קרישה, קולטנים מופעלי פרוטאז ומחלת כליות סוכרתית: לקחים מעכברים חסרי ENOS

סינתאז תחמוצת החנקן האנדותלידוע כי תפקוד לקוי (eNOS) מחמיר את ההתקדמות והפרוגנוזה שלמחלת כליות סוכרתית(DKD). אחד המנגנונים שבאמצעותם זה מושג הוא שרמות eNOS נמוכות קשורות לקרישיות יתר, המקדמת פגיעה בכליות. במפל הקרישה החיצוני, גורם הרקמות (פקטור III) וגורמי הקרישה במורד הזרם, כגון פקטור X פעיל (FXa), מחמירים את הדלקת באמצעות הפעלה של הקולטנים המופעלים על ידי פרוטאז (PARs). לאחרונה, הוכח כי היעדר או מופחת של ביטוי eNOS בעכברים סוכרתיים, כמודל של DKD מתקדם, מגביר את רמות פקטור רקמת הכליה ואת ביטוי PAR1 ו-2 בכליות שלהם. יתר על כן, עיכוב תרופתי או מחיקה גנטית של גורמי קרישה או PARsדלקת משופרתב-DKD בעכברים חסרי eNOS. בסקירה זו, אנו מסכמים את הקשר בין eNOS, קרישה ו-PARs ומציעים אפשרות טיפולית חדשה לטיפול בחולים עם DKD.

מילות מפתח:גלומרולוסקלרוזיס סוכרתי; פקטור Xa;דַלֶקֶת; גורם רקמות

לחץ כאן כדי לקבל תמצית CISTANCHE אורגנית טבעית עם 25% אכינאקוסיד ו-9% אקטוזיד לתפקוד הכליה

מבוא

מספר החולים עםמחלת כליות סוכרתית(DKD) עולה ברחבי העולם (de Boer et al. 2011; Kainz et al. 2015; Ogurtsova et al. 2017). DKD הוא אחד הגורמים העיקריים לתמותה בחולים עם סיבוכי סוכרת (Afkarian et al. 2013). יתר על כן, DKD הוא פרוגרסיבי ומהווה את הגורם העיקרי למחלת כליות סופנית הדורשת טיפול חלופי כליות (Gregg et al. 2014; Liyanage et al. 2015). ביפן, נפרופתיה סוכרתית מהווה יותר מ-39% מחולי דיאליזה חדשים (Nitta et al. 2020). לכן, הפיתוח שלטיפול חדשנינדרשות אפשרויות לטיפול בחולים עם DKD.

מערכת בפתוגנזה של DKD. קרישיות יתר קשורה ל-DKD (Goldberg 2009; Domingueti et al. 2016). רמת פיברינוגן מוגברת בדם הוכחה כקשורה לקצב נמוך משוער של סינון גלומרולרי, פרוטאינוריה גבוהה ופציעה היסטולוגית חמורה, והיא הייתה מנבא של התקדמות למחלת כליות סופנית (Dalla Vestra et al. 2005; Pan et al. al. 2018; Zhang et al. 2018). כמה מחקרים הראו מתאם בין רמת ה-D-dimer, תוצר פירוק פיברין, לבין תפקוד לקוי של הכליות ב-DKD (Domingueti et al. 2018; Pan et al. 2018). קרישיות יתר ב-DKD נקבעת ככל הנראה על ידי מספר גורמים. לדוגמה, מערכת רנין-אנגיוטנסין-אלדוסטרון מפעילה גורם רקמה (TF, פקטור III) ומגבירה אירועים פקקת (Dielis et al. 2005). אחרת, היפרגליקמיה, דיסליפידמיה, דלקת או תפקוד לקוי של האנדותל מעורבים במצב הפרו-טרומבוטי תחת פתוגנזה של DKD (Goldberg 2009).

