שיטות גנטיקה קומבינטורית לגילוי שילובים רגולטוריים מסדר גבוה ומניעים גנטיים להנדסה להבחנה עצבית

צולל לתוך החיפוש אחר גורמי התמיינות תאים יעילים

חוקרים עדיין שואפים למצוא תרופות טובות יותר כדי להחזיר או להאט את ההתקדמות של הפרעות נוירולוגיות כמו מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר ומחלת הנטינגטון. הפרעות אלו הן תוצאה של מוות של תאים עצביים בחלקים שונים של המוח. תרופות או טיפולים המשמשים להקלה על הסימפטומים בחולים לא הוכחו היטב.

לחץ ל-cistanche tubulosa אבקת להגנה עצבית

הם אינם משחזרים את הרקמות העצביות הפגומות ועלולים לגרום לתופעות לוואי לא רצויות. לכן, מספר גדל והולך של מחקרים מסתכלים על תאי גזע כטיפול מבטיח, בגלל יכולות ההתחדשות העצמית שלהם וגמישות ההתמיינות שלהם לשושלת תאים רצויה לצורך השתלה במטופל כדי לשחזר את הרקמות העצביות האבודות.

עם זאת, לפני שניתן להשתמש בתאי גזע קלינית בטיפול בהפרעות נוירולוגיות, עדיין ישנם תחומים הדורשים הבנה טובה יותר כדי לנצל את מלוא הפוטנציאל שלהם. תאי גזע מתחדשים וניתנים לגיבוש, עם הנטייה להפוך לכל סוג תא בהינתן התערובת הנכונה של גורמים להנעת התמיינות. עם זאת, יש עומק של מורכבות ברשת הגדולה של גורמים.

חשוב לקבוע את השילובים של גורמי שעתוק (TF), מולקולות קטנות ו/או גורמי גדילה כדי להשיג את הסינרגיה האופטימלית להתמיינות תאי גזע כולל תאי גזע עובריים (ESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים בקצב המהיר ביותר, וכתוצאה מכך באוכלוסייה הטהורה ביותר של שושלת נוירונים. עם זאת, יכולה להיות דרך אסטרטגית לסנן את הגורמים הללו בצורה חסכונית יותר וחסכונית יותר בזמן.

זה יעזור לייעל את הפרוטוקולים שכבר הוקמה שעדיין מייגעים או לאפיון נוסף של תת-סוגים נוירונים כגון נוירונים קוצניים בינוניים, נוירונים תחושתיים ונוירונים סרוטונרגיים. זה נותר אתגר להציג את המניעים של הגורל הנוירוני באופן מקיף ולהגדיר כיצד אלמנטים אלה מתקשרים זה עם זה ברשת הרגולטורית.

כמה קבוצות השתמשו בגישות סקר חדשות עם תפוקה גבוהה כדי להבהיר את הרשת הרגולטורית של גורל התא וסיפקו תובנות אינפורמטיביות על גורמים המניעים המרה והישרדות נוירונים. Liu et al. (2018) השתמשו בהפעלת CRISPR (CRISPRa) כדי לחפש TFs או גורמים קושרי DNA המקדמים את הגורל הנוירוני של ESCs. עם זאת, העבודה הוגבלה לחקר גורמים בודדים או שילובים זוגיים.

סינון שיטתי נוסף נערך על ידי Tsunemoto et al. (2018), שחקרה את הקשר בין TFs. רוב ה-TF הבודדים שנבחרו לא הראו השפעות במחקר, עם זאת, הם זיהו 76 שילובי TF זוגיים כדי לקדם את ההתמיינות של פיברובלסטים של עכברים לנוירונים המושרים.

יש לציין כי התוצאות שלהם לא היו עקביות מסוימת עם מחקרים קודמים, כגון אי זיהוי הטרנספורטר הפעיל של דופמין Slc6a3 בנוירונים המושרים, אולי בגלל החמצה של גורמים נוספים. מחקר אחר קבע את הגנים החיוניים לשמירה או שיפור ההישרדות של נוירונים על ידי ביצוע סקר מבוסס הפרעות CRISPR (CRISPRi) (Tian et al., 2019). ושוב, הם היו מוגבלים להקרנה של sgRNA בודדים.

