Cistanche Deserticolapolysaccharides מקלים על ירידה קוגניטיבית בעכברי מודל הזדקנות על ידי שחזור ציר המיקרוביוטה-מוח של המעי

איש קשר: ali.ma@wecistanche.com

Yuan Gao1,*, Bing Li1,*, Hong Liu1, Yajuan Tian2, Chao Gu1, Xiaoli Du1, Ren Bu1, Jie Gao1, Yang Liu1, Gang Li1

תַקצִיר

עדויות אחרונות מצביעות על כך ששינויים בציר המיקרוביוטה-מוח של המעי עלולים לגרום לפגיעה קוגניטיבית עםהְזדַקְנוּת. במחקר הנוכחי, ראינו כי מתן ממושך של D-galactose לעכברים גרם לירידה קוגניטיבית, דיסביוזה מיקרוביאלית במעיים, דלקת היקפית ולחץ חמצוני. במודל זה של ירידה קוגניטיבית הקשורה לגיל,פוליסכרידים של Cistanche deserticola(CDPS) שיפר את התפקוד הקוגניטיבי בעכברים שטופלו ב-D-גלקטוז על ידי שחזור הומאוסטזיס מיקרוביאלי במעיים, ובכך הפחתת מתח חמצוני ודלקת היקפית. ההשפעות המועילות של CDPS בעכברים מזדקנים אלה בוטלו באמצעות אבלציה של מיקרוביוטה של ​​המעי עם אנטיביוטיקה או דיכוי חיסוני עם cyclophosphamide. פרופיל מטבולומי בסרום הראה שרמות של קריאטינין, ולין, L-methionine, o-טולואידין, N-ethylaniline, חומצת שתן ופרולין השתנו ב-הְזדַקְנוּתדגמי עכברים, אך שוחזרו על ידי CDPS. ממצאים אלה הוכיחו זאתCDPSמשפר את התפקוד הקוגניטיבי ב-D-galactose-inducedהְזדַקְנוּתמודל בעכברים על ידי שחזור הומאוסטזיס של ציר המוח של מיקרוביוטת המעי, אשר הקל על חוסר איזון חומצות אמינו, דלקת היקפית ולחץ חמצוני.CDPSכך מראה פוטנציאל טיפולי עבור חולים עם הפרעות זיכרון ולמידה, במיוחד אלה הקשורות לדיסביוזיס של מעיים.

לחץ ל-Cistanche תופעת לוואי של אנטי אייג'ינג

מבוא

מתן ממושך של מלחי D-galactose (D-gal) ובריליום גורם להזדקנות במודלים ניסיוניים של בעלי חיים ותרביות תאים ראשוניים במבחנה ומשמש לזיהוי מנגנונים העומדים בבסיס תהליך ההזדקנות הטבעי [1-4]. מחקרים קודמים מראים שירידה קוגניטיבית ב-D-galactose-inducedהְזדַקְנוּתעכברי מודל קשורים לרמות חלבון מופחתות של גורם גדילה עצבי (NGF) ולעלייה במיני חמצן תגובתיים (ROS) במוח, שניהם גורמים לניוון של נוירוני ההיפוקמפוס ולהפחית נוירוגנזה [3, 4]. מחקרים אחרונים הראו גם שהרכב ומספר המיקרוביוטה של ​​המעי האנושי משתנים באופן משמעותי במהלךהְזדַקְנוּתתהליך[5].

Cistanchedeserticola הוא עשב שגדל בעיקר באזור המדבר הצפון-מערבי של סין ומשמש ברפואה סינית מסורתית. זה מכונה בדרך כלל "ג'ינסנג של המדבר". תמציות Cistanche deserticola מכילות מספר תרכובות פעילות פרמקולוגית, כולל פנילתנואידים גליקוזידים, אירידואידים, ליגנוזה, אוליגוסכרידים, פוליסכרידים וחומצות אמינו; תרכובות אלו קשורות לתכונות אנטי-דלקתיות, נוגדות חמצון, אנטי-מזדקנות, נוירו-פרוטקטיביות ואימונומודולטוריות [6, 7]. לדוגמה, פוליסכרידים המופקים מ- Cistanche deserticola שימשו ברפואה הסינית המסורתית לטיפול בסרטן המעי הגס [8]. מגוון רחב של פוליסכרידים רעילים חלשים עם ביולוגיות שימושיות בודד ממספר אורגניזמים, כגון פוליסכריד צ'ואנג'יונג, פוליסכריד Ganoderma lucidum ופוליסכריד Lycium barbarum [9-11]. CDA 0.05 הוא גלקטוגלוקן שבודד מCistanchedeserticola המעודדת צמיחה של מספר חיידקי מעיים מועילים, כולל כמה מינים של Bacteroides ו-Lactobacillus [12].

