שמנים אתריים המכילים סיטרל כמעכבי טירוזינאז פוטנציאליים: גישת חלוקה מודרכת ביו

איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com

תַקצִיר:

ייצור מופרז של מלנין גורם למצבים דרמטולוגיים חמורים וכן לבעיות אסתטיות מינוריות (כלומר, נמשים ולנטיגו סולארית). הורדת הוויסות של טירוזינאז היא גישה רווחת לטיפול בהפרעות כאלה, ותמציות צמחים הוכחו לעתים קרובות כמקורות יקרי ערך שלטירוזינאזמעכבים. ציטרל (תערובת של נרל וגרניאל) הוא מרכיב ניחוח חשוב שהראה פוטנציאל אנטי טירוזינאז. הוא מרוכז מאוד בשמנים האתריים (EOs) של Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. ו- Verbenaofficinalis L. עם זאת, רק L. cubeba EO נחקר עבור להשתמש כחומר פוטנציאלי להלבנת עור. עבודה זו מעריכה את המבחנהטירוזינאזפעילות מעכבת של EOs ומחקרים אלה, תוך שימוש בחלוקה מונחה ביולוגית, בין אם ההרכבים הכימיים השונים שלהם משפיעים על פעילויות מעכבי ה-EO הכוללות באמצעות אינטראקציות סינרגטיות, תוספיות ו/או תחרותיות בין רכיבי EOs. הפעילות המעכבת של C. schoenanthus EO ושל M. officinalis EOs, עם כמויות זניחות (פלוס)-ציטרונליות, היו בקנה אחד עם התוכן הציטרלי שלהם. מצד שני, L. cubebaand V. officinalis EOs מעכביםטירוזינאזבמידה ניכרת יותר מכיוון שהם הכילו -מירסין, שתרם לפעילות ה-EO הכוללת. תצפיות דומות נעשו עבור M. officinalis EO, הנושא תכולת ציטרונלאלית גבוהה (פלוס) שהגבירה את פעילות הציטרלית.

מילות מפתח:טירוזינאזעַכָּבָּה; שמנים חיוניים; ציטרל

ל-cistanche יש תפקיד הלבנה

מבוא

טירוזינאזהוא האנזים המרכזי בביוסינתזה של פיגמנטים מלנין במספר חיידקים, פטריות, צמחים, בעלי חיים ובני אדם. בבני אדם, טירוזינאז מזרז את השלבים המגבילים את הקצב במסלול הביוסינתטי של המלנין. ביוסינתזה זו מאופיינת במספר תגובות אנזימטיות וכימיות המובילות להיווצרות מלנין מחומצת האמינו L-tyrosine, כאשר טירוזינאז מזרז את ההידרוקסילציה שלו ל-o-dopaquinone דרך פעילות המיקופנולט והדיפנולים. למרות שיש אנזימים אחרים המעורבים במלנוגנזה, רק התגובות המזוזות טירוזינאז אינן יכולות להתרחש באופן ספונטני, בעוד שהשלבים הנותרים יכולים להמשיך ללא פעילות אנזים ב-pH פיזיולוגי [1]. מסיבה זו, הורדת ויסות טירוזינאז היא גישה רווחת מאוד להפחתת עודף מלנין ייצור, והשימוש במעכבי טירוזינאז כחומרי הלבנת עור הוכיחו בולטות קלינית וקוסמטית משמעותית [2].

בשוק האיחוד האירופי, הטירוזינאזמעכבים המשמשים כחומרי הלבנת עור יכולים להיות מקובצים לשתי קטגוריות עיקריות: אלה האסורים על פי תקנה קוסמטית של האיחוד האירופי 1223/2009 (כלומר, הידרוקינון ומונו-בנזיל אתר הידרוקינון) בשל תופעות הלוואי החמורות שלהם, אך עדיין משמשים לטיפול בהיפרפיגמנטציה במסגרת רפואית פיקוח; ומעכבי טירוזינאז המותרים לשימוש במוצרי קוסמטיקה (כלומר, ארבוטין, אלוזין, חומצה קוג'ית) [2,3]. עם זאת, קבוצה שנייה זו עדיין מאופיינת בתופעות לוואי פוטנציאליות משמעותיות; מחקרים קליניים על חומצה קוג'ית אכן הדגישו מקרים של אריתמה, תחושות צריבה ואקזמה במגע לאחר היישום. באופן דומה, הוועדה המדעית האירופית לבטיחות צרכנים העלתה חששות בנוגע לשימוש בארבוטינה, מרכיב קוסמטי [2], בשל ההידרוליזה הפוטנציאלית של הקשר הגליקוזידי שלו המשחרר הידרוקינון. לכן יש צורך בתבניות ו/או תערובות של מולקולות חדשות של תרכובות ביו-אקטיביות לטיפול בהיפרפיגמנטציה.

צמחים היו מקורות יקרי ערך לחומרים להלבנת עור, ושלושה מתוך חמישה מהסוכנים המועסקים ביותר, הן מבחינה רפואית והן מבחינה קוסמטית, מטבוליטים צמחיים מיוחדים (כלומר, הידרוקינון, -ארבוטין, אלוזין). עד כה, תרכובות פנוליות נחקרו בעיקר כפוטנציאלטירוזינאזמעכבים, ואלה כוללים פלבנואידים (לדוגמה, קוורצטין [4]), סטילבנים (למשל, רסברטרול [1]), פניל-פרופנואידים (למשל, סינמלדהיד [5], ואוגנול [6]), וחומצות פנוליות (למשל, חומצה אניסית ו חומצה בנזואית [7]). העניין של ה-forterpenoids היה נמוך במידה ניכרת, והם לא נחקרו באופן יחסי כתרופות נוגדות טירוזינאז.