תפקוד לקוי של האנדותל קיים ב-DKD שמתקדם לסיבוכים מיקרו-וסקולריים (Goldberg 2009; Nakagawa et al. 2011). פגיעה בייצור תחמוצת החנקן האנדותל (eNOS) או פעילות eNOS מופחתת (למשל, פגיעה בזרחן eNOS) היא סימן היכר של תפקוד לקוי של האנדותל ב-DKD (Nakagawa et al. 2011; Cheng et al. 2012). הראינו כי אובדן ביטוי eNOS היה קשור לעלייה ברמת ה-TF ולפעילות מערכת הקרישה החיצונית (Li et al. 2010; Wang et al. 2011a), אשר קשורה קשר הדוק לאירועי פקקת בחולים עם כליה כרונית. מחלות (Kolachalama et al. 2018).

בנוסף לסיכון המוגבר לאירועי פקקת, פרוטאזות קרישה, כגון פקטור פעיל FVII (FVIIa), פקטור פעיל (FXa) וטרומבין, הנמצאים במפל הקרישה החיצוני, מתווכים פגיעה ברקמות באמצעות קולטן המופעל פרוטאז ( מנגנון תלוי PAR (Madhusudhan et al. 2016; Posma et al. 2019). בסקירה זו, אנו מסכמים את הממצאים שהתקבלו מעכברים סוכרתיים חסרי eNOS ודנים בקשר בין מסלול הקרישה-PAR, רמות eNOS ו-פתוגנזה של DKD.

מסלול רצפטורים המופעלים על ידי רקמות פקטור/פרוטאז

רקמות פקטור (TF), המכונה פקטור III, הוא חלבון טרנסממברנלי של 47 kDa המקיים אינטראקציה עם פקטור VII (FVII) (Grover and Mackman 2018). קומפלקס TF/FVIIa הוא מפעיל של מפל הקרישה החיצוני ומזרז את ההפעלה של FX ו-FIX. FXa ו-Co-factor V מופעל (FVa) יוצרים קומפלקס פרוטרומבוטי שיוצר תרומבין. לבסוף, תרומבין הופך פיברינוגן לפיברין, וכתוצאה מכך היווצרות טרומביים (Grover and Mackman 2018). TF מתבטא הן בתאי שריר חלק וסקולריים והן בפיברובלסטים אדוונטציאליים. בתנאים דלקתיים, הביטוי שלו מושרה בתאי אנדותל או בתאים במחזור כמו מונוציטים (Østerud and Bjørklid 2006).

קולטנים המופעלים על ידי פרוטאז (PARs) הם חברים במשפחת הקולטנים המחוברים ל-G-protein, הכוללת ארבעה חלבוני PAR (PAR1-4). PARs עוברים ביקוע על ידי פרוטאזות בקצה ה-N-טרמינלי ומופעלים עם הקישור ל-N-terminus חדש המכיל ליגנד קשור. ארבעת האיברים של PARs (PAR1-4) מופעלים על ידי פרוטאזות קרישה ספציפיות: קומפלקס TF ו-FVIIa מפעיל PAR2, פקטור Xa מפעיל גם PAR1 וגם PAR2, וטרומבין מפעיל את PAR1, PAR3 ו-PAR4 (Camerer et al. 2000; Coughlin 2005; Rothmeier and Ruf 2012; Zhao et al. 2014). הקשר בין TF, פרוטאזות קרישה ו-PARs מוצג באיור 1.

ידוע כי PARs מתבטאים באופן נרחב בתאי כליה ומעורבים בפתופיזיולוגיה של פגיעה בכליות. גם PAR1 וגם PAR2 באים לידי ביטוי בתאי אנדותל גלומרולריים, תאי מזנגיה ותאי צינורי כליה שמקורם באדם או בעכבר; PAR2, PAR3 ו-PAR4 מתבטאים בפודוציטים אנושיים; PAR1, PAR3 ו-PAR4 מתבטאים בפודוציטים של עכברים (Tanaka et al. 2005; Vesey et al. 2005; Madhusudhan et al. 2012; Dong et al. 2015; Madhusudhan et al. 2016).

