ביטוי Clr-f מווסת הומאוסטזיס חיסוני וכליות מטבולי Ⅲ

דִיוּן

הדלקה ותיווך תאי חיסוןלנזק יש תפקיד מוביל בהתפתחות והתקדמות של פגיעה ותפקוד כלייתי. במחקר זה, אנו מדווחים על דרישה ל-Clr-f בתחזוקה שלבריאות הכליותותפקודכשליטה הומאוסטטית מהותית נגדנזק כלייתי בתיווך חיסוני ומטבולי. הממצאים שלנו מראים חדירת תאים חיסוניים, ותצהיר אימונוגלובולינים וחלבונים משלימים בכליות של עכברים חסרי Clr-f. תכונות חיסוניות אלו של עכברים חסרי Clr-f משודכים למראה הקשור לגיל של נגעים צינוריים וגלומרולריים, הצטברות שומנים חוץ רחמיים וחוסר ויסות של תהליכי שעתוק רבים.

לחץ ל-cistanche herba למחלת כליות

חלבוני Clr המקודדים בתוך ה-NKC בין קולטני ה-NKR-P1 המקושרים גנטית שלהם היו מוקד המחקר כמתווכים בלתי תלויים בדרגה I של MHC שאינם מיותרים של זיהוי חסר עצמי על ידי NKR-P1 המבטאים תאי חיסון9,27-31. הביטוי המוגבר של חלבוני Clr נבחרים בתגובה ללחץ בתאים מדווח גם כמרסן פונקציונלית את התגובות החיסוניות של תאי חיסון השוכנים ברקמות7,12,32. בהתאם לכך, Clr-f של המעי תורם לסובלנות חיסונית בתוך סביבת המעי האימונוגנית ביותר, דרך האינטראקציה שלו עם לימפוציטים תוך אפיתליאליים המעכבים המבטאים קולטן NKR-P1G7. עבודה שנעשתה על ידי Leibelt et al. הראו כי עכברים שאותגרו עם poly(I:C) הפגינו ביטוי מוגבר של Clr-f וכי אינטראקציות Clr-f/NKR-P1G במבחנה מעכבות מאוד את תאים המבטאים NKR-P1G. יחד ניתן לפרש את הממצאים הללו כמנגנון פוטנציאלי שבאמצעותו Clr-f עשוי למנוע תגובתיות של תת-קבוצות חיוביות של NKR-P1G תוך אפיתל במעיים כלפי מחסום האפיתל שמתגרה כל הזמן על ידי גירויים מיקרוביאליים7.

הדור של עכברים חסרי Clr-f סיפק לנו את ההזדמנות הראשונה להעריך אתהשלכות תפקודיותשל ביטוי Clr-f in vivo ואיפשר לנו לחקור את התפקידים ההומאוסטטיים החיסוניים הפוטנציאליים של Clr-f בכליה. הנזק לכליות שנצפה בעכברי Clr-f-/- מתיישב עם המודל לפיו ויסות הירידה של Clr-f משמש כאינדיקטור ללחץ ופגיעה בתאים המשחררים אילוצים על תאי אפקטור המבטאים NKR-P1G. העלייה ב-NKR-P1G על תאי T בכליות של עכברים Clr-f-/- מרמזת שביטוי NKR-P1G מוגבר בקרב תאי T תושבי כליה בהיעדר Clr-f, או שהכליות של Clr- עכברי f-/- נתונים לחדירה של תאי T המבטאים NKR-P1G. היעדר שינוי ניתן לזיהוי בנוכחות או הפצה של תאים המבטאים NKR-P1G במעיים של עכברי Clr-f-/− עשוי להצביע על כך שההשלכות התפקודיות של NKR-P1G: אינטראקציה Clr-f במעיים מוגבלות. לבקרת תגובתיות חיסונית בהקשר של זיהום ולא סובלנות חיסונית. לחלופין, אינטראקציות מיותרות עשויות גם לשלוט בפעילות של תאים המבטאים NKR-P1G. זה נתמך על ידי ממצאים ש-NKR-P1G נקשר לא רק ל-Clr-f אלא גם ל-Clr-d ול-Clr-g33, שהאחרון שבהם מתבטא בצורה מתונה ברקמות של הכליה וגם של המעי6. בעוד שהממצאים שלנו חושפים דרישה ל-Clr-f כדי להגן מפני נזק לכליות אוטואימוניות, התפקיד המתווך על ידי NKR-P1G בפתולוגיות הכליות האוטואימוניות של עכברי Clr-f-/- אינו שלם. יש לציין, למרות שיש עלייה בתאי T המבטאים NKR-P1G בכליה של עכברי Clr-f-/-, ההבדל הוא עצום. ייתכן שקולטן חלופי משתתף במעקב אחר Clr-f בכליה. כדי לטפל באופן מלא בציר השליטה הזה בהומאוסטזיס של הכליות, יש צורך במחקרים נוספים