ציטרל הוא בין המספר המצומצם של נגזרות טרפנואיד עם תכונות נוגדות טירוזינאז שנחקרו. זוהי תערובת של שני איזומרים, cis-ו-trans-3,7-dimethyl-2,6-octadienal (כלומר, neral ו-gernial), אשר הוכחו כחוסמים הפעילות האנזימטית במבחנה של פטריותטירוזינאז[8]. בנוסף לחשיבותו כמרכיב ריח של משקאות, מזון ומוצרי קוסמטיקה, ציטרל הראה פעילויות ביולוגיות מבטיחות במבחנה, כולל השפעות אנטי-פטרייתיות, אנטי-בקטריאליות, נוגדות חמצון ואנטי-דלקתיות [9-11]. יתרה מכך, מחקרים עדכניים הראו. הדגיש כי לציטרל יש משמעות טיפולית פוטנציאלית כמרפי שרירים חלקים והרדמה מקומית, שכן הוא מקדם הרפיה בשרירים החלקים של קנה הנשימה, הרחם ואבי העורקים ומעכב את התרגשות העצבים במודלים של בעלי חיים [12-15].

ציטרל מתקבל משמנים אתריים (EOs) של כמה מינים בוטניים, כולל Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L., ו- Verbena officinalis L. למיטב המחברים. ידע, רק L. cubeba EO נחקר עבורוטירוזינאזפעילות מעכבת [16]. לכן, מטרת מחקר זה היא להעריך את הפעילויות המעכבות טירוזינאז של EOs של C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis ו-V.officinalis, באמצעות בדיקה קולורימטרית חוץ גופית, כדי להעריך אם ההרכבים הכימיים השונים משפיעים על הפעילות הכוללת של מעכבי EO באמצעות כל אינטראקציות סינרגטיות, תוספות ו/או תחרותיות אפשריות בין מרכיביהן. מחקר זה משתמש בגישת חלוקה מונחית א-ביו-assay כדי להעריך באופן מקיף את מרכיבי ה-EOs והאננטיומרים שלהם, כאשר הם כיראליים, התורמים לפעילות מעכבת EO נגד מקור פטריות של טירוזינאז, שהיא מערכת מודל טובה לבדיקה ראשונית שלטירוזינאזמעכבים [17].

2. תוצאות ודיון

2.1. הרכב כימי ותכולת ציטרלית של השמן האתרי שנחקר

בניסיוננו לאפיין באופן מקיף את כל רכיבי ה-EO הפוטנציאליים התורמים לפעילות הביולוגית הנחשבת, ה-EOs שנחקרו נותחו על ידי GC, עם זיהוי FID וגם MS. האחוזים היחסיים המנורמלים (מחושבים מהאזורים האבסולוטיים המנורמלים לתקן הפנימי C13 באמצעות גורמי תגובה [18,19]) של כל התרכובות שזוהו נקבעו ושימשו להשוואת הרכבים של EO. איור 1 מדווח על פרופיל ה-GC-MS של ה-EOs שנחקרו מנותחים בעמודה קונבנציונלית. טבלה 1 מפרטת, עבור כל EO נחקר, את התרכובות שהציגו שפע אחוז מנורמל מעל 0.1, בעוד שההרכבים הכימיים של EO המלאים מדווחים בחומרים המשלימים (טבלאות S1-S5).

כל ה-EOs הנחקרים עשירים בנראלים (cis{{0}},7-dimethyl-2,6-octadienal) וג'רניאלים (טרנס-3,{ {5}}דימתיל-2,6-אוקטדינל), שהן התרכובות הנפוצות ביותר. היחס התרופתי/גרניאלי היה דומה מאוד בכל ה-EOs שנחקרו והתאים ל-0.74 ± 0.05. ה-C. schoenanthus ו-L. cubeba EO מציגים את התוכן הנראלי והגרניאלי הגבוה ביותר, המהווה, בממוצע, 60 אחוז מכל הרכבי ה-EO שלהם, ואשר גדול פי 1.5- מאשר ב-V. officinalis EO וב שלושת M. officinalis EOs (כלומר, מדגם 1, 2 ו-3). התרכובות המחומצות הנוספות המשותפות לכל ה-EO הן 6-מתיל-5-הפטן-1-און, לינולול וציטרונלל. האחרון נמצא בשפע באופן משמעותי יותר ב-M. officinalis EO 1 מאשר ב-EOs האחרים שנחקרו, כולל M. officinalis EO2 ו-3.

השפע של חלק הפחמימנים משתנה באופן משמעותי ב-EOs.M השונים. officinalis EO 1 מכיל רק trans- -caryophyllene ו-humulene כ-sesquiterpenehydrocarbons, המהווים 2.7 אחוז ו-0.13 אחוז מסך ה-EO, בהתאמה. ה-C.schoenanthus EO מציג שבריר פחמימנים עשיר מעט יותר מ-M. officinalis EO 1 (כלומר,7.0 אחוזים), המכיל את שני המונוטרפנים (כלומר, קמפן, cis{{1{{20 }}}}ocimene, limonene, -pinene,trans- -ocimene, -thujene) וססקוויטרפנים (כלומר, טרנס- -caryophyllene, -cadinene,δ-cadinene, germacrene D, -elemene) במידה בינונית כמויות. ב-L. cubeba ו-V.officinalis EO, חלק הפחמימנים מהווה 20 אחוזים מסך ה-EO והלימונן הוא התרכובת הנפוצה ביותר (כלומר, 15.0 ו-10.9 אחוזים, בהתאמה), ואחריו -פינן, פינן , sabinene, trans- -caryophyllene, -myrcene, camphene ו-copaene. לבסוף, M.officinalis EO 2 ו-3 מאופיינים בתכולת חלקי הפחמימנים הגבוהים ביותר (38.8 אחוז ו-31.8 אחוז מסך ה-EO, בהתאמה). בשתי הדגימות, חלק הפחמימנים מכיל בעיקר ססקוויטרפנים, כלומר טרנס- -קריופילן (27.8 אחוזים ו-20.0 אחוזים, בהתאמה), ו-הומולן (3.0 אחוזים ו-2.6 אחוזים), ושבר מונוטרפן מופחת המאופיין בעיקר על ידי לימונן ( 4.2 אחוזים ו-3.2 אחוזים, בהתאמה).