למרות ההשפעות המזיקות או המגנות של PARs בפגיעה בכליותהוכח, נתונים מצטברים מצביעים על כך ש-PARs מחמירים את הדלקת על ידי גירוי ייצור ציטוקינים וכימוקינים (Rothmeier and Ruf 2012; Isermann 2017; Posma et al. 2019). בהתאם לממצא זה, אגוניסטים PAR1 ו-PAR2 מקדמים את הביטוי של מתווכים דלקתיים, כגון חלבון כימוקטי מונוציטי 1 (MCP1) ומעכבי מפעיל פלסמינוגן-1 (PAI-1), ומולקולות פרו-פיברוטיות באנדותל. , mesangial, ותאי צינוריות של הכליה (Vesey et al. 2005; Vesey et al. 2013; Ellinghaus et al. 2016; Waasdorp et al. 2016; Oe et al. 2019). במחקרים in vivo, היעדר PAR1 או נוכחות של מעכבי PAR1 הפחיתו את הדלקת במודלים של גלומרולונפריטיס סהרונית או פגיעה בכליות חסימתית (Cunningham et al. 2000; Waasdorp et al. 2019; Lok et al. 2020). באופן דומה, ההשפעות הטיפוליות של עיכוב PAR2 בפציעות כליות לוו על ידידלקת מופחתתבכליות (Hayashi et al. 2016; Du et al. 2017; Han et al. 2019; Watanabe et al. 2019).

פולימורפיזמים סינתזיים של תחמוצת החנקן האנדותל ב-DKD

סינתאז תחמוצת החנקן האנדותל(eNOS) הוא אחד משלושת האיזופורמים של NOS, והוא תורם לייצור NO באנדותל כלי הדם (Walford and Loscalzo 2003). NO המיוצר על ידי eNOS באנדותל כלי הדם ממלא תפקיד מכריע בוויסות הרפיית כלי הדם, אנטי דלקת ומניעת היווצרות פקקת (Walford and Loscalzo 2003). ביטוי eNOS לקוי קשור להתפתחות של DKD. מטא-אנליזות שנערכו לאחרונה על בני אדם גילו כי הגנים G894T (rs1799983), C-786T (rs2070744) ואינטררון 4b/4a ​​(rs869109213) בגנים eNOS (NOS3) קשורים קשר הדוק עם פיתוח של DKD (Dellamea et al. 2014; Zhang et al. 2015; Dong et al. 2018). מבין הגרסאות הללו, התפקיד של הפולימורפיזם G894T (Glu298Asp) בתפקוד eNOS אופיינו היטב. הייצור המופחת של הצטברות NO או ניטריט הוכח בתאי CHO שעברו טרנספקציה עם 298Asp בהשוואה לאלו עם 298Glu (Noiri et al. 2002). יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שהייצור המופחת של NO על ידי תפקוד לקוי של eNOS חשוב להתקדמות של DKD בבני אדם.

עכברים סוכרתיים חסרי eNOS כמודל של נפרופתיה סוכרתית אנושית

הקמת מודלים פרה-קליניים אמינים הדומים ל-DKD אנושי חיונית לחקר אפשרויות טיפוליות חדשות. בהתבסס על העדויות המראות קשר בין פולימורפיזם eNOS ל-DKD, מספר מחקרים הוכיחו כי מודלים נוק-אאוט של eNOS מסוג I וסוג II DM הם חלק מהמודלים המוצלחים המחקים DKD אנושי (Brosius et al. 2009; Azushima et al. al. 2018). הוכח כי עכברים סוכרתיים הנגרמת על ידי סטרפטוזוטוצין וחסרי eNOS מפתחים אלבומינוריה חמורה, התרחבות מסנגיאלית, עיבוי של קרום הבסיס הגלומרולרי והיאלינוזה עורקית, הדומה ל-DKD אנושי (Nakagawa et al. 2007). באופן דומה, עכברים סוכרתיים מסוג II (db/db) חסרי eNOS הראו גלומרולוסקלרוזיס חמורה ואלבומינוריה (Zhao et al. 2006).

