנו, במיוחד בכך שלא ניתן להפריד בקלות מוטציות מיותרות (סוג ומיקום זהים) ממספר דומה של מוטציות שעלולות להתרחש במיקומים ייחודיים בכל מבודד (מוטציות לא מיותרות). לפיכך, השיטה שלנו אינה מתאימה לדירוג גנים המתפתחים במהירות. אף על פי כן, השיטה מאפשרת לזהות בקלות גנים ללא שונות ונמוכה בהתבסס על שיעורים נמוכים של פולימורפיזם המשפיעים על שינויים בחומצות אמינו. הגישה הדגימה כי גנים או גנים חיוניים לחיים שאומתו וחזויים ניסויים טומנים בחובם פחות פולימורפיזם מסוג זה בין מבודדים, מאשר אלו שתפקודיהם ניתנים לביצוע עבור תהליכים אלה. לבסוף, הרחבנו את הגישה הזו כדי לזהות פונקציית ארסיות חדשה של נוקלאוזיד דיפוספט קינאז (NDK), שהציג את הווריאציה הכי קטנה מכל הגנים במחיקת 5-גן T-DNA. בהתבסס על ממצאים אלה, אנו מציעים שניתן להשתמש ברמות של פולימורפיזם בגנים הליבה שזוהו בפאנגנומיה כדי להסיק פונקציות חשובות לחלבונים המקודדים ובכך לתעדף גנים לניתוח פונקציונלי כדי לזהות יעדים חדשים להגנת היבול ובריאות בעלי חיים.

חולשה מתהווה בביולוגיה של הזיהום של Z. tritici ופתוגנים קשורים?

מחקר זה סיפק גם תובנות ספציפיות נוספות לגבי ביולוגיית הזיהום של פתוגן חיטה חשוב זה. ראשית, לא הושגה ראיות התומכות בנוכחות של פעילויות אפקטור נקרוטרופי עיקריות עבור 88 חלבונים מופרשים שנבחרו הן מהגנום הליבה והן מהגנום הנלווה. איננו יכולים לבטל את האפשרות שלא בחרנו את החלבונים הנכונים או שמספר אפקטורים יכולים לעבוד יחד כדי לעורר מוות של תאי צמחים (מוצע גם על ידי פרופילי ביטוי דומים). אם הדבר האחרון הוא המקרה, זה יהיה שונה מהחשיבות הברורה של אפקטורים נקרוטרופיים בודדים בפטריות קשורות המדבקות חיטה, בעיקר מיני Parastagonospora nodorum ו- Pyrenophora [35]. ייתכן גם שרמות הביטוי שאנו מפיקים ממערכת ה-FoMV החולפת נמוכות מאלה הנדרשות עבור אפקטורים שהזיהוי שלהם פחות בולט מזה של SnToxA. עם זאת, הנתונים המוצגים כאן אינם מספקים תמיכה ברעיון שהמעבר לצמיחה סימפטומטית ומוות של תאי צמחים מופעלים על ידי ההכרה של אפקטורים נקרוטרופיים Z. tritici עיקריים (יחיד). לכן יתכן שייצור המוני של חלבונים אלה בתחילת הסימפטומים עשוי לשמש במקום זאת להגנה על היפאות פטרייתיות מפני היפראקטיבציה לכאורה של מוות תאים ותגובת צמחים. בהתאם לכך, משפיעים המופרשים מפטריות זו ומפטריות אחרות הוכחו כבעלי יכולת לעכב פרוטאזות שמקורן בצמחים, צ'יטינאזות ואנזימים תוקפים אחרים בדופן התא, אשר בעצמם מושרים על ידי צמחים במהלך תגובות הגנה [46, 48, 64, 65 ]. לאחרונה, הוכחו גם אפקטורים פטרייתיים לתמרן ולעצב מחדש מיקרו ומיקרוביומים [66, 67].