נזק לכליות בתיווך חיסוני מאופיין בחדירה של תאים דלקתיים לחלל הבין-סטיציאלי או לגלומרולוס34. הצטברויות הכליות של מונוציטים, תאי B ו-T, נוגדנים אנטי-גלומרולריים, ציטוקינים IL-12 ו-IFN מוגברים ופתולוגיות גלומרולריות שונות בעכברי Clr-f-/- דומים מאוד לנוף האוטואימוני של דגמי העכברים של LN ( כלומר, MRL-Faslpr)35–37. למרות שכליות Clr-f−/− מפגינות משקעים מנזגיאליים דומיננטיים של IgA עם שקיעת IgM ו-IgG קשורה, והתקבצות של פרופילי תעתיק Clr-f−/− ו-IgAN, סביר להניח כי מוקדם מדי להציע שפנוטיפים אלו מעידים על סוג של CKD עם IgAN38. במקום זאת, פציעות אלו, יחד עם נוכחות של מזנגיוליזה, עיבוי GBM ומוות פודוציטים בכליות Clr-f−/− כמו גם שינויים tubulointerstitial, הצטברות שומן וחוסר ויסות משמעותי במסלולים מטבוליים הם מרכיבים משותפים למגוון פתולוגיות נגזר מפגמים מטבוליים שהוחמרו על ידי מערכת החיסון37,39,40. ללא קשר לגורם הבסיסי או לסוג המחלה של הפרעה בתפקוד הכליות של עכבר Clr-f-/−, נראה כי Clr-f ממלא תפקיד מקל נגד התפתחות אוטואימוניות עם פתולוגיה ברורה הקשורה לגלומרולונפריטיס.

הבדיקה שלנו של עכברי Rag1-/-Clr-f-/- מצביעה על תרומה בולטת של מתווכים בלתי תלויים בתאי T ו-B לתגובות האוטואימוניות של עכברי Clr-f-/-. בפרט, הצטברות של תאי CD11c+ פריגלומרולרי, תאי F4/80+ ותאי NKp46+ בולטת אף יותר בהיעדר תאי T ו-B, ונמצאת בקורלציה עם נוכחות משמעותית של נזק גלומרולרי. זה מצביע על כך שבעוד שתאי T ו-B יכולים לתרום להדלקה הפוגעת בכליות ולקומפלקסים של נוגדנים עצמיים, בעכברי Clr-f-/- ייתכן שאלה אינם גורמים מרכזיים לפתולוגיה, אלא תורמים משניים לפעילות הדלקתית של תאי חיסון אחרים או עשויים להיות גורמים פוטנציאליים לפתולוגיה. משרתים תפקיד אימונו-רגולטורי בעכברים חסרי Clr-f. זה מנוגד לראיות ממודל העכבר ddY של IgAN שמראה תגובה חזקה מקוטבת T1, כאשר תאי T מייצרים IFN גדלים עם הגיל והתקדמות של פגיעה גלומרולרית41. החדירה הכלייתית של תאי B בעכברים חסרי Clr-f הוכחה גם במודלים של עכברים של SLE42. נכון להיום, לא ברור אם תאי B בכליה תורמים להדלקה המזיקה ב-CKD או ממלאים תפקידים רגולטוריים יותר43. עדויות אחרונות ל-CKD בחולים קשישים מצאו שירידה באוכלוסיות תאי B קשורות להתקדמות של מחלת כליות44. עדויות מתאי T ו-B הוכחו כבעלי פעילות מדכאת חיסונית במחלות כליה אוטואימוניות45,46, ולכן המידה שבה הם תורמים או מווסתים את הפתולוגיות של עכברי Clr-f-/− דורשת חקירה נוספת.

הממצאים שלנו יחד מראים דרישה לביטוי Clr-f באפיתל הצינורי של הצינוריות המפותלים הפרוקסימליים, הפודוציטים ו/או אפיתל המעי. אובדן ביטוי Clr-f מוביל למפל אוטואימוני ודלקתי מובהק המוביל לנזק לכליות ולשומן הנלווה אליו. נראה כי התגובות החיסוניות המתעוררות עקב אובדן Clr-f אינן תלויות בתאי T ו-B. באופן כללי, ניתן לדמיין תפקיד פונקציונלי של Clr-f בכליה כמולקולה מעכבת עבור תאי חיסון אפקטור מעקבים בכליה כפי שהם נמצאים במעיים, או בתורמווסת פנימי של תפקוד תא צינורי.

חומרים ושיטות עכברים.

