Cistanche Polysaccharides משפרים את ספיגת האכינאקוסיד ב-Vivo ומשפיעים על המיקרוביוטה של ​​המעי

איש קשר: emily.li@wecistanche.com

Zhifei Fu, et al

תַקצִיר

הפוליסכרידים ופנילתנואידים גליקוזידיםמCistanche deserticolaהוכחו כבעלי יתרונות בריאותיים שונים, אולם ההשפעה האינטראקטיבית בין שני סוגי התרכובות הללו in vivo אינה ידועה בפירוט. מטרת מחקר זה הייתה לחקור את הפעולות הסינרגטיות של פוליסכרידים ציסטאנצ'י עם גליקוזיד פנילתנואיד ואת ההשפעות של פוליסכרידים על מיקרוביוטת המעיים. חולדות Sprague-Dawley הוזנו בסוגים שונים של פוליסכרידים ציסטאנצ'י במשך 20 יום, ביום האחרון, כל החולדות קיבלוechinacosideב-100 מ"ג/ק"ג. התוצאות הושוו בעיקר על ההבדל בפרמטרים פרמקוקינטיים, הרכב המיקרוביוטה של ​​המעי ותכולת חומצות שומן קצרות שרשרת. התוצאות הצביעו על כך שכל פוליסכרידים הציסטאנצ'י, כולל פוליסכרידים גולמיים, מולקולריים גבוהיםמשקל פוליסכרידים, ופוליסכרידים במשקל מולקולרי נמוך, יכולים לווסת את מגוון המיקרוביוטה של ​​המעיים, להגביר חיידקים מועילים ובעיקר לשפר את הצמיחה של Prevotella spp. כמו גם לשפר את ייצור חומצות שומן קצרות שרשרת ואת ספיגת האכינאקוסיד. על ידי בחינת הפעולות הסינרגטיות של פוליסכרידים עם מולקולות קטנות, ממצאים אלה מצביעים על כך שפוליסכרידים ציסטאנצ'ים, במיוחד פוליסכרידים במשקל מולקולרי נמוך, יכולים לשמש כמניפולטור של מיקרוביוטה במעיים לקידום בריאות.

מילות מפתח:Cistancheמדבריתפוליסכרידאכינאקוסיידמיקרוביוטה במעיים

לחץ כאן כדי לקבל מידע נוסף על מוצרי cistanche

1. הקדמה

בשנים האחרונות, התברר שפוליסכרידים מווסתים את הרכב המיקרוביוטה של ​​המעי וששינויים יכולים לתווך ספיגה תזונתית מרובת [1] ולייצר תפקוד פיזיולוגי [2,3]. פוליסכרידים מהרפואה הסינית המסורתית (TCM) הוכחו כמועמדים אידיאליים לוויסות מיקרוביוטה של ​​המעיים והראו השפעות פרה-ביוטיות. במערכת העיכול, פוליסכרידים וכמה תרכובות מולקולריות קטנות מגע בהכרח, מראים השפעות מסוימות על פעילויות ביולוגיות [4]. כאחד מהמרכיבים הפעילים העיקריים בג'ינסנג Panax, שנמצא בשימוש נרחב במשך אלפי שנים, הפוליסכרידים הראו טובהַשׁבָּחָהבתוך הפְּנִימִיחילוף חומריםוקְלִיטָהשֶׁלג'ינסנוזידיםin vivo [5]. Polysaccharides Codonopsis pilosula הראו את השפעת הקידום של ספיגת ספונינים בעכברי קוליטיס הנגרמת על ידי דקסטרן סולפט נתרן [6]. הפוליסכרידים של Ganoderma lucidum, במיוחד החלק המולקולרי הגבוה, התגלו כבעליפרה-ביוטיקהפונקציותבדגמי עכברי דיסביוזיס במעיים הנגרמות על ידי דיאטה עתירת שומן [7]. פוליסכרידים של לונגן מווסתים את המיקרוביוטה של ​​המעי ואת מטבוליטים במעיים (העלאת תכולת פירובאט ובוטנואט) כדי לייצר פעילויות אימונומודולטוריות [8].

Cistanche deserticola, כרפואה סינית מסורתית, נמצא בשימוש נרחב כתוסף תזונה בסין. מחקרים פרמקולוגיים הוכיחו שזה הפגיןנוירו-פרוטקטיבי, אימונומודולטורי, הורמונלימְאַזֵן, אַנְטִי-עייפות, אַנְטִי-דַלַקתִי, הגנה על הכבד,אַנְטִי-חמצוני, אַנְטִי-חיידקי, אַנְטִי-נְגִיפִי, ואַנְטִי-גידול סרטניאפקטים [9]. ניתוח כימי הראה שגליקוזידים של פנילאתנואידים ופוליסכרידים היו המרכיבים הפעילים העיקריים. Echinacoside, הגליקוזיד הפנילטנואיד העיקרי ב-C. deserticola, הראה פעולות תרופתיות רחבות, אולם יכולת הסמים שלו מוגבלת בשל הזמינות הביולוגית הירודה, חילוף החומרים המהיר והנרחב in vivo. מחקרים הוכיחו שאכינאקוסיד יכול לעבור חילוף חומרים על ידי מיקרוביוטת המעיים במבחנה [10,11]. עם זאת, העדויות in vivo לא נחקרו. כידוע, למיקרוביוטה של ​​המעי היה תפקיד חשוב בתיווך הפעילות הביולוגית המטבולית של תרופות צמחיות. לכן, המטרה העיקרית של עבודה זו הייתה לחקור את ההשפעה שלcistanche polysaccharidesעל המיקרוביוטה של ​​המעיים וההשפעות על חילוף החומרים של אכינאקוסיד.

2. חומרים ושיטות

2.1. חומרים וכימיקלים

Cistanche deserticola YC Ma הושג מאלאשאן, מונגוליה הפנימית מנדלה תעשיית החול לפיתוח Co., LTD, סין. הם אושרו על ידי פרופסור Lijuan Zhang (אוניברסיטת טיאנג'ין לרפואה סינית מסורתית). דגימת שובר הופקדה במעבדה שלנו. החומר הסטנדרטי כגון echinacoside, acteoside וחומצה כלורוגנית התקבל מהמכון הלאומי לבקרה על מוצרים פרמצבטיים וביולוגיים (בייג'ינג, סין). הטוהר של כל תקן היה גדול או שווה ל-98 אחוז. אצטוניטריל ומתנול בדרגת כרומטוגרפיה נרכשו מפישר סיינטיפיק (פיטס בורג, הרשות הפלסטינית). חומצה פורמית נרכשה מחברת Anaqua Chemical Supply Inc. (ווילמינגטון, ארה"ב). שאר הריאגנטים הכימיים היו בדרגה אנליטית ונרכשו מ-Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd (Shanghai, סין).

