שיבוט, זיהוי פונקציונלי וניתוח ביטוי של סינתז צ'לקון מ-Cistanche Tubulosa Ⅱ
Mar 25, 2024
3 תוצאות וניתוח
3.1 שיבוט של גן CtCHS
ארבעה רצפים שהובאו כ"כלקון סינתאז" עברו סינון באמצעות נתוני התעתיק של פרחי Cistanches tubulosa. באמצעות השוואת Blast של NCBI, נמצא שרק רצף אחד היה באורך מלא של הגן CHS ובעל FPKM גדול מ-10. פרימרים ספציפיים תוכננו על סמך רצף זה, ומקטע של כ-1200 bp התקבל על ידי הגברה של PCR באמצעות Cistanches tubulosa flower cDNA כתבנית (איור 1). תוצר ה-PCR שוחזר בג'ל וחובר לווקטור pCE2TA/Blunt-Zero. תוצאות הרצף היו עקביות עם ניתוח ה-transcriptome. הגן נקרא CtCHS. אורך הרצף הוא 1173 bp ומקודד 390 חומצות אמינו.
השירות התומך של Wecistanche - יצואנית ה-cistanche הגדולה בסין:
דוא"ל:wallence.suen@wecistanche.com
ווטסאפ/טלפון:+86 15292862950
קנה לפרטי מפרטים נוספים:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
3.2 ניתוח ביואינפורמטיקה של CtCHS
3.2.1 תכונות פיסיקליות וכימיות של CtCHS וניתוח תחום טרנסממברני
התוכנה המקוונת ProtParam שימשה לניתוח התכונות הפיזיקליות והכימיות של החלבון המקודד על ידי הגן CtCHS. CtCHS מקודדת 390 חומצות אמינו, הנוסחה המולקולרית היא C1908H3041N511O562S22, המסה המולקולרית היחסית היא 42 836.54, הנקודה האיזואלקטרית התיאורטית היא 5.85, והיא לא יציבה. מקדם II הוא 43.24, שהוא חלבון לא יציב, וההידרופיליות הממוצעת הכוללת (GRAVY) היא -0.052, שהוא חלבון הידרופילי. הכלי המקוון Prot Scale שימש עוד כדי לנתח את ההידרופיליות/הידרופוביות של החלבון. תוצאות הניתוח הראו שהערך המקסימלי של הידרופיליות/הידרופוביות של חלבון CtCHS היה 2.422 (342) והערך המינימלי היה -2.489 (119). בשרשרת הפפטידים של חומצת האמינו המקודדת על ידי הגן CtCHS יש יותר שאריות חומצות אמינו הידרופיליות מאשר שאריות חומצות אמינו הידרופוביות, ולכן מדובר בחלבון הידרופילי. התוכנה המקוונת TMHMM שימשה כדי לחזות את המבנה הטרנסממברני של החלבון. לחלבון CtCHS אין תחום טרנסממברני.
איור 1 הגברה של PCR של גן CtCHS
3.2.2 חיזוי מבנה משני ומבנה שלישוני של חלבון CtCHS
הכלי המקוון SOPMA שימש כדי לחזות את המבנה המשני של החלבון. התוצאות מוצגות באיור 2-א. 44.87% -סלילים, 31.03% סלילים אקראיים, 15.64% שרשרות מורחבות ו-8.46% -גליונות מהווים את המבנה המשני של חלבון CtCHS. מבנה מפלס. תוכנת הניתוח המקוונת SWISS-MODEL שימשה לניבוי המבנה השלישוני של החלבון, ומבנה הגביש של אורז CHS1 שימש כתבנית לניבוי המבנה התלת מימדי של חלבון CtCHS. התוצאות מוצגות באיור 2-ב. העקביות בין Cistanche tubulosa CtCHS לאורז CHS1 היא 83.55%.
3.2.3 השוואת רצפים וניתוח ויישום עצים פילוגנטיים
תוכנת DNAMAN מבצעת השוואה הומולוגית בין CtCHS לרצפי חומצות האמינו CHS של מינים אחרים. התוצאות מוצגות באיור 3-ג. רצף חומצות האמינו CtCHS עולה בקנה אחד עם Sesamum indicum L. (XP_011091402.1) ו- Antirrhinum majus L. (P06515. 1), Mazus pumilus (NL Burman)Steenis (AAN05791.1), Erythranthe lewisiiG. L. Nesom & NS Fraga (AHJ80976.1), Perilla frutescens (L.) Britton (O04111.1 ) ו- Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (NP_196897.1). רצפי חומצות האמינו של CHS דומים מאוד, כאשר הדמיון הוא 90.93%, 90.68%, 90.18%, 89.42%, 89.42% ו-81.61%.
תמצית CISTANCHE אורגנית טבעית עם 30% אכינאקוסיד ו-12% אקטוזיד
בנוסף, יישור רצף מרובה גם הראה ש-CtCHS שימר שיירים קטליטיים Cys164, His303 ו-Asn336. על מנת להבין יותר את המיקום האבולוציוני של Cistanche tubulosa CtCHS במשפחת הצמחים CHS, תוכנת MEGA-X שימשה לבניית עץ פילוגנטי בין חלבוני CtCHS ו-CHS של צמחים אחרים. התוצאות מוצגות באיור 3-DE lewisii AHJ80976.1) ElCHS קשורה קשר הדוק.