כל העכברים נשמרו בסביבה ייעודית ללא פתוגנים. עכברי C57BL/6 (WT) ו-B6.129S7- Rag1tm1Mom /J (Rag1−/−) נרכשו ממעבדת ג'קסון (Bar Harbor, ME, ארה"ב). עכברים הנושאים את מוטציות האפס המשולבות ב-Rag1 ו-Clr-f (Rag1−/−;Clr-f −/−) נוצרו על ידי הצלבת עכברים חסרי Clr-f (Clr f −/−) עם עכברים (Rag1−/−). . כל הגידול והמניפולציות שבוצעו על בעלי חיים היו בהתאם להנחיות האוניברסיטה ואושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת דאלהוזי והוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת אוטווה. כל העיצובים, הניסויים והדיווחים של מחקר בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות ARRIVE.

דור של עכברים חסרי Clr-f. עכברים חסרי Clr-f (Clr-f −/−) נוצרו על ידי ריקומבינציה הומולוגית של מבנה מיקוד המכיל קלטת פוספוגליצראט קינאז (PGK)-Neomycin שועל ורצף גנומי המשתרע על אקסונים 3, 4 וחלק מאקסון 5 של גן Clr-f. מבנה המיקוד המלא אושר על ידי ריצוף במכון המחקר של בתי החולים של אוטווה (OHRI) לפני אלקטרופורציה לתוך תאי גזע עובריים (ES) C57BL/6 Bruce-4. בחירת שיבוט ES על ידי התנגדות G{{10}} בוצעה על ידי מתקן ליבה טרנסגני של IRCM (Montreal Clinical Research Institute) (מונטריאול, QC, קנדה). בינתיים, הגשושיות 5' ו-3' Clr-f נבדקו בניתוח פולימורפיזם של אורך שברי מוגבל (RFLP) באמצעות DNA גנומי תימי מעכבר WT B6, שעוכל עם BamHI ו- PstI, בהתאמה. שברי DNA מעוכל נפתרו על ג'ל אגרוז 1% והועברו לכתמי ממברנה ניילון. בדיקות Clr-f cDNA סומנו עם רדיואקטיבי 32P-dCTP (Perkin Elmer, Guelph, ON, קנדה) באמצעות ערכת לוט NEB (New England Biolabs, ארה"ב). כתמים עברו בדיקה באמצעות בדיקות Clr-f cDNA המסומנות ב-32P בתמיסת הכלאה (10% (w/v) דקסטרן סולפט; 1 M NaCl; 1% SDS). הכלאה בוצעה בן לילה ב-65 מעלות ושטיפות לאחר הכלאה בוצעו עם תמיסה המכילה 2× SSC ו-1% SDS שחוממת מראש ל-65 מעלות. Te blots נחשפו לסרטי צילום כדי לחשוף את אותות ההכלאה (איורים S1A, S3B). הממברנות הופשטו עם 0.2% SSC/0.2% SDS למשך 30 דקות ב-85 מעלות בין הכלאות שונות. שיבוטים עמידים לנאומיצין נבדקו על ידי ניתוח סאות'ן כתם, ונצפתה יעילות מיקוד של ~15%. שיבוטים נבחרים של ES הוזרקו מיקרו לבלסטוציסטים במתקן IRCM Microinjection Service כדי ליצור את עכברי מייסד Clr-flox הכימריים. העכברים נבדקו על ידי אנליזה של סאות'ן כתם ולאחר מכן גדלו עם נקבות B6 כדי לייצר עכברים הטרוזיגוטיים Clr-fwt/lox. עכברים הטרוזיגוטיים עברו גזע כדי להשיג עכברי Clr-flox/lox. כדי להסיר את קלטת ה-neomycin, עכברי Clr-flox/lox גדלו עם עכברים מהונדסים מסוג CMV-cre על רקע B6 (מעבדת ג'קסון). CMV-CreTg/0 ההטרוזיגוטי הכפול שנוצר; עכברי Clr-f-/+ עברו הגזע כדי לייצר עכברי Clr-f-/- שחסרו את הטרנסגן CMV-cre. עכברים עברו גנוטיפ באמצעות פריימרים ספציפיים (טבלה 1, איור S1B,C ואיור S3C,D). הגברה של PCR בוצעה באמצעות AccuStart II Taq DNA פולימראז (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, ארה"ב). תערובת ה-PCR הוכנה בהתאם להוראות היצרן. ה-DNA אוזן המופק מפנול/כלורופורם שימש כתבניות. נעשה שימוש בפרמטרים הבאים של רכיבת PCR: 30 מחזורי הגברה של 94 מעלות למשך 40 שניות, 60 מעלות למשך 45 שניות, 72 מעלות למשך 60 שניות. בכל הניסויים נעשה שימוש בחברים של WT ו-Clr-f −/−, אלא אם צוין אחרת.