חולדות זכר של Sprague-Dawley (200-220 גרם) סופקו על ידי Beijing HFK Bioscience CO., LTD (בייג'ינג, סין, מס' רישיון SCXK (Jing) 2014- 0004). כל החיות גודלו ושוכנו בתנאי SPF במתקן החיות. הניסוי בוצע על פי ההנחיות שנקבעו על ידי הטיפול בבעלי חיים ומשתמש בוועדה של TJUTCM ובהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שפורסם על ידי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב (פרסום NIH מספר 85–23, מתוקן 1996 ). לאחר תקופת הסתגלות של שבוע, חולקו חולדות באופן אקראי לארבע קבוצות: קבוצת ביקורת, קבוצת פוליסכרידים כוללת, קבוצת פוליסכרידים גבוהה מולקולרית וקבוצת פוליסכרידים נמוכה. כל קבוצה כללה 6 חולדות, שגודלו באותו כלוב.

2.2. הכנת פוליסכרידים של Cistanche

3.0 ק"ג של Cistanche deserticola YC Ma נוקה ויובש ב-40 מעלות בתנור הייבוש באוויר, ולאחר מכן נכתש לאבקה גסה. האבקה הגסה היבשה חולצה עם 85 אחוז אתנול מימי (v/v) ב-60 מעלות פעמיים, ו-2 שעות לכל פעם. יחסי המוצק-נוזל היו 1:12 ו-1:10, בהתאמה. שאריות הצמחים חולצו במים ב-100 מעלות פעמיים נוספות, זמן המיצוי ויחסי מוצק-נוזל היו זהים עם 85 אחוז אתנול. תמיסת המים אוחדה ורוכזה בלחץ מופחת ולאחר מכן שקעה ב-80 אחוז אתנול, תוך עמידה מתחת ל-4 מעלות למשך 24 שעות. המשקע בודד באמצעות צנטריפוגה ב-8000 סל"ד למשך 10 דקות ב-4 מעלות ולאחר מכן lyofilized כדי לקבל את סך הפוליסכרידים (ZT). לאחר מכן הומס ZT במים דה-יונים וסונן על קרום סינון אולטרה-פילטר של סיבים חלולים של 100 קילו-דאה, נאספו פוליסכרידים מולקולריים גבוהים (HM). התסנין המחלחל סונן עם ממברנת אולטרה סינון של 6 kDa. הושגו הפוליסכרידים המולקולריים האמצעיים (MM) והפוליסכרידים הנמוכים המולקולריים (LM) החדירים.

2.3. אפיון ראשוני של פוליסכרידים cistanche

תכולת הפוליסכריד נקבעה בשיטת פנול חומצה גופרתית באמצעות גלוקוז כסטנדרט [12]. תכולת החלבון הכוללת נקבעה בשיטת BCA [13]. ניתוח הרכב החד-סוכרים נערך על ידי HPLC (מערכת UltiMate 3000) מצויד בעמודת SinoPak C18 (5 מיקרומטר, 150 מ"מ × 4.6 מ"מ) וגלאי מערך דיודות (VWD-3000). ההפרדה הכרומטוגרפית של נגזרות קדם-עמודה של PMP (1-פניל-3- מתיל-5-pyrazolone) בוצעה באמצעות חיץ פוספט 100 mM ואצטוניטריל ביחס של 82:18 (v/v , אחוזים) כפאזה ניידת בקצב זרימה של 1.0 מ"ל/דקה. 10 μL מכל דגימה הוזרק והופעל זמן ריצה של ניתוח של 30 דקות עם זיהוי ב-245 ננומטר. רכישת נתונים ועיבודם בוצעו באמצעות Chromeleon Software 7.1 (Dionex, Sunnyvale, CA, ארה"ב).

המשקל המולקולרי (Mw) נקבע על ידי כרומטוגרפיה בעלת ביצועים גבוהים של אי הכללת גודל (HPSEC, UltiMate 30{{10}}0 מערכת), מצוידת בג'ל TSK G3000 PWXL (7.8 × 300.0 מ"מ, Tosoh, יפן) ו-TSK ג'ל GMPWXL (7.8 × 300.0 מ"מ, Tosoh, יפן) וגלאי מקדם השבירה RefractoMax521 (RID). הדגימות חולקו עם 0.1 מ"ל/ליטר Na2SO4 בקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה. הטמפרטורה של העמוד נשמרה על 35 מעלות. Dextran כסטנדרטים ועקומת התקן שורטטו בהתאם לזמן הפליטה שצולם כנגד הלוגריתם של המשקל המולקולרי.

2.4. מחקר פרמקוקינטי

דגימות דם נאספו מהקנטוס הפנימי בשעה {{0}} שעות, 0.083 שעות, 0.167 שעות, 0.25 h, 0.5 h, 0.75 h, 1.0 h, 2.0 h, 3.{{20}} שעות, 4.0 שעות, 6.0 שעות, 8.0 שעות, 10 שעות, 12 שעות ו-24 שעות לאחר מתן אכינאקוסיד (100 מ"ג/ק"ג). דגימות פלזמה התקבלו על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות בשעה 7500 בערב. ל-100 μL של דגימת הפלזמה, נוספו 10 μL של תמיסת IS (חומצה כלורוגנית) ו-500 μL של מתנול. לאחר מכן התערובת עברה מערבולת במשך 3 דקות וצנטריפוגה ב-14,000 סל"ד למשך 10 דקות. הסופרנטנט נאסף וייבש בחנקן בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השאריות הומסו ב-100 μL מתנול מימי 50 אחוז, צנטריפוגה ב-14,000 סל"ד שוב למשך 10 דקות. לבסוף, 3 μL מהסופרנטנט הוזרק למערכת LC-MS/MS לצורך ניתוח. הדגימות נותחו בשיטה לפי דיווח שדווח בעבר. השלב הנייד כלל CH3CN (ממס A) ו-H2O (המכיל 0.1 אחוז HCOOH; ממס B) תוך שימוש בשיפוע הבא: 0-1 דקות, 10 אחוז A; 1–8 דקות, 10–90 אחוז A; 8–9 דקות, 90–10 אחוז A; 9-11 דקות: 10 אחוז A. הדגימה הופרדה בעמודה ACQUITY HSS T3 (1.8 מיקרומטר, 100 מ"מ × 2.1 מ"מ מזהה). קצב הזרימה היה 0.3 מ"ל/דקה וטמפרטורת העמודה נקבעה ל-35 מעלות. בניתוח MS, נעשה שימוש במצב יינון שלילי, עם הפרמטרים האופטימליים הבאים: מתח נימי, 2.5 קילו וולט; טמפרטורת ההרס, 450 מעלות. חנקן שימש כגז דה-solvation ו-cone, בקצב זרימה של 900 ליטר לשעה ו-150 ליטר לשעה, בהתאמה. לפיכך בוצע כימות באמצעות MRM של המעברים של m/z 785.29 → 623.26 עבור echinacoside, m/z 353.06 → 191.07 עבור חומצה כלורוגנית (IS), m/z 623.24 → 161.09 עבור אקטאוזיד. מתח החרוט עבור echinacoside, IS ו-acteoside היה 100 וולט, 32 וולט ו-74 וולט; אנרגיית התנגשות, 32 וולט, 14 וולט ו-30 וולט.

