Cistanche Tubulosa מגן על נוירונים דופמינרגיים באמצעות ויסות של אפופטוזיס וגורם נוירוטרופי שמקורו בתאי גליה: in Vivo ו-in Vitro-Ⅰ

מָבוֹא

מחלת פרקינסון (PD) היא מחלה נוירודגנרטיבית שכיחה המופיעה בקרב קשישים עם ביטויים פתולוגיים של אובדן של נוירונים דופמינרגיים ב-substantia nigra (SN) עקב ניוון. חומרת המחלה נמצאת בקורלציה עם אובדן תאי עצב של דופמין (DA) ב-SN, מה שעולה בקנה אחד עם הדעה שהתהליך הנוירוניווני מתקדם במשך שנים רבות לפני הופעת סימפטומים כלשהם (סויל ומאירס, 1993). האופי המתקדם של המחלה מציע אפשרויות מעניינות להתערבות טיפולית על ידי חסימת התהליך הנוירו-דגנרטיבי הבסיסי. החיפוש אחר פעולות חזקות וספציפיות הנגרמות על ידי טיפול של גורמים נוירוטרופיים על הישרדות נוירוני DA הוא אפוא בעל עניין רב.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA להגנה על נוירונים דופמינרגיים PHGS75% ECH 30% ACT 12%

גורמים נוירוטרופיים הם חלבונים חיוניים, כולל גורם גדילה עצבי (NGF), גורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF) וגורם נוירוטרופי שמקורו בתאי גליה (GDNF), אשר מקדמים צמיחת עצב, התפתחות נוירולוגית, הדרכה אקסונלית ותפקוד עצבי. בין כל הגורמים הנוירוטרופיים המגינים ומקדמים את תיקון הנוירונים הדופמינרגיים, ל-GDNF יש את ההשפעות החזקות ביותר (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). GDNF הוכח כבעל השפעות נוירוטרופיות חזקות על נוירוני DA במבחנה (Lin et al., 1993) ומפעיל השפעות נוירוטרופיות in vivo. הוכח כי GDNF מציל נוירוני DA ניגרלי ממוות תאי שנגרם כתוצאה מנגע לאחר אקטומיה כירורגית או רעלנית בחולדות (Beck et al., 1995; Kearns and Gash, 1995; Sauer et al., 1995) ובחלקו גם לאחר ניהול מערכתי שלN-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)בעכברים (Tomac et al., 1995). השכיחות המוגברת של אפופטוזיס נוירוני והפחתת השפעות ההגנה של גורמים נוירוטרופיים, שעלולים להופיע על ידי גורמים פתולוגיים שונים, עומדים בבסיס הניוון של נוירונים דופמינרגיים (Holden et al., 2006).

C. tubulosa היא תרופה צמחית שמקורה במספר צמחים מהסוג Cistanche. זוהי אפשרות טיפולית מרכזית לתסמונת מחסור בכליות הקשורה קשר הדוק להורמוני אנדרוגנים ברפואה הסינית המסורתית (TCM). עד כה, הרבה מחקרים קליניים ובסיסיים על C. tubulosa הראו את הפעילות של מחלות ניווניות. הזיהוי של מרשמים מגניב כליות TCM בטיפול ב-PD עשוי אפוא לספק טיפול קליני חלופי ל-PD.Echinacoside (ECH)הוא מרכיב ביואקטיבי עיקרי המצוי בצמח המרפא C. tubulosa. מחקרים הראו את ההשפעות הטיפוליות של גליקוזידים של Cistanche ו-ECH,verbascoside(VER), ו-icariin (ICA) על מחלת אלצהיימר (AD), PD וחולי דמנציה כלי דם אחרים (Urano and Tohda, 2010; Wang et al., 2013; Wu et al., 2014). וו וחב'. (2014) הציעו שתמציות C. tubulosa שהכילו מספיק ECH ואקטאוזיד שיפרו את התפקוד הקוגניטיבי שנגרם על ידי A -42 באמצעות חסימת שקיעת עמילואיד והיפוך תפקוד נוירוני דופמינרגי כולינרגי והיפוקמפוס. טאו וחב'. (2015) מצא את זהפנילתנואידים גליקוזידיםמ-C. tubulosa (Ph Gs-Ct) מנעו בצקת מוחית בגובה רב על ידי הפחתת ביטוי החלבון וה-mRNA של AQP4 ברקמת המוח של דגמי חולדות.