המנגנונים הבסיסיים של הנורמליהְזדַקְנוּתהתהליך מעורב גם במספר מחלות אנושיות כגון הפרעות ניווניות, טרשת עורקים כליליים, סוכרת מסוג 2 (T2DM) ויתר לחץ דם [13, 14]. מחקרים אחרונים הראו ששינויים בפלורת המעיים ממלאים תפקיד משמעותי בהזדקנות האדם [15]. מספר מחקרים הראו כי מתן ממושך של D-galactose בעכברים וחולדות ניסויים מחקה את תהליך ההזדקנות הרגיל ומהווה מודל שימושי לחקרהְזדַקְנוּתפנוטיפים הקשורים כמו ירידה בקוגניציה [16]. יתר על כן, עכברי מודל הזדקנות המושרה על ידי D-גלקטוז מראים שינויים בהרכב המיקרוביוטה של ​​המעיים [17]. לכן, שיערנו ששינויים בהרכב המיקרוביוטה של ​​המעי עלולים לגרום לירידה קוגניטיבית בעכברי מודל ההזדקנות הנגרמת על ידי גלקטוז D, וחקרנו אםפוליסכרידים של Cistanche deserticola(CDPS) עשוי להקל על ירידה קוגניטיבית על ידי שחזור דיסביוזיס של מיקרוביוטה במעיים.

תוצאות

עכברי מודל הזדקנות המושרה על ידי D-גלקטוז מדגימים ירידה קוגניטיבית ודיסביוזה מיקרוביאלית של המעיים

ניתחנו את הביצועים ההתנהגותיים של עכברים מסוג פרא (WT) ואלה שטופלו ב-150 מ"ג D-gal לק"ג משקל גוף במשך חודשיים (מודל או Mod) באמצעות זיהוי אובייקטים חדשניים ומבחני מוריס מים (MWM). ערכי האינדקס המועדפים במבחן זיהוי האובייקטים החדשים הופחתו באופן משמעותי בעכברי קבוצת Mod בהשוואה לעכברי קבוצת WT (איור 1A, 1B). תוצאות בדיקת MWM הראו כי זמן האחזור של הבריחה לאחר היום השישי גדל באופן משמעותי בקבוצת Mod בהשוואה לקבוצת WT (איור 1C, 1D). יתר על כן, חציית פלטפורמת יעד וזמני השחייה ברביע היעד הופחתו באופן משמעותי בקבוצת Mod בהשוואה לקבוצת WT (איור 1E, 1F). תוצאות אלו הדגימו ירידה משמעותית ביכולות הלמידה והזיכרון של ה-D gal-inducedהְזדַקְנוּתדגמי עכברים.

לאחר מכן ניתחנו את ההבדלים בשפע ובהרכב של החיידקים במעיים, סוגים ומינים בדגימות הצואה של קבוצות ה-Mod וה-WT של עכברים תוך שימוש בנתוני רצף 16S ריבוזומי RNA (rRNA) מדגימות צואה. פלורת המעיים השולטת בעכברים מקבוצת WT ו-Mod היו Firmicutes ו-Bacteroides. עם זאת, השפע של Bacteroides הצטמצם באופן משמעותי והשפע של Firmicutes גדל באופן משמעותי בקבוצת Mod בהשוואה לקבוצת WT (איור 2A). לאחר מכן, ביצענו ניתוח מבחין ליניארי (LDA) כדי לקבוע ציוני גודל אפקט LDA (LEfSe) ואחריו בדיקות Kruskal-Wallis ו- Wilcoxon כדי להעריך את השפע היחסי של טקסונים שונים בעכברים מקבוצת WT ו-Mod. תוצאות ה-LDA מוצגות באיור 2B. יתר על כן, בנינו קלדוגרמות המציגות העשרה דיפרנציאלית של סוגים ומינים שונים השייכים ל-Bacteriodes ו-Firmicutes בקבוצות ה-WT והמודלים (איור 2C). בסך הכל, התוצאות שלנו הדגימו יכולת קוגניטיבית לקויה ודיסביוזה מיקרוביאלית במעיים בעכברי מודל ההזדקנות המושרה על ידי D-גלקטוז.

טיפול CDPS משפר את היכולת הקוגניטיבית בעכברי מודל ההזדקנות המושרה על ידי D-gal

ניתחנו אםCDPSהטיפול מקל על ירידה קוגניטיבית ב-D-gal-inducedהְזדַקְנוּתדגמי עכברים. במהלך 2 החודשים של המתן, משקל הגוף נמדד כל יומיים. משקלי הגוף של המודל וקבוצות ה-CDPS של עכברים היו דומים (איור 3A). ערכו ניסויים התנהגותיים לאחר המנה האחרונה. זיהוי אובייקטים חדשני ותוצאות בדיקת מבוך המים של מוריס הראו שזיכרון לטווח קצר היה גבוה משמעותית בקבוצות ה-CDPS של עכברים בהשוואה לקבוצת העכברים המודלית; זיכרון לטווח ארוך בקבוצת העכברים CDPS היה גבוה יותר אך חסר משמעות סטטיסטית בהשוואה לקבוצת העכברים המודל (איור 3B, 3C). זה הצביע על כך שטיפול CDPS ביטל אובדן של זיכרון זיהוי אובייקט לטווח קצר בעכברים שטופלו ב-D-gal.