יתרונות cistanche לגברים - מחזקים את המערכת החיסונית

הזיהוי של תפקיד מפתח בארסיות עבור NDK הוא עם זאת משמעותי. חלבונים אלה יוחסו לתפקודים מרובים מאורגניזמים פרוקריוטיים ואוקריוטיים שונים. בפטריות, יש דיווח אחד המייחס תפקיד לאפנון של חסינות הצמח [68], בעוד שבזן אחר (A. fumigatus), הודגם פונקציה חיונית לחיים [69]. עם זאת, התפקיד העיקרי והשמור של חלבונים אלה הוא זרחון דיפוספטים נוקלאוזידים, בדרך כלל באמצעות ATP כמצע, כדי ליצור טריפוספטים נוקלאוזידים אחרים (NTPs) הנדרשים כדי לסייע בדלק תהליכים תאיים שונים [70, 71]. זה חשוב במיוחד כאשר משאבים מוגבלים מקשים על יצירת NTP מסוימים באמצעים אחרים. כמו כן, NDKs מציגים פעילות מסלול הצלה מרכזית להתחדשות של NTPs, ככל הנראה חשובה כאשר המשאבים החוץ-תאיים מוגבלים. תפקידים חשובים למספר מסלולי הצלה אחרים, ובמיוחד מסלולים ביו-סינתטיים, הופיעו לאחרונה ממחקרי תפקוד גנים אחרים על Z. tritici. לדוגמה, ביו-סינתזה של ליזין חיונית לזיהום ולגידול היפל על חומרי תזונה דלים [72], וכך גם ביו-סינתזה של פורין [73]. פונקציות אלו מיותרות לצמיחה במדיה שלמה. נתוני תעתיקים קודמים על השלב המוקדם מאוד של התיישבות פני העלים הצביעו על כך שהפטרייה נמצאת בסביבה מדולדלת של חומרים מזינים ונשענת על ניצול מאגרים תוך תאיים [33]. בשילוב עם המחקרים הפונקציונליים הקודמים, ותפקיד המפתח שהראה ל-NDK, ברור ש-Z. tritici פגיע ביותר לעיכוב של מסלולי ביוסינתטי וחילוץ מרכזיים כאשר הוא נמצא על פני העלים במהלך התיישבות מוקדמת, ופוטנציאל עד להשראת מוות של תאי צמחים כ-7-10 ימים לאחר מכן. לפיכך, מוצרים או אסטרטגיות חדשות להגנת הצומח יכולים להיות מכוונים לעיכוב של תהליכים אלה, אשר עשויים לייצג חולשה ב-Z. tritici, ואפשר למגוון רחב של פטריות קשורות אחרות עם אופני זיהום דומים.

מסקנות

מחקר זה מספק תמיכה ראשונית לשימוש המשולב ב-pangenomics וב-transcriptomics להגדרת גנים המייצגים את הליבה, והחולשות הניתנות לניצול, בפתוגנים המתפתחים במהירות. עם זאת, באופן עקרוני, הגישות יכולות לשמש לתעדוף גנים בכל מערכת ביולוגית שבה זמינים מספר גנומים ותעתיקים. אנו צופים כי גישות אלו יכולות לקדם צינורות גילוי של תהליכי ליבה ביולוגיים במערכות ביולוגיות רבות ומגוונות.

הפניות

1. פישר MC, Hawkins NJ, Sanglard D, Gurr SJ. הופעתה העולמית של עמידות לתרופות אנטי פטרייתיות מאתגרת את בריאות האדם ואת בטחון המזון. מַדָע. 2018;360. https://doi.org/10.1126/science.aap7999.

2. פישר MC, Henk DA, Briggs CJ, Brownstein JS, Madoff LC, McCraw SL, et al. איומים פטרייתיים מתעוררים לבריאות בעלי חיים, צמחים ומערכות אקולוגיות. טֶבַע. 2012;484. https://doi.org/10.1038/nature10947.

3. Lucas JA, Hawkins NJ, Fraaije BA. האבולוציה של עמידות קוטלי פטריות. Adv Appl Microbiol. 2015;90. https://doi.org/10.1016/bs.aambs.2014.09.001.

4. Heitman J. רבייה מינית ואבולוציה של פתוגנים מיקרוביאליים. קור ביול. 2006;16. https://doi.org/10.1016/j.cub.2006.07.064.

5. Dong S, Raffaele S, Kamoun S. הגנום הדו-מהירות של פתוגנים חוטים: ואלס עם צמחים. Curr Opin Genet Dev. 2015;35:57–65. https://doi.org/10.1016/J.GDE.2015.09.001.