חטיפי תמצית סיטנשה טבעיים משפרים זיכרון PHGS75% ECH 30% ACT 12%

מחקרים קודמים הראו כי תרכובות צמחי מרפא סיניות, כולל שלושת המרכיבים של C. tubulosa, epimedium ו-rhizoma polygonati, הקלו על נזק לנוירונים דופמינרגיים ועל רמות דופמין על ידי ויסות הביטוי של גורמים נוירוטרופיים (Wu et al., 2013). לפיכך, עדיין לא ידוע אם ההשפעות הנוירו-פרוטקטיביות הנגרמות על ידי C. tubulosa הן ארוכות טווח ובאיזו מידה הצלה של נוירונים DA ניגרליים על ידי מתן GDNF יכולה להרשות לעצמה שימור משמעותי של התנהגויות מוטוריות הרלוונטיות לסימפטומטולוגיה של חיות PD. במחקר זה נעשה שימוש במתכון לחיזוק כליות מסוג TCM, C. tubulosa nanopowder, שקיבל פטנט לאומי (מספר פטנט: 2011103028541) בסין והראה בעבר השפעה טיפולית מסוימת ב-PD. המחקר הנוכחי, לפיכך, נועד לבחון את ההשפעות הנוירו-פרוקטטיביות והרגנרטיביות של טיפול ב-C. tubulosa ולחקור את האפופטוזיס על תאי MES23.5 וחולדות התנהגותיות סופיות, ואת הוויסות של GDNF, כפי שנמדד על ידי סוללת בדיקות מטרה .

חומרים ושיטות

חומרים, ריאגנטים וציוד

C. tubulosa נרכשה מ- Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., בייג'ינג, סין. ECH, VER ו-ICA הגיעו מהמכונים הלאומיים לבקרת מזון ותרופות, סין. קו התאים הנוירונים הדופמינרגיים MES23.5 היה מתנת פרופסור ביאו צ'ן, המעבדה לנוירוביולוגיה, אוניברסיטת קפיטל רפואית, בייג'ינג, סין. 50 עכברים זכרים C57BL/6 (במשקל 20-25 גרם כל אחד) נרכשו משנגחאי SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (מספר רישיון: SCXK2012-0002), שנחאי, סין.

MPP+, MTT וגלוטמין נרכשו מ-Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, ארה"ב); DMEM/F12 סרום בקר בינוני ועוברי נרכשו מחברת Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, ארה"ב); ו-MPTP, תקן DA ותקן חומצה הומונילית (HVA) נרכשו מ-Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, ארה"ב). נוגדני -actin, Bax, Bcl2, GDNF, GDNF משפחת קולטן אלפא (GFR 1) ונוגדנים Ret נרכשו מ- Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, ארה"ב); ערכת ריאגנטים לצביעה 3,3'-דיאמינובנזידין (DAB) נרכשה מ-Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Fujian, סין); וערכת הכנת דגימת ג'ל SDS-PAGE, ערכת זיהוי מוגברת כימילומינסנציה אולטרה-רגישה (ECL) ומבחן חומצה ביצינצ'ונינית (BCA) נרכשו מ-Beyotime Institute of Biotechnology (בייג'ינג, סין).

מחקר זה השתמש במכשירים הבאים: ELX800 קורא microplate (Bio Tek Winooski, VT, ארה"ב); חממת CO2 (Heraeus, Hanau, גרמניה); ג'ל DOC 2000 מערכת ניתוח הדמיית ג'ל, תא אלקטרופורזה ומיכל אלקטרופורזה (Bio-Rad, Hercules, CA, ארה"ב); מנתח חלבון DU-650 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, ארה"ב); צנטריפוגה מקורר במהירות גבוהה 5417R (אפנדורף, המבורג, גרמניה); טחנת כדורים פלנטריים כפולים SXQM (Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Hunan, סין); טחנת מיקסר MM400 (Retsch GmbH, Haan, גרמניה); Agilent 1200 כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC; Agilent Technologies, סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב); PowerPac Basic אלקטרופורזה, PowerPac Basic מערכת העברת ממברנה, Universal Hood II chemiluminescence imager, S1000 Thermal Cycler RNA מערכת שעתוק לאחור (Bio-Rad); מערכת Motic Med 6.0 לניתוח רקמות ותמונה (Motic China Group, Co., Ltd, Xiamen, China).