נדרשים מחקרים נוספים לצורך בדיקה בלתי משוחדת של גורמים גנטיים אחרים, ולהגדלת מספר שילובי הגורמים, שכן הוכח כי עשוי להידרש קוקטייל של יותר משני גורמים בהקשרים שונים כדי להניע ביעילות בידול ותכנות מחדש.

דוגמה טובה היא השילוב של Oct4, Sox2, Klf4 ו-c-Myc, הכרחי לוויסות רשת האיתות ההתפתחותית לריבוי-פוטנציה של ESCs (Takahashi and Yamanaka, 2006). במערכות מורכבות שכאלה, יש צורך לאפיין באופן מקיף את הפונקציות של שילובים גנטיים מסדר גבוה באופן תפוקה גבוהה, ויתכן ששיטת Combinatorial Genetics En Masse (CombiGEM) יכולה לעשות זאת.

שיטת CombiGEM למסך תפוקה גבוה, מסדר גבוה ושיטתי של שילובי גורמים

CombiGEM מציעה לא רק דרך שיטתית לביצוע מסכים מאוחדים בקנה מידה גדול, אלא יש גם את היכולת של הרכבה ניתנת להרחבה של ספריות גנטיות קומבינטוריות מסדר גבוה (Wong et al., 2015, 2016; Zhou et al., 2020). תהליך סיר אחד מאפשר למשתמש לבצע בדיקה למספר רב של שילובים גנטיים; 1-דרך, 2-דרך, 3-דרך, ובתיאוריה ספריות n-way.

זה מספק אלטרנטיבה מהירה לתהליך המקובל של בנייה ובדיקה של שילובי מועמדים בודדים של עניין. בעוד שפותחו גם כמה אסטרטגיות סקר CRISPR קומבינטוריות לחקר שילובים גנטיים זוגיים (Han et al., 2017; Shen et al., 2017; Najm et al., 2018; Truong et al., 2019; DeWeirdt et al., 2020 ), CombiGEM מציעה הזדמנות ייחודית להעריך אינטראקציות בין שלושה שילובים גנטיים או יותר.

לדוגמה, אם המשתמש שואף להשתמש ב-CRISPRa או ב-CRISPRi עבור ביטוי יתר או הדחקה, בהתאמה, רשימה של שילובי TF מועמדים, אפשר לסנן ספרייה מקודדת של שילובי sgRNA המכוונים ל-TF באמצעות CombiGEM-CRISPR v2.0 ( Wong et al., 2016; Zhou et al., 2020) כפי שמוצג באיור 1.

על ידי שימוש בשלבי קשירה של סיר אחד, ספריית ה-sgRNAs והברקודים שלהם משולבים בוקטור יעד לנטי-ויראלי המדווח על ביטוי של חלבון פלואורסצנטי עם הפעלה של מקדם ספציפי לסוג תא נוירון, כגון טובולין 1. הספרייה של sgRNAs ווקטור lentiviral נפרד המאחסן את Cas9 החסר מבחינה אנזימטית, או התמזגו עם מפעיל שעתוק או מדכא, יכולים להימסר לתאי ההתחלה הרצויים.

עם הזמן, כאשר תאים מתחילים להתמיין, רק תאים דמויי נוירונים המושרים יבטאו קרינה, וניתן לבודד תאים אלה באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה לצורך אחזור שילובי ה-TF המאכסנים שלהם באמצעות רצף ברקוד.

כדי לקבל הבנה טובה יותר של השילובים המניעים שושלות תאים ספציפיות, תאים אלה יכולים להיבדק גם עבור כתבים או סמנים ידועים של שושלת תאים בהתבסס על העדפת שלבי הבידול שהמשתמש בוחר ללמוד. ניתן להשתמש במיון תאים המופעל מגנטי כדי להפריד תאים בעלי עניין בהתאם לביטויי סמן פני התא.