נחקרו שלוש דגימות של L. cubeba, V. officinalis ו-C. schoenanthus Eos שיוצרו בשנים שונות וכן שלוש דגימות של M. officinalis EOs מיצרנים שונים. ניתוחי GC-MS של C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis ו-V. officinalis לא גילו הבדלים איכותיים וכמותיים משמעותיים בהרכב הכימי של שלוש הדגימות של שנות ייצור שונות. זה עשוי להיות מיוחס לתנאי אחסון אופטימליים, כלומר, במיכל זכוכית ענבר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך עם מרווח ראש זניח. מצד שני, ניתוחי GC-MS הראו הבדלים משמעותיים בשפע של ציטרונלל וטרנס{{4 }}caryophyllene בשלושת EOs של M. officinalis שנחקרו. ציטרונלה הסתכם ב-19.6 אחוזים, 0.26 אחוזים ו-0.31 אחוזים ב-M. officinalis EO 1, 2 ו-3, בהתאמה. להיפך, כפי שתואר קודם, הטרנס- -קריופילן נמצא בשפע הרבה יותר ב-M. officinalis EOs 2 ו-3 מאשר ב-M. officinalis EO 1. תוצאות אלו תואמות את הממצאים שדווחו על ידי Seidler-Lozykawska וחב', שהדגיש הבדלים משמעותיים בשכיחות הציטרל, הציטרונלל והטרנס- -קריופילן ב-EOs שהתקבלו מ-22 גנוטיפים נבחרים של M. officinalis שמקורם בגנים הבוטניים באירופה [20].

בוצעה כמות אמיתית על ידי כיול התקן החיצוני כדי להעריך במדויק את שפע התרכובות הייחודיות הביו-אקטיביות הפוטנציאליות (כלומר, נרל, גרניאל, לימונן, -מירקן וציטרונלל. טבלאות 2 ו-3 מדווחות על היונים האבחוניים (מ/ז) המשמשים עבור SIM- כימת MS של תרכובות הסמן הנחקרות יחד עם טווח הכיול, משוואת עקומת הכיול, ערכי מתאם ושגיאת רגרסיה של כל אנליט ותוצאות הכימות, בהתאמה.

2.2. פעילות מעכבת חוץ גופית של השמנים האתריים שנחקרו נגד טירוזינאז פטריות

כפי שתואר קודם, ה-EOs של C. schoenanthus, M. officinalis, L. cubeba ו-V.officinalis מציגים רמות גבוהות של ציטרל, המאופיינת בפעילות מעכבת לא תחרותית נגד מקור פטרייתי של טירוזינאז [8,16,21] . מחקר זה נועד לבחון את המבחנהטירוזינאזפעילויות מעכבות של EOs אלה כדי לבחון האם ניתן לייחס את הפעילות המעכבת שלהם לתוכן הציטרלי שלהם בלבד, או האם יש תרכובות ביולוגיות אחרות המשפיעות על ההשפעות המעכבות של ה-EOs.

פטרייהטירוזינאזאומץ כאן בגלל ההומולוגיה הגבוהה שלו ל-Humantyrosinase, העלות הנמוכה יחסית שלו והזמינות המוכנה שלו, שהופכים אותו למערכת מודלים טובה לבדיקה ראשונית של מעכבי טירוזינאז [17]. הדיוק של המבחנהטירוזינאזבדיקת העיכוב הוערכה במונחים של חזרות (על ידי ביצוע מבחן העיכוב האנזימטי חמש פעמים באותו יום) ודיוק ביניים (על ידי חזרה על מבחן העיכוב האנזימטי חמש פעמים כל ארבעה שבועות במשך תקופה של שישה חודשים). טבלה 4 מדווחת על מקדם הווריאציה (CV) עבור בדיקות עיכוב שבוצעו עם חומצה קוג'ית, ששימשה כביקורת חיובית, ועם L. cubeba EO. התוצאות היו משביעות רצון שכן קורות החיים מעולם לא עלה על 7 אחוזים עבור חזרות ו-10 אחוזים עבור דיוק בינוני. טבלה 4 מדווחת על מקדם השונות עבור בדיקות עיכוב שבוצעו עם חומצה קוג'ית, המשמשת כביקורת חיובית, ועם L. cubeba EO. ערכי דיוק דומים הושגו עבור כל ה-EOs שנבדקו.

עקומת ריכוז-תגובה ציטרלית נחקרה על ידי התוות של הפעילות המעכבת הנצפית כפונקציה של הריכוז שלה בתערובת התגובה. כל ה-EOs נבדקו בריכוז של 166.7 מיקרוגרם/מ"ל, מה שסיפק, ללא קשר ל-EO, ריכוז ציטרלי שנוצר בטווח הליניאריות של עקומת הריכוז-תגובה שלו (y=0.3956x בתוספת 1.8094,R{{7} }.9951, שגיאת רגרסיה: 2.08448, טווח ליניאריות: 6.7-166.7 מיקרוגרם/מ"ל) ולא יצרו בעיות מסיסות בתערובת התגובה.