הלמידה המרחבית והזיכרון של עכברים אלה הוערכו על ידי בדיקת מבוך המים של מוריס, והתוצאות הראו כי זמני האחזור של הבריחהCDPSקבוצת העכברים היו דומות לקבוצת העכברים WT וקצרים משמעותית מקבוצת העכברים Mod (איור 3D). יתר על כן, זמני האחזור לבריחה היו נמוכים משמעותית ביום השישי שלאחר מתן CDPS בהשוואה לקבוצת המודל (איור 3E). זמן השחייה ברביע המטרה היה גבוה משמעותית בקבוצות CH ו-CM בהשוואה לקבוצת המודל. קבוצת CL גבוהה יותר מקבוצת המודל אך ללא מובהקות סטטיסטית (איור 3F). יתרה מכך, מספר מעברי הפלטפורמה היה גבוה משמעותית בקבוצות CM ו-CL בהשוואה לקבוצת המודל. עם זאת, קבוצת CH גבוהה מקבוצת המודל ואין לה מובהקות סטטיסטית (איור 3G). תוצאות אלו הוכיחו שטיפול CDPS שיפר למידה מרחבית וזיכרון בעכברי מודל ההזדקנות המושרה על ידי D-gal.

טיפול CDPS משחזר הומאוסטזיס של הרכב המיקרוביוטה של ​​המעי בעכברי מודל ההזדקנות D-גלקטוז

חד-סוכרים ופולי-סוכרים הם רכיבי התזונה החיוניים הדרושים לצמיחת חיידקים [18-21]. כך מדווח גםCDPSמסדיר את הרכב המיקרוביוטה של ​​המעיים [22]. לכן, ניתחנו אם טיפולי CDPS מקלים על הדיסביוזיס המיקרוביאלית של המעיים בעכברי קבוצת המודל על ידי הערכת נתוני רצף rRNA16S של דגימות צואה מקבוצות העכברים WT, המודל וה-CDPS.

ראשית, חישבנו מדדי גיוון אלפא כדי להעריך את העושר הכולל של המיקרוביוטה הצואה וההבדל המבני בין הקבוצות הללו. ניתחנו אינדקסים של גיוון אלפא (-גיוון) כגון מינים שנצפו, ערכי אינדקס של שאנון, צ'או 1, ACE וסימפסון כדי לקבוע שינויים בהרכבם של מיני חיידקים שונים בדגימות הצואה של קבוצות מווריניות שונות. מדדי הגיוון (מינים נצפים, שאנון, צ'או 1, ACE ומדד סימפסון) היו גבוהים יותר ב-WT וCDPSקבוצות של עכברים בהשוואה לקבוצת המודל, אך מובהקות סטטיסטית נצפתה רק עבור ערכי אינדקס Chao 1 בין קבוצת CM לקבוצת Mod. זה הצביע על כך שמתן עם CDPS מגביר את עושר המיקרוביום (איור 4A-4E). לאחר מכן, ניתחנו מדדי גיוון כדי לזהות הבדלים במין החיידקים במעיים בין קבוצות העכברים WT, המודל וה-CDPS באמצעות קנה מידה רב-ממדי לא-מטרי (NMDS), ניתוח קואורדינטות ראשי (PCoA) וניתוח רכיבים ראשיים (PCA) . PCA הראה וריאציות בהרכב החיידקים במעיים של עכברי קבוצת המודל במהלךהְזדַקְנוּתתהליך, כולל הפחתת מימד ותחזוקה של דפוסים ומגמות (איור 4F). ההבדלים במיקרוביוטה הצואה בין קבוצות ה-WT, המודל וה-CDPS זוהו בהתבסס על PCoA של מרחקי UniFrac הבלתי משוקללים עבור גנים rRNA 16S (איור 4G). ניתוח אשכולות הראה הבדלים משמעותיים ב-NMDS בין קבוצת המודל לקבוצות WT ו-CDPS (איור 4H).

הערכנו את 10 הפילות המובילות של מיקרוביוטת המעיים ומצאנו ששפע ה-Bacteroides phyla היה גבוה משמעותית בקבוצת CH, CM ו-CL בהשוואה לקבוצת המודל (איור 4I). זה הציע ש-CDPS שיחזר את ההומאוסטזיס של מיקרוביוטת המעיים בעכברים שטופלו ב-D-gal. הקלדוגרמות הראו העשרה דיפרנציאלית של סוגים ומינים שונים השייכים ל-Bacteriodes ו-Firmicutes phyla ב-WT, במודל ובקבוצות CDPS (איור 4J). כפי שמוצג במפות החום,CDPSהטיפולים הפחיתו את השפע היחסי של Thermoplasmata, Bacilli, Actinobacteria לא מזוהה, Fusobacteriia ו-Elusimicrobia לא מזוהה והגדילו את השפע היחסי של Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, לא מזוהה_Deferribacteres,Mollicutes, אנטרוסיפלינה{0}ולא מזוהה }ציאנובקטריה בהשוואה לקבוצת המודלים (איור 4K). תוצאות אלו הוכיחו שטיפול ב-CDPS שיקם באופן משמעותי הומאוסטזיס של מיקרוביוטת המעי בעכברי מודל ההזדקנות המושרה על ידי D-gal.