2.5. מחקר על חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFAs).

חולדות Sprague-Dawley זכרים קיבלו דרך הפה ZT, HM ו-LM למשך 3 שבועות. קביעת SCFAs (חומצה אצטית, חומצה פרופיונית, חומצה איזובוטירית, חומצה בוטירית, חומצה איזוולרית, חומצה ולרית וחומצה הקסנואית) על ידי כרומטוגרפיה גז (GC) נעשתה כמתואר קודם לכן עם כמה שינויים [14]. בקצרה, דגימת צואה של 0.5 גרם התפזרה ב-2.5 מ"ל של מים Milli-Q, סובב במערבולת למשך 10 דקה, ותמיסת 7.5 מ"ל 1 אחוז HCl/אתנול המכילה סטנדרטים פנימיים (חומצה בוטירית 24.0 ug. נוספו/מ"ל ו-2- חומצה אתיל הקסנואית 1.32 ug/mL כסטנדרטים פנימיים). התערובות הומוגגו במשך 5 דקות ועברו צנטריפוגה ב-14,000 סל"ד למשך 10 דקות ב-4 מעלות. חמישה מיקרוליטר של סופרנטנט הוזרק במצב מפוצל ביחס של 30:1. הגז המוביל היה N2 (99.999 אחוזים) ב-1 מ"ל/דקה. גז האיפור (N2) היה 25 מ"ל/דקה. קצב הזרימה של H2 ואוויר היה 30 מ"ל לדקה ו-300 מ"ל לדקה, בהתאמה. דגימות צואה נאספו ביום ה-20 של מחקר זה ואוחסנו מיד ב-80 מעלות.

2.6. איסוף צואה, מיצוי DNA ורצף גנים של 16S rRNA

כ-200 מ"ג של דגימת צואה טריה נאספו בשפופרת Eppendorf סטרילית של 1.5 מ"ל מכל חולדה ואוחסנה ב-80 מעלות להכנת DNA מאוחר יותר. ה-DNA הוצא מהצואה באמצעות ערכת המיני של QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN). כמות ה-DNA נקבעה באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop (Thermo Electron Corporation); השלמות והגודל נבדקו על ידי אלקטרופורזה של 1.0 אחוז אגרוז ג'ל. לפי הריכוז, ה-DNA דולל ל-1 ng/μL באמצעות מים סטריליים.

16S rRNA הוגבר באמצעות פריימר ספציפי (V4: 515F-806R) עם הברקוד. כל תגובות ה-PCR בוצעו עם Phusion® High Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs). מערבבים נפח שווה של חיץ טעינה של 1× (המכיל SYB ירוק) עם מוצרי PCR והפעל אלקטרופורזה על ג'ל agarose של 2 אחוזים לזיהוי. הרצועות הראשיות הבהירות בין 400 ל-450 bp נבחרו לניסויים נוספים. מוצרי PCR היו מעורבים ביחסי צפיפות באיחוד האירופי. לאחר מכן, תערובת של מוצרי PCR טוהרה עם ערכת מיצוי ג'ל Qiagen (Qiagen, גרמניה).

ספריות רצף נבנו באמצעות TruSeq® DNA PCR Free Preparation Sample Kit (Illumina, ארה"ב) בהתאם להמלצות היצרן ונוספו קודי אינדקס. איכות הספרייה הוערכה על ידי Qubit® 2.0 פלואורומטר (Thermo Scientific) ומערכת Agilent Bioanalyzer 2100. הספרייה בוצעה ברצף על פלטפורמת Illumina HiSeq 2500 ונוצרו קריאות קצה זוגיות של 250 bp.

2.7. ניתוח ביואינפורמטיקה

ניתוק רצף הברקוד וה-primer, הרכבת הרצף וסינון הנתונים בהתאם ל-QIIME (V 1.7.0). רצפים בעלי דמיון גדול או שווה ל-97 אחוז הוקצו לאותם OTUs. ה-OTUs מסומנים כתוויות SILVA. מדדי גיוון אלפא העריכו את עושר הקהילה המיקרוביאלית במעיים (מדדי ACE ו-Chao1) ואת גיוון הקהילה (מדדי שאנון וסימפסון) חושבו באמצעות Qiime (גרסה 1.9.1). ניתוח גיוון בטא שימש כדי לחקור את הווריאציות המבניות של הקהילות המיקרוביאליות באמצעות מרחק UniFrac. ההבדלים בין כל הקבוצות נבדקו על ידי מבחן Tukey ומבחן Wilcox. ניתוח הקואורדינטות העיקרי (PCoA) יושם כדי להסביר את ההבדלים בהרכב בין ארבע הקבוצות באמצעות חבילות R. שיטת השפעת ניתוח אפקט מבחין ליניארי (LEfSe) תוכננה במיוחד עבור גילוי סמנים ביולוגיים ונתוני רצף הסבר. וניתוח מבחין ליניארי (LDA) שימש כדי לחשב את גודל ההשפעה של כל חיידקי מעיים באופן דיפרנציאלי ואת המאפיינים הקשורים לכל קבוצת חולדות. ניתוח המתאם יושם באמצעות חבילות R gcorrplot (גרסה 1.1.463).