ניתן לצרף רצף RNA של תא בודד להקרנה הקומבינטורית של CRISPR כקריאה לפרופיל הסוג והרמות של וויסות עלייה או מטה של ​​הגנים וניתן לקבוע את השילוב של TFs ממוקדים באמצעות קריאות הברקוד (Replogle et al., 2020). ניתן להשתמש בהדמיה בעלת תוכן גבוה כדי לנטר את השינויים במורפולוגיה של התא מהשלבים המוקדמים ועד המאוחרים יותר של התפתחות הנוירונים.

ניתן לקבוע את הרלוונטיות הפיזיולוגית או הפונקציונליות של תאים דמויי עצב המושרה על ידי תיוג אימונוציטוכימי ספציפי להתבגרות נוירונים, כגון NeuN, TUJ1 ו-MAP2, ואמצעים אלקטרו-פיזיולוגיים. כפי שהוזכר קודם לכן, מחקרים שילבו TF ומולקולות קטנות כדי לתמרן את גורל התא.

ניתן להשתמש ב-CombiGEM גם כדי לזהות שילובים של מולקולות קטנות שיכולות לשמור על חידוש עצמי של תאי גזע, לגרום להתמיינות של שושלת תאים, או להקל על תכנות מחדש על ידי הגברת היעילות והחלפת גורמים גנטיים. ניתן ליישם CombiGEM גם על ידי קביעת מטרות מולקולות קטנות של מסלולי איתות, גורמי תהליכים אפיגנטיים או תאיים.

לאחר מכן, באמצעות עיצוב ספריית sgRNA כדי להפעיל או להשבית את המטרות הניתנות לסמים, ניתן לזהות את השילובים היעילים של מולקולות קטנות כדי לשפר את הבידול או התכנות מחדש. מושג זה משתקף היטב במחקרים שערכנו קודם לכן כדי לגלות שילובי מטרה של תרופות נגד סרטן ומחלת פרקינסון (Zhou et al., 2020).

השימוש ב-CombiGEM אינו מוגבל רק להפרעות המבוססות על CRISPR, אלא יכול להיות מיושם גם על גורמי רגולציה אחרים של DNA או RNA כדי לחקור את מסכי אובדן הפונקציה עם הפרעות RNA, כמו גם מסכי רווח בתפקוד עם הביטוי של microRNAs (Wong et al., 2015) ומסגרות קריאה פתוחות אנושיות מאומתות ברצף, כמו אלה שדווחו בספריית TFome האנושית (Ng et al., 2020).

שיטת CombiSEAL להנדסה בתפוקה גבוהה של גורמי תמלול

מציאת השילוב האידיאלי של גורמים גנטיים המתרחשים באופן טבעי עדיין יכולה להציב אתגרים, כמו הגבלה ל-TFs מאופיינים של הגנום עם ידע מוקדם על ביטוים ותפקידיהם בהתמיינות. מחקרים הוכיחו כי הנדסת TFs או יצירת גורמי שעתוק מלאכותיים פותחים שדרה חדשה של אפשרויות להאיץ את קצב ההתמיינות באמצעות מסלולים חלופיים, לעלות על התלות של ביטוי קדם של גורמים משותפים אנדוגניים אחרים ברשת הרגולטורית הגנים, או להחליף לחלוטין TFs טבעיים עם יעילים יותר (Jauch, 2018).

זה מאפשר לחוקרים להתאים את הגורמים הנדרשים בהתאם לצרכי הניסוי שלהם. אנו מציעים שאם שואפים לבצע מוטגנזה בתפוקה גבוהה במספר אתרים ל-TF הכולל תחומים שונים, CombiSEAL יכולה להתגלות כפלטפורמה שימושית (Choi et al., 2019). שיטת CombiSEAL מרכיבה שברי DNA המקודדים לחומצות אמינו המתויגים בשילוב עם ברקודים (איור 1).