TF מוגבר בעכברים סוכרתיים ללא eNOS

NO מעכב את היווצרות הפקקת ואת הצטברות הטסיות (Walford and Loscalzo 2003). מכיוון שהיווצרות פקקת גלומרולרית נצפתה בעכברים סוכרתיים חסרי eNOS (Nakagawa et al. 2007), ביטוי eNOS לקוי קשור ככל הנראה לעלייה בקרישה תלוית TF. הקשר בין eNOS ו-TF ב-DKD טופל בדוחות הקודמים שלנו (Li et al. 2010; Wang et al. 2011a; Oe et al. 2016) (איור 2).

ביטוי מופחת או חוסר בביטוי eNOS מגביר את פעילות TF הכלייתית בעכברי אקיטה סוכרתיים אפינו את ביטוי TF בעכברי אקיטה (Ins2Akita/+) סוכרתיים, מודל מסוג I DM, עם רמות ביטוי שונות של eNOS (eNOS+/+, eNOS+/- , ו-eNOS-/-) (Wang et al. 2011a). מצאנו כי חומרת DKD קשורה לביטוי eNOS מופחת. הפרשת אלבומין בשתן, גלומרולוסקלרוזיס והפחתה בקצב הסינון הגלומרולרי הוחמרו בסדר הבא: eNOS+/+; Ins2Akita/+ < eNOS+/-; Ins2Akita/+ < eNOS-/-; Ins2Akita/+. באופן מעניין, ביטוי ופעילות TF של הכליות עלו ב-eNOS+/-; Ins2Akita/+ ו-eNOS-/-; עכברי Ins2Akita/+ בהשוואה לאלו ב-eNOS+/+; עכברי Ins2Akita/+. שקיעת פיברין גלומרולרית הייתה יוצאת דופן גם ב-eNOS+/-; Ins2 Akita/+ ו-eNOS-/-; עכברי Ins2 Akita/+. יתר על כן, ביטוי ה-Tf mRNA הכלייתי נמצא בקורלציה עם חומרת המחלה, הפרשת אלבומין בשתן, וכליות דלקתיותביטוי ציטוקינים.

דיאטה עתירת שומן והיעדר eNOS מעלים סינרגטית TF בעכברים סוכרתיים

מחקרים רבים הוכיחו קשר בין השמנת יתר לפקקת (Samad and Ruf 2013). לדוגמה, וויסות עלייה של מסלול TLR4-NF-kB בתנאי מחלה מטבולית מעלה את רמות ה-TF (Lv et al. 2009; Owens et al. 2012; Rogero and Calder 2018). יתר על כן, חומצת שומן רוויה פלמיטאט משרה שחרור היסטון H3 באמצעות מנגנונים תלויי מסלול ROS ו-JNK והיסטונים חוץ-תאיים, אשר מגבירים את ביטוי TF במונוציטים (Shrestha et al. 2013). תוך התמקדות בקשר בין קרישה, eNOS ודיסליפידמיה, המחקר הקודם שלנו הוכיח את ההשפעות המשולבות של מחסור ב-eNOS ודיאטה עתירת שומן על ביטוי TF (Li et al. 2010). במחקר, עכברי eNOS null טופלו במינון נמוך של STZ כדי לפתח DM והוזנו בדיאטה עתירת שומן. היעדר ביטוי eNOS הגביר את הפרשת אלבומין בשתן ופציעות היסטולוגיות, שהוחרפו עוד יותר על ידי תזונה עתירת שומן. הביטוי והפעילות של TF עלו בכליות עכברים בגלל חוסר ביטוי eNOS ותזונה עתירת שומן באופן סינרגטי. באופן מעניין, עלייה ברמת ה-TF immunoreactive הודגמה על ידי ניסויי colocalization עם סמן גלומרולרי מונוציט/מקרופאג.