נתוני SCFAs נותחו באמצעות ANOVA של SPSS 22.0.

3. תוצאות ודיון

3.1. הכנה וניתוח כימי של פוליסכרידים cistanche

Cistanches Herba משמש גם כמזון וגם כתרופה בסין. פוליסכרידים שבודדו ממנו משכו תשומת לב רבה בשל פעילותם המשמעותית. במחקר זה, הושגו ארבעת החלקים של פוליסכרידים cistanche (ZT, HM, MM ו-LM) בשיטה של ​​מיצוי מים, משקעי אלכוהול ואולטרה סינון. ההרכבים הכימיים של ארבעה חלקים של פוליסכרידים מוצגים בטבלה 1.

תכולת הסוכר הכוללת של הדגימות באמצעות עקומה סטנדרטית של גלוקוז. התוצאה הראתה שהתשואות של HM ו-LM היו גבוהות מ-MM. פוליסכרידים הראו תכונות פרמקולוגיות מגוונות, במיוחד פעילות חיסונית. מחקרים הראו שתכולת וסוג החד-סוכרים, המשקל המולקולרי, סוג הקבוצה התחליפית ממלאים תפקיד חשוב בפעילותם של פוליסכרידים [15]. החלקים השונים של הרכב החד-סוכרים של פוליסכרידים של ציסטאנצ'י היו דומים, ומנוס (Man), חומצה גלקטורונית (GalUA), גלוקוז (Glc), גלקטוז (Gal) ו-arabinose (Ara) היו החד-סוכרים העיקריים.

עם זאת, התוכן היה שונה בין ארבעת החלקים. גלוקוז וארבינוז היו המרכיבים העיקריים של ZT ו-HM, בעוד שגלוקוז היה יחידת הסוכר העיקרית של LM, מלבד זאת, מעט רמנוזה וחומצה גלוקורונית (GlcUA) זוהו גם בשברים אלו.

המשקלים המולקולריים היחסיים של הדגימות נחקרו על ידי כרומטוגרפיה בעלת ביצועים גבוהים (HPSEC). על פי העקומה הסטנדרטית של הדקסטרנים וזמן השמירה בעמודות, משקלי השיא המולקולריים העיקריים ב-ZT נצפו ב-1.68 × 106 Da ו-1.70 × 104 Da, ב-HM נקבעו כ-1.54 × 106, 2.06 × 105, וכן 4.81 × 104, ב-MM וב-LM נקבעו להיות 1.09 × 104 ו-2.05 × 104, בהתאמה. התשואות שלהם נרשמו בטבלה 1 והתפוקה של MM הייתה נמוכה ולא מספיקה לניסוי בבעלי חיים. מחקרים קודמים הצביעו על ההשפעות התלויות במבנה של פוליסכרידים cistanche על פעילויות ביולוגיות מגוונות [16]. עדיין דרושים ניסויים נוספים, במיוחד טיהור, יש ליישם ניתוח מבני Fifine עבור מחקר המבנה-פעילות

3.2. מחקר פרמקוקינטיקה

הפרמקוקינטיקה של האכינאקוסיד נחקרה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד משולשת קוודרופול (UPLC ו-Xevo TQ-S) לאחר מתן פומי של אכינאקוסיד. פרופילי ריכוז הזמן הממוצעים בפלזמה של echinacoside הוצגו באיור 1. לפי תוכנת התרופות והסטטיסטיקה (DAS, גרסה 2.0), הפרמקוקינטיקה של echinacoside מתאימה למודל של תא אחד, והשני פרמטרים בקבוצות ZT, HM ו-LM סוכמו בטבלה 2, כולל הזמן להגיע לריכוז המקסימלי (Tmax), הריכוז המרבי (Cmax), השטח מתחת לעקומת הריכוז-זמן (AUC) וזמן השהייה הממוצע (MTR) ). מחקר פרמקוקינטי הראה שה-Cmax הממוצע של echinacoside בקבוצות ZT, HM ו-LM נמצא 646.4 ng/mL, 732.0 ng/mL ו-898.4 ng/mL שהיו 1.6, 1.8 ו-2.2 פעמים בהשוואה לקבוצת הביקורת (406.8 ng/ml), בהתאמה. על ידי טיפול מקדים עם פוליסכרידים, AUC(0-24 h) של echinacoside עלו בהתאמה ב-6.6 אחוזים, 36.7 אחוזים ו-63.6 אחוזים בקבוצות ZT, HM ו-LM, בהשוואה לקבוצת הביקורת, שהוכיחה שהפוליסכרידים הראו. פעילות של קידום ספיגת מולקולה קטנה. תוצאות אלו היו דומות למדי לזה שה-chitooligosaccharides שיפרו את הזמינות הביולוגית של פניל-אתנואיד גליקוזידים בתמצית Fructus Forsythia [17] והפוליסכרידים של Polygonum multiflorum שיפרו את התכונות הביופרמצבטיות של 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxy-stilbene{{{3-8}} O- -D-glucoside בחולדות ספראג-דאולי רגילות [18]. מיקרוביוטה של ​​המעי מכילה מגוון של אנזימים הקשורים לחילוף חומרים, והמנגנונים של צורות המיקרוביום הפרמקוקינטיקה והפרמקודינמיקה של התרופה עדיין לא ידועים [19]. פוליסכרידים עשויים להזין את המיקרוביוטה של ​​המעי על ידי הגברת המערכת החיסונית, ספיגת חומרים מזינים והפחתת גדילת פתוגנים [20,21]. למרות שספרות דיווחה שפוליסכרידים של cistanche יכולים להגביר את המטבוליטים של אכינאקוסיד (כגון אקטאוזיד) במבחנה, לא מצאנו שהפוליסכרידים הקיימים עשו תועלת להמרה של אכינאקוסיד לאקטאוזיד in vivo [10,11].

3.3. תוכן SCFAs בצואת חולדות

פוליסכרידים מותססים במיקרוביוטה במעיים, מייצרים פולימרים ביו-אקטיביים ומטבוליטים שונים, כגון SCFAs [3]. כמטבוליטים העיקריים של פוליסכרידים, SCFAs נותחו בצואה. ה-SCFAs, כולל חומצה אצטית, חומצה פרופיונית ובוטיראט דווחו כבעלי השפעות מועילות על חילוף החומרים של גלוקוז, כולסטרול ושומנים. אצטט הוא ה-SCFAs העיקרי במעי הגס ומהווה מצע חשוב לסינתזת כולסטרול, פרופיונאט הוא מצע לגלוקוניאוגנזה בכבד ובוטיראט הוא מצע האנרגיה המועדף של קולונוציטים ובעל אנטי דלקתיות במעיים [22,23].