עלילת הקופסה המדווחת באיור 2 מציגה את האחוז שלטירוזינאזעיכוב עבור כל EO. עבור L. cubeba, V. officinalis ו-C. schoenanthus EOs, התוצאות שדווחו באיור 2 מתאימות לפעילות מעכבת טירוזינאז פטריות של EOs של 2020, מכיוון שניתוח השונות לא גילה הבדלים מובהקים סטטיסטית בין EOs שונים שנות ייצור (p > 0.05). בהתייחס ל-L. cubeba ו-C. schoenanthus EOs, תוצאות אלו תואמות היטב את התוצאות שהתקבלו מניתוחי GCMS כמותיים שחשפו כמות ציטרלית כמעט זהה ב-EOs של שנות ייצור שונות. אצווה 2020 של V. officinalis EO מכילה כמות ציטרלית מעט גבוהה יותר מזו של קבוצות 2019 ו-2018. עם זאת, על פי עקומת ריכוז-תגובה ציטרלית, עודף הציטרלים באצוות 2020 אינו מספיק כדי לקבוע אחוז גבוה יותר מבחינה סטטיסטית של עיכוב אנזימטי בהתחשב בעיכוב אקראי. שגיאה הקשורה למדידות. לפרטים נוספים, ראה איור S1 בחומר המשלים. מצד שני, ניתוח השונות (ANOVA) ואחריו של Tukey–Kramer לאחר הבדיקה גילה ששלושת ה-M. officinalis EOs שנבדקו, שסופקו על ידי יצרנים שונים, מעכבים פטריותטירוזינאזבהיקפים שונים, אשר יתוארו עוד בפסקאות הבאות. הפעילויות המעכבות הגדולות ביותר נצפו עבור EOs של L.cubeba, M. officinalis 1 ו-V. officinalis, שעיכבו 59 ± 6 אחוזים, 55 ± 7 אחוזים ו-52 ± 6 אחוזים שלטירוזינאזפעילות, בהתאמה, כאשר נבדקה בריכוז של 166.7 מיקרוגרם/מ"ל. נצפו פעילויות נמוכות יותר מבחינה סטטיסטית (p < 0.05)="" עבור="" ה-eos="" של="" c.="" schoenanthus="" ו-m.officinalis="" 2="" ו-3="" שפעילות="" מעכבת="" האנזים="" שלהם="" הייתה="" 42="" ±="" 5="" אחוזים,="" 40="" ±="" 5="" אחוזים="" ו-38="" ±="" 6="" אחוזים,="" בהתאמה.="" טבלה="" 5="" מספקת="" את="" ריכוז="" המעכבים="" שהפחית="" בחצי="" את="" פעילות="" האנזים="" בתנאי="" הניסוי="" הנתונים="" (ic50)="" עבור="" כל="" מעכב="" שנחקר="" (כלומר,="" eos,="" תרכובות="" בודדות="" וחומצה="" קוג'ית).="" כל="" ה-eos="" עיכבו="" ביעילות="" טירוזינאז="" פטריות="" והציגו="" פעילות="" מעכבת="" שהייתה,="" בממוצע,="" 100-פי="" כמה="" נמוכה="" מזו="" של="" kojicacid,="" ששימש="" כביקורת="">

2.3. זיהוי של רכיבים ביו-אקטיביים נוספים, מלבד ציטרל, על-ידי פיצול מודרך ביו-assay ההיסטוגרמה המדווחת באיור 3 משווה את אחוז העכבות האנזימטיות שנמדדו בניסוי לערכים שניתן היה לצפות אילו נראל וגרניאלי (נחשב כסכום, כלומר ציטרל) רק תרכובות פעילות ב-EOs שנחקרו. ערכים אלה נמדדו באמצעות אינטרפולציה מעקומת הריכוז-תגובה של הציטרלים. כפי שניתן לציין, C. schoenanthus, M. officinalis 2 ו- M. officinalis 3 הציגו פעילויות מעכבות שהיו בקנה אחד עם התוכן הציטרלי שלהם, בעוד L. cubeba, M. officinalis 1 ו-V. officinalis EOs עיכבו פטריות טירוזינאז במידה רבה מהצפוי. אומצה גישה ביו-מונחית לזיהוי התרכובות הנוספות התורמות לפעילות ציטרלית. חלקי החמצן והפחמימנים של ה-L. cubeba, M. officinalis 1 ו-V. officinalis EOs בודדו באמצעות כרומטוגרפיה הבזק ונבדקו בנפרד עבור הפטריות שלהםטירוזינאזפעילות מעכבת. החלקים הפיטוהמיים שנבדקו עבור פעילותם מעכבת טירוזינאז פטריות. השברים הפיטוהמיים של השברים נבדקו באותו ריכוז כמו הריכוז שהתקבל כאשר נבדקו 166.7 מיקרוגרם/מ"ל של ה-EO בהתאמה (ראה סעיף חומרים ושיטות בסעיף 3.2). טבלה 6 מדווחת על הריכוז של נראל, גרניאל, ציטרונלל, לימונן, ו-myrcene בשברי חמצן ופחמימנים של ה-EOs המחולקים.

באשר ל-L. cubeba ו-V. officinalis EOs, גם חלקי החמצן וגם הפחמימנים עכבו טירוזינאז של פטריות, אם כי בהיקפים שונים. הפעילויות של שברים מחומצנים (53 ± 3 אחוזים ו-44 ± 5, בהתאמה) אחראיות לרוב ה-EOsanti-טירוזינאזפוטנציאל והיו בקנה אחד עם תכולת הציטרלית בהתאמה, דבר המצביע על כך שהתרכובות התורמות לפעילות הציטרלית שייכות לשברי הפחמימנים. שברי ה-Hydrocarbon של ה-L. cubeba ו-V. officinalis EOs מציגים הרכבים כימיים דומים למדי. לימונן (68.4 ו-50.3 אחוזים, בהתאמה), טרנס- -קריופילן (12.0 ו-7.8 אחוזים, בהתאמה), -פינן (1.7 ו-7.5 אחוזים, בהתאמה), -פינן (2.5 ו-12.9 אחוזים, בהתאמה), סבינן (2.7 ו-3.8, בהתאמה), ו-מירקן (2.0 ו-2.4 אחוזים, בהתאמה) הם התרכובות השכיחות ביותר בשני השברים והן קיימות בכמויות דומות למדי, למעט -pinene ו-pinene, השוררים בשבריר פחמן הידרו של V. officinalis EO.