טיפול CDPS מקל על ניוון עצבי בעכברי מודל ההזדקנות המושרה על ידי D-gal על ידי הפחתת מתח חמצוני

לאחר מכן ניתחנו את ההשפעות של CDPS על דלקת על ידי ניתוח רמות הסרום של ציטוקינים פרו-דלקתיים (IL-2 ו-TNF-), וציטוקינים אנטי-דלקתיים (IL-4 ו-IL-10 ) בקבוצות שונות של עכברים. רמות הסרום של IL-2 ו-TNF- היו נמוכות משמעותית ורמות הסרום של IL-4 ו-IL-10 היו גבוהות משמעותית בקבוצת CH, CM ו-CL בהשוואה לקבוצת המודל . זה הראה את זהCDPSיש השפעות אנטי דלקתיות (איור 5A-5D).

מתח חמצוני נגרם על ידי ייצור מוגבר של מיני חמצן תגובתיים (ROS) והוא אחד הגורמים העיקריים המעודדיםהְזדַקְנוּת[23]. לכן, ניתחנו את ההשפעות של CDPS על עקה חמצונית במודל העכבר ההזדקנות המושרה על ידי D-gal על ידי הערכת רמות הסרום של האנזים נוגד החמצון, SOD, ושל תוצר החמצן של שומנים, מלונדאלדהיד (MDA). רמות הסרום של MDA היו גבוהות משמעותית ורמות הסרום של SOD הופחתו משמעותית בקבוצת Mod בהשוואה לקבוצת WT, אבל,CDPSהטיפול הפך את ההשפעות הללו (איור 5E, 5F). תוצאות אלו הוכיחו כי מתח חמצוני היה מוגבר בעכברי מודל ההזדקנות המושרה על ידי D-gal, אך הופחת על ידי טיפול CDPS.

יתר על כן, הערכנו את רמות הלחץ החמצוני ברקמות המוח על ידי ניתוח הרמות של מוצר החלבון המחומצן המתקדם (AOPP), חמצון שומנים ישיר (LPO) ו-MDA וכן פעילויות של אנזימים נוגדי חמצון כגון גלוטתיון פרוקסידאז (GSH-Px) ) וסופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) ברקמת המוח הומוגנית. המוח של עכברים מקבוצת Mod הראה פעילות מופחתת משמעותית של SOD ו- GSH-PX ורמות מוגברות משמעותית של AOPP, LPO ו-MDA בהשוואה לקבוצת WT, אך השפעות אלו התהפכו בקבוצת CH, CM ו-CL (איור 6A-6E ).

יתר על כן, ביצענו צביעה היסטולוגית של חלקי המוח עם כתמי H&E ו- Nissl כדי להעריך את ההשפעות המגן שלCDPSעל המוח של D-gal המושרההְזדַקְנוּתדגמי עכברים. העכברים בקבוצת Mod הראו ירידה משמעותית במספר הנוירונים ובנפח, עלייה בפער בין נוירונים, סידור לא סדיר של נוירונים ופיקנוזה גרעינית באזור ההיפוקמפוס CA1 בהשוואה לקבוצת WT, אך שינויים פתולוגיים אלו הופחתו משמעותית על ידי טיפולי CDPS ( איור 6F). תוצאות אלו הוכיחו שטיפולי CDPS הפחיתו באופן משמעותי מתח חמצוני ופתולוגיה מוחית בעכברי מודל ההזדקנות המושרה על ידי D gal.

טיפול CDPS מפחית דלקת היקפית ולחץ חמצוני על ידי שמירה על הומאוסטזיס מיקרוביאלי במעיים בעכברי מודל המושרה על ידי D-gal

לאחר מכן, ניתחנו אם השינויים בהרכב המיקרוביוטה של ​​המעי היו קשורים לעלייה בדלקת היקפית ולחץ חמצוני במהלך ההזדקנות. לשם כך, השתמשנו בקוקטייל אנטיביוטי משולש (קבוצת ABX) או בציקלופוספמיד (קבוצת Cy; ראה גם חומרים ושיטות) כדי לבטל את המיקרוביוטה של ​​המעי או לגרום לדיכוי חיסוני במטופלים שטופלו ב-CDPSהְזדַקְנוּתדגמי עכברים. הטיפול האנטיביוטי ביטל את ההשפעות המועילות של טיפול CDPS בעכברים מזדקנים. ראינו פגיעה בלמידה ובזיכרון (איור 7A), ושינויים בהרכב המיקרוביוטה של ​​המעיים (איור 7B, 7C) בעכברים בקבוצת ABX בהשוואה לקבוצה שטופלה ב-CDPS. התוצאות לעיל מצביעות על כך שאפילו הממשל שלCDPSלא יכול להגביר את יכולת הלמידה והזיכרון של עכברים לאחר שינוי פלורת המעיים. יתרה מכך, ראינו רמות מוגברות של ציטוקינים פרו-דלקתיים במוח ובנסיוב של עכברים מקבוצת ABX בהשוואה לקבוצת CDPS (איור 7D-7N). התוצאות של קבוצת ABX וקבוצת CY הראו שלאחר שהפלורה של המעיים והתפקוד החיסוני הושמדו, אפילו מתן CDPS לא יכול לשפר את יכולת הלמידה והזיכרון של עכברים. תוצאות אלו הצביעו על כך שטיפול CDPS הפחית דלקת היקפית, מתח חמצוני וירידה קוגניטיבית ב-D gal-inducedהְזדַקְנוּתדגמי עכברים על ידי מניעת דיסביוזיס במעיים.