נטרול נוגדנים נגד TF משפר דלקת בכליות סוכרתיות בעכברי eNOS-Nockout

עלייה בקרישה תלוית TF קשורה לדלקת מוגברת (Witkowski et al. 2016). עיכוב מערכת הקרישה התלויה ב-TF השתפרמחלות דלקתיות, כגון אלח דם המושרה על ידי LPS (Pawlinski et al. 2010). כדי להבהיר את הקשר הסיבתי בין דלקת ל-TF ב-DKD, בחנו את ההשפעה לטווח קצר של נטרול נוגדנים נגד TF על דלקת של כליות סוכרתיות בעכברים חסרי eNOS (Li et al. 2010). התוצאות הראו כי מתן נוגדנים נגד TF הפחית באופן ניכר את רמות הביטוי הכליות של גנים הקשורים לדלקת ופיברוזיס כגון Tnfa, Ccl2, Tgfb ו-Col4 mRNA בכליות עכברים ארבעה ימים לאחר נטרול TF.

מעכב קרישה FXa משפר פגיעה בכליות בעכברים סוכרתיים חסרי eNOS

קרישה FXa, הממוקמת במורד הזרם של TF/VIIa, תורמת גם היא לדלקת דרך המסלול התלוי ב-PAR. תפקידו ב-DKD הוכח במספר מודלים של בעלי חיים. סומי וחב'. (2011) הדגימו כי fondaparinux, מעכב FXa, הפחית את רמות החלבון בשתן, היפרטרופיה גלומרולרית ותצהיר פיברין בעכברי db/db. ההשפעה הטיפולית של עיכוב FXa בעכברי DKD חסרי eNOS הוכחה על ידי הקבוצה שלנו (Oe et al. 2016). Edoxaban (50 מ"ג/ק"ג/יום), מעכב FXa דרך הפה, ניתן ל-eNOS-/-; עכברי Ins2Akita/+ במשך שלושה חודשים, והתוצאות הראו שיפור בפציעות היסטולוגיות, כגון שגשוג מטריצה ​​mesangial. רמות הביטוי של גנים דלקתיים בכליות הופחתו על ידי אדוקסבן (טבלה 1). FXa מפעיל גם PAR1 וגם PAR2. כדי להבהיר את המנגנון של פגיעה בכליות בתיווך FXa, הדגמנו שההשפעות האנטי-דלקתיות של מעכבי FXa דומות לאלו שנמצאו בעכברי PAR2-/- ועכברי PAR2-/- עם מעכבי FXa . ממצאים אלה הצביעו על כך שסביר להניח ש-FXa גרם לדלקת באמצעות מנגנון תלוי PAR2- ב-DKD. לעומת זאת, edoxaban לא שיפר את הפגיעה בגלומרולרית ב-eNOS+/+; עכברי Ins2Akita/+, מה שמצביע על כך שהאפקט הטיפולי של עיכוב FXa היה קשור לקרישיות יתר תלוית eNOS בעכברים סוכרתיים מסוג I.

גורמי קרישה אחרים ב-DKD

מכיוון שהתרומבין מכוון ל-PAR1, שמקדם דלקת כלי דם (Chen and Dorling 2009), סביר להניח שהטרומבין מחמיר את DKD. עם זאת, התפקידים המגנים או המזיקים של תרומבין בפתוגנזה של DKD הוכחו; תרומבין במינון נמוך (50 pM) נמנע, ואילו תרומבין במינון גבוה (20 nM) החמיר אפופטוזיס המושרה על ידי גלוקוז בפודוציטים (Wang et al. 2011b). יש להבהיר בעתיד את ההשפעות של מעכבי תרומבין כגון דביגטרן על עכברים סוכרתיים חסרי eNOS.

פיברינוגן מעורב במצבי דלקת שונים. מעניין לציין שהפחתה חלקית או היעדר פיברינוגן היו מועילים למודלים של איסכמיה-רפרפוזיה של הכליה או פיברוזיס חסימתית בכליות (Sörensen et al. 2011; Craciun et al. 2014). מכיוון שמשקע הפיברין הגלומרולרי מוגבר בעכברים סוכרתיים חסרי eNOS (Nakagawa et al. 2007; Li et al. 2010; Wang et al. 2011a), הבהרת תפקידה בפתוגנזה של DKD ראויה למחקר נוסף.