3.3 CtCHS ביטוי וטיהור פרוקריוטי
הפלסמיד pET-28a-CtCHS עבר טרנספורמציה לזן ביטוי E. coli BL21 (DE3), וביטוי חלבון הושרה על ידי IPTG בטמפרטורה נמוכה. החלבון טוהר באמצעות עמודת כרומטוגרפיה זיקה ליוני ניקל, והחלבון המטוהר זוהה על ידי 10% SDSPAGE. התוצאות מוצגות באיור 3. פס החלבון CtCHS הופיע ליד 40,000, מה שעולה בקנה אחד עם המסה המולקולרית היחסית של חלבון CtCHS של 42,800.
3.4 ניתוח פעילות האנזים CtCHS
כדי לזהות את הפונקציה של CtCHS, חלבון CtCHS המטוהר הודגר עם malonyl-CoA, 4-coumaroyl-CoA והמוצרים זוהו באמצעות HPLC ו-MS. בתנאים טבעיים, נרינגנין-כלקון אינו יציב בתמיסה והופך בקלות ל-naringenin. לכן, naringenin-chalcone ו-naringenin נבחרו כבקרות סטנדרטיות.
תוצאות בדיקת HPLC מוצגות באיור 4-A ו-B. זמן השמירה של תוצר התגובה האנזים דומה לזה של תקן naringenin. לשניהם ספיגה מקסימלית ב-289 ננומטר בספקטרום ספיגת ה-UV, השונה מזמן השמירה של נרינגנין-כלקון. ספקטרום ספיגת הזמן ו-UV היו שונים, אך כביקורת שלילית, התוצר לאחר הדגירה של חלבון ה-CtCHS המומת בטמפרטורה גבוהה עם המצע לא הכיל נרינגנין, צ'לקון ונרינגנין. גילוי נוסף באמצעות ספקטרומטריית מסה, ספקטרום המסה ברמה הראשונה (איור 4-C, D) הראה שלתוצר התגובה האנזים יש [MH]-peak m/z271.060 97, בעוד שלנרינגן יש [MH] ]-peak m/z 271.060 91.
בהשוואה בין הספקטרום של MS2 (איור 5-E, F), לתוצר התגובה של האנזים CtCHS ול-naringenin יש פסגות של קטעים אופייניים ב-m/z 107, 151 ו-177, מה שעולה בקנה אחד עם דוח הספרות [19], מה שמצביע על כך של-CtCHS יש קומפלקס צ'לקון. פעילות אנזימטית, היא יכולה לזרז את התגובה של malonyl-CoA ו-4-coumaroyl-CoA ל-naringenin-chalcone.
3.5 ניתוח לוקליזציה תת-תאית
על מנת לחקור את התפקיד של חלבון CtCHS בתאים, הפלסמיד pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS נבנה והומר לפרוטופלסטים של Arabidopsis thaliana כדי לראות את הלוקליזציה התת-תאית שלו. התוצאות מוצגות באיור 5. כביקורת, החלבון pCAMBIA1300-35S-GFP הופץ בגרעין ובציטופלזמה, בעוד שחלבון ההיתוך pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS הופץ בעיקר ב הציטופלזמה, המצביע על כך שחלבון CtCHS עשוי לתפקד בציטופלזמה של תאי צמחים. פוּנקצִיָה.
3.6 ניתוח דפוסי ביטוי CtCHS
qRT-PCR שימש לזיהוי הביטוי היחסי של CtCHS בפרחי Cistanche deserticola עם שלושה צבעים: לבן, סגול ואדום. התוצאות מוצגות באיור 6. הביטוי של CtCHS בפרחים סגולים ואדומים היה גבוה משמעותית מזה שבפרחים לבנים. כַּמוּת. בהשוואה לפרחים לבנים, רמת הביטוי של CtCHS בפרחים סגולים גבוהה פי 8.44, ורמת הביטוי של CtCHS בפרחים אדומים גבוהה פי 3.21. תוצאות אלו מצביעות על כך ששינויים ברמות ביטוי CtCHS עשויים להיות קשורים להבדל בצבע הפרח של Cistanche deserticola. ככל שרמת ההבעה גבוהה יותר, צבע הפרח כהה יותר. , ככל שרמת ההבעה נמוכה יותר, צבע הפרח בהיר יותר.