לאחר מכן השתמשנו בתרופה מדכאת החיסון, cyclophosphamide [24] כדי לקבוע את תפקידה של דלקת בהשפעות המיטיבות של CDPS. עכברי CDPS שטופלו בציקלופוספאמיד (קבוצת Cy) הראו פגיעה ביכולת הלמידה והזיכרון, שינויים בהרכב המיקרוביוטה של ​​המעי ורמות חריגות של ציטוקינים פרו ואנטי דלקתיים במוח ובנסיוב בהשוואה לסוג הבר וCDPSעכברים קבוצתיים. עם זאת, אין משמעות בהשוואה לדגם ולקבוצת ABX. (איור 7A–7N). נתונים אלה מוכיחים ששינויים בהרכב המיקרוביוטה של ​​המעי מגבירים דלקת היקפית ב-D-gal-inducedהְזדַקְנוּתדגמי עכברים.

CDPS מונע הזדקנות הנגרמת על ידי D-gal על ידי ויסות חילוף החומרים של חומצות אמינו

המערכת החיסונית של המארח מושפעת ממטבוליטים הנוצרים על ידי המיקרוביוטה של ​​המעי [25]. המטבוליטים הצואה מייצגים קריאה פונקציונלית של חילוף החומרים של חיידקים במעיים והרכב חיידקים במעיים[26]. יתר על כן, מטבוליטים של המיקרוביוטה של ​​המעי נכנסים למחזור הדם ומשפיעים על חילוף החומרים והבריאות של המארח [26, 27]. בסך הכל זוהו 1058 מטבוליטים בדגימת סרום מ-fWT, Mod ו-CDPSעכברים. לאחר מכן, ניתחנו את המטבוליטים הללו באמצעות BioCyc, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genmes (KEGG) ומאגר מידע מטבולום אנושי (HMDB) ומצאנו ש-65 מטבוליטים באו לידי ביטוי דיפרנציאלי בקבוצת Mod בהשוואה לקבוצת WT. יתרה מכך, מצאנו שרמות של 8 מטבוליטים (קריאטינין, ולין, L-(-)-מתיונין, o-טולואידין, N Ethylaniline, חומצת שתן, פרולין ופנילאלנין) היו שונות באופן משמעותי בין קבוצות WT, Mod ו-CDPS. ניתוח העשרה של מסלולים של 8 מטבוליטים אלה באמצעות MetaboAnalyst [28, 29] הראה כי מטבוליטים אלו היו קשורים לחילוף חומרים של ארגינין, היסטידין, ארגינין, פרולין ופורין (איור 8A, 8B). 7 מטבוליטים שונים של קבוצת MOD וקבוצת CDPS בקבוצת WT.

לאחר מכן ניתחנו אם שינויים במטבוליזם של חומצות אמינו קשורים לשינויים בהרכב המיקרוביוטה של ​​המעי. ראינו ש-7 מטבוליטים שונים של קבוצות WT, Mod ו-CDPS (קריאטינין, ואלין, L-(-)-מתיונין, o-טולואידין, N-אתילנילין, חומצת שתן ופרולין) ירדו באופן משמעותי ב-ABX, Cy, ו קבוצות מוד בהשוואה לקבוצות WT ו-CDPS. יתר על כן, אין משמעות בין קבוצות ABX ו- Cy (איור 8C). לבסוף, על מנת לחקור יש מתאם בין חילוף חומרים דיפרנציאלי ומחלות אחרות הקשורות להזדקנות. ניתחנו את המתאם בין שבעת מטבוליטים המבוטאים בצורה דיפרנציאלית ומחלות אנושיות באמצעות מסד הנתונים MetaboAnalyst ומצאנו שמטבוליטים אלו היו קשורים למחלת אלצהיימר (p=0.00173; איור 8D, 8E). בסך הכל, הנתונים הללו הצביעו על כךCDPSמגן מפני D-gal-inducedהְזדַקְנוּתעל ידי ויסות חילוף החומרים של חומצות אמינו.

דִיוּן

ירידה מתקדמת בתפקוד הקוגניטיבי היא מאפיין אופייני להזדקנות. מחקרים קודמים הראו שטיפול ב-CDPS שיפר משמעותית את הלמידה והזיכרון בעכברים מזדקנים [30-33]. במחקר זה, הדגמנו שטיפול CDPS שיפר את התפקוד הקוגניטיבי על ידי עיכוב דלקת היקפית ולחץ חמצוני באמצעות שחזור הומאוסטזיס מיקרוביאלי במעיים ב-D-gal-inducedהְזדַקְנוּתמודל עכברים (איור 9). חולדות ספראג-דאולי הניזונות עםציסטאנצ'י פוליסכרידיםהראה צמיחה מוגברת של חיידקי מעיים מועילים וגיוון חיידקי מעיים משופר [34]. CDA-0.05, פוליסכריד ניטרלי Cistanche, שיפר את הצמיחה של לקטובצילים פרוביוטיים [22]. נתונים אלה הצביעו על כך שפוליסכרידים של Cistanche שיפרו את ההומאוסטזיס של חיידקי המעי.