6. Tettelin H, Masignani V, Cieslewicz MJ, Donati C, Medini D, Ward NL, et al. ניתוח גנום של מבודדים פתוגניים מרובים של Streptococcus aga-lactiae: השלכות על ה"פאן-גנום" המיקרוביאלי. Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102. https://doi.org/10.1073/pnas.0506758102.

7. Lefébure T, Stanhope MJ. אבולוציה של הליבה והפאן-גנום של סטרפ-לקוקוס: ברירה חיובית, רקומבינציה והרכב הגנום. גנום ביול. 2007;8. https://doi.org/10.1186/gb-2007-8-5-r71.

8. Tian CF, Zhou YJ, Zhang YM, Li QQ, Zhang YZ, Li DF, ועוד. גנומיקה השוואתית של פולי סויה הנודלים של rhizobia מציעה גיוס נרחב של גנים ספציפיים לשושלת בהתאמות. Proc Natl Acad Sci US A. 2012;109. https://doi.org/10.1073/pnas.1120436109.

9. Syme RA, Tan KC, Rybak K, Friesen TL, McDonald BA, Oliver RP, et al. Panparastagonospora ניתוח גנום השוואתי-אפקטור חיזוי ואבולוציה של הגנום. גנום Biol Evol. 2018;10. https://doi.org/10.1093/ gbe/evy192.

10. מקארתי CGP, פיצפטריק DA. ניתוחי פאן-גנום של מיני פטריות מודלים. מיקרוב. גנומיקה. 2019;5. https://doi.org/10.1099/mgen.0.000243.

11. Yang X, Li Y, Zang J, Li Y, Bie P, Lu Y, et al. ניתוח של פאן-גנום לזיהוי גני הליבה והגנים החיוניים של Brucella spp. Mol Gen Genomics. 2016;291. https://doi.org/10.1007/s00438-015-1154-z.

12. Barber AE, Sae-Ong T, Kang K, Seelbinder B, Li J, Walther G, et al. ניתוח פאן-גנום של Aspergillus-lus fumigatus מזהה גרסאות גנטיות הקשורות לזיהום אנושי. נאט מיקרוביול. 2021;6. https://doi.org/10.1038/ s41564-021-00993-x.

13. Zhang X, Liu B, Zou F, Shen D, Yin Z, Wang R, et al. ריצוף מחדש של הגנום כולו חושף שונות טבעית ואבולוציה אדפטיבית של Phytophthora sojae. מיקרוביול קדמי. 2019;10. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019. 02792.

14. Torriani SFF, Melichar JPE, Mills C, Pain N, Sierotzki H, Courbot M. Zymoseptoria tritici: איום מרכזי לייצור חיטה, גישות משולבות לבקרה. פטרייתי ג'נט ביול. 2015;79. https://doi.org/10. 1016/j.fgb.2015.04.010.

15. Zhan J, Mundt CC, McDonald BA. מדידת הגירה ורבייה מינית באוכלוסיות שדה של Mycosphaerella graminicola. פיטו-פתולוגיה. 1998;88. https://doi.org/10.1094/PHYTO.1998.88.12.1330.

16. Zhan J, Kema GHJ, Waalwijk C, McDonald BA. הפצה של אללים מסוג הזדווגות בפתוגן החיטה Mycosphaerella graminicola על פני קשקשים מרחביים מנגעים ליבשות. פטרייתי ג'נט ביול. 2002;36. https://doi. org/10.1016/S1087-1845(02)00013-0.

17. Stukenbrock EH, Banke S, Javan-Nikkhah M, McDonald BA. מקור וביות של פתוגן החיטה הפטרייתי Mycosphaerella gramini-cola באמצעות speciation סיממטרי. מול ביול אבול. 2007;24. https://doi.org/10. 1016/S1087-1845(02)00013-0.

18. Linde CC, Zhan J, McDonald BA. מבנה האוכלוסייה של Mycosphaere-lla graminicola: מנגעים ליבשות. פיטופתולוגיה. 2002;92. https://doi.org/10.1094/PHYTO.2002.92.9.946.

19. Croll D, McDonald BA. הבסיס הגנטי של הסתגלות מקומית לפטריות פתוגניות במערכות אקולוגיות חקלאיות. מול אקול. 2017;26. https://doi.org/ 10.1111/mec.13870.

20. Croll D, Lendenmann MH, Stewart E, McDonald BA. ההשפעה של נקודות חמות של רקומבינציה על התפתחות הגנום של פתוגן צמחי פטרייתי. גנטיקה. 2015;201. https://doi.org/10.1534/genetics.115.180968.

21. Dutta A, Croll D, McDonald BA, Barrett LG. שמירה על שונות בארסיות ורבייה באוכלוסיות של פתוגן צמחי חקלאי. Evol Appl. 2021;14. https://doi.org/10.1111/eva.13117.

22. Feurtey A, Stevens DM, Stephan W, Stukenbrock EH, Stajich J. החלפת גנים בין-ספציפית מציגה שונות גנטית גבוהה בפתוגן היבול. גנום Biol Evol. 2019;11. https://doi.org/10.1093/gbe/evz224.

23. Hartmann FE, Sánchez-Vallet A, McDonald BA, Croll D. פתוגן חיטה פטרייתי פיתח התמחות מארח על ידי סידורים כרומוזומליים נרחבים. ISME J. 2017;11. https://doi.org/10.1038/ismej.2016.196.

24. Fouché S, Plissonneau C, McDonald BA, Croll D. Meiosis מובילה לשונות מתפשטת של מספר העתקים ולהורשה מעוותת של כרומו עזר-חלק מפתוגן החיטה Zymoseptoria tritici. גנום Biol Evol. 2018;10. https://doi.org/10.1093/gbe/evy100.

25. Stephens C, Ölmez F, Blyth H, McDonald M, Bansal A, Burcu Turgay E, et al. שינויים מדהימים לאחרונה במגוון הגנטי של הגן Avirulence AvrStb6 באוכלוסיות גלובליות של פתוגן החיטה Zymoseptoria tritici. מול צמח פאתול. 2021. https://doi.org/10.1111/mpp.13101.

26. Goodwin SB, M'Barek S, Dhillon B, Wittenberg AHJ, Crane CF, Hane JK, et al. הגנום המוגמר של פתוגן החיטה הפטרייתי Mycosphaerella graminicola חושף את מבנה הנפקה, הפלסטיות של הכרומוזומים ופתוגנזה של התגנבות. PLoS Genet. 2011;7. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002070.

27. Badet T, Oggenfuss U, Abraham L, McDonald BA, Croll D. A 19-מבודד פנגנום גלובלי באיכות התייחסות לפתוגן החיטה הפטרייתי Zymoseptoria tritici. BMC ביול. 2020;18. https://doi.org/10.1186/ s12915-020-0744-3.

28. Plissonneau C, Hartmann FE, Croll D. Pangenome ניתוחים של פתוגן החיטה Zymoseptoria tritici חושפים את הבסיס המבני של גנום אוקריוטי פלסטי מאוד. BMC ביול. 2018;16. https://doi.org/10.1186/ s12915-017-0457-4.

29. Wittenberg AHJ, van der Lee TAJ, M'Barek SB, Ware SB, Goodwin SB, Kilian A, et al. מיוזיס מניעה פלסטיות גנום יוצאת דופן בפתוגן הצמח הפטרייתי ההפלואידי Mycosphaerella graminicola. PLoS ONE. 2009;4. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005863.

30. Steinberg G. Cell biology of Zymoseptoria tritici: ארגון תאי פתוגן וזיהום חיטה. פטרייתי ג'נט ביול. 2015;79. https://doi.org/10. 1016/j.fgb.2015.04.002.

31. Kema GHJ, Yu DZ, Rijkenberg FHJ, Shaw MW, Baayen RP. היסטולוגיה של הפתוגנזה של Mycosphaerella graminicola בחיטה. פיטופתולוגיה. 1996;86. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-777.

32. Rudd JJ, Kanyuka K, Hassani-Pak K, Derbyshire M, Andongabo A, Devon-Shire J, et al. פרופיל תעתיק ומטבוליטים של מחזור ההדבקה של Zymoseptoria tritici על חיטה חושף אינטראקציה דו-פאזית עם חסינות צמחית הכרוכה בתרומות כרומוזומליות של פתוגן דיפרנציאלי ושינוי בהגדרת אורח החיים ההמיביוטרופי. צמח פיזיול. 2015;167. https://doi.org/10.1104/pp.114.255927.