התוצאות שלנו הראו כי אצטט היה ה-SCFAs העיקריים שנוצרו בצואה עבור כל הקבוצות, ואחריו בוטיראט ופרופיונאט, בעוד הריכוז של valerate ו-SCFAs מסועפים (חומצה איזובוטירית וחומצה איזובלרית) היה נמוך יותר. הוכח שהאצטט מגביר את פעילות האנזים ברקמת הכבד, וכתוצאה מכך שליטה טובה יותר ברמת הסוכר בדם [24]. ביום ה-20 (איור 2), לקבוצת LM הייתה רמה משמעותית יותר של אצטט (pb 0.05), שיעור הפרופיונאט נטה לרדת, ושיעור הבוטיראט נטה לעלות למרות השינוי היה לא משמעותי בצואה בהשוואה לקבוצת הביקורת.

עם זאת, לקבוצת HM היה שיעור נמוך משמעותית של בוטיראט בהשוואה לקבוצת הביקורת (pb 0.05). התוכן של סך SCFAs בין LM ל-HM היה מגמה הפוכה בהשוואה לקבוצת הביקורת ורק לקבוצת LM היה הבדל משמעותי.

גורמים רבים משפיעים על רמת ה-SCFAs בצואה, כולל הרכב וכמות המיקרוביוטה של ​​המעיים, המקור התזונתי והזמן שלוקח למזון לעבור דרך מערכת העיכול [22]. מחקרים מצטברים מראים שמבנה הפוליסכרידים, כולל הרכב שאריות חד-סוכרים, מידת הפילמור, שניהם יכולים להשפיע על תכונות התסיסה וייצור SCFAs [25]. מהתוצאות שלנו, אנו יכולים להסיק שפוליסכרידים cistanche מווסתים את ייצור SCFAs ולפוליסכרידים במבנה שונה יש השפעות שונות.

3.4. פוליסכרידים של Cistanche גרמו לשינויי ליבה בהרכב ובמגוון המיקרוביוטה של ​​המעיים

הרכב החיידקים של דגימות הצואה (n=4) נבדק באמצעות טכניקת רצף תפוקה גבוהה של Illumina. הספרייה בוצעה ברצף על פלטפורמת Illumina HiSeq2500 והופקו קריאות קצה זוגיות של 250 bp. הם עובדו לצורך זיהוי טקסונומי וניתוח גיוון. עקומות השתקפות נדירות (איור 3א) הראו כי עבור כל דגימה, עושר מינים של חיידקים התיישר ככל שעומק הדגימה גדל, מה שמצביע על כך שמאמץ הרצף היה מספיק ושהמגוון הכולל בתוך המדגם נתפס. עקומת שאנון (איור 3b) הראתה שמספר מיני החיידקים הייחודיים גדל ככל שמספר הרצפים המזוהים גדל. רוויה של עקומות שאנון פירושה שנתוני הרצף הספיקו כדי לכסות את כל מיני החיידקים.

ניתוח גיוון אלפא משמש למדידת המגוון בתוך מדגם. מדדי הגיוון של Chao1, ACE, שאנון וסימפסון חושבו על ידי המבחן של Tukey כדי לתאר את גיוון האלפא. ניתוח הגיוון המבוסס על מדדי ACE ו-Chao 1 חשף את העושר הקהילתי של מיקרוביוטת המעיים ברמת ה-OTU. מדדי ACE ו-Chao 1 היו נמוכים משמעותית בדגימות הצואה של קבוצת LM בהשוואה לקבוצת הביקורת (pb 0.05) (איור 4a, b), מה שמרמז שעושר המינים של מיקרוביוטת המעיים ירד על ידי האכלה של LM. ניתוח הגיוון המבוסס על אינדקסים של שאנון וסימפסון חשף את המגוון הקהילתי של מיקרוביוטת המעיים. לא היה שינוי ברור במדדים הגיוון של שאנון וסימפסון כאשר טופלו בפוליסכרידים של cistanche בהשוואה לקבוצת הביקורת.

פוליסכרידים של Cistanche גרמו לשינויים גדולים בטקסות. יתרה מכך, בארבע קבוצות N98 אחוזים מה-OTUs היו קשורים ל-phyla Bacteroidetes, Firmicutes ו-Proteobacteria. הפילום השולט ביותר היה Bacteroidetes שתרם 55.09 אחוזים, 57.89 אחוזים, 52.72 אחוזים ו-69.{{20}}4 אחוזים מהמיקרוביוטה הצואה בשליטה, ZT, HM ו קבוצות LM בהתאמה, ואחריהן Firmicutes, תורמות 41.39 אחוזים, 38.03 אחוזים, 42.15 אחוזים ו-28.15 אחוזים בהתאמה (איור 5א, ב). בהשוואה לקבוצת הביקורת, הוכח שקבוצת ZT גורמת להשפעות חלשות על השפע היחסי של הפילות העיקריות, מלבד השפע הנמוך של Actinobacteria גדל באופן משמעותי (MetaStat, pb 0.05). בקבוצת HM, Proteobacteria גדל באופן משמעותי (pb 0.01). זה הצביע על כך שפוליסכריד HM Cistanche יכול לקדם את ההעשרה של פרוטאובקטריה כדי להשפיע על חילוף החומרים של חומרים בחולדות. בקבוצת LM, השפע של Bacteroidetes, שהתורמים העיקריים שלהם היו Prevotellaceae ו-Prevotellaceae_UCG-001 גדל באופן מובהק (pb 0.05) ושפע ה-Firmicutes, כולל Peptococcaceae, ירד באופן מובהק (0p) ב-0. . חברי ה-Prevotella וה-Bacteroides תוארו בעבר כמפרקי סיבים תזונתיים [26], המייצרים תוצרי קצה מטבוליים כגון סוצ'ינט ואצטט [27]. ממצאים כאלה אישרו מחקרים קודמים שהראו שחלק מה-Prevotella spp. יכול לפרק פוליסכרידים צמחיים מורכבים. דיווחים קודמים הראו גם ששתי חלוקות החיידקים הדומיננטיות, היחס המוגבר של הפילה Firmicutes/Bacteroidetes קשורים להשמנה [28]. השפע הנמוך יותר של הראשון והשפע הגבוה יותר של האחרון בקבוצת LM הציעו כי LM יכול לעזור להשיל קילוגרמים.