במחקר זה הוכחנו זאתCDPSבעל השפעות אנטי דלקתיות ומשפר את היכולת הקוגניטיבית של עכברי המודל המזדקן על ידי אפנון השפע של סוגים של חיידקי מעיים כגון Bacteroidetes, Firmicutes ו-Proteobacteria. לפיכך, CDPS עשוי להיות מועיל מבחינה טיפולית למחלות הקשורות להזדקנות על ידי עיצוב מחדש של הרכב המיקרוביוטה של ​​המעי [35,36]. יתרה מכך, מחקרים קודמים הראו כי רמות הציטוקינים הדלקתיים בסרום ובמעי הגס קשורות לשפע היחסי של סוגים חיידקיים כגון Bacteroidetes, Firmicutes ו-Proteobacteria [37, 38]. יתר על כן, הרכב החיידקים במעיים מווסת את תפקוד המוח על ידי אפנון רמות מחזוריות של מספר ציטוקינים [39-43]. התוצאות שלנו הראו שטיפול ב-CDPS הפחית את השפע היחסי של Thermoplasmata, Bacilli, Actinobacteria לא מזוהה, Fusobacteriia ו-Elusimicrobia לא מזוהה, והגדיל את השפע היחסי של Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria,_Deferribacteria, Nierooscuteria, Nierooscuteria, לא מזוהה, Erysipelotrichia, וציאנובקטריה לא מזוהה_.

מטבוליטים מיקרוביאליים במעיים משתחררים לזרם הדם ומווסתים את הבריאות ומטבוליזם של המארח [26, 27]. ניתן להעריך את המטבוליטים המיקרוביאליים במעיים על ידי הערכת הרכב המטבוליטים בצואה, המשתנה עם שינויים בהרכב החיידקים במעיים [44]. מחקרים אחרונים הראו כי רמות פלזמה של ציטרולין, פרולין, ארגינין, אספרגין, פנילאלנין ותריונין קשורות להפרעות ניווניות של עצבים כולל מחלת אלצהיימר [45, 46]. המחקר שלנו הראה שרמות סרום של קריאטינין, ולין, L-methionine, o-Toluidine, N ethylaniline, חומצת שתן ופרולין היו קשורות ל-D-gal-inducedהְזדַקְנוּתבעכברים.

הזרועות המולדות והסתגלניות של מערכת החיסון ממלאות תפקיד משמעותי בשמירה על הומאוסטזיס מארח-מיקרוביאלי במשטח הלומינלי של המעי [47]. למיקרוביוטה של ​​המעי יש גם תפקיד משמעותי בוויסות מערכת העצבים המרכזית (CNS) והחסינות על ידי שחרור ציטוקינים ומטבוליטים לזרם הדם [48, 49]. הציטוקינים הפרו-דלקתיים ממלאים תפקיד מפתח במספר מחלות ניווניות [50-52]. לדוגמה, ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD) וגלאוקומה קשורים להצטברות חוץ-תאית של עמילואיד (A ) ותצהיר תוך תאי של טאו (p-tau) וזרחן יתר וברזל בתאי הגנגליון ברשתית (RGC) [44]. יתר על כן, לדלקת יש תפקיד משמעותי בפתוגנזה הקשורה לגלאוקומה [53]. ליקוי ראייה הוא סימפטום מוקדם של מחלת אלצהיימר (AD) ומתבטא לפני תחילת הירידה הקוגניטיבית [54]. המחקר שלנו הוכיח זאתCDPSמגן מפני ירידה קוגניטיבית ודלקת היקפית על ידי שמירה על ההומאוסטזיס של מיקרוביוטת המעיים.

ישנן מספר מגבלות למחקר זה. ראשית, הקשר בין חילוף החומרים של חומצות אמינו להרכב המיקרוביוטה של ​​המעי אינו ידוע היטב. שנית, ההרכב והמבנה המולקולרי של CDPS אינם ידועים. לכן, נדרשים מחקרים עתידיים כדי לחקור עוד את התפקיד הרגולטורי של CDPS בהקלה על AD דרך ציר איתות מיקרוביוטה-מוח של המעי.

לסיכום, המחקר שלנו הוכיח זאתCDPSיכולת קוגניטיבית משופרת ב-D-gal-inducedהְזדַקְנוּתדגמי עכברים על ידי שחזור ההומיאוסטזיס של המיקרוביוטה של ​​המעיים, ובכך משחזר חוסר איזון חומצות אמינו, דלקת היקפית ולחץ חמצוני. ממצאים אלו מצביעים על כך ש-CDPS הוא תרופה טיפולית פוטנציאלית עבור חולים עם הפרעות למידה וזיכרון, במיוחד אלו הקשורות לדיסביוזיס במעיים.