הכלאה באתרו.

ניתוח הכלאה באתרו של Clr-f הושגו על ידי שיבוט גדיל החישה באורך מלא CDS וגדיל אנטי-סנס המתפרש על Clr-f לתוך וקטור pGEM-T Easy כפי שתואר קודם לכן. בדיקות אנטי-סנס ו-Sense RNA המסומנות ב- Digoxi גנין תועתקו מפלסמידים ליניאריים המקודדים את הגן Clr-f עם T7 פולימראז באמצעות תערובת תיוג DIG RNA (Roche, Basel, שוויץ). רקמות נאספו מעכברי B6 בוגרים ותוקנו ב-10% פורמלין ב-RT או ב-4% פרפורמלדהיד ב-4 מעלות עם ניעור עדין למשך עד 24 שעות. לאחר מכן הוטבעו רקמות בפרפין וחתכים של 4 מיקרומטר הוכנו על שקופיות זכוכית. שקופיות רקמות הופקו על ידי טיפול ב-0.2 N HCl למשך 15 דקות ו-30 מיקרוגרם/מ"ל של proteinase K ב-37 מעלות למשך 20 דקות. רקמה נקבעה ב-4% PFA למשך 10 דקות ולאחר מכן טיפול עם 0.25% אנהידריד אצטית ב-0.1 M triethanolamine פעמיים למשך 5 דקות כל אחת. השקופיות עברו הכלאה מראש עם תמיסת הכלאה (50% (v/v) פורמאמיד/5×SSC, pH 4.5; 2% (w/v) אבקת חסימה (Roche); 0.05% (w/v) CHAPS; 5 mM EDTA; 50 מיקרוגרם/מ"ל הפרין; 1 מיקרוגרם/מ"ל RNA שמרים) בתנור של 58 מעלות למשך שעה אחת לפחות, ולאחר מכן דגירה עם תמיסת הכלאה המכילה 500 ng/mL בדיקה מסומנת דיגוקסיגנין למשך הלילה בטמפרטורה של 58 מעלות. שטיפות שלאחר הכלאה בוצעו עם 50% פורמאמיד/2× SSC, pH 4.5 ב-55 מעלות 3× למשך 20 דקות כל אחת, ושקופיות נצבעו בנוגדנים מצומדים נגד דיגוקסיגנין אלקליין פוספטאז כבשים בדילול 1:1000 בתמיסה חוסמת ( רוש). פיתוח הצבע בוצע על ידי הוספת מצעים של nitro blue tetrazolium/5-Bromo, 4-chloro ו-3-indoylphosphate (NBT/BCIP, Roche) לשקופיות. השקופיות נשמרו בחושך ב-RT עד שהופיעו אותות אופטימליים. תיוג הבקרה בוצע באמצעות בדיקה של גדיל חוש ומחקרי קישור תחרותיים עם בדיקה של חוש ואנטיסנס מאומתים ספציפיות. השקופיות נצבעו אז בירוק בהיר או ירוק מתיל והוצגו תחת מיקרוסקופ אור.

RT-PCR. רקמות כליה מעכברי WT ו-Clr-f −/− התואמים גיל ומין נכרתו, נשטפו עם PBS והוקפאו בדרגה -80. RNA בודד מרקמות קפואות באמצעות ריאגנט למיצוי RNA RiboZol (AMRESCO Inc., West Chester, PA, ארה"ב) בהתאם להוראות היצרן. כ-1 ug של RNA הועתקו ל-cDNA באמצעות ערכת Verso cDNA (Thermo Scientific, Waltham, MA, ארה"ב). הגברה של PCR בוצעה על 1 μL של מוצר cDNA באמצעות פריימרים ספציפיים (טבלה 1). תנאי ה-PCR היו 94 מעלות למשך 30 שניות, 58 מעלות למשך 30 שניות, 72 מעלות למשך 60 שניות ו-35 מחזורי הגברה. מוצרי PCR הוצגו על גבי ג'ל agarose 1% מוכתם באתידיום ברומיד (איור 1C, איור S3A).

אימונוהיסטוכימיה.

רקמות כליה של עכברי WT ו-Clr-f −/− תואמות גיל ומין טופלו על ידי שלוש דגירות של 5 דקות בקסילן, שתי דגירות של 5 דקות ב-100}% אתנול, ואחריהן 90 % אתנול, לאחר מכן 80% אתנול, ולבסוף 70% אתנול. השקופיות הוזלו מחדש על ידי שטיפה במים מזוקקים (20 מטבלים), והחזרת אפיטופים המושרים בחום בוצעה באמצעות סיר לחץ במאגר ציטראט (pH 6.0). פרוקסידאזים אנדוגניים נחסמו עם 3% מי חמצן במים סטריליים למשך 10 דקות, וחלבונים נחסמו באמצעות Background Sniper (Biocare Medical, Pacheco, CA, ארה"ב). לאחר מכן הודגרו קטעים עם נוגדנים חד שבטיים נגד עכבר נגד עכבר נגד Clr-f7 ב-4 מעלות למשך הלילה. למחרת, השקופיות נשטפו עם 0.1 M PBS והודגרו למשך שעה אחת בנוגדנים משניים. הצביעה פותחה באמצעות ערכת HRP-פולימר עז על מכרסם (Biocare Medical) ו- Betazoid DAB Bufer (Biocare Medical), ולאחר מכן צביעה נגדית המטוקסילין. אותו תהליך שימש לצביעה של קטע רקמת כליה לסימון IHC של תאי NKp46+ ו-CD3+, באמצעות אנטי-NKp46 (eBioscience, Santa Clara, CA, USA, Clone 29A1.4, CAT# 48-3351-82) ואנטי-CD3 (BioLegend CAT#100,327) בהתאמה כנוגדנים ראשוניים. סימון IHC של F4/80 בוצע על קטעי כליה קפואים באמצעות נוגדן חד שבטי BM8 אנטי-F4/80 של חולדה. נעשה שימוש בנוגדן משני מצומד של IgG H&L HRP של עיזים נגד חולדות (Abcam, Cambridge, UK CAT#ab97057) כמפורט לעיל ופותחו IHCs עם מצע פרוקסידאז חזרת (HRP) שימש ערכת מצע DAB (Abcam, CAT# ab64238).

אימונופלואורסצנטי.

רקמות הכליות ו/או המעי של עכברי WT ו-Clr-f −/− התואמים גיל ומין נשמרו ב-30% סוכרוז ב-80 מעלות בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית של Tissue-Tek (Fisher Scientific, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב). קטעי קריוסטט בגודל 20 מיקרומטר נקבעו עם אצטון במנדף בטמפרטורת החדר למשך 16 דקות ויובשו באוויר לפחות 30 דקות, לאחר כביסה ב-0.01 M PBS, pH 7.4. קישור לא ספציפי נחסם עם 10% סרום חמור. קטעים הודגרו למשך הלילה ב-4 מעלות עם הנוגדנים העיקריים: אנטי-Clr-f7, אנטי-NKR-P1G (נוגדן חד שבטי אנטי עכבר שתואר בעבר7), אנטי-IgA (שרשרת אלפא של עז נגד עכבר (Abcam, Cambridge) , UK CAT#ab97235), anti-IgG-PE (BioLegend, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב CAT#405324, anti-IgM-FITC (Life Technologies, Carlsbad, CA, ארה"ב CAT#A21042), Complement C3 Anti body (11H9 ) (Novus Biologicals, Littleton, CO, ארה"ב Cat# NB200-540), anti-IFN -PE (BD-Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA CAT#554411), anti-IL-12-PE (BD-Pharmingen CAT# 554479), אנטי-CD45-FITC (BioLegend CAT#103108), אנטי-CD11c-FITC (eBioscience CAT#11-0114-85), אנטי-F4/80- APC (BioLegend CAT#123116), ו-anti-NKp46-eFluor 450 (eBioscience, CAT#48-3351-82) בריכוז 1:100 בסרום תקין של 5% בתא לח. סימון נוגדנים משני של אנטי נוגדנים Clr-f ו-anti-NKR-P1G באמצעות נוגדנים פוליקלונליים מצומדים FITC בוצעו ב-RT למשך דגירה של שעה. הדגימות נצבעו ב-DAPI גרעינית ב-RT למשך 5 דקות, נשטפו ב-PBS והותקנו על שקופיות זכוכית עם טיפה אחת של VECTASHIELD PLUS חומרי הרכבה נגד דהייה (Vector Laboratories, סן פרנסיסקו, קליפורניה, ארה"ב) ומכוסה בכיסוי זכוכית. השקופיות נבדקו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי סריקת לייזר Zeiss LSM 510.

ניקוד היסטולוגיה ופתולוגיה.

קטעי כליה של עכברי WT, Clr-f −/−, Rag1−/− ו-Rag1−/−Clr-f −/− (3 מיקרומטר) תואמי WT, Clr-f −/−, ו-Rag1−/−Clr-f −/− (3 מיקרומטר) נצבעו Periodic acid-Schif (PAS). רקמת הכליה הוערכה עבור תאיות מסנגיאלית (מוגדרת כ-4 גרעינים או יותר לכל אזור mesangial), ריבוי אנדוקפילרי, סהרונים וטרשת גלומרולרית. הקטעים הוערכו גם עבור נוכחות של טובולופתיה, פיברוזיס בין-סטיציאלי, ניוון צינורי וחדירת תאי tubulointerstitial. עבור ניקוד פתולוגיה גלומרולי נעשה שימוש בציון חצי כמותי כדי להעריך את מידת הנזק הגלומרולרי. לפחות 50 גלומרולים בכל קבוצה נבדקו וחומרת הנגע דורגה מ-0 ל-+3: נגע+1 מייצג מעורבות של פחות מ- או שווה ל-30% של הגלומרולוס,+2 של 30-60%, בעוד שנגע+3 הצביע על מעורבות גדולה או שווה ל-60% מהגלומרולוס. מדידת עובי GBM בוצעה על מיקרוסקופ אלקטרונים גלומרולרי של WT ו-Clr-f -/- באמצעות תמונה J V1.53a47. רקמת כליה צבועה ב-PAS משני עכברי Rag1−/− ושני Rag1−/−Clr-f −/− קיבלה ניקוד עיוור נוסף על נוכחות המאפיינים הפתולוגיים לעיל, והמאפיינים המכומתים חושבו מארבעת קטעי הכליה הממוצעים לכל עכבר.

אלקטרון מיקרוסקופי.

עיבוד רקמות עבור מיקרוסקופ אלקטרונים העברה פעל לפי הפרוטוקול שפורסם48. בקצרה, חתיכות קטנות של רקמות כליה מעכברי WT ו-Clr-f −/− בני שבוע 12- נקבעו בתמיסת גלוטאראלדהיד של 2.5% ולאחר מכן עובדו בשיטת 1% אוסמיום טטרוקסיד/אורניל אצטט. דגימות הוטבעו בשרף Epon Araldite לפני החיתוך באמצעות רייכרט-יונג אולטרה-מיקרוטום E. דגימות הוצגו על גבי מיקרוסקופ אלקטרוני תמסורת JEOL JEM 1230 ותמונות נלכדו באמצעות מצלמה דיגיטלית של Hamamatsu ORCA-HR.

שתן ופלזמה פסולת כימית ומדידות אלקטרוליטים.

כ-150 μL של שתן נאספו מדי יום מעכברי WT ו-Clr-f −/− זכרים בני שבוע 12- באותו הזמן של היום במשך 5 ימים רצופים. השתן עבר צנטריפוגה ב-10,000 סל"ד כדי להסיר פסולת ולאחר מכן אוחסן ב-80 מעלות. דם וריד הפנים נאסף מאותם עכברים בצינורות שעברו הפרין ובודד באמצעות צנטריפוגה ב-3000g למשך 5 דקות ואוחסן ב-80 מעלות. דגימות שתן ופלזמה נשלחו למעבדות Idexx (Markham, אונטריו) למדידת ריכוז חלבון, קריאטינין ואלקטרוליטים.

מדידות לחץ דם בעכברים בני 12 ו-24 שבועות. לחץ דם סיסטולי ודיאסטולי (BPs) נמדדו על ידי plethysmography של tail-cuff בעכברי WT ו-Clr-f −/− זכרים בני 12 ו-24- שבועות במצב יציב באמצעות מודל BP2000 Visitech. לחץ הדם נמדד מדי יום באותו חדר ובאותה שעה ביום במשך 5 ימים רצופים. ערכי BP של 3 המדידות האחרונות ברציפות שימשו כדי לחשב את ערך ה-BP הממוצע שכן 2 הימים הראשונים נחשבו חיוניים להסתגלות לעכברים.

Kidney RNA sequencing. For kidney RNA-seq, total RNA was isolated from freshly frozen kidneys of three age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice at 7, 13, and 24 weeks of age using TRIzol (Thermo Fisher Scientific) and RNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). RNA samples were sent to Genome Quebec Innovation Centre, McGill University, Montreal, QC for library preparation and RNA-seq. RNA-seq was performed on the Illumina HiSeq 4000 platform, with paired-end reads, at>עומק קריאה של 30×106 לכל דוגמה.

RNA‑seq analysis. Te quality of the sequencing reads was inspected using FastQC tool V0.11.5 (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) and reads with a Phred quality score of 30 over 90% of the reads were retained utilizing the Fastx-toolkit V0.0.13 (http://hannonlab.cshl.edu/). Next, the high-quality reads were mapped to the mouse GENCODE M25 annotation database (GRCm38.p6)49 using the STAR aligner V2.7.5a50. STAR aligner was then used to remove duplicates, create transcriptome hits count tables, and generate wiggle fles. Subsequently, DESeq2 package V1.28.151 was used to remove hits with CPM values less than 1 and calculate differentially expressed genes with FDR-transformed P-value>{{0}}.05 וחיתוך שינוי קיפול יומן של 1.5. ערכי FPKM עבור כל נקודות הזמן והדגימות מסופקים (קובץ נתונים משלים 1). ניתוח העשרה פונקציונלית. אונטולוגיה של גנים וניתוח העשרה תפקודית בוצעה באמצעות g: Profiler (גרסה e102_eg49_p15_7a9b4d6) עם g: SCS שיטת תיקון בדיקות מרובה המיישמת סף מובהקות של 0.05 (https: //biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost) 52 ומערכת הסיווג PANTHER עם בדיקת פישר מדוייקת וסף FDR של<0.05 (http://pantherdb.org/citePanther.jsp) 53. 