The chiral recognition revealed high enantiomeric purities in favor of the (-)-configured enantiomers for trans-β-caryophyllene (>99 אחוז בשני EOs), לימונן (97 ו-94 אחוז ב-L. cubeba ו-V. officinalis EO, בהתאמה) ו-sabinene (87 אחוז בשני EOs), בעוד שעודפים אננטיומריים שונים נצפו עבור -pinene (-)- אננטיומר: 38 אחוז ב-L. cubebaEO ו-73 אחוז ב-V. officinalis EO) ו-pinene ((-)-enantiomer: 67 אחוז ב-L. cubeba EO ו-88 אחוז ב-V. officinalis EO). בשני ה-EOs, (-)-לימונן מהווה יותר מ-50 אחוז מהחלק כולו. עם זאת, למרות שמחקרים קודמים דיווחו על פעילות מעכבת נגד טירוזינאז פטריות בגלל השפע הגבוה שלה [22,23], (-)-לימונן כאן לא הראה פעילות מעכבת טירוזינאז. תוצאות דומות התקבלו עבור (פלוס)-לימונן, התערובת הגזעית, והתרכובות (-)-טרנס- -קריופילן, (±)- -פינן ו-(±)- -פינן . Sabinene לא נבדק מכיוון שכבר הוכח שיש לו פטריות זניחהטירוזינאזהשפעות מעכבות [8]. בהסכמה לממצאים קודמים [8], מירקן הפחית את פעילות טירוזינאז פטריות. כאשר נבדק בריכוז שנצפה ב-166.7 מיקרוגרם/מ"ל של L. cubeba ו-V. officinalis EOs, פעילות ה-myrcene גישרה על הפער בין ההשפעות המעכבות הצפויות של EOs אם ציטרל היה התרכובת הפעילה היחידה ותוצאות הניסוי. בניגוד לתצפיות של Matsuura et al. [8], -myrcene הוכח כמעכב טירוזינאז פטריות חזק יותר מאשר ציטרל, מכיוון שה-IC50 שלו היה נמוך כמעט פי עשרה (13.3 מיקרוגרם/מ"ל לעומת 121.8 מיקרוגרם/מ"ל). הבדל זה עשוי להיות מיוחס למצעים השונים בהם נעשה שימוש; Matsuura et al. חקרו רק פעילות טירוזינאז דיפנולז של פטריות, שכן הם השתמשו ב-L-DOPA כמצע, בעוד שבמחקר זה נעשה שימוש ב-L-טירוזין. הממצאים הנוכחיים מצביעים על כך ש-myrcene עשוי להיות יעיל יותר בעיכוב פעילות טירוזינאז מונופנולאז פטריות מאשר הדיפנולאז.

ה-M. officinalis EO 1 מציג שבריר פחמימנים קטן המהווה פחות מ-3 אחוזים מהכלל, ואין לו פעילות מעכבת טירוזינאז. עם זאת, החלק המחומצן M. officinalisEO 1 עיכב טירוזינאז פטריות במידה רבה יותר ממה שניתן היה לצפות מתכולת הציטרלית שלו (איור 3). חלק זה מכיל כמויות משמעותיות של ציטרונלל בנוסף לנראל ולגרניאל והניתוח הכירי גילה טוהר גבוה של ציטרונלל לטובת האננטיומר (פלוס) (98.3 אחוז). כאשר נבדק באופן עצמאי, בריכוז של 166.7 מיקרוגרם/מ"ל, (פלוס)-ציטרונלל עיכב את הפטריות טירוזינאז במידה זניחה, אם כי פעילותו הוגברה באופן משמעותי כאשר נבדק בשילוב עם ציטרל. תוצאות אלו עשויות להסביר את ההבדלים שנצפו באחוזים של פטריותטירוזינאזעיכוב ב-EOs השונים של M. officinalis. M.officinalis EO 2 ו-3 מציגים תוכן ציטרונללי נמוך מאוד, וזו עשויה להיות הסיבה לכך שהפעילות המעכבת שלהם נמוכה משמעותית מזו של M. officinalis EO 1.

3. חומרים ושיטות

3.1. ריאגנטים

דימתיל סולפוקסיד (DMSO), טירוזינאז פטריות מ-Agaricus bisporus (JE Lange)Imbach, L-tyrosine, kojic acid, citral, citronellal, -myrcene, (plus )-limonene, (-)-limonene, (±)-limonene, ( ±)-, ו-pinene נרכשו מ- Merck Life Science Srl (מילאנו, איטליה). Litsea cubeba, Verbena officinalis ו- Cymbopogon schoenanthus EOs סופקו על ידי Erboristeria Magentina Srl (Poirino, איטליה). שלוש קבוצות של שנים שונות (כלומר, 2020, 2019, 2018) נבדקו עבור כל אחת. שלוש דגימות של Melissa officinalis EOs נחקרו; אחת סופקה על ידי Agronatura (Spigno Monferrato, Alessandria), אחת על ידי ErboristeriaMagentina Srl, ואילו האחרונה נרכשה מחנות מקומית והייתה מ- SpecchiasolS.rl (Bussolengo, איטליה). בטקסט, המחברים מתייחסים ל-EOs השונים של Melissaofficinalis כאל M. officinalis EOs 1, 2 ו-3, בהתאמה. ה-EOs שסופקו הושגו בעקבות ההליכים המתוארים בפרמקופאה האירופית [24]. Melissa officinalis ו- Verbena officinalis EOs הופקו על ידי הידרוסטילציה מהעלים ומהחלקים הצמחיים, בהתאמה; באופן דומה, Litsea cubeba ו- Cymbopogon schoenanthus EOs הושגו על ידי זיקוק בקיטור של הפירות הטריים וחלקי האוויר הטריים, בהתאמה. כל EO נותח באופן אינדיבידואלי על ידי GC-MS ברגע שהוא נרכש/סופק על ידי היצרן המקביל, בכל שנת אחסון, ורגע לפני המחקר של פעילות מעכבת הפטריות טירוזינאז שלו.