חומרים ושיטות

הכנת CDPS

בערך 1.0 ק"ג מנוקהCistanche deserticolaיובש באוויר בתנור בחום של 40 מעלות צלזיוס ופורק לאבקה גולמית. האבקה חולצה באתנול חם למשך 3 שעות. השאריות סוננו דרך גזה כדי להסיר את התסנין ולאחר מכן דיללו במים (8X) ועברו ריפלוקס ברצף למשך שעתיים, 1.5 שעות ושעה אחת ב-90 מעלות צלזיוס. בכל נקודת זמן, התמיסה עברה צנטריפוגה כדי להפריד את הסופרנטנט בשילוב עם התסנין החום-אדום. לאחר מכן, התסנין רוכז בלחץ מופחת, מקורר לטמפרטורת החדר, הוסף באיטיות ל-95 אחוז אתנול (3X), והותיר לעמוד ב-4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר מכן, הפתרון היה צנטריפוגה ב-6000 r/min למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. המשקע נאסף לאחר חזרה על מיצוי המים ומשקעי אלכוהול שלוש פעמים. המשקע שוחזר במים, הוסר מחלבון, עבר דיאליזה ומיובש בהקפאה כדי לקבל גולמיפוליסכריד Cistanche deserticola(CDPS). תכולת הפוליסכרידים הייתה יותר מ-90 אחוז כפי שהוערך על ידי ספקטרופוטומטריה אולטרה סגול.

קיבוץ בעלי חיים וטיפולים

עכברי קונמינג זכרים בני שמונה שבועות (מספר רישיון SCXK 2019-0010) נרכשו מ-SPF Biotechnology Co. Ltd (בייג'ינג, סין), שוכנו בחדר אור ומבוקר טמפרטורה, והוזנו במזון ובמים. כל הניסויים בבעלי חיים נערכו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של מונגוליה הפנימית. הניסויים בוצעו על פי מדריך המכון הלאומי לבריאות (NIH) לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

לאחר הסתגלות של שבוע אחד לסביבה החדשה, 120 עכברים חולקו ל-7 הקבוצות הבאות: (1) שליטה מסוג פראי (WT); קבוצת מודל (150 מ"ג/ק"ג ליום D-gal; Mod); (3) CH: D-gal בתוספת 100 מ"ג/ק"ג CDPS; (4) CM: D-gal בתוספת 50 מ"ג/ק"גCDPS; (5) CL: D-gal בתוספת 25 מ"ג/ק"ג CDPS; (6) קבוצת ABX: אנטיביוטיקה בתוספת D-gal בתוספת 50 מ"ג/ק"ג CDPS; (7) קבוצת Cy: cyclophosphamide בתוספת D-gal בתוספת 50mg/kg CDPS.

העכברים מקבוצת המודל, ABX, Cy ו-CDPS קיבלו זריקות תת עוריות של 15 0 מ"ג/ק"ג D-gal מומסים במלח כל יום במשך חודשיים. לקבוצת ה-WT הוזרקה תת עורית עם נפח שווה של מי מלח למשך חודשיים. העכברים בקבוצת CDPS ניתנו מדי יום עם זריקות תוך קיבה המכילות 100 מ"ג/ק"ג, 50 מ"ג/ק"ג או 25 מ"ג/ק"ג CDPS למשך חודשיים. העכברים מקבוצת ABX קיבלו מי שתייה עם 0.1 מ"ג/מ"ל אמפיצילין ו-0.5 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין למשך חודשיים בנוסף ל-D-gal ו-CDPSזריקות. לפני מתן D-gal, העכברים קיבלו זריקות המכילות 0.1 מ"ג/מ"ל אמפיצילין, 0.5 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין ו-0.1 מ"ג/מ"ל קוליסטין למשך 7 ימים בקבוצת ABX. העכברים מקבוצת Cy קיבלו זריקות תוך צפקית של 20 מ"ג/ק"ג cyclophosphamide כל יומיים (qod) במשך חודשיים בנוסף לזריקות יומיות של D-gal ו-CDPS.

מבחן זיהוי אובייקטים חדש

ערכו ניסויים התנהגותיים לאחר המנה האחרונה. מבחן זיהוי האובייקט כלל שלבי היכרות, אימון ובדיקה. במהלך שלב ההיכרות, עכברים הורגלו בתא בדיקה ריק למשך 10 דקות במשך יומיים. לאחר מכן, ביום השלישי (יום האימון), הונחו שני חפצים באותו גודל, צורה וצבע (A1 ו-A2) על קצוות מנוגדים של החדר. כל עכבר קיבל אז 10 דקות לחקור את שני האובייקטים הדומים. לאחר 1-שעה (ביום השלישי) ו-24-שעה (ביום הרביעי) מרווחי אימון לבדיקה, אחד מהאובייקטים הדומים (A1 או A2) הוחלף ב-B או C אובייקט שונה בגודל, בצבע ובצורה ביום הבדיקה. במהלך שלב הבדיקה, כל עכבר נבדק במשך 5 דקות והאינדקס המועדף חושב כדי לקבוע את הזיכרון של זיהוי אובייקט חדש (B או C) באמצעות הנוסחה הבאה: אינדקס מועדף=זמן על אובייקט B או C/( זמן על אובייקט B או C בתוספת זמן על אובייקט A)×100 אחוז .