33. Keon J, Antoniw J, Carzaniga R, Deller S, Ward JL, Baker JM, et al. התאמה תעתיק של Mycosphaerella graminicola למוות תאי מתוכנת (PCD) של מארח החיטה הרגיש שלו. Mol Plant-Microbe Interact. 2007;20. https://doi.org/10.1094/MPMI-20-2-0178.

34. Rudd JJ, Keon J, Hammond-Kosack KE. קינאזות החלבון המופעלות על ידי מיטוגן חיטה TaMPK3 ו-TaMPK6 מווסתות באופן דיפרנציאלי ברמות מרובות במהלך אינטראקציות מחלות תואמות עם Mycosphaerella graminicola. צמח פיזיול. 2008;147. https://doi.org/10.1104/pp.108. 119511.

35. פריזן TL, Faris JD. אפיון של אינטראקציות אפקטור-מטרה במערכות פתולוגיות נקרוטרופיות חושף מגמות ווריאציות במניפולציה של המארח. עננו ר' פיטופתול. 2021;59. https://doi.org/10.1146/annur ev-phyto-120320-012807.

36. פריזן TL, פאריס JD, סולומון PS, אוליבר RP. רעלנים ספציפיים למארח: משפיעים על פתוגניות נקרוטרופית. Cell Microbiol. 2008;10. https://doi.org/10. 1111/j.1462-5822.2008.01153.x.

37. Ben M'Barek S, Cordewener JHG, Tabib Ghafary SM, van der Lee TAJ, Liu Z, Mirzadi Gohari A, et al. FPLC וספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלים מזהים חלבונים מועמדים לגרימת נמק מתסנני תרבית של פתוגן החיטה הפטרייתי Zymoseptoria tritici. פטרייתי ג'נט ביול. 2015;79. https://doi.org/10.1016/j.fgb.2015.03.015.

38. Wyka S, Mondo S, Liu M, Nalam V, Broders K. גנום עזר גדול ושיעורי רקומבינציה גבוהים עשויים להשפיע על התפוצה העולמית ומגוון המארח הרחב של פתוגן הצמח הפטרייתי Claviceps purpurea. PLoS ONE. 2022;17. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496.

39. Moolhuijzen PM, ראה PT, Shi G, Powell HR, Cockram J, Jørgensen LN, et al. פגנום גלובלי לפתוגן פטרייתי החיטה Pyrenophora triticirepentis וחיזוי של הומולוגיה מבנית של חלבון אפקטור. מיקרוב. גנומיקה. 2022;8. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496.

40. Kema GHJ, Sayoud R, Annone JG, Van Silfhout CH. וריאציה גנטית עבור ארסיות ועמידות במערכת נתיב חיטה-Mycosphaerella graminicola II. ניתוח של אינטראקציות בין בידודים של פתוגנים וזני מארח. פיטופתולוגיה. 1996;86. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-213.

41. Kema GHJ, Annone JG, Sayoud R, Van Silfhout CH, Van Ginkel M, De Bree J. וריאציה גנטית לארסיות ועמידות בחיטה Mycosphaerella graminicola pathosystem I. אינטראקציות בין מבודדים פתוגנים וזני מארח. פיטופתולוגיה. 1996;86. https://doi.org/ 10.1094/Phyto-86-200.

42. Zhan J, Pettway RE, McDonald BA. המבנה הגנטי העולמי של פתוגן החיטה Mycosphaerella graminicola מאופיין בגיוון גרעיני גבוה, מגוון מיטוכונדריאלי נמוך, רקומבינציה סדירה וזרימת גנים. פטרייתי ג'נט ביול. 2003;38. https://doi.org/10.1016/S1087- 1845(02)00538-8.

43. Palma-Guerrero J, Torriani SFF, Zala M, Carter D, Courbot M, Rudd JJ, et al. ניתוחי תעתיק השוואתיים של זני Zymoseptoria tritici מראים מעברי אורח חיים מורכבים ושונות תוך-ספציפית בפרופילי התמלול. מול. צמח פאתול. 2016;17. https://doi.org/10.1111/mpp.12333.