מתוך 72 משפחות שזוהו, ה-Taxa top10 בודדו ונותחו (איור 5c, ד). ה-Lachnospiraceae וה-Ruminococcaceae הן שתיים מהמשפחות הנפוצות ביותר שנמצאות בסביבת המעי של היונקים והן קשורות לשמירה על בריאות המעיים [29]. במחקר הנוכחי, משפחות Bacteroidales_S24-7_(39.11 ± 6.04 אחוזים, 36.88 ± 4.44 אחוזים, 28.37 ± 4.01 אחוזים, 35.81 ± 7.91 אחוזים), Prevotellaceae (0. ±1.5 ± 64 אחוזים (0. ± 0.5 64 אחוזים) אחוזים, 19.65 ± 8.97 אחוזים, 21.05 ± 8.39 אחוזים), Lachnospiraceae (18.21 ± 5.20 אחוזים, 15.09 ± 3.29 אחוזים, 12.13 ± 7.14 אחוזים, 13.12 ± 6.82 אחוזים), ורומינוקוקאקה (9.64 ± 0.88 אחוז, 11.45 אחוזים, 11.45 אחוזים, 115.2.272, 11.64, 10.64, 10.62, 10.28, 10.6, 10.28, 10.6, 10.6, 1085, 1185, 1185, 10.28, ± 4.70 אחוזים, 8.19 ± 1.72 אחוזים) היו שולטים בכל קבוצה. דווח על משפחת S24-7 שהכילה שפע של אנזימים מפרקי פחמימות [30]. Prevotellaceae הציגו עלייה ו- Lachnospiraceae הציגו נטייה יורדת בקבוצת הפוליסכרידים בהשוואה לקבוצת הביקורת [31]. ההנחה הייתה שלא היו אנזימים פעילים של cistanche polysaccharides תואמים בקבוצת Bacteroidales_S24-7_ וב-Lachnospiraceae או מודולים קושרים לפחמימות של חיידקים בפוליסכרידים. סוגים של Prevotella דווחו בקשר עם לוקוסים של ניצול פוליסכרידים ואנזימים פעילים בפחמימות [32]. על מנת למצוא את הקשר בין חיידקים ל-SCFAs, הוחל ניתוח מתאם של Spearman. סוגים מסוימים כמו Bacteroides, Prevotella ו-Lactobacillus במיקרוביוטה של ​​המעיים ממלאים תפקיד חשוב בהידרוליזה של פוליסכרידים ל-SCFAs [33]. התוצאות שלנו הראו גם שה-Bacteroidaceae נמצא בקורלציה חיובית ומיקרוביוטה נשלטת יצרה יותר בוטיראט [34], בעוד שה-Prevotellaceae נמצאה בקורלציה חיובית ומיקרוביוטה נשלטת יצרה יותר אצטט. Lactobacillaceae ו- Ruminococcaceae שלטו במיקרוביוטה שיצרה יותר פרופיונאט (איור 6).

נעשה שימוש בניתוח גיוון בטא כדי לחקור את הווריאציות המבניות של מיקרוביוטת המעי על פני הדגימות באמצעות מדדי מרחק של UniFrac. הבדלים במרחקי Unifrac נותחו על ידי מבחן Tukey ו- Wilcox (איור 7). באמצעות ניתוח לא משוקלל של uniFrac, מצאנו ש-LM מאכילים עכברים מקבצים הרחק מקבוצות אחרות. זוהה דפוס מקבץ לכאורה עבור קבוצות בקרה, ZT, HM ו-LM.

השפע של חיידקים אלה היה מווסת באופן דיפרנציאלי עם טיפולי פוליסכרידים. כדי לזהות את טקסיות החיידקים הספציפיות בכל קבוצה, הושווה הרכב המיקרוביוטה מקבוצות הביקורת, ZT, HM ו-LM בשיטת גודל אפקט ניתוח מבחין ליניארי (LEfSe). ניתוח מבחן ליניארי (LDA) משמש לחישוב גודל ההשפעה של כל תכונה בשפע באופן דיפרנציאלי. סף ציוני ה-LDA גבוה יותר מרשימת 4 היו, מה שמצביע על שפע קהילתי יחסי גבוה יותר בקבוצה המקבילה מאשר בקבוצות אחרות. בשיטה זו מצאנו ש-19 OTUs היו שונים באופן מובהק בכל הקבוצות, כלומר, 6 OTUs בקבוצת הביקורת היו גבוהים יותר, רק 1 OTU בקבוצת ZT היה גבוה יותר, 10 OTUs בקבוצת HM היו גבוהים יותר. ו-2 OTUS בקבוצת LM היו גבוהים יותר מקבוצות אחרות (איור 8). השפע של g_Prevotelaceae_ UCG_001 ב-LM גדל באופן משמעותי (8.47 ± 1.9 אחוזים ב-LM, 0.40 ± {{21 }}.09 אחוזים בקבוצת הבקרה, pb 0.01). התוצאה הייתה עקבית עם הדו"ח שפוליסכרידים מסוג Porphyra haitanensis ו-Ulva prolifera יכולים כמובן לקדם את התפשטותם של Prevotellaceae UGC-001 (pb 0.05) ו-Rikenellaceae RC9 (pb 0.01) [35].