איור 1 ｜ שיטות CombiGEM ו-CombiSEAL לבדיקת מניעים גנטיים יעילים של בידול. דוגמה לשיטת CombiGEM היא הרכבה של מספר רב של sgRNAs המובעים מאותו מבנה, ושילובי sgRNA מיוצגים על ידי הברקודים המשורשרים שלהם. שיטת CombiSEAL כוללת מוטציות המוכנסות לחלקים שונים של חלבון, כגון גורמי שעתוק, המסומנים כ-P1, P2, P(n) ו-P(n פלוס 1). והשילובים של המוטציות באים לידי ביטוי בברקודים המשורשרים התואמים שלהם. המשתמש יכול להחיל את ההגדרות על מערכות אספקת DNA אחרות, ובייצוג זה נעשה שימוש בוקטורים לנטי-ויראליים. אסטרטגיות ההקרנה יכולות להתבצע על ידי פורמט מאוחד, ובדוגמה זו, זיהוי אוכלוסיות תאים שמתמיינות לשושלת נוירונים ספציפית מזוהה על ידי הפעלה של האמרגן לביטוי חלבון ניאון, המסומן כ-X-fluorescence בתרשים. רצף הדור הבא (NGS) של הברקודים ממאגר התאים יפענח את מטרות ה-DNA או וריאנט(ות) התעתיק. ניתוח קפדני של גורמים המניעים את ההתמיינות של סוגי נוירונים שונים יכול להשתמש בשיטות מבוססות מערך כגון חיטוט של תאים עם סמני שושלת תאים ואחריו מיון תאים מופעל מגנטי (MACS) לתוך לוחות מרובות בארות, אשר ניתן לעקוב אחריהם עם הדמיה בתוכן גבוה. לחלופין, רצף RNA חד-תא (RNA-Seq) מאפשר למשתמש ליצור פרופיל של ביטויי הגנים של תאים עם הפנוטיפים הרצויים ויוכל לאחזר את הברקודים כדי לזהות שילובי sgRNA או שילובי מוטציות של וריאנט/ים מפתח. FACS: מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה.

CombiSEAL מתחיל בחתך החלקים הראשונים של החלבון שבהם רצוי המוטגנזה. המשתמש יכול ליצור כל מספר של גרסאות עבור כל חלק, ואז לתייג אותם עם ברקודים כדי לזהות את המיקום והשילוב של המוטציות. כל מאגר של מקטעים מורכב לאחר מכן ברצף על ידי הכנסתם לוקטור יעד המכיל את רצף החלבון מסוג פראי שונה עם אנזימים מסוג IIS מאגפים באזור המוטגנזה המיועדת.

ערכת היתוך ללא צלקות זו של קישור חלקים מרובים של חלבון חשובה כדי להימנע מהוספת חומצות אמינו לא רצויות לחלבון. שיטת CombiSEAL מאפשרת לקבוע את רצפי חומצות האמינו של מאגר גרסאות העניין שנבחרו בצורה יעילה וחסכונית יותר, תוך מניעת הצורך ברצף קריאה ארוך על פני החלבון כולו כדי לזהות את סוגי המוטציות והיכן הן ממוקמות על פני חֶלְבּוֹן.

הגדרה מתודית זו מאפשרת ניתוח קל יותר על ידי ביצוע רצף בתפוקה גבוהה של מאגר ברקודים קצרים שרשורים המסיקים את השילוב של סוגים ומיקומים של מוטציות חומצות אמינו, או שינויים רצויים אחרים כגון החלפת דומיין, החדרה ומחיקה, שהיו תוכנן והותקן בתחילה על ה-TF

סיכום

בהשוואה לשיטות ניסוי וטעייה, הושגו התקדמות בשימוש בגישות שיטתיות יותר לקביעת הגורמים או השילובים החיוניים הנדרשים כדי להניע את ההמרה של סוג תא אחד לשושלת עצבית. עם זאת, היכולת לזהות שילובים מסדר גבוה הייתה חסרה, וכאן אנו מציעים ששיטת CombiGEM עשויה להיות מסוגלת לטפל במגבלות כאלה.