3.2. בדיקה מעכבת טירוזינאז במבחנה

הטירוזינאזפעילויות מעכבות של EOs ותרכובות מבודדות נחקרו במבחנה באמצעות בדיקת אנזים מבוססת קריאה קולורימטרית שעברה אופטימיזציה על ידי Zengh et al. [25], עם שינויים קלים. הפעילות המעכבת טירוזינאז של EOs, כמו גם חלקי הפחמימנים והמחומצנים שלהם ותרכובות טהורות בהתאמה, נחקרו בבדיקת זגוגית של בדיקת אנזים מבוססת קריאה קולורימטרית שעברה אופטימיזציה על ידי Zengh et al. [25], עם שינויים קלים: הבדיקה בוצעה בטמפרטורת החדר וטירוזינאזהעיכוב נמדד בהתחשב בשליטה ובספיגת הדגימה לאחר 6 דקות של דגירה, ולא לאחר 20 דקות, כדי לפעול מתחת לחלק הליניארי של היצירה האנזימטית, מה שמספק תוצאות עיכוב מדויקות יותר [26,27]. פטריות טירוזינאז מ-Agaricus bisporus (JE Lange) Imbach נבחרה למחקר זה. נעשה שימוש ב-L-Tyrosine כמצע, כלומר הפעילות הכוללת של מעכב טירוזינאז נחקרה מבלי להבחין בין פעילות טירוזינאז מונופנולאז ודיפנולאז. מדידות פוטומטריות ב-475 ננומטר בוצעו על Genesys6 של Thermo spectronic ומעכבת הבקרה החיובית של קוג'ית שימשה כמעכבת הבקרה החיובית. הפתרונות של המעכבים הפוטנציאליים שנחקרו (EOs, חלקים מבודדים EO, תרכובות בודדות של EO ו-kojicacid) הוכנו ב-DMSO. טבלה 7 מדווחת על הריכוזים שנבדקו עבור כל מעכב פוטנציאלי שנחקר. הפטרייהטירוזינאזתמיסה 200 יח'/מ"ל (27.9 מיקרוגרם/מ"ל) הוכנה במאגר נתרן פוספט (pH 6.8) ומנות של 9 מ"ל אוחסנו ב-18 ◦C והופשרו ממש לפני הניסויים. תמיסת טירוזין 0.1 מ"ג/מ"ל הוכנה במאגר נתרן פוספט (pH 6.8) וחודשה מדי יום. מרכיבי תערובת התגובה הונחו בבקבוקון בסדר הבא: 1 מ"ל של תמיסת טירוזינאז פטריות 200 U/mL; 1 מ"ל של תמיסת חיץ נתרן פוספט; 10 μL של תמיסת EO/תרכובת יחיד/חומצה קוג'ית; ולבסוף, 1 מ"ל של תמיסת טירוזין 0.1 מ"ג/מ"ל. אחוז ה-DMSO הסופי בתערובת התגובה היה 0.3 אחוזים. הבדיקה בוצעה בבקבוקון אטום של 4 מ"ל כדי למנוע אובדן של רכיבי EO כלשהם לסביבה הסובבת וכדי למזער את שחרורם לחלל הראש מעל תערובת התגובה. תערובת התגובה הודגרה באמבט מים תרמוסטטי ב-25 ◦C למשך 6 דקות. לאחר מכן, הספיגה ב-475 ננומטר נרשמה, מכיוון שאורך גל זה מאפשר זיהוי של דופאכרום. הספיגה המקבילה ל-100 אחוז מפעילות טירוזינאז נמדדה על ידי החלפת ה-EOs/תרכובת בודדת/תמיסת חומצה קוג'ית ב-10 μL של DMSO טהור. פתרונות ריקים הוכנו כדלקמן: 2 מ"ל תמיסת חיץ נתרן פוספט, 10 μL של EO/תרכובת בודדת. תמיסת חומצה/קוג'ית/DMSO, ו-1 מ"ל של תמיסת טירוזין 0.1 מ"ג/מ"ל. אחוז עיכוב טירוזינאז נמדד לפי המשוואה שלהלן: אחוז עיכוב=∆A (שליטה) − ∆A (מדגם) / ∆A (שליטה) × 100,∆A (שליטה) או (מדגם) {{ 33}} A475 (בקרה) או (מדגם) − A475 (ריק בקרה) או (ריק מדגם).

3.3. כרומטוגרפיית עמודת הבזק

חלוקת EO בוצעה על מערכת כרומטוגרפיה של עמודת הבזק PuriFlash450 על ידי Sepachrom (Rho, מילאנו, איטליה), המצוידת בגלאי UV ו-ELSD כאחד. כמות EO מחולקת: 900.0 מ"ג. שלב נייח: חלקיקי סיליקה ג'ל כדוריים, 50 מיקרומטר, 25 מ"ג (Purezza®-Sphera Cartridge Stationary) היו מ-Sepachrom; פאזה ניידת: פטרולתר (A) ואתיל אצטט (B); קצב זרימה 25 מ"ל/דקה. פליטת גרדיאנט ליניארי אומצה מ-100 אחוז מ-A ל-80 אחוז מ-A ו-20 אחוז מ-B במשך 20 דקות.

3.4. תנאי ניתוח

תמיסות ה-EOs ואלו של השברים המתאימים שלהם הוכנו בציקלוהקסאן בריכוז של 5.0 מ"ג/מ"ל ונותחו על ידי GC-MS. ציטרל, ציטרונלל, -מירקן ולימונן כומתו בכל EO ובשברים המבודדים המתאימים באמצעות שיטת הכיול הסטנדרטית החיצונית. רמות כיול מתאימות הוכנו אינציקלוהקסאן ונותחו על ידי GC-MS. Tridecane (C13) 1.0 מ"ג/מ"ל שימש כתקן פנימי לנרמל את אותות האנליט. טבלה 2 מסכמת את טווח הריכוזים הנחשב עבור כל תרכובת מכומדת.

ניתוחי GC-MS בוצעו באמצעות מדגם רב-תכליתי Gerstel MPS-2 (Mülheim an der Ruhr, גרמניה) המותקן על Agilent 6890 N GC מחובר ל-5975 MSD ומצויד ב- ChemStation גרסה E. 02.02.1431 מערכת עיבוד נתונים (AgilentTechnologies, סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב). תנאי GC: טמפרטורת מזרק: 250 ◦C; מצב הזרקה: פיצול; יחס: 1/20; גז נשא: הליום; קצב זרימה קבוע: 1 מ"ל/דקה; עמודות: Mega5 (95 אחוז polydimethylsiloxane, 5 אחוז פניל) df 0.25 מיקרומטר, dc 0.25 מ"מ, אורך 25 מ', מ-MEGA (Legnano, איטליה). תוכנית טמפרטורה: 50 ◦C//3 ◦C/min//180 ◦C//10 ◦C/min//250 ◦C(5 min). תנאי MSD: MS מופעלת במצב EI (70 eV); טווח סריקה: 35 עד 350 אמו; זמן שהייה 40 אלפיות השנייה; טמפרטורת מקור יונים: 230 ◦C; טמפרטורת קוואדרופול: 150 ◦C; טמפרטורת קו העברה: 280 ◦C. סמני EO זוהו על ידי השוואת שני מדדי החזקת קווים (ITs), המחושבים מול תערובת פחמימנים C9-C25, וספקטרום המסה שלהם או מול אלו של דגימות אותנטיות, או מספריות מסספקטרליות זמינות מסחרית (Adams, 2007). ניתוחים כיראליים של EO בוצעו על ידי אימוץ תנאי אנליזה זהים על 2,3-di-O-methyl-6-Ot-butyldimethylsilyl- -CD (2,3DM6TBDMS -CD) df 0.25 µm, dc 0.25 מ"מ, אורך 25 מ' מ-MEGA. תוכניות טמפרטורה: 40 ◦C (1 דקה)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 דקות).