הכנה שלC. tubulosaננו-אבקה

C. tubulosa נשקל, לאחר מכן טוהר והתייבש. לאחר פירוק קונבנציונלי, אבקת C. tubulosa דקה הועברה דרך מסננת רשת 200- וייבוש בהקפאה. טחנת כדורים עם שליטה בטמפרטורה ובאנרגיה גבוהה שימשו להכנת ננו-אבקת C. tubulosa. ראשית, ננו-אבקת C. tubulosa גולמית הונחה במיכל טחינה כדורי ואקום שהיה עמוס בכדורי טחינה קרביד. היחס בין כדורי הטחינה ל-C. tubulosa nanopowder נע בין 15:1 ל-5:1. כדי להשיג אבקה דקה, המהירות ומשך הזמן של טחנת הכדורים עתירת האנרגיה נקבעו ל-300 סל"ד ו-20 דקות, בהתאמה. האבקה העדינה נשקללה לעיבוד חומרים ננומטריים ועובדה בטחנת המיקסר בתדירות של 25/s ותנודה של 20 שניות לשלוש חזרות. PBS שימש להמסה והכנת תמיסה של 25 מ"ג/מ"ל, ואחריה 30 דקות של בדיקת קול, חיטוי, ולבסוף אחסון ב-20◦C.

בקרת איכות של הרכיבים הפעילים שלC. tubulosaעל ידי HPLC

ה-ECH וה-VER הכילו פליטת גרדיאנט עם סיליקה קשורה אוקטדצילסילאן כחומר מילוי, מתנול כפאזה A ניידת, ותמיסת חומצה פורמית של 0.1% כפאזה B ניידת. אורך הגל הזיהוי היה 330 ננומטר. ה-ICA הכיל פליטת גרדיאנט עם סיליקה קשורה אוקטדצילסילאן כחומר מילוי ומים אצטוטריל (30:70) כשלב הנייד. אורך הגל לזיהוי היה 270 ננומטר. המדגם, הביקורת והביקורת השלילית נמדדו כ-10 μL כל אחד עבור הבדיקה.

תרבית תאים ומבחן MTT למדידת כדאיות MPP+-תאים מטופלים

תאי MES23.5 חוסנו עם 5% סרום עגל עוברי, 1% גלוטמין, 2% 50× תמיסה של Sato ו-DMEM/F12 מדיום עם 2% פניצילין/סטרפטומיצין. הם הודגרו ב-37◦C באינקובטור של 5% CO2 עם לחות רוויה. התאים בודדו והועברו עם 0.25% טריפסין ותרחיף התאים נקצר בשלב הצמיחה הלוגריתמי. תאים מבודדים עם צפיפות של 1 × 105 נזרעו לצלחות 96- מצופות פוליליזין, ולאחר מכן הוספת ריכוזים סופיים שונים (6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 ו-800 מיקרומול/ליטר ) של מדיה MPP+. תאי MES23.5 שהודגרו עם מדיום תרבות רגיל במשך 24 שעות ו-48 שעות שימשו כבקרות שליליות בניסויים במבחנה. התאים מקבוצות הטיפול השונות הודגרו עם מגיב MTT למשך 4 שעות. התמיסה בבארות הושלך לאחר מכן ונוספו 150 μL של DMSO ותנודה למשך 10 דקות. הספיגה של כל דגימה באורך גל של 570 ננומטר נמדדה באמצעות קורא מיקרו-לוחות אוטומטי. אחוז כדאיות התא (%)=ממוצע הספיגה של קבוצת הניסוי/ספיגה ממוצעת של קבוצת הביקורת השלילית × 100%.

ריכוזים רלוונטיים של מדיום MPP+ נוספו לטיפול 24-שעתי בתאי MES23.5 תוך שימוש באותה גישה כמו לתרבית חוץ גופית. לאחר הטיפול, התמיסה בבאר נזרקה. מדיה המכילה ריכוזים שונים (10, 50, 100, 200, 250, 500 ו-1000 מיקרוגרם/מ"ל) של ננו-אבקת C. tubulosa נוספה לתאי MES23.5 בבארות שונות ונשארה לדגירה במשך 24 שעות ו-48 שעות. תאי MES23.5 שהודגרו עם מצע תרבות רגיל במשך 24 שעות ו-48 שעות שימשו כביקורות שליליות. תאי MES23.5 שהודגרו במדיום MPP+ שימשו ככלי הרכב. המדידות נעשו בשלושה עותקים עבור כל דגימה. הספיגה של קבוצות הטיפול והביקורת המקבילות נמדדה כדי לחשב את כדאיות התא.