44. Kellner R, Bhattacharyya A, Poppe S, Hsu TY, Brem RB, Stukenbrock EH. פרופיל ביטוי של פתוגן החיטה Zymoseptoria tritici חושף דפוסים גנומיים של שעתוק ותוכניות רגולציה ספציפיות למארח. גנום Biol Evol. 2014;6. https://doi.org/10.1093/gbe/evu101.

45. Steinhauer D, Salat M, Frey R, Mosbach A, Luksch T, Balmer D, et al. הפרלוג הנותר של תת-יחידה C של succinate dehydrogenase מתווך עמידות בפני תת-סיווג של קוטלי פטריות SDHI ב-Zymosep-toria tritici. PLoS Pathog. 2019;15. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 1007780.

46. ​​Marshall R, Kombrink A, Motteram J, Loza-Reyes E, Lucas J, Hammond Kosack KE, et al. ניתוח של שני הומולוגים LysM efector המובעים מצמחים מהפטרייה Mycosphaerella graminicola מגלה תכונות פונקציונליות חדשות ותרומות שונות לארסיות בחיטה. צמח פיזיול. 2011;156. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.

47. Lee WS, Rudd JJ, Hammond-Kosack KE, Kanyuka K. Mycosphaerella graminicola רשימת אפקטור-תיווך פתוגנזה של התגנבות מערערת את ההכרה הן באמצעות הומולוגים cerk1 והן של cebip בחיטה. Mol Plant-Microbe Interact. 2014;27. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.

48. Tian H, MacKenzie CI, Rodriguez-Moreno L, Van den Berg GCM, Chen H, Rudd JJ, et al. שלושה אפקטורים LysM של Zymoseptoria tritici מנטרלים ביחד את חסינות הצמח המופעלת על ידי כיטין. מול צמח פאתול. 2021;22. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.

49. Zhong Z, Marcel TC, Hartmann FE, Ma X, Plissonneau C, Zala M, et al. חלבון קטן המופרש ב-Zymoseptoria tritici אחראי על תעוזה על זני חיטה הנושאים את הגן העמידות ל-Stb6. פיטול חדש. 2017;214. https://doi.org/10.1111/nph.14434.

50. Kema GHJ, Mirzadi Gohari A, Aouini L, Gibriel HAY, Ware SB, Van Den Bosch F, et al. מתח ורבייה מינית משפיעים על הדינמיקה של אפקטור פתוגן החום AvrStb6 ועמידות לסטרובילורין. נאט ג'נט. 2018;50. https://doi.org/10.1111/nph.14434.

51. Saintenac C, Lee WS, Cambon F, Rudd JJ, King RC, Marande W, et al. חלבון דמוי קולטן חיטה Stb6 שולט בעמידות גן-עבור-גן לפתוגן פטרייתי Zymoseptoria tritici. נאט ג'נט. 2018;50. https://doi.org/ 10.1038/s41588-018-0051-x.

52. Tan KC, אוליבר RP, Solomon PS, Mofat CS. אפקטורים נקרוטרופיים חלבוניים בארסיות פטרייתית. Funct Plant Biol. 2010;37. https://doi.org/10. 1071/FP10067.

53. Bouton C, King RC, Chen H, Azhakanandam K, Bieri S, Hammond-Kosack KE, et al. וירוס פסיפס זנב שועל: וקטור ויראלי לביטוי חלבון בדגנים. צמח פיזיול. 2018;177. https://doi.org/10.1104/pp.17.01679.

54. Motteram J, Küfner I, Deller S, Brunner F, Hammond-Kosack KE, Nürn-berger T, et al. אפיון מולקולרי וניתוח פונקציונלי של MgNLP, החלבון היחיד המכיל תחום NPP1, מפתוגן עלי החיטה הפטרייתי mycosphaerella graminicola. Mol Plant-Microbe Interact. 2009;22. https://doi.org/10.1094/MPMI-22-7-0790.

55. Faris JD, Zhang Z, Lu H, Lu S, Reddy L, Cloutier S, et al. גן ייחודי דמוי התנגדות למחלת חיטה שולט ברגישות המופעלת על ידי אפקטורים לפתוגנים נקרוטרופיים. Proc Natl Acad Sci US A. 2010;107. https://doi. org/10.1094/MPMI-22-7-0790.