4. מסקנות

ברור שיש קשר בין מרכיבים כימיים של TCM, מיקרוביוטה של ​​המעי ומטבוליטים מסוימים הנובעים מחיידקים במעיים. הממצאים הנוכחיים שלנו סיפקו שיטה לחקר סינרגיות מטבוליזם של אכינאקוסייד עם סוגים שונים של פוליסכרידים המבוססים על מיקרוביוטה של ​​המעי. מיקרוביוטה במעיים יכולה לבצע חילוף חומרים של TCM ו-TCM יכול להשפיע על הצמיחה של מיקרוביוטה במעיים. מצד אחד, לאחר מתן פומי של פוליסכרידים למעי, מגוון של מיקרוביוטות במעיים מקודדות לאנזימים מטבוליים, הממלאים תפקיד חשוב בפירוק פוליסכרידים, ולייצור מטבוליטים ביו-אקטיביים. מצד שני, לתרומות של פוליסכרידים יש השפעה מסוימת על איזון המיקרו-סביבה של המעיים בתהליך. באמצעות השוואה של עם או בלי פוליסכרידים, מצאנו שפוליסכרידים, למרות שהמארח עכל אותם ישירות, פעלו כפרה-ביוטיקה, מה שהוביל לשינויים חיוביים במיקרוביוטה של ​​המעיים על ידי קידום הצמיחה של פרוביוטיקה. פוליסכרידים של Cistanche הסדירו את מגוון המיקרוביוטה של ​​המעיים, הגבירו חיידקים מועילים ובמיוחד פוליסכרידים מולקולריים נמוכים שיפרו את הצמיחה של Prevotella spp. יתר על כן, המיקרוביוטה המשופרת של המעי הגבירה את הספיגה של אכינאקוסיד ב- Cistanche deserticola. אבל הסיבה לא לגמרי ברורה, עשויה להיות תוצאה של הפגמים המשולבים של מיקרוביוטת המעיים, SCFAs וחסינות, ומחקר נוסף נחוץ למודל מחלה. קשה להוכיח את ההשפעות של פרה-ביוטיקה במודלים של בעלי חיים בריאים שקהילת המיקרוביוטה שלהם יציבה וגמישה. פוליסכרידים של Cistanche deserticola עשויים להיות מפותחים כמוצרים פרוביוטיים לוויסות המיקרוביוטה של ​​המעיים וניתן ליישם אותם על חילוף חומרים סינרגטי של מולקולות קטנות בעתיד. נתונים אלה יעזרו לנו לתכנן התערבויות כדי למנוע מקבוצות פגיעות של אנשים לשפר את בריאותם.

הצהרת עניין מתחרה

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים בנוגע לפרסום מאמר זה.

תודות

מחברים מודים בהכרת תודה לקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס' 81830112 ו-81904058)