CombiGEM משתמשת במערכת קשירת ברקוד עם סיר אחד כדי לחבר שילובים מסדר גבוה יותר של גורמי קישור ל-DNA ל-DNA למטרה במכה אחת, ולעקוף את התהליך של סבבי סקר מרובים כדי לצמצם את מספר ההתאמות לגודל שניתן לנהל עבור אימותים במורד הזרם. . יתר על כן, ניתן להחליף TFs טבעיים פחות יעילים ב-TFs מלאכותיים או מהונדסים כדי לווסת טוב יותר את ביטוי הגנים. אנו מתארים שיטת מוטגנזה של חלבון, CombiSEAL, שתאפשר למשתמשים ליצור מאגרים גדולים של וריאנטים של גורמי שעתוק על ידי הרכבה פשוטה של ​​מספר מוטציות אתרים מתויגות בברקודים בתוך החלבון והתחומים השונים שלהם.

זה יאיץ ויוריד את עלות הליכי ההקרנה כדי לאחזר את המידע על סוגי המוטציות של גרסאות העניין. אנו מקווים שהשיטות המוצעות יכולות לסייע בהבנה נוספת ובהרחבת האפשרויות לקידום התחדשות עצבית ויכולות להיות ישימות נרחבות לתחומי מחקר אחרים.

מנגנון ההשפעה הנוירו-פרוטקטיבית של Cistanche

ל-Cistanche הוכח כי יש השפעות נוירו-פרוטקטיביות באמצעות מספר מנגנונים:

1. השפעות אנטי דלקתיות: Cistanche מכיל תרכובות שהוכחו כמעכבות דלקת בחלקים שונים של המוח, מה שיכול לסייע בהגנה על נוירונים מנזק.

2. השפעות נוגדות חמצון: Cistanche מכיל תרכובות בעלות תכונות נוגדות חמצון חזקות. נוגדי חמצון עוזרים להגן על נוירונים מנזק הנגרם על ידי רדיקלים חופשיים ולחץ חמצוני.

3. ויסות של נוירוטרנסמיטורים: הוכח כי Cistanche מווסת מוליכים עצביים מסוימים, כגון סרוטונין ודופמין, שיכולים לסייע בהגנה על נוירונים ובשיפור התפקוד הקוגניטיבי.

4. גירוי גורם נוירוטרופי: הוכח כי Cistanche ממריץ ייצור של גורמים נוירוטרופיים, כגון גורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF), שיכול לקדם את הצמיחה וההישרדות של נוירונים.

בסך הכל, מנגנונים אלו פועלים יחד כדי להגן על נוירונים מנזק, לקדם את צמיחתם והישרדותם ולשפר את התפקוד הקוגניטיבי.

הפניות

Choi GCG, Zhou P, Yuen CTL, Chan BKC, Xu F, Bao S, Chu HY, Thean D, Tan K, Wong KH, Zheng Z, Wong ASL (2019) מוטגנזה קומבינטורית מייעלת באופן גורף את פעילויות עריכת הגנום של SpCas9. שיטות נאט 16:722-730.

DeWeirdt PC, Sanson KR, Sangree AK, Hegde M, Hanna RE, Feeley MN, Griffith AL, Teng T, Borys SM, Strand C, Joung JK, Kleinstiver BP, Pan X, Huang A, Doench JG (2020) Optimization of AsCas12a לבדיקות גנטיות קומבינטוריות בתאים אנושיים. Nat Biotechnol 39:94-104.

Han K, Jeng EE, Hess GT, Morgens DW, Li A, Bassik MC (2017) שילובי תרופות סינרגטיים לסרטן שזוהו במסך CRISPR לאינטראקציות גנטיות זוגיות. Nat Biotechnol 35:463- 474.

Jauch R (2018) תכנות מחדש של גורל התא באמצעות הנדסה של גורמי תמלול מקוריים. Curr Opin Genet Dev 52:109-116.