רשתות העשרה פונקציונליות נוצרו באמצעות ערכות גנים של GO Biological Processes (GO: BP) עבור Mus Musculus (GRCm38. p6) שחרור BioMart: 2020-12-08 הורד מ-g: Profiler (https://biit.cs.ut.ee /gprofiler/gost). ניתוח מערך גנים (GSEA) בוצע באמצעות GSEA V4.0354,55 באמצעות העשרה ברשת המבוססת על FDR<0.05. Networks were assembled, curated, and visualized using Cytoscape V3.7.156. Heatmaps were generated and clustered by Euclidian distance using Morpheus (https://sofware.broadinstitute.org/morpheus).

ניתוח שומנים בטן וחוץ רחמי. הצטברות השומן נקבעה לפי משקל השומן הבטני שמנותח מעכברים בודדים. מדידות משקל הגוף נלקחו לפני מיצוי שומן. עבור צביעת Oil Red O (ORO), חלקי כליה קפואים נחתכו ב-10 מיקרומטר באמצעות קריוסטט ולאחר מכן ייבוש באוויר למשך 30 דקות. צביעת ORO בוצעה על ידי קיבוע החתכים עם 3 שטיפות של 60% איזופרופנול, הדגירה שלהם עם ריכוז עבודה (66%) של תמיסת ORO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב) צביעה למשך 15 דקות. השקופיות נשטפו במהירות עם 60% איזופרופנול, נצבעו במהירות בהמטוקסילין של מאייר כדי להדגיש גרעינים, ולאחר מכן הותקנו באמצעות VectaMount AQ Aqueous Monting Media (Vector Laboratories).

ניתוח פתוטיפוס. ניתוח פתוטייפ בוצע באמצעות גנים מפורשים (DEGs) עם q<0.05 identified from RNA-seq of WT and Clr-f −/− 13-week-old mouse kidneys. Signifcant Clr-f −/− DEGs with identifiable ENSEMBL human orthologs were compared with DEGs of 15 human kidney disease expression sets (disease versus healthy kidney)57–64 downloaded from Nephroseq database at (http://www.nephroseq.org) (Supplementary Dataset File 2)65. Clr-f −/− mouse and human kidney disease DEG sets were hierarchically clustered by Euclidean distance and graphed in a similarity matrix using the Morpheus software (https://sofware.broad institute.org/morpheus). Functional enrichment using g: Profler, (using parameters described above) was performed on four groups of expression clusters with corresponding increased and decreased DEGs and non-corresponding DEGs from the compared expression profiles of Clr-f −/− and IgA nephropathy (IgAN) kidney disease. Flow cytometry. Kidneys from age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice were harvested, homogenized in a Petri dish on ice with RPMI media containing collagenase type 4 (2 mg/mL) (Fisher), and incubated at 37 °C for 30 min with gentle agitation. 

רקמה מעוכלת הועברה דרך מסנן ניילון 70-מיקרומטר, PBS נשטפה, והתאים האדומים הנותרים חולקו עם חיץ ליזה ACK למשך 5 דקות על קרח. תאי מערכת החיסון של הכליה בודדו על ידי צנטריפוגה RT ב-2000 סל"ד למשך 30 דקות ב-40% Percoll. גלולת התאים הושעתה מחדש ב-PBS וספירת תאים התקבלה על ידי המוציטומטר. נעשה שימוש ב-mAbs שונים לאימות ביטוי חלבון משטח התא, תאים נצבעו לצורך ניתוח ציטומטריית עוף בנוגדנים של עכבר עם תווית פלואורכרום: אנטי-CD45 (eBioscience, שיבוט 30-F11), אנטי-TCR (eBioscience, clone H{ {12}}), אנטי-NK1.1 (eBioscience, שיבוט PK136), אנטי-CD19 (BioLegend, שיבוט 1D3/CD19), אנטי-CD11b (BioLegend, שיבוט M1/70), אנטי-F4/80 (BioLegend, שיבוט BM8), אנטי-MHCII(IA/IE) (BioLegend, שיבוט M5/114.15.2), אנטי-Ly6G (BioLegend, שיבוט 1A8), אנטי-NKp46 (eBioscience, שיבוט 29A1.4) ובקרות איזוטיפ. כדאיות התא נקבעה באמצעות צבען Viability Fix שניתן לתקן (eBioscience, Cat# 65-0865-14). כדי לזהות ולכמת אוכלוסיות של תאים חיסוניים בכליות WT ו-Clr-f −/−, נעשה שימוש בניתוח ציטומטריית עוף רב-פרמטרי באמצעות נוגדנים כנגד סמנים ספציפיים לתא לזיהוי נויטרופילים (CD11b+Ly6G+), מקרופאגים (CD11b+Ly6G-F4/{ {57}}MHCII+), תאי NK (CD11bloLy6G−TCR −NK1.1+), ותאי NKp46+ (CD11bloLy6G−TCR −NKp46+), תאי T (Ly6G−NK1 .1−TCR +) ותאי B (CD11b−Ly6G−TCR −CD19+). כל הדגימות נרכשו על ציטומטר פוף BD-Fortessa.