ביטוי של PAR1 ו-PAR2 בעכברים סוכרתיים ללא eNOS

ביטוי מוגבר של PARs קשור לפגיעה בכליות. אנו ואחרים הדגמנו שרמות הביטוי של Par1 ו/או Par2 mRNA עלו במודלים של בעלי חיים עם נפרופתיה סוכרתית, פגיעה בכליות הנגרמת על ידי ade nine, פיברוזיס כלייתי חסימתי ופגיעה בכליות הנגרמת על ידי ציספלטין (Chung et al. 2013; Hayashi et al. 2016; Oe et al. 2016; Watanabe et al. 2019). יתר על כן, רמות חלבון PAR2 גלומרולרי עלו בעכברי db/db, מודל של DM מסוג II (Sumi et al. 2011). הדגמנו את הקשר בין ביטוי PAR לבין מחסור ב-eNOS בעכברים סוכרתיים (Oe et al. 2016). רמת הביטוי של Par1 mRNA הייתה גבוהה משמעותית ב-eNOS-/-; עכברי Ins2Akita/+ מאשר ב-eNOS−/−; Ins2Akita/+ ועכברים שאינם DM. באופן דומה, הביטוי של Par2 היה גבוה משמעותית ב-eNOS-/-; עכברי Ins2Akita/+ מאשר בעכברים שאינם DM. לעומת זאת, רמות ה-MRNA של Par4 לא היו שונות בין הגנוטיפים. מחסור ב-eNOS מחמיר את הדלקת ב-DKD (Wang et al. 2011a). מכיוון שדווח כי ציטוקינים פרו-דלקתיים מגבירים את ה-PARs (Nystedt et al. 1996), דלקת מוגברת הנגרמת על ידי חוסר eNOS עשויה לגרום לביטוי Pars כליות ב-DKD. יחד, תוצאות המחקרים שלנו הצביעו על כך שרמות הביטוי של PAR1 ו-PAR2, בדומה למקרה של TF, עלו בכליות סוכרתיות כאשר eNOS היה חסר (איור 2).

מחיקת PAR2 פגיעה בכליות סוכרתית משופרת בעכברים עם eNOS מופחת

אנחנו ואחרים התייחסנו לתפקיד של PAR2 ב-DKD במחקרים קודמים. מחיקת Par2 לא השפיעה על פגיעה גלומרולרית בעכברי אקיטה סוכרתיים מסוג פרא (Ins2Akita/+) עם eNOS (Oe et al. 2016). יתרה מזאת, עכברים סוכרתיים הנגרמות על ידי STZ וחסרים PAR2 הראו אלבומינוריה מופחתת בהשוואה לעכברים מסוג פרא סוכרתיים, אך מוגברת התרחבות מסנגיאלית (Waasdorp et al. 2017). יחד, תוצאות אלו מוכיחות שאין השפעות טיפוליות קלות של עיכוב PAR2 על פגיעה בכליות במודלים המוקדמים והקלים של DKD. לעומת זאת, הדגמנו את ההשפעות של מחסור ב-PAR2 על DKD בעכברי אקיטה סוכרתיים עם ביטוי מופחת של eNOS (eNOS+/-; Ins2Akita/+) (Oe et al. 2016). היעדר PAR2 הפחית משמעותית את רמות הפרשת אלבומין בשתן, התפשטות מסנגיאלית ועובי ה-GBM. רמות הביטוי של גנים פרו-דלקתיים וקשורים לפיברוזיס, כולל Tnfa, Tgfb ו- Col4, הופחתו גם בכליות עכברים. ממצאים אלו מצביעים על כך ש-PAR2 הוא פתוגני לא בשלב מוקדם, אלא בפגיעה בגלומרולרית סוכרתית מתקדמת יחסית הנגרמת על ידי מחסור ב-eNOS (טבלה 1).

השירות התומך של Wecistanche - יצואנית ה-cistanche הגדולה בסין:

דוא"ל:wallence.suen@wecistanche.com

ווטסאפ/טלפון:+86 15292862950

קנה לפרטי מפרטים נוספים:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop