Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosides מעוררים אפופטוזיס בתאי Eca-109 דרך הנתיב התלוי במיטוכונדריה
Mar 06, 2022
איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com
CHANGSHUANG FU, JINYU LI, ADILA AIPIRE, LIJIE XIA, YI YANG, QIUYAN CHEN, JIE LV, XINHUI WANG ו-JINYAO LI
תַקצִיר
Cistanche tubulosaבעל תפקידים ביולוגיים שונים. במחקר הנוכחי, נחקרה ההשפעה האנטי-גידולית של גליקוזידים מסיסים במים של פנילתנואידים של C. tubulosa (CTPG-W) על סרטן הוושט. תאי Eca-109 טופלו ב-CTPG-W וכדאיות התא נמדדה על ידי מבחן MTT. האפופטוזיס, מחזור התא, פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריה (Δψm) ומינים של חמצן תגובתי נותחו על ידי ציטומטריית זרימה. רמות החלבונים במסלולים אפופטוטיים זוהו על ידי אנליזה של Western blot. נקבע כי CTPG-W הפחית משמעותית את הכדאיות של תאי Eca-109 באמצעות השראת אפופטוזיס ועצירת מחזור התא. לאחר טיפול ב-CTPG-W, ה-Δψm של Eca-109 ירד באופן ניכר, אשר קשור לרמות המווסתות של לימפומה מסוג B-cell-2 (Bcl-2) הקשורות ל-X ולרמות מטה. של Bcl-2. כתוצאה מכך, הרמות של ציטוכרום c ו-c-Jun NH2-טרמינלי קינאז עלו, מה שהעלה את הרמות של פולימראז מפוצל (ADP-ribose) ו-Caspase מפוצל-3, {{18} } ו--9, אך לא caspase-8. בהתאם, הרמות של מיני חמצן תגובתיים בתאי Eca-109 הראו שינויים בולטים. תוצאות אלו הצביעו על כך ש-CTPG-W גרמה לאפופטוזיס של תאי Eca-109 דרך מסלול תלוי מיטוכונדריה.
מבוא
סרטן הוושט הוא אחד מסוגי הסרטן הנפוצים ביותר עם שיעור התחלואה ה-11 בגובהו ושיעור התמותה ה-6 בגובהו בעולם וגרם ל-439,000 תמותה בשנת 2015 (1). השכיחות של סרטן הוושט משתנה במיוחד בין אזורים שונים, כאשר מזרח אסיה ומזרח ודרום אפריקה מציגים את שיעורי ההיארעות הגבוהים ביותר ומערב אפריקה מציגים את השיעורים הנמוכים ביותר בשנת 2012 (1,2). בסין, אומדן המקרים והתמותה של סרטן הוושט היו 477,000 ו-375,000, בהתאמה, בשנת 2015 (3). למרות ששיעור התחלואה בסרטן הוושט ירד במדינות אינדקס סוציו-דמוגרפי בינוני וגבוה-בינוני בין השנים 2005 ו-2015, שיעור התמותה נותר גבוה עקב הפרוגנוזה הגרועה (1,4). השילוב של כריתה כירורגית עם כימותרפיה או הקרנות שימש לטיפול בסרטן הוושט, עם זאת, דווח שבין 2003 ל-2014 שיעור ההישרדות של 5-שנה נשאר<20% in="" china,="" the="" usa,="" and="" europe="" (4,5).="" for="" these="" reasons,="" it="" is="" urgent="" to="" develop="" novel="" therapeutic="" agents="" to="" treat="" esophageal="">
רפואת צמחי מרפא סינית מסורתית (CHM) שימשה לטיפול בסוגי סרטן שונים, כולל סרטן ריאות של תאים לא קטנים (6), סרטן המעי הגס (7), קרצינומה של הכבד (8). לאחרונה, הניסויים הקליניים דיווחו כי השילוב של CHM עם כימותרפיה או הקרנות לא רק הוכיח מספר יתרונות על איכות החיים והקלה על תופעות הלוואי הנגרמות על ידי כימותרפיה או הקרנות (9,10), אלא גם שיפר את שיעור ההישרדות של החולים עם סרטן ריאה, כבד, קיבה, המעי הגס, חלחולת, אף או צוואר הרחם (9). עם זאת, קיימות עדויות סותרות לגבי היעילות של טיפול CHM בסרטן הוושט (10,11). מחקרים רבים קבעו שמספר תרופות או רכיבים צמחיים יכולים לעכב את הצמיחה של תאי סרטן הוושט במבחנה ובאינבו, כולל Andrographis paniculata (12,13), Daikenchuto (14), icariin (15), Rosa Roxburghii Tratt ו-Fagopyrum Cymosum (16), Jaridonin (17), Marsdenia tenacissima (18), OP16 (דיטרפנואיד חדשני ent-kaurene) (19), Qigesan (20) ומרתח טונגליאני (21). Cistanche הוא סוג של CHM ומפעיל פונקציות ביולוגיות שונות, כולל אנטי חמצון, אנטי דלקתיות והגנה עצבית (22,23). המחקר הקודם שלנו הוכיח זאתCistanche tubulosa phenylethanoid גליקוזידים(CTPG) יכול לדכא את הצמיחה של תאי מלנומה B16-F10 in vitro ו-in vivo (24). עם זאת, מסיסות המים הירודה של CTPG בשימוש בעבר מגבילה את פיתוח התרופה (24). לכן, נעשה שימוש ב-CTPG מסיס במים (CTPG-W) ונחקרה ההשפעה האנטי-גידולית על תאי סרטן הוושט (Eca-109). נקבע כי CTPG-W יכול לעכב באופן תלוי מינון את הכדאיות של תאי Eca-109 באמצעות אינדוקציה של אפופטוזיס דרך מסלול תלוי מיטוכונדריה.
חומרים ושיטות בעלי חיים.
נקבות עכברי C57BL/6 (6-8 שבועות, ~25 גרם) נרכשו מהמרכז לחקר בעלי חיים במעבדת בייג'ינג (בייג'ינג, סין) ושוכנו בטמפרטורה מבוקרת (25˚C), עם מחזור אור (12/ 12) מתקן לבעלי חיים של אוניברסיטת שינג'יאנג (אורומצ'י, סין). כל החיות קיבלו מים ומזון ללא פתוגנים.
קו תאים ותרבות. קו תאי קרצינומה של הוושט האנושי (Eca-109) נשמר על ידי מעבדת המפתח של שינג'יאנג למשאבים ביולוגיים והנדסה גנטית (המכללה למדעי החיים והטכנולוגיה, אוניברסיטת שינג'יאנג, אורומצ'י, סין) ותופח ב-RPMI{{1} } בינוני (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, ארה"ב) בתוספת של 10% סרום בקר עוברי מושבת בחום (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, סין), 1% L -גלוטמין (100 מ"מ), 100 U/ml פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ב-37°C באווירה לחה המכילה 5 אחוז CO2.
כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC). CTPG-W (מספר קטלוגי SGJG20170410) נרכש מ-Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Shanghai, סין). התרכובות העיקריות של CTPG הוסמכו וכומתו על ידי HPLC על פי המחקר הקודם שלנו (24). בקצרה, HPLC בוצע על עמודת ZORBAX SB-C18 (250x4.6 מ"מ; 5 מיקרומטר) ב-30˚C ונשלף עם תמיסת חומצה פורמית של 0.2 אחוז ושיפוע של מתנול החל מ-23 אחוז, שכן 1 מ"ל הוסיפו כל דקה למשך 45 דקות עד שמגיעים ל-31 אחוזים. סה"כ דגימה של 10 μl הוזרקה וזוהתה ב-330 ננומטר. תקן ה-Echincoside נרכש מ-Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (שנחאי, סין), ותקן ה-acteoside נרכש מ-Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, גרמניה). הסטנדרטים שימשו לניתוח המרכיבים של CTPG-W.
בדיקת MTT. שגשוג תאים נמדד במבחן MTT. תאי Eca{{0}} חוסנו לתוך 96-צלחות באר בצפיפות של 5x103 תאים ב-100 µl RPMI{{5 }} בינוני/באר ומתורבת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, ולאחר מכן טופל בריכוזים שונים (0, 200, 400, 600 ו-800 מיקרוגרם/מ"ל) של CTPG-W או 0.4 אחוז דימתיל סולפוקסיד (DMSO) למשך 24, 48 ו-72 שעות. DMSO שימש כבקרת ממס (800 מיקרוגרם/מ"ל CTPG-W המכיל 0.4 אחוז DMSO). Cisplatin (20 מיקרוגרם/מ"ל) שימש כביקורת חיובית. לאחר מכן, הסופרנטנט נזרק בעקבות צנטריפוגה ב-225 xg למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ו-100 µl תמיסה של MTT (0.5 מ"ג/מ"ל במדיום RPMI-1640 ללא FBS) נוספה לכל באר והודגרה ב-37°C למשך 3 שעות. גבישי הפורמזן שנוצרו הומסו ב-200 μl DMSO. ערכי הצפיפות האופטית (OD) נמדדו באורך גל של 490 ננומטר על ידי 96-קורא microplate באר (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ארה"ב). כדאיות התא היחסית חושבה לפי הנוסחה: כדאיות התא ( אחוז )=(ODtreated/ODuntreated)x100 אחוז . המורפולוגיה של תאי Eca-109 נצפתה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך (הגדלה, x200) (Nikon Eclipse Ti-E; Nikon Corporation, טוקיו, יפן).
לצורך התפשטות הספלנוציטים, עכברי C57BL/6 הורדמו על ידי נקע בצוואר הרחם, והטחול בודד. ההשעיה החד-תאית נוצרה וספלנוציטים זרעו לתוך 96-צלחות באר בצפיפות של 1x105 תאים/באר במדיום RPMI-1640 של 100 µl, ולאחר מכן טופלו בריכוזים שונים (0, 200, 400, 600 ו-800 מיקרוגרם/מ"ל) של CTPG-W למשך 24, 48 ו-72 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5 אחוז CO2. התפשטות הספלנוציטים נמדדה על ידי בדיקת MTT, על פי הפרוטוקול הנ"ל. אינדקס מגרה=ODtreated/ODuntreated.
מדידת אפופטוזיס ומחזור התא. תאי Eca{{0}} תורבו בצלחות של 60 מ"מ בצפיפות של 2.5x105 תאים לצלחת במשך 24 שעות וטופלו בריכוזים שונים ({{31} }, 200, 400, 600 ו-800 µg/ml) של CTPG-W או 0.4 אחוז DMSO למשך 24 שעות ב-37°C עם 5 אחוז CO2. תאים נאספו ונצבעו עם ערכת איתור אפופטוזיס של אנקסין V-fluorescein (FITC)/פרופידיום יודיד (PI) (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, סין), בהתאם לפרוטוקולים של היצרן. דגימות נאספו על ידי ציטומטריית זרימה (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, ארה"ב) ונותחו על ידי FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, ארה"ב). כדי לנתח את ההשפעה של CTPG-W על מחזור התא, 2.5x105 Eca-109 זרעו תאי תרבית בגודל 60 מ"מ וטופלו ב-CTPG-W (0, 100, 200 ו-400 מיקרוגרם/מ"ל) או 0.4 אחוז DMSO למשך 24 שעות ב-37˚C עם 5 אחוז CO2. כל התאים נקצרו ונשטפו פעמיים עם PBS קר כקרח (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), ולאחר מכן קבוע באתנול קר כקרח ב-4°C למשך 30 דקות. לאחר שטיפה פעמיים עם PBS קר כקרח, התאים הושעו מחדש במאגר צביעה של 300 μl PI/RNase (BD Biosciences, סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. התפלגות מחזור התא נותחה עם תוכנת ModFit LT 3.0 על ידי ציטומטריית זרימה (BD FACSCalibur).
ניתוח של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (Δψm) ומיני חמצן תגובתיים (ROS). כדי לנתח את ה-Δψm, תאי Eca{{0}} טופלו ב-CTPG-W (0, 400, 600 ו-800 מיקרוגרם/מ"ל) או 0.4 אחוז DMSO עבור 24 שעה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5 אחוז CO2, וצובעים בערכת בדיקת פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית עם JC-1 (ביוטיים המכון לביוטכנולוגיה, שנחאי, סין), לפי פרוטוקול היצרן, למשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס . לאחר כביסה פעמיים עם חיץ כביסה JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology), הדגימות הושעו מחדש עם חיץ כביסה של 300 µl JC-1 ונותחו באמצעות ציטומטריית זרימה (BD FACSCalibur). הקרינה של צבע JC-1 בתאי Eca-109 נצפתה גם עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך (הגדלה, x200; Nikon Eclipse Ti-E). לצורך ניתוח של ROS, תאי Eca-109 טופלו ב-CTPG-W (0, 400, 600 ו-800 מיקרוגרם/מ"ל) במשך 2, 4, 6, 12 ו-24 שעות, והוצבעו במין חמצן ריאקטיבי ערכת בדיקה (ביוטיים מכון לביוטכנולוגיה), לפי פרוטוקול היצרן, למשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר כביסה שלוש פעמים עם PBS קר כקרח, דגימות נאספו באמצעות ציטומטריית זרימה (BD FACSCalibur) ונותחו על ידי תוכנת FlowJo 7.6.
פעילות ניקוי רדיקליים של 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). פעילות ניקוי הרדיקלים החופשיים של CTPG-W נקבעה עם בדיקת DPPH רדיקלים חופשיים לפי הפרוטוקול שפורסם עם שינוי מינורי, שכן מתנול הוחלף באתנול כדי להמיס DPPH (25,26). למדידות במצב יציב, 150 µl DPPH (100 mmol/l) באתנול מעורבב עם ריכוזים שונים של CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 ו-600 מיקרוגרם/מ"ל) ב-50 מיקרוגל PBS, והודגר בחושך למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הספיגה ב-517 ננומטר זוהתה בנוכחות והיעדר CTPG-W. סה"כ 50 μl של ויטמין C שימשו כביקורת חיובית. פעילות ההסרה הרדיקלית של DPPH חושבה באמצעות הנוסחה: איסוף ( אחוז )=[1-(A sample-Ablank)/A0] x100, כאשר Ablank היא הספיגה של הבקרה (ללא DPPH), דגימה היא הספיגה של המדגם ו-A0 היא הספיגה של PBS עם DPPH.
ניתוח כתם מערבי. תאי Eca{{0}} טופלו ב-CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) או 0.4 אחוז DMSO למשך 24 שעות ב-37°C עם 5 אחוז CO2. הכביסה הבאה פעמיים עם PBS, תאים עברו lysis ב-Radioimmunoprecipitation Assay חיץ ליסיס (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., בייג'ינג, סין) במשך 20 דקות על קרח. לאחר צנטריפוגה ב-10,000 xg למשך 10 דקות ב-4˚C, הסופרנטנטים נאספו, וריכוזי חלבון זוהו עם ערכת חומצה ביצינצ'ונינית (Thermo Fisher Scientific, Inc.) בהתאם לפרוטוקולים של היצרן. ניתוח הכתם המערבי בוצע על פי התיאור הקודם שלנו (24). הנוגדנים נגד קספס-7 (מס' קטגוריה D120077), קספס-8 (מספר קטגוריה D155240), קספס-9 (מספר קטגוריה D220078), לימפומה של תאי B{ {24}} (Bcl-2) הקשורים ל-X (Bax) (מספר קטגוריה D220073) ו-Bcl-2 (מספר קטגוריה D260117), ופרוקסידאז נגד IgG-חזרת עכברים (HRP) ) (מספר קטגוריה D111050) ו-IgG-HRP נגד ארנבת (מספר קטגוריה D110058) נרכשו מ-BBI Life Sciences (שנחאי, סין). הנוגדנים נגד קספס-3 (מספר קטגוריה E-AB-10050) וקספאז פעיל-3 (מספר קטגוריה E-AB-22115) נקנו מ-Elabscience ( ווהאן, סין). נוגדנים אחרים נגד קספס-7 (מספר קטגוריה 9492), פולימראז פולי (ADP-ribose) (PARP) (מספר קטגוריה 9542), ציטוכרום c (מספר קטגוריה AC909), c-Jun NH{ {48}}טרמינלי קינאז (JNK) (מספר קטגוריה 9252S), ו-אקטין (מספר קטגוריה 58169) התקבלו מ- Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, ארה"ב). כל הנוגדנים הראשוניים והמשניים היו מדוללים ב-1:1,000. הנוגדנים הראשוניים הודגרו ב-4°C למשך הלילה והנוגדנים המשניים הודגרו ב-37°C למשך שעה.
חלבוני המטרה זוהו באמצעות ערכת בדיקת כימילומינסנציה משופרת (Beyotime Institute of Biotechnology), על פי פרוטוקול היצרן.
ניתוח סטטיסטי. מובהקות סטטיסטית חושבה על ידי ניתוח חד-כיווני של השונות עם מבחן הפוסט-הוק של Tukey והתוצאות נותחו באמצעות תוכנת GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, ארה"ב) בקרב קבוצות הטיפול והביקורת. כל הנתונים הוצגו כממוצע ± סטיית התקן. פ<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Cistanche tubulosa phenylethanoid גליקוזידים(CTPG)
תוצאות
CTPG-W מדכא את הצמיחה של תאי Eca-109. הרכיבים של CTPG-W הוסמכו וכומתו על ידי HPLC (איור 1), אשר הושוו עם הסטנדרטים של echinacoside ו-acteoside. על פי זמני השיא של השיא ואזורי השיא, CTPG-W הכיל 39.16 אחוזים של אכינאקוסיד ו-2.44 אחוזים של אקטאוזיד. ראשית, ההשפעה של CTPG-W על הכדאיות של תאי Eca-109 נקבעה באמצעות בדיקת MTT. CTPG-W הומס ב-DMSO ב-200 מ"ג/מ"ל ומדולל במדיום RPMI-1640 המכיל 10 אחוז FBS מושבת בחום לריכוזים המצוינים. תאי Eca-109 טופלו ב-CTPG-W וכדאיות התא נותחה במבחן MTT בנקודות הזמן המצוינות. טיפול ב-CTPG-W הפחית באופן משמעותי את הכדאיות של תאי Eca-109 באופן תלוי מינון וזמן (P<0.001; fig.="" 2a).="" the="" morphology="" of="" eca-109="" cells="" was="" observed="" with="" an="" inverted="" fluorescence="" microscope="" (magnification,="" x200)="" following="" ctpg‑w="" treatment="" for="" 24="" h,="" which="" changed="" notably="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" with="" the="" cells="" shrinking="" and="" becoming="" round="" following="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 2b).="" these="" results="" indicate="" that="" ctpg-w="" suppresses="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells.="" the="" effect="" of="" ctpg-w="" on="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" was="" also="" detected="" with="" an="" mtt="" assay.="" ctpg-w="" significantly="" promoted="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="" 2c),="" indicating="" that="" it="" has="" no="" cytotoxic="" effect="" on="">
CTPG-W משרה אפופטוזיס בתאי Eca-109. כדי לחקור האם CTPG-W דיכא את הצמיחה של תאי Eca-109 באמצעות אינדוקציה של אפופטוזיס או נמק, תאים טופלו בריכוזים שונים של CTPG-W. לאחר 24 שעות, האפופטוזיס והנמק של תאי Eca-109 זוהו עם צביעה של Annexin V/PI. כפי שמתואר באיור 3A, תאי אנקסין V-/PI פלוס הוגדרו כתאים נמקיים, ותאי Annexin V plus /PI plus ו-Annexin V plus /PI- הוגדרו כתאים אפופטוטיים. CTPG-W גרמה בעיקר לאפופטוזיס של תאי Eca-109 באופן תלוי מינון, אם כי גם תאי ה-Eca{12}} הנמקיים עלו באופן משמעותי בטיפול של 600 ו-800 מיקרוגרם/מ"ל CTPG-W (P<0.001 at="" 600="" µg/ml="" and=""><0.05 at="" 800="" µg/ml).="" consistently,="" the="" levels="" of="" pro-apoptotic="" bax="" and="" anti-apoptotic="" bcl-2="" in="" eca-109="" cells="" were="" upregulated="" and="" downregulated,="" respectively,="" upon="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 3b).="" the="" results="" indicated="" that="" ctpg-w="" primarily="" inhibited="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells="" through="" the="" induction="" of="">
CTPG-W גורם להפסקת מחזור התא בשלב S בתאים Eca-109. הפרעה במחזור התא הסרטני תדכא את צמיחת התאים ותקדם אפופטוזיס (27). התפלגות מחזור התא בתאי Eca-109 זוהתה עם צביעת PI בעקבות טיפול CTPG-W במשך 24 שעות. נצפה כי תאים בשלב S עלו ותאים בשלבי G0/G1 הצביעו על ירידה משמעותית כוללת בטיפול ב-CTPG-W (P<0.05; fig.="" 4),="" indicating="" that="" ctpg-w="" arrests="" the="" eca-109="" cell="" cycle="" at="" the="" s="">
CTPG-W מקטין את Δψm וגורם לשחרור ציטוכרום c. אפופטוזיס יכול להיות מושרה על ידי מסלול תלוי מיטוכונדריה (28,29). החברים הפרו-ואנטי-אפופטוטיים של משפחת חלבוני BCL-2 ממלאים תפקידים חשובים בוויסות שלמות הממברנה המיטוכונדריאלית (30,31). לאחר טיפול CTPG-W במשך 24 שעות, ה-Δψm הוערך באמצעות צביעה JC-1. צבר JC-1 (קרינה אדומה שזוהתה ב-FL-2) יתפרק למונומר (קרינה ירוקה זוהתה ב-FL-1) כאשר Δψm מצטמצם (32). כפי שמתואר באיור 5A, התדרים של תאי FL-1 בתוספת FL-2-/פלוס עלו באופן משמעותי באופן תלוי מינון, מה שמצביע על כך שה-Δψm של תאי Eca-109 ירד. שינויי הקרינה בתאי Eca-109 נצפו גם עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך (איור 5B). עם הגדלת הריכוזים של CTPG-W, הקרינה האדומה ירדה והקרינה הירוקה עלתה, מה שעולה בקנה אחד עם הנתונים מ-flow cytometry. כמו כן, נצפה כי רמת הציטוכרום c בציטוזול גדלה באופן ניכר (איור 5C), שהיא תוצאה של הפחתה של Δψm. זה מחזק את המסקנה שהתקבלה מהספירה המוגברת של FL-1 פלוס FL-2-/ פלוס תאים ש-Δψm ירד כתוצאה מטיפול ב-CTPG-W. דווח ש-JNK יכול לווסת את ההפעלה של משפחת חלבוני BCL-2 הגורמת לשחרור ציטוכרום c (33-35). כמו כן, נקבע כי רמת ה-JNK הייתה מווסתת במיוחד בעקבות טיפול ב-CTPG-W (איור 5C). התוצאות הצביעו על כך ש-CTPG-W עשוי לגרום לאפופטוזיס של תאי Eca-109 דרך מסלול תלוי מיטוכונדריה.
ההשפעה של CTPG-W על יצירת ROS תוך תאי. ROS יכול להפחית את Δψm כדי לגרום לאפופטוזיס (36). כדי לחקור אם CTPG-W יכול להגביר את ייצור ROS, תאי Eca-109 טופלו בריכוזים שונים של CTPG-W. תאים נאספו בנקודות הזמן המצוינות והוצבעו עם DCFH-DA. הייצור של ROS תוך תאי בתאי Eca-109 נקבע על ידי ציטומטריית זרימה. כפי שמתואר באיור 6A, 800 מיקרוגרם/מ"ל CTPG-W הגדיל באופן משמעותי את ייצור ROS מ-2-6 שעות וירד מ-12-24 שעות. בנוסף, 400 מיקרוגרם/מ"ל CTPG‑W הגדילו משמעותית את ייצור ה-ROS מ-12-24 שעות. יתר על כן, 200 מיקרוגרם/מ"ל CTPG-W לא שינו באופן משמעותי את ייצור ROS. השינויים הדינמיים של ייצור ROS עשויים להיות קשורים לאפופטוזיס של תאי Eca-109. כמו כן, נקבע של-CTPG-W הייתה פעילות ניקוי רדיקלים חופשיים (איור 6B), אשר עשויה להיות קשורה לירידה בייצור ROS בתאי Eca-109 שטופלו ב-800 מיקרוגרם/מ"ל CTPG-W לאחר 12 שעות.
CTPG-W מגביר את הפעילות של caspase-3, caspase-7, caspase-9 ו-PARP. שחרור ציטוכרום c עקב הפחתת Δψm יכול להפעיל את פרוטאזות הקספאז כדי לגרום לאפופטוזיס (29,30,37). לאחר טיפול CTPG-W במשך 24 שעות, ההפעלה של caspase-3, 7, 8, 9 ו-PARP זוהתה בניתוח Western blot. בהשוואה לבקרה, הרמות של קספאזה מפוצלת-9, קספאזה מפוצלת-7, קספאזה מפוצלת-3 ו-PARP מפוצלת, אך לא הרמות של קספס מפוצל{{ 20}}, הווסרו על ידי טיפול CTPG באופן תלוי מינון (איור 7). תוצאות אלו הצביעו על כך ש-CTPG-W הפחית את Δψm וקידם שחרור ציטוכרום c להפעלת קספסות המעוררות אפופטוזיס של תאי Eca-109.
תמצית Cistanche tubulosa
דִיוּן
CHM מסורתי יכול לגרום לאפופטוזיס של תאי סרטן הוושט דרך מסלולים שונים, כולל קולטן המוות החיצוני, מסלולי הלחץ המיטוכונדריאליים והאנדופלזמיים (29). המחקר הקודם שלנו הראה ש-CTPG, כמרכיב העיקרי של C. tubulosa, עיכב את הצמיחה של תאי מלנומה B16-F10 באמצעות השראת אפופטוזיס דרך מסלול תלוי מיטוכונדריה (24). במחקר הנוכחי, נחקרה ההשפעה האנטי-גידולית של CTPG-W על תאי Eca-109 ונקבע כי CTPG-W דיכא את הצמיחה של תאי Eca-109, גרם לאפופטוזיס ועצירת מחזור התא, הפחתת Δψm, הגבירה את שחרור ציטוכרום c וקספאזות מופעלות. CTPG ו-CTPG-W יכולים לגרום לאפופטוזיס ולעצירת מחזור תאים בתאי סרטן. עם זאת, המנגנונים המדויקים שונים בשל המרכיבים השונים של CTPG (26.64 אחוז אכינאקוסיד, 10.19 אחוז אקטאוזיד ו-1.71 אחוז איזואקטאוזיד) ו-CTPG-W (39.16 אחוז אכינאקוסיד ו-2.44 אחוז אקטאוזיד). CTPG עצר תאי B16-F10 בשלבי G0/G1, אך CTPG-W עצר תאי Eca-109 בשלב S (24). ייצור ROS גדל בהתאם למינון על ידי CTPG, אך הוא הצביע על שינוי באופן תלוי זמן על ידי מינון גבוה של CTPG-W, שעלה משמעותית בתחילת הטיפול ב-CTPG-W (2-6 שעות) ו ירד באופן משמעותי לאחר 12 שעות, בהשוואה לביקורת. סיבה אפשרית היא שהמרכיב העיקרי של CTPG-W הוא echinacoside. מספר מחקרים דיווחו שאכינאקוסיד יכול לעכב ייצור ROS ואפופטוזיס המושרה על ידי ROS כדי להפעיל את ההשפעות הנוירו-פרוקטטיביות והאנטי-אייג'ינג שלו (38-40). באופן דומה, פעילות ניקוי הרדיקלים החופשיים נצפתה במחקר הנוכחי. לכן, השערה הייתה שרכיבים מסוימים, כולל verbascoside, iso-verbascoside ו-salidroside במינון גבוה של CTPG-W עשויים לגרום מיד ליצירת ROS לגרום לאפופטוזיס של תאי Eca-109 (41,42), ולאחר מכן ROS נספה על ידי echinacoside. סיבה אפשרית נוספת להבדלים בייצור ROS על ידי CTPG ו-CTPG-W היא ששורות תאים שונות שימשו במחקר זה ובמחקר קודם (24). Dong et al (43) דיווחו שאכינאקוסיד יכול לגרום לאפופטוזיס של תאי סרטן המעי הגס SW480 אנושיים באמצעות יצירת נזקי DNA חמצוני ללא רמות ROS מוגברות.
טיפול ב-CTPG-W הפחית את Δψm וגרם לשחרור של ציטוכרום c, המקדם את המחשוף של קספס-9 (28). באופן עקבי, הרמות של קספאז מפוצל-9 הוסרו על ידי טיפול CTPG-W. לאחר מכן, הקספאז הפעיל-9 יכול להפעיל את הקספאז-3 כדי לגרום לאפופטוזיס (44). רמות הקספאז המפוצלות-3 גם הוסרו על ידי טיפול CTPG-W. עם זאת, caspase-8 לא הופעל על ידי CTPG-W, מה שמצביע על כך שמסלול קולטן המוות החיצוני לא היה מעורב באפופטוזיס המושרה על ידי CTPG-W. תצפיות אלו מצביעות על כך ש-CTPG-W משרה אפופטוזיס של תאי Eca-109 באמצעות הפעלה של מסלול תלוי במיטוכונדריה.