56. Lu Y, Deng J, Rhodes JC, Lu H, Lu LJ. חיזוי גנים חיוניים לזיהוי מטרות תרופות פוטנציאליות באספרגילוס fumigatus. Comput Biol Chem. 2014;50. https://doi.org/10.1016/j.compbiolchem.2014.01.011.

57. Osmani AH, Oakley BR, Osmani SA. זיהוי וניתוח של גנים חיוניים של Aspergillus nidulans באמצעות טכניקת ההצלה heterokaryon. נאט פרוטוק. 2006;1. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.406.

58. Hu W, Sillaots S, Lemieux S, Davison J, Kaufman S, Breton A, et al. זיהוי גנים חיוני ותעדוף יעדי תרופות באספרגילוס fumigatus. PLoS Pathog. 2007;3. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 0030024.

59. Habig M, Quade J, Stukenbrock EH. הגישה הגנטית קדימה חושפת את החשיבות התלויה בגנוטיפ המארח של כרומוזומים נלווים בפתוגן החיטה הפטרייתי Zymoseptoria tritici. MBio. 2017;8. https://doi. org/10.1128/mBio.01919-17.

60. Fouché S, Badet T, Oggenfuss U, Plissonneau C, Francisco CS, Croll D. דינמיקה של אלמנט טרנספוזיציה מונעת טרנספוזיציה והתפתחות ארסיות בפתוגן פטרייתי. מול ביול אבול. 2020;37. https://doi. org/10.1093/molbev/msz216.

61. Möller M, Habig M, Freitag M, Stukenbrock EH. חוסר יציבות גנום יוצאת דופן וסידורי כרומוזומים נרחבים במהלך צמיחה וגטטיבית. גנטיקה. 2018;210. https://doi.org/10.1534/genetics.118.301050.

62. Bertazzoni S, Williams AH, Jones DA, Syme RA, Tan KC, Hane JK. אביזרים מרכיבים את התלבושת: כרומוזומי עזר ואזורי דנ"א אחרים בפטריות פתוגניות לצמחים. Mol Plant-Microbe Interact. 2018;31. https://doi.org/10.1094/mpmi-06-17-0135-f.

63. Krishnan P, Meile L, Plissonneau C, Ma X, Hartmann FE, Croll D, et al. החדרות של אלמנטים הניתנים להעברה מעצבים ויסות גנים וייצור מלנין בפתוגן פטרייתי של חיטה. BMC ביול. 2018;16. https://doi. org/10.1094/mpmi-06-17-0135-f.

64. Sánchez-Vallet A, Tian H, Rodriguez-Moreno L, Valkenburg DJ, Saleem Batcha R, Wawra S, et al. אפקטור LysM מופרש מגן על היפאות פטרייתיות באמצעות פילמור הומודימר תלוי-כיטין. PLoS Pathog. 2020;16. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008652.

65. Breen S, Williams SJ, Winterberg B, Kobe B, Solomon PS. חלבוני PR-1 של חיטה ממוקדים על ידי חלבוני אפקטור פתוגנים נקרוטרופיים. צמח י' 2016;88. https://doi.org/10.1111/tpj.13228.

66. Snelders NC, Petti GC, van den Berg GCM, Seidl MF, Thomma BPHJ. חלבון אנטי-מיקרוביאלי עתיק שנכלל בשיתוף פתוגן צמחי פטרייתי למניפולציה של planta mycobiome. Proc Natl Acad Sci US A. 2021;118. https://doi.org/10.1073/pnas.2110968118.

67. Snelders NC, Rovenich H, Petti GC, Rocafort M, van den Berg GCM, Vorholt JA, et al. מניפולציה של מיקרוביום על ידי פתוגן צמחי פטרייתי הנישא באדמה באמצעות חלבוני אפקטור. צמחי נאט. 2020. https://doi.org/10. 1038/s41477-020-00799-5.

68. Rocha RO, Wilson RA. Magnaporthe oryzae nucleoside diphosphate kinase נדרש להומאוסטזיס מטבולי ודיכוי חסינות מולד בתיווך חיזור. מול מיקרוביול. 2020;114. https://doi.org/ 10.1111/mmi.14580