Najm FJ, Strand C, Donovan KF, Hegde M, Sanson KR, Vaimberg EW, Sullender ME, Hartenian E, Kalani Z, Fusi N, Listgarten J, Younger ST, Bernstein BE, Root DE, Doench JG (2018) Orthologous CRISPR- אנזימים Cas9 למסכים גנטיים קומבינטוריים. Nat Biotechnol 36:179-189.

Ng AHM, Khoshakhlagh P, Rojo Arias JE, Pasquini G, Wang K, Swiersy A, Shipman SL, Appleton E, Kiaee K, Kohman RE, Vernet A, Dysart M, Leeper K, Saylor W, Huang JY, Graveline A, Taipale J, Hill DE, Vidal M, Melero-Martin JM, et al. (2020) ספרייה מקיפה של גורמי שעתוק אנושיים להנדסת גורל התא. Nat Biotechnol Doi: 10.1038/s41587-020-0742-6.

Replogle JM, Norman TM, Xu A, Hussmann JA, Chen J, Cogan JZ, Meer EJ, Terry JM, Riordan DP, Srinivas N, Fiddes IT, Arthur JG, Alvarado LJ, Pfeiffer KA, Mikkelsen TS, Weissman JS, Adamson B (2020) מסכי CRISPR חד-תאיים קומבינטוריים על ידי לכידת RNA מדריך ישיר ורצף ממוקד. Nat Biotechnol 38:954- 961.

Shen JP, Zhao D, Sasik R, Luebeck J, Birmingham A, BojorquezGomez A, Licon K, Klepper K, Pekin D, Beckett AN, Sanchez KS, Thomas A, Kuo CC, Du D, Roguev A, Lewis NE, Chang AN , Kreisberg JF, Krogan N, Qi L, et al. (2017) מסכי CRISPRCas9 קומבינטוריים למיפוי דה נובו של אינטראקציות גנטיות. שיטות נאט 14:573-576.

Takahashi K, Yamanaka S (2006) אינדוקציה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מתרביות פיברובלסטים עובריים ומבוגרים של עכברים על ידי גורמים מוגדרים. תא 126:663-676.

Tian R, Gachechiladze MA, Ludwig CH, Laurie MT, Hong JY, Nathaniel D, Prabhu AV, Fernandopulle MS, Patel R, Abshari M, Ward ME, Kampmann M (2019) פלטפורמה מבוססת הפרעות CRISPR למסכים גנטיים מולטי-מודאליים ב-iPSC אנושי נוירונים שמקורם. Neuron 104:239-255.

Truong VA, Hsu MN, Kieu Nguyen NT, Lin MW, Shen CC, Lin CY, Hu YC (2019) CRISPRai להפעלה ועיכוב בו-זמנית של גנים לקידום כונדרוגנזה של תאי גזע והתחדשות עצם השוקית. חומצות גרעין Res 47:e74. Wong AS, Choi GC, Cheng AA, Purcell O, Lu TK (2015) גנטיקה קומבינטורית מסדר גבוה בתאים אנושיים. Nat Biotechnol 33:952-961.

Wong AS, Choi GC, Cui CH, Pregernig G, Milani P, Adam M, Perli SD, Kazer SW, Gaillard A, Hermann M, Shalek AK, Fraenkel E, Lu TK (2016) הקרנת CRISPR-Cas9 מרובת ברקודים מופעלת על ידי CombiGEM . Proc Natl Acad Sci USA 113:2544-2549.

Zhou P, Chan BKC, Wan YK, Yuen CTL, Choi GCG, Li X, Tong CSW, Zhong SSW, Sun J, Bao Y, Mak SYL, Chow MZY, Khaw JV, Leung SY, Zheng Z, Cheung LWT, Tan K , Wong KH, Chan HYE, Wong ASL (2020) מסך CRISPR קומבינטורי תלת כיווני לניתוח אינטראקציות בין מטרות שניתן לסמים. נציג סלולרי 32:108020.

Dawn GL Thean, Alan SL Wong*