ניתוחי GC-FID בוצעו על אותו מכשיר. תנאי GC: טמפרטורת מזרק: 250 ◦C; מצב הזרקה: פיצול; יחס: 1/20; גז נשא: מימן; קצב זרימה: 1 מ"ל/דקה. תוכניות טמפרטורה: 40 ◦C (1 דקה)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 דקות).

4. מסקנות

מטרות חקירה זו היו (1) לבחון באופן מקיף את הפטרייה החוץ גופיתטירוזינאזפעילות מעכבת של EOs Cymbopogon schoenanthus, Litsea cubeba, Melissa officinalis ו-Verena officinalis ו-(2) כדי לקבוע אם הפעילות הביולוגית שלהם מיוחסת לתכולת הציטרלית שלהם בלבד או אם יש מונוטרפנים ביו-אקטיביים נוספים שתורמים לפעילות הביולוגית הנחקרה באמצעות גישת שבירה מונחה ביולוגית. מחקר זה זיהה כי ב-L. cubeba ו-V. officinalis EOs, ה-myrcene תורם לפעילויות מעכבות EOs למרות הכמות המועטה שלו והוכח כבעל כוח מעכב גדול יותר לציטרל. הממצא העיקרי השני היה שפטריית ציטרלית משופרת (פלוס)-ציטרונלליתטירוזינאזכוח מעכב, אינטראקציה פוטנציאלית באמצעות סינרגיסטית מכיוון שהוא לא הציג פעילות בפני עצמה. הממצא האחרון הסביר מדוע ב-M. officinalis EOs הנושאים כמויות זניחות (פלוס)-ציטרונליות, הפעילויות המעכבות היו בקנה אחד עם התוכן הציטרלי שלהם בעוד שההיפך היה נכון עבור M. officinalis EO עם שפע גבוה יחסית (פלוס)-ציטרונללי. אפילו אם כי עדיין נדרשים מחקרים נוספים כדי להגדיר במדויק את סוג האינטראקציות המתרחשות בין -מירקן לציטרל ובין ציטרונלל לציטרל, ולהעריך את הפעילויות המעכבות של EOs אלה ותרכובות בודדות על בני אדםטירוזינאזתוצאות מחקר זה עשויות לסייע בתכנון רציונלי של תערובות של EOs או EOs מועשרים המשפרים את היעילות הביולוגית שלהם ומגדילים את הפוטנציאל שלהם כעזרים בטיפול בהיפרפיגמנטציה.

הפניות

1. Pillaiyar, T.; מניקם, מ.; Namasivayam, V. Skin Whitening Agents: Medicinal chemistry of inhibitors tyrosinase.J. אנזים. Inhib. Med. Chem. 2017, 32, 403–425. [CrossRef]

2. דסמדט, ב.; Courselle, P.; De Beer, JO; Rogiers, V.; גרוסבר, מ.; Deconinck, E.; De Paepe, K. סקירה כללית של סוכני הלבנת עור עם תובנה על שוק הקוסמטיקה הבלתי חוקי באירופה. J. Eur. אקד. דרמטול. Venereol. 2016, 30, 943–950. [CrossRef] [PubMed]

3. דסמדט, ב.; ואן הוק, E.; Rogiers, V.; Courselle, P.; De Beer, JO; דה פאפה, ק.; Deconinck, E. אפיון של מוצרי קוסמטיקה להלבנת עור בלתי חוקית. ג'יי פארם. ביומד. אנאלי. 2014, 90, 85–91. [CrossRef] [PubMed]

4. קובו, I.; Ikuyo, KH Flavonols מפרח זעפרן: פעילות מעכבת טירוזינאז ומנגנון עיכוב. J. Agric. Food Chem.1999, 47, 4121–4125. [CrossRef]

5. Chang, C.-TT; Chang, W.-LL; Hsu, J.-CC; שי, י.; Chou, S.-TT הרכב כימי ופעילות מעכבת טירוזינאז של שמן אתרי Cinnamomum casia. בוט. סוּס הַרבָּעָה. 2013, 54, 2–8. [CrossRef]

6. גרסיה-מולינה, MDM; Muñoz-Muñoz, JL; גרסיה-מולינה, פ.; García-Ruiz, PA; Garcia-Canovas, F. פעולת טירוזינאז על פנולים מוחלפים: השפעה אפשרית על השחמה ומלנוגנזה. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 6447–6453. [CrossRef]

7. קובו, I.; Kinst-Hori, I. Tyrosinase Inhibitors from Cumin. J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 5338–5341. [CrossRef]

8. Matsuura, R.; אוקדה, ח; Sawamura, M. Tyrosinase פעילות מעכבת של שמנים אתריים הדרים. J. Agric. Food Chem. 2006,54, 2309–2313. [CrossRef]

9. Lertsatitthanakorn, P.; Taweechaisupapong, S.; Aromdee, C.; Khunkitti, W. ביולוגיות במבחנה של שמנים אתריים המשמשים למניעת אקנה. Int. ג'יי ארומתר. 2006, 16, 43–49. [CrossRef]

10. בוזנה, ח.; חפאיד, נ.; Giroux-Metges, M.-A.; אלפקי, א.; Talarmin, H. תכונות ביולוגיות של ציטרל והשפעות ההגנה הפוטנציאליות שלו מפני ציטוטוקסיות הנגרמת על ידי אספירין בתאי IEC-6. ביומד. פרמקוטר. 2017, 87, 653–660. [CrossRef]