****P＜0.000 1איור. 6 רמת ביטוי יחסית של CtCHS בפרחים עם צבעים שונים
4 דיון
CHS הוא אאנזים מפתח במסלול הביוסינתטי של הפלבנואידיםוהוא קשור ל-thהסדרת צבע הפרחיםבצמחים רבים. לדוגמה, צבע הפרח שלDianthus chinensisל.[20] ופטוניה × hybrida Hort. exVilm.[22] כולם מושפעים מ-CHS. לִשְׁלוֹט.Cistanches tubulosaיש בעיקר שלושה צבעי פרחים: לבן, אדום וסגול, אך עדיין לא דווח על מנגנון ויסות צבע הפרח שלו. במחקר זה, גן CtCHS שובט באמצעות RT-PCR throughניתוח נתוני transcriptome של פרחי Cistanches tubulosa, ושלו
ניתוח ביואינפורמטיקהנערך, והתוצאות הראו של-CtCHS יש דמיון גבוה וקשר גנטי הדוק עם רצף חומצות האמינו של ElCHS של Physalis nigra (AHJ80976.1). CHS הוא סוג III polyketide synthase (PKSIII), ומחקרים מצאו של-CHS יש טריאדה קטלטית Cys-His-Asn משומרת [23]. במחקר זה, ניתוח יישור רצף חומצות אמינו הראה ש-CtCHS שימר שיירים קטליטיים Cys164, His303 ו-Asn336, מה שמצביע על כך של-CtCHS עשוי להיות פונקציה טיפוסית של כלקון סינתאז.
יכול. ניתוח פעילות האנזים בוצע באמצעות ביטוי פרוקריוטי של חלבון CtCHS ב-Escherichia coli וזוהה על ידי HPLC ו-MS. נמצא שחלבון CtCHS יכול לזרז 4-קומארויל-CoA ומלוניל-CoA לייצור נרינגנין-כלקון.
CHS מעורב בסינתזה של פלבנואידים בצמחים רבים, אך מיקומו התת-תאי שונה במינים שונים. לדוגמה, Carthamus tinctorius L. CtCHS1[24], Morus atropurpurea Roxb. MaCHS[25], Eupatorium adenophorum Spreng. כל אחד [26] נמצא בציטופלזמה, בעוד Paeonia delavayi var. lutea (Delavay ex Franch.) Finet et Gagnep. PdCHS
[27], חציל Solanum melongena L. SmCHS [28] נמצא בציטופלזמה ובגרעין, ובענב Vitis vinifera L. VvCHS ממוקם בציטופלזמה, בגרעין ובדופן התא [29]. במחקר זה, נעשה שימוש בפלסמיד pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS להפיכת פרוטופלסטים של Arabidopsis thaliana ונצפה שחלבון CtCHS היה מקומי בעיקר בציטופלזמה, ועשוי לזרז את הייצור של naringenin-chalcone בציטופלזמה כדי לקדם הצטברות של פלבנואידים.
מסלול הפניל-פרופנואידים מסתעף מ-4-coumaroyl-CoA למסלול סינתזת הפלבנואידים ולמסלול הביוסינתזה של ליגנן. CHS מזרז את 4-קומארויל-CoA ומלוניל-CoA כדי ליצור נרינגין ו-chalcone כדי ליזום פלבנואידים. המסלול הביוסינתטי של תרכובות דמויות תרכובות הוא האנזים המפתח הראשון במסלול זה [30]. לכן, CHS בעל ביטוי גבוה מועיל לצמחים לצבור רמות גבוהות יותר של פלבנואידים ולייצר פרחים כהים יותר. לדוגמה, רמת הביטוי של CHS בזני פרחים סגולים של Hosta plantaginea (Lam.) Aschers גבוהה מזו של זנים פרחים לבנים. Hosta HpCHS הופך לטבק להשגה בהשוואה לטבק מסוג בר, לצמחי ביטוי יתר יש עלי כותרת כהים יותר ותכולת אנתוציאנין כוללת גבוהה יותר [31].
במחקר זה, רמת הביטוי של הגן CtCHS קשורה לצבע של פרחי Cistanches tubulosa. הוא מתבטא מאוד בפרחים סגולים כהים יותר ופרחים אדומים, והוא נמוך בפרחים לבנים בהירים. ההבדל בביטוי של CtCHS עשוי לנבוע מההבדל בפרחי Cistanches tubulosa. אחת הסיבות לבעלות חליפות וצבעים שונים. לסיכום, מחקר זה שיבט גן CtCHS מפרחי Cistanche deserticola וערך עליו ניתוח ביואינפורמטיקה. החלבון הרקומביננטי CtCHS הושג על ידי ביטוי אקסוגני ב-Escherichia coli. ניתוח פעילות האנזים הוכיח שחלבון CtCHS יכול לזרז 4-קו-אנזים קומארויל. A ומלוניל-קואנזים A יוצרים נרינגין-כלקון. נמצא שהגן CtCHS מתבטא מאוד בפרחים סגולים ואדומים ודל בפרחים לבנים. תוצאות אלו מצביעות על כך שהגן CtCHS עשוי לווסת את הייצור של צבעי פרחים שונים ב-Cistanche deserticola, מה שמועיל למחקר נוסף על מנגנון הוויסות של צבע פרחי Cistanche tubulosa ומספק התייחסות למחקרים הבאים על תפקידו של CtCHS בוויסות של צבע פרח ב- Cistanche deserticola.