הפניות
[1] I. Khangwal, P. Shukla, Potential Prebiotics and their transmission: recent approaches, J. Food Drug Anal. 27 (3) (2019) 649–656.
[2] XF Xu, PP Xu, CW Ma, J. Tang, XW Zhang, מיקרוביוטה של ​​המעיים, בריאות המארח ופוליסכרידים, ביוטכנול. עו"ד 31 (2) (2013) 318–337.
[3] NT Porter, EC Martens, התפקידים הקריטיים של פוליסכרידים באקולוגיה ופיזיולוגיה של חיידקים במעיים, Annu. Rev. Microbiol. 71 (2017) 349–369.
[4] QW Guo, QQ Ma, ZH Xue, XD Gao, HX Chen, מחקרים על מאפייני הקישור של שלושה פוליסכרידים בעלי משקל מולקולרי שונה ופלבנואידים ממשי תירס (סטיגמה Maydis), Carbohyd. Polym. 198 (2018) 581–588.
[5] SS Zhou, J. Xu, H. Zhu, J. Wu, JD Xu, R. Yan, XY Li, HH Liu, SM Duan, Z. Wang, HB Chen, H. Shen, SL Li, Gut microbiota מנגנונים מעורבים בהגברת החשיפה המערכתית של ג'ינסנוזידים על ידי פוליסכרידים קיימים במרתח ג'ינסנג, Sci. רפ' 6 (2016), 22474.
[6] YP Jing, AP Li, ZR Liu, PR Yang, JS Wei, XJ Chen, T. Zhao, YR Bai, LJ Zha, CJ Zhang, Absorption of Codonopsis pilosula saponins על ידי פוליסכרידים דו-קיום מקלה על דיסביוזיס מיקרוביאלית במעיים עם דקסטרן סולפט. קוליטיס נגרמת בעכברי מודל, Biomed. מילון Int. 2018 (2018), 1781036 (18 עמודים).
[7] CJ Chang, CS Lin, CC Lu, J. Martel, YF Ko, DM Ojcius, SF Tseng, TR Wu, YYM
Chen, JD Young, HC Lai, Ganoderma Lucidum מפחית השמנת יתר בעכברים על ידי אפנון הרכב המיקרוביוטה של ​​המעי, Nat. Commun. 6 (2015) 7489.
[8] JC Zhang, GM Yang, YZ Wen, SX Liu, CF Li, RL Yang, W. Li, מיקרוביוטה של ​​המעיים מעורבים בפעילויות האימונומודולטוריות של פוליסכריד לונגן, Mol. נוטר. Food Res. 61 (11) (2017), 1700466.
[9] T. Wang, XY Zhang, WY Xie, Cistanche deserticola YC Ma, "Desert Ginseng": סקירה, Am. ג'יי צ'ין. Med. 40 (6) (2012) 1123–1141.
[10] Y. Li, GS Zhou, SH Xing, PF Tu, XB Li, זיהוי מטבוליטים של אכינאקוסיד המיוצרים על ידי חיידקי מעיים אנושיים באמצעות נוזל בעל ביצועים גבוהים
chromatography–quadrupole time-of-flight ספקטרומטריית מסה, J. Agr. Food Chem. 63 (30) (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, Y. Peng, MY Wang, PF Tu, XB Li, Human gastrointestinal metabolism of Cistanches Herba water extract in vitro: הבהרת הפרופיל המטבולי מבוסס על זיהוי מטבוליטים מקיף במיץ קיבה, מיץ מעיים, מעיים אנושי חיידקים, ומיקרוזום מעיים, J. Agric. Food Chem. 65 (34)
(2017) 7447–7456.
[12] M. Dubois, K. Gilles, JK Hamilton, PA Rebers, F. Smith, Colorimetric method for determination of sugars and related materials, Anal. Chem. 168 (4265) (1956) 167.
[13] NH Cho, SY Seong, KH Chun, YH Kim, IC Kwon, BY Ahn, SY Jeong. מהדורה 53 (1–3) (1998) 215–224.
[14] XY Zhao, ZZ Jiang, F. Yang, Y. Wang, XM Gao, YF Wang, X. Chai, GX Pan, Y. Zhu, זיהוי רגיש ומפושט של השפעה אנטיביוטית על השינויים הדינמיים והרבגוניים של קצר צואה חומצות שומן שרשרת, PLoS One 11 (12) (2016), e167032.
[15] SJ Li, QP Xiong, XP Lai, X. Li, MJ Wan, JN Zhang, YJ Yan, M. Cao, L. Lu, JM Guan, DY Zhang, Y. Lin, שינוי מולקולרי של פוליסכרידים והפעילות הביולוגית הנובעת מכך , Compr. הכומר אוכל. Sci. ו' 15 (2) (2016) 237–250.
[16] ZF Fu, X. Fan, XY Wang, XM Gao, Cistanches Herba: סקירה כללית של תכונת הכימיה, הפרמקולוגיה והפרמקוקינטיקה שלו, J. Ethnopharmacol. 219 (2018) 233–247.
[17] W. Zhou, XB Tan, JJ Shan, T. Liu, BC Cai, LQ Di, Effect of chitooligosaccharides on
הספיגות במעיים של גליקוזידים פנילתנואידים בתמצית Fructus Forsythia, Phytomedicine 21 (12) (2014) 1549–1558.
[18] LL Sun, M. Wang, HJ Zhang, GJ You, YN Liu, XL Ren, YR Deng, The impact of polysaccharides from Ophiopogon japonicus on 2,3,5,4′-tetrahydroxy-stilbene-2- ז. Fu et al. / International Journal of Biological Macromolecules 149 (2020) 732–740 739 O- -d-glucoside לגבי תכונות ביו-פרמצבטיות במבחנה ופרמקוקינטיקה in vivo, Int. ג'יי ביול. מקרומול. 119 (2018) 677–682.
[19] KN Lam, M. Alexander, PJ Turnbaugh, Precision medicine goes microscopic: הנדסת המיקרוביום לשיפור תוצאות התרופה, Cell Host Microbe 26 (1) (2019) 22–34.
[20] I. Khangwal, P. Shukla, Prospecting prebiotics, methoden הערכה חדשניות, ויישומי הבריאות שלהן: סקירה, 3 Biotech. 9 (5) (2019) 187.
[21] GR Gibson, R. Hutkins, ME Sanders, SL Prescott, RA Reimer, SJ Salminen, K. Scott, C. Stanton, KS Swanson, PD Cani, K. Verbeke, G. Reid, The International Scientific Association for Probiotics והצהרת קונצנזוס פרה-ביוטיקה (ISAPP) על ההגדרה וההיקף של הפרה-ביוטיקה, נאט. כומר גסטרו. Hepat. 14 (8) (2017) 491–502.
[22] JMW Wong, R. de Souza, CWC Kendall, A. Emam, DJA Jenkins, Colonic health: fermentation and short-chain fatty acids, J. Clin. גסטרואנטרול. 40 (3) (2006) 235–243.
[23] SI Cook, JH Sellin, מאמר סקירה: חומצות שומן קצרות שרשרת בבריאות ומחלות, Aliment. פארם. ת'ר. 12 (6) (1998) 499–507.
[24] H. Yamashita, K. Fujisawa, E. Ito, S. Idei, N. Kawaguchi, M. Kimoto, M. Hinamori, H. Tsuji, Improvement of obesity and glucose tolerance by acetate in diabetes type 2 Otsuka Long- חולדות אוונס טוקושימה שומניות (OLETF), Biosci. ביוטכנולוגיה. Biochem. 71 (5) (2007) 1236–1243.
[25] AL Ho, O. Kosik, A. Lovegrove, D. Charalampopoulos, RA Rastall, תסיסה חוץ גופית של xylooligosaccharides ושברים Xylo-polysaccharide עם משקלים מולקולריים שונים על ידי חיידקי צואה אנושיים, Carbohyd. Polym. 179 (2018) 50–58.
[26] TT Chen, WM Long, CH Zhang, S. Liu, LP Zhao, BR Hamaker, יכולת ניצול הסיבים משתנה במיקרוביוטת המעיים הנשלטת על ידי Prevotella לעומת Bacteroides, Sci. נציג 7 (1) (2017) 2594.
[27] M. Sakamoto, M. Ohkuma, Bacteroides sartorii היא מילה נרדפת הטרוטיפית מוקדמת יותר של Bacteroides chinchilla ובעלת עדיפות, Int. ג'יי סיסט. Evol. מיקר. 62 (6) (2012) 1241–1244.
[28] PJ Turnbaugh, RE Ley, MA Mahowald, V. Magrini, ER Mardis, JI Gordon, An obesity-associated gut microbiome with better capabilitet for קציר אנרגיה, Nature 444 (7122) (2006) 1027-1131.
[29] LF Gomez-Arango, HL Barrett, HD McIntyre, LK Callaway, M. Morrison, NM Dekker, Connections between the gut microbiome and metabolic hormones in early pregnancy in overweight and obese women, Diabetes 65 (8) (2016) 2214 –2223.
[30] KL Ormerod, DL Wood, N. Lachner, SL Gellatly, JN Daly, JD Parsons, CG Dal Molin, RW Palfreyman, LK Nielsen, MA Cooper, M. Morrison, PM Hansbro, P. Hugenholtz, אפיון גנומי של משפחת Bacteroidales ללא תרבות S24-7 המאכלסת את המעיים של בעלי חיים הומיאותרמיים, Microbiome. 4 (1) (2016) 36.
[31] JD Zhang, LJ Song, YJ Wang, C. Liu, L. Zhang, SW Zhu, SJ Liu, LP Duan, Beneficial effect of butyrate-producing Lachnospiraceae on stress-induced visceral hypersensitivity in rats, J. Gastro. הפטול. 34 (8) (2019) 1368–1376.
[32] T. Accetto, G. Avguštin, מנגנון הפירוק הצמחי הרב-סוכר המגוון והענף של מיני Prevotella ברום ובמעי האחורי: גורם בשכיחותם בכל מקום? סיסט. יישום מיקרוביול. 42 (2) (2019) 107–116.
[33] KE באך קנודסן, MS Hedemann, HN Lærke, תפקיד הפחמימות בבריאות המעיים של חזירים, Anim. הזנה. Sci. טק. 173 (1–2) (2012) 41–53.
[34] SA Parker, A. Geirnaert, L. Berchtold, A. Greppi, L. Krych, RE Steinert, T. de Wouters, C. Lacroix, הבנת הפוטנציאל הפרה-ביוטי של סיבים תזונתיים שונים באמצעות מודל תסיסה למבוגרים מתמשך במבחנה (PolyFermS), Sci. נציג 8 (1) (2018) 4318.
[35] ZS Zhang, XM Wang, SW Han, CD Liu, F. Liu, Effect of two polysaccharides אצות על מיקרוביוטה של ​​המעי בעכברים שהוערכו על ידי Illumina PE250 sequencing, Int. ג'יי ביול. מקרומול. 112 (2018) 796–802.