תמצית סיטנשה טבעית נגד עייפות PHGS75% ECH 30% ACT 12%

ביטוי TH נמדד על ידי אימונוציטוכימיה

כאשר C. tubulosa nanopowder היה ב-100, 200 ו-250 מיקרוגרם/מ"ל, שיעור ההישרדות של התא עלה באופן משמעותי (איור 2G). לפיכך, בניסויים הבאים, בדקנו את שלושת הריכוזים: קבוצות במינון נמוך, במינון בינוני ובמינון גבוה. נבדקו שלושה שכפולים עבור כל אחת מקבוצות C. tubulosa. כיסויי כיסוי מעוקרים, מצופים בפוליזין, הונחו לתוך 6-צלחות באר. לאחר מכן, 5 × 104 תאים נזרעו בכל באר והודגרו במשך 24 שעות. מדיום טרי קונבנציונלי הוחלף בקבוצת הביקורת הרגילה וריכוז סופי של 100 µmol/L MPP+ מדיום הוחלף בקבוצות הטיפול הנותרות לדגירה למשך 24 שעות. לאחר מכן הוחלפו מדיות טריות קונבנציונליות בקבוצת הביקורת הרגילה וקבוצת הרכב, וריכוזים סופיים של 100, 200 ו-250 מיקרוגרם/מ"ל ננופודר C. tubulosa הודגרו עם התאים במשך 24 שעות במינון נמוך, בינוני וגבוה. קבוצות טיפול ב-C. tubulosa, בהתאמה. תאי MES23.5 בקבוצות השונות נשטפו שלוש פעמים ב-PBS כדי להסיר את הסופרנטנט וקיבוע עוד יותר ב-4% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות. לאחר שטיפה עם PBS, התאים הודגרו עם חוסם פרוקסידאז ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחר מכן נשטפו שוב עם PBS. נעשה שימוש בתמיסת 0.2% Triton X-100 לחדירת תאים למשך 10 דקות, ולאחר מכן כביסה עם PBS. סרום עיזים רגיל הוסף לכל דגימה והודגר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן הוסר סרום העיזים הרגיל והנוגדן הראשוני מדולל 1:400 ב-PBS הוסף לכל דגימה והודגר ב-4◦C למשך הלילה. התאים בקבוצת הביקורת השלילית הודגרו עם PBS ב-4◦C למשך הלילה. לאחר שטיפה עם PBS, התאים הודגרו עם נוגדנים משניים המסומנים ביוטין בתא הלחות ב-37◦C למשך 20 דקות. כל דגימה נשטפה לאחר מכן ב-PBS וסומנה עם חזרת פרוקסידאז-סטרפטווידין מצומדות (תמיסת עבודה C) ב-37◦C למשך 20 דקות. לאחר שטיפה עם PBS, התאים נצבעו עם מגיב DAB בחושך למשך כ-1-10 דקות ופיתוח של צבע חום נוטר במיקרוסקופ אור. לאחר מכן כל דגימה נשטפה פעמיים במים מזוקקים למשך 1-2 דקות והגרעינים נצבעו נגדי בתמיסת המטוקסילין למשך 0.5-1 דקות. לאחר שטיפה יסודית של כל דגימה במים, התאים נטבלו באלכוהול 1% חומצה הידרוכלורית לצורך התמיינות ו-1% אמוניה מימית, ולאחר מכן שטיפה יסודית של התאים במים. התאים מכל דגימה היו מיובשים ב-70% אתנול למשך 2 דקות, 80% אתנול למשך 2 דקות, 90% אתנול למשך 2 דקות פעמיים, 95% אתנול למשך 2 דקות פעמיים, ו-100% אתנול למשך 2 דקות פעמיים. לאחר מכן התאים נטבלו בתמיסת קסילן למשך 2 דקות פעמיים והותקנו על שקופית זכוכית עם שרפים ניטרליים. תחת מיקרוסקופ אור, כל דגימה עברה לכידת תמונה ובחירה אקראית של 5-10 שדות ראייה יעילים כדי לקבוע את הביטוי של חלבונים נבחרים בנוירונים דופמינרגיים המסומנים על ידי עוצמת החלקיקים החומים וכדי לכמת למחצה את תכולת החלבון לפי הערך האפור הממוצע שלו. .