11. לי, HJ; ג'ונג, HS; קים, DJ; נו, י"ה; יוק, DY; Hong, JT השפעה מעכבת של ציטרל על ייצור NO על ידי דיכוי של ביטוי iNOS והפעלת NF-κB בתאי RAW264.7. קֶשֶׁת. פארם. מילון 2008, 31, 342–349. [CrossRef]

12. Carvalho, PMM; Macêdo, CAF; Ribeiro, TF; סילבה, א.א.; דה סילבה, RER; de Morais, LP; Kerntopf, MR; Menezes, IRA;Barbosa, R. השפעת השמן האתרי החום Lippia alba (Mill.) NE ומרכיביו העיקריים, ציטרלים ולימונן, על שריר קנה הנשימה החלק של חולדות. ביוטכנולוגיה. נציג 2018, 17, 31–34. [CrossRef] [PubMed]

13. Pereira-de-Morais, L.; Silva, AdA; דה סילבה, RER; Costa, RHSd; Monteiro, Á.B.; Barbosa, CRdS; אמורים, תד"ש; deMenezes, IRA; Kerntopf, MR; Barbosa, R. פעילות טוקוליטית של השמן האתרי Lippia alba ומרכיביו העיקריים, ציטרל אנדלימונן, על הרחם המבודד של חולדות. Chem. ביול. אינטראקציה. 2019, 297, 155–159. [CrossRef]

14. דה סילבה, RER; de Morais, LP; סילבה, א.א.; Bastos, CMS; Pereira-Gonçalves, Á.; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Leal-Cardoso,JH; Barbosa, R. Vasorelaxant השפעה של שמן אתרי Lippia alba והמרכיב העיקרי שלו, citral, על ההתכווצות של אבי העורקים isolatedrat. ביומד. פרמקוטר. 2018, 108, 792–798. [CrossRef] [PubMed]

15. סוזה, ד"ג; סוזה, SDG; סילבה, RER; סילבה-אלבס, ק"ש; Ferreira-da-Silva, FW; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Leal-Cardoso,JH; Barbosa, R. שמן אתרי של Lippia alba והמרכיב העיקרי שלו ציטרלי חוסמים את העוררות של עצבי סכיאט של חולדה. בראז. J. Med.Biol. מילון 2015, 48, 697–702. [CrossRef] [PubMed]

16. הואנג, X.-W.; פנג, י.-צ.; הואנג, י.; לי, ה.-ל. יישום קוסמטי פוטנציאלי של שמן אתרי המופק מפירות Litsea cubeba מסין. ג'יי אסנט. Oil Res. 2013, 25, 112–119. [CrossRef]

17. זולגדרי, ש.; בהרמי, א.; חסן חאן, MT; Munoz-Munoz, J.; גרסיה-מולינה, פ.; גרסיה-קנובס, פ.; Saboury, AA סקירה מקיפה על מעכבי טירוזינאז. J. Enzym. Inhib. Med. Chem. 2019, 34, 279–309. [CrossRef]

18. Bicchi, C.; ליברטו, E.; מתאודו, מ.; סגורביני, ב.; מונדלו, ל.; צלנר, ב"ד; קוסטה, ר.; Rubiolo, P. ניתוח כמותי של שמנים אתריים: משימה מורכבת. טעם Fragr. י' 2008, 23, 382–391. [CrossRef]

19. רוביולו, פ.; סגורביני, ב.; ליברטו, E.; קורדרו, סי; Bicchi, C. שמנים אתריים וחומרים נדיפים: הכנה וניתוח של דגימות. סקירה.Flavour Fragr. י' 2010, 25, 282–290. [CrossRef]

20. סיידלר-לוזיקובסקה, ק. בוצ'אנובסקי, י. Król, D. הערכת השונות של תכונות מורפולוגיות וכימיות של הגנוטיפים הנבחרים של מליסה לימון (Melissa officinalis L.). Ind. Crops Prod. 2013, 49, 515–520. [CrossRef]

21. קובו, I.; Kinst-Hori, I. Tyrosinase מעכב פעילות של תרכובות הטעם שמן זית. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 4574–4578. [CrossRef] [PubMed]

22. Fiocco, D.; ארסיולי, מ.; ארנה, MP; בנבנותי, ש.; Gallone, A. הרכב כימי והפוטנציאל האנטי-מלנוגני של שמנים אתריים שונים. טעם Fragr. י' 2016, 31, 255–261. [CrossRef]

23. Hu, JJ; לי, X.; ליו, XH; Zhang, WP השפעה מעכבת של שמן אתרי לימון על פעילות טירוזינאז פטריות במבחנה. מוד. FoodSci. טכנול. 2015, 31, 97–105. [CrossRef]

24. מועצת אירופה. פרמקופיה אירופית, מהדורה 10; מועצת אירופה: שטרסבורג, צרפת, 2020; ISBN 978-92-871-8921-9.

25. Zheng, ZP; טאן, HY; חן, ג'; Wang, M. אפיון מעכבי טירוזינאז בזרדים של Cudrania tricuspidata ומחקר יחסי מבנה-פעילות שלהם. Fitoterapia 2013, 84, 242–247. [CrossRef] [PubMed]

26. וויליאמס, KP; Scott, JE עיצוב מבחני אנזים להקרנה בתפוקה גבוהה. בהקרנת תפוקה גבוהה. שיטות בביולוגיה מולקולרית (שיטות ופרוטוקולים); Janzen, WP, Paul, B., Eds.; Humana Press: Clifton, NJ, ארה"ב, 2009; כרך 565, עמ'. 107–126.

27. ברוקס, ח.ב; Geeganage, S.; קאהל, ס"ד; Montrose, C.; Sittampalam, S.; סמית', MC; Weidner, JR יסודות מבחני אנזימטיים עבור HTS. ב-Asay Guidance Manual; Markossian, S., Sittampalam, S., Grossman, A., Eds.; אלי לילי וחברה והמרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום: בת'סדה, MD, ארה"ב, 2004