PARP ממלא תפקידים חשובים ביציבות הגנומית וניתן לבקע אותו על ידי הקספסות הפעילות, במיוחד קספסות-3 ו--7 (45). נקבע שטיפול ב-CTPG-W הפעיל את הקספאז-3 ו--7, שעשוי לפצח PARP כדי לעכב תיקון DNA ולגרום לאפופטוזיס.
CTPG-W גם מדכא באופן תלוי מינון וזמן את הצמיחה של תאי קרצינומה כבדית אנושית BEL-7404 (נתונים שלא פורסמו). למרות ש-CTPG-W מעכב את הצמיחה של תאי Eca-109 ו-BEL-7404, הוא מקדם שגשוג של ספלנוציטים, שעשוי לנבוע מתכולת הפוליסכרידים (~50 אחוז) ב-CTPG-W (46 ). באופן דומה, מספר מחקרים דיווחו שפוליסכרידים יכולים לקדם שגשוג של ספלנוציטים (46-49). במודל העכבר, נקבע כי CTPG-W העלה באופן משמעותי את אינדקס הטחול, בהשוואה לקבוצת הביקורת, אך לא השפיע על משקל הגוף ואינדקס האיברים האחרים כולל לב, כבד, כליות וריאה (נתונים שלא פורסמו). מה שמצביע על כך של-CTPG-W אין השפעה ציטוטוקסית על תאים נורמליים.
ביחד, הנתונים הצביעו על כך ש-CTPG-W מעכב את הצמיחה של תאי Eca-109 על ידי אינדוקציה של אפופטוזיס דרך מסלול תלוי מיטוכונדריה.
יתרונות cistanche: אנטי אפופטוזיס
תודות
המחברים רוצים להודות לד"ר Jianhua Yang (Baylor College of Medicine) על ליטוש כתב היד.
מימון
מחקר זה נתמך על ידי תכנית החומש ה-13 לפרויקט מתן הצעות מפתח לביולוגיה משמעתית (מענק מס' 17SDKD0202), האוניברסיטה הרגילה של שינג'יאנג והמעבדה המרכזית ליישום ורגולציה של מגוון ביולוגי בסביבה ב-Xinjiang (מענק מס' XJTSWZ-2017-04) ל-JL ולמענק הקרן הלאומית למדעי הטבע הסינית (מענק מס' 31760260) ל-XW.
זמינות נתונים וחומרים
נתונים וחומרים ששימשו ונותחו במהלך המחקר הנוכחי זמינים מהמחבר המתאים על פי בקשה סבירה.
תרומות מחברים
CF, AA, YY ו-QC ביצעו את הניסויים. LX, JLv ו-XW ניתחו את הנתונים ואת הנתונים המוכנים. JinyuL ו-JinyaoL תכננו את הפרויקט וכתיבו את כתב היד.
אישור אתיקה והסכמה להשתתפות
כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של מעבדת מפתח של שינג'יאנג למשאבים ביולוגיים והנדסה גנטית (אישור, מס' BRGE-AE001; אוניברסיטת שינג'יאנג).
הסכמת המטופל לפרסום
לא ישים.
אינטרסים מתחרים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.
הפניות
Wu CR, Lin HC ו-Su MH: היפוך על ידי מימיתמציות של Cistanche tubulosaמליקויים התנהגותיים במודל חולדות דמוי מחלת אלצהיימר: רלוונטיות לתצהיר עמילואיד ותפקוד נוירוטרנסמיטר מרכזי. BMC Complement Altern Med 14: 202, 2014.
Li J, Aspire A, Gao L, Huo S, Luo J ו-Zhang F:פנילתנואידים גליקוזידים מ- Cistanche tubulosaמעכב את הצמיחה של תאי B16-F10 הן in vitro והן in vivo על ידי אינדוקציה של אפופטוזיס דרך נתיב תלוי מיטוכונדריה. J Cancer 7: 1877-1887, 2016.
Brand-Williams W, Culver ME, ו-Berset C: שימוש בשיטת רדיקלים חופשיים להערכת פעילות נוגדת חמצון. LWT-Food Sci Technol 28: 25-30, 1995.