קצב אפופטוזיס של תאי MES23.5 נמדד על ידי ציטומטריית זרימה

תאים דבקים נשטפו פעם אחת עם PBS. לבידוד תאים, נוספה כמות מתאימה של תמיסת טריפסין נטולת EDTA בטמפרטורת החדר והתמיסה בוצעה בפיפטציה בעדינות כדי לאפשר לתאים נצמדים להתנתק. לאחר מכן הוסף מדיום לתרבית תאים כדי לעצור את הטריפסיניזציה. התערובת הועברה לצינור צנטריפוגה חדש ולאחר מכן עברה צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-1500 סל"ד כדי לאסוף את התאים המבודדים. לאחר השלכת הסופרנטנט, גלולת התאים הושעתה מחדש בעדינות באמצעות PBS, והתאים נספרו. כ-1 × 105 עד 5 × 105 תאים מורחקים מחדש הועברו לצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-1500 סל"ד והסופרנטנט הושלך. חמישה מיקרוליטר של תמיסת קושרת Annexin V-FITC נוספו לכדורית התא כדי להשהות מחדש בעדינות את התאים. נוספו עוד 5 μL של Annexin V-FITC וערבבו היטב. חמישה מיקרוליטר של תמיסת יודיד פרופידיום שימשו לצביעה של תאים על ידי דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות זמן קצר לפני ציטומטריית הזרימה.

Western Blot Analysis עבורבַּמַבחֵנָה

התאים חולקו לקבוצה רגילה, קבוצת טיפול MPP+, במינון נמוךC. tubulosaקבוצת טיפול, קבוצת טיפול C. tubulosa במינון בינוני וקבוצת טיפול ב-C. tubulosa במינון גבוה. הביטוי של Bcl2 ו-Bax נמדד בכל אחד מהם. סך של 1 × 105 תאים לבאר בצלחת 6-הבאר שימשו למידול וטיפול בכל קבוצה לפני קצירת התאים. ליזאט מעורב, המכיל חיץ RIPA, מעכב פרוטאז ומעכבי פוספטאז, התווסף לליזה של התאים למשך 30 דקות על קרח. לאחר צנטריפוגה, הסופרנטנט שימש לניתוח חלבון. החלבון הכולל הוכמת באמצעות בדיקת BCA והופרד על ידי 10% SDS-PAGE. החלבונים המופרדים הועברו לממברנה והודגרו עם חיץ חוסם חלב רזה של 5% בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר מכן הודגרה הממברנה בנוגדן ראשוני (Bcl-2 0.34 מ"ג/מ"ל, Bax 0.11 מ"ג/מ"ל, דילול 1:200) ב-4◦C למשך הלילה. לאחר שלב כביסה, הממברנה הודגרה בנוגדן משני (0.5 מ"ג/מ"ל, דילול 1:5000) ב-4◦C למשך שעה אחת ולאחר מכן במפתח ECL למשך 2 דקות לפיתוח קונבנציונלי. תוכנת Quantity One שימשה לניתוח חצי כמותי של ביטוי חלבון.

סיטנשה טבעית להגנה על כבד נגד עייפות PHGS75% ECH 30% ACT 12%

מודלים ניסויים של בעלי חיים וניהול תרופות

חמישים עכברים זכרים בני שבוע 8-ללא פתוגנים ספציפיים חולקו אקראית לחמש קבוצות: קבוצה רגילה, קבוצת טיפול MPTP (רכב), קבוצת טיפול במינון נמוך של C. tubulosa, טיפול במינון בינוני של C. tubulosa קבוצה, וקבוצת טיפול במינון גבוה של C. tubulosa. החיות אוכסנו בטמפרטורה של 20-22◦C עם גישה חופשית למזון ומים. לעכברים בקבוצה הרגילה הוזרק תוך צפק עם נפח שווה של תמיסת מלח רגילה במשך שבעה ימים רצופים. העכברים בקבוצות הטיפול האחרות הוזרקו תוך-צפקית עם MPTP (30 מ"ג/ק"ג/ד') במשך שבעה ימים רצופים כדי להקים כלי רכב.

במהלך מודל PD, העכברים בקבוצות הטיפול במינון נמוך, במינון בינוני ובמינון גבוה של C. tubulosa ניתנו תוך קיבה בנפחים קליניים מקבילים של 4 גרם/ק"ג/ד', 8 גרם/ק"ג/ד' ו-16 גרם/ ק"ג/דC. tubulosa nanopoder, בהתאמה, במשך 14 ימים רצופים. העכברים בקבוצת הביקורת והרכב קיבלו תוך קיבה נפחים מקבילים של תמיסת מלח רגילה במשך 14 ימים רצופים. כל ההליכים הניסויים אושרו על ידי הוועדה האתית של אוניברסיטת פוג'יאן של TCM ובוצעו על פי העקרונות המקובלים בעולם לשימוש וטיפול בחיות מעבדה. כל המאמצים נעשו כדי למזער סבל של בעלי חיים במחקר זה.