הפניות

1. Hato, T. & Dagher, PC כיצד מערכת החיסון המולדת חשה בצרות וגורמת לצרות.קלינ. ריבה. Soc. נפרול.10, 1459–1469 (2015).

2. קרוגר, ט.et al.זיהוי ואפיון פונקציונלי של תאים דנדריטים בכליה בריאה של העכבר ובניסויגלומרולונפריטיס.ריבה. Soc. נפרול.15, 613–621 (2004). 

3. Weisheit, CK, Engel, DR & Kurts, C. תאים דנדריטים ומקרופאגים: זקיפים בכליה.קלינ. ריבה. Soc. נפרול.10, 1841–1851 (2015).

4. וולטמן, AMet al.כימות של תת-קבוצות של תאים דנדריטים ברקמת כליה אנושית בתנאים נורמליים ופתולוגיים.כליות אינט.71, 1001–1008 (2007). 5. גוטשלק, סי.et al.תאים דנדריטים תלויי Batf3- בבלוטת הלימפה הכלייתית גורמים לסובלנות נגד אנטיגנים במחזור.ריבה.Soc. נפרול.24, 543–549 (2013).

6. ג'אנג, ש.et al.Mouse Nkrp1-ניתוחי רצף וביטוי של אשכול גנים Clr חושפים שימור של MHC ספציפי לרקמותמעקב חיסוני עצמאי.PLoS ONE7, e50561 (2012).

7. לייבלט, ש.et al.חיסון ייעודי של אפיתל המעי של העכבר בהקלה על ידי זוג דמויי לקטינים מחוברים גנטיתקולטנים.רירית אימונול.

8, 232–242 (2015). 8. רחים, MMAet al.העכבר NKR-P1B: מערכת זיהוי Clr-b היא מווסת שלילי של תגובות חיסון מולדות.דָם125, 2217–2227 (2015). 

9. Carlyle, JRet al.חסר זיהוי עצמי של Ocil/Clr-b על ידי קולטני תאי רוצח טבעיים מעכבים של NKR-P1.פרוק. נאטל. אקד. Sci.U.S.A. 101, 3527–3532 (2004). 

10. רוטקובסקי, א.et al.Clr-a: מולקולה דמוית לקטין מסוג C חדשה הקשורה למערכת החיסון המתבטאת באופן בלעדי על ידי אפיתל מעי עכבר.J. אימונול.198, 916–926 (2017).

11. Balaji, GRet al.זיהוי של המארח Clr-b על ידי הקולטן המעכב NKR-P1B מספק בסיס לזיהוי חסר עצמי.נאט.Commun.9, 4623 (2018)

12. Friede, ME, Leibelt, S., Dudziak, D. & Steinle, A. Select ביטוי Clr-g על תאים דנדריטים פעילים מקל על אינטראקציה קוגנטיתעם תת-קבוצה מינורית של תאי NK בטחול המבטאים את הקולטן המעכב Nkrp1g.J. Immunol.200, 983–996 (2018). 

13. אבו-סמרה, א.et al.ביטוי NKR-P1B בתאי לימפה מולדים הקשורים במעיים נדרש לשליטה על מערכת העיכולזיהומים בדרכי הדם.תָא. מול. אימונול.16, 868–877 (2019).

14. ז'רמן, סי.et al.אפיון של גרסאות תמליל שחבורות לחלופין של הגן CLEC2D.ג'יי ביול. Chem.285, 36207–36215 (2010).

השירות התומך של Wecistanche - יצואנית ה-cistanche הגדולה בסין:

דוא"ל:wallence.suen@wecistanche.com

ווטסאפ/טלפון:+86 15292862950

קנה לפרטי מפרטים נוספים:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

קבל תמצית CISTANCHE אורגנית טבעית עם 25% אכינאקוסיד ו-9% אקטוזיד לזיהום בכליות