מבחן מבוך המים של מוריס

בדיקת מבוך המים של מוריס בוצעה בבריכה עגולה שעומקה 45 ס"מ וקוטרה 90 ס"מ. הפרוטוקול המתואר על ידי Ruediger S, et al. (2011) [55] ו-Wood RA, et al. (2018) [56] הועסק כאן. עומק המים בבריכה היה 30 ס"מ, וטמפרטורת המים הייתה 20±1 מעלות צלזיוס. המשטח היה בקוטר 6 ס"מ ו-1 ס"מ מתחת למים. זמן ההדרכה והבדיקה היה 60 שניות כל אחד. לצורך הדרכה, ערכנו ארבעה ניסויים של 60 שניות כל אחד עם פלטפורמה נסתרת כל יום במשך חמישה ימים רצופים. אם הפלטפורמה לא התגלתה על ידי העכברים תוך 60 שניות, הם הונחו לפלטפורמה והונחו על הפלטפורמה למשך 5 שניות. במהלך שלב הבדיקה, תועדו ונותחו זמן השהייה להגיע לפלטפורמה הנסתרת בפגישות אימון וניסוי בדיקה, מספר המעבר על מיקום הפלטפורמה שהוסר, והזמן שהייה ברביע היעד (הפלטפורמה).

מבחני ELISA

רמות הסרום של ציטוקינים פרו-דלקתיים כגון IL-2(), IL-4, IL-10 ו-TNF- נותחו עבור כל קבוצת עכברים באמצעות ערכות ELISA שנרכשו משנגחאי Yi Li ביולוגי טכנולוגיה ושות', בע"מ (שנחאי, סין) על פי הוראות היצרן. הפעילות של אנזים נוגד חמצון, סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) ורמות של תוצר חמצון שומנים, מלונדאלדהיד (MDA), בסרום של כל קבוצת עכברים נותחה על ידי ערכות בדיקה שנרכשו מהמכון הביו-הנדסי של נאנג'ינג Jiancheng (נאנג'ינג, סין) . הרמות של מוצרי חלבון חמצון מתקדמים (AOPP) בדגימות ההיפוקמפוס של העכברים נאמדו באמצעות ערכת ELISA מבית Shanghai Yi Li Biological Technology Co. Ltd.(Shanghai, סין) לפי הוראות היצרן.

הערכה של מתח חמצוני במוח של עכברים

עשינו הומוגניות של רקמת היפוקמפוס של 100 מ"ג עם 0.9 מ"ל מי מלח מצונן בקרח וההומוגנט עבר בצנטריפוגה ב-12000 סל"ד למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. תכולת החלבון בסופרנטנט נותחה באמצעות ערכת BCA Protein Assay Kit ( ביו-טיים ביוטכנולוגיה, שנחאי, סין). רמות החמצן של שומנים (LPO) ומלונדיאלדהיד (MDA), והפעילות של GSH-Px ו-SOD בדגימות ההיפוקמפוס נותחו על ידי קולורימטריה באמצעות ערכות מהמכון הביו-הנדסי של Nanjing Jiancheng (נאנג'ינג, סין) לפי הוראות היצרן.

הרכב מיקרוביוטה במעיים

דגימות צואה נאספו מכל העכברים ואוחסנו מיד ב--80 מעלות צלזיוס. אזור V3 פלוס V4 של הגן 16S rRNA רושם באמצעות Illumina MiSeq (Beijing Novogene Co. Ltd., בייג'ינג, סין) ונותח באמצעות QIIME פלטפורמה פתוחה לקביעת פרופילי המיקרוביוטה של ​​המעיים.

ניתוח LC/MS של מטבוליטים בסרום

דגימות סרום הודגרו במשך 0 דקות עם מתנול מקורר מראש ביחס של 1:3 כדי לזרז את החלבונים. הדגימות עברו צנטריפוגה במהירות של 12000r/min במשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הסופרנטנטים נותחו על ידי Thermo Scientific Dionex UltiMate3000 Rapid Resolution Liquid Chromatography וספקטרום מסה QExactive. התנאים הכרומטוגרפיים מוצגים בטבלה 1. האנליטים הופרדו בעמודה כרומטוגרפית XBridge BEH Amide (2.1×100 מ"מ; Waters Co., Milford, MA, ארה"ב) תוך שימוש ב-0.1 אחוז חומצה פורמית ואצטוניטריל כשלבים ניידים A ו-B , בהתאמה. קצב הזרימה נקבע על 0.4 מ"ל/דקה, נפח ההזרקה היה 5 μl, וטמפרטורת העמודה נקבעה על 25 מעלות צלזיוס (טבלה 1). אותות ספקטרום המסה התקבלו באמצעות מצבי סריקת יונים חיוביים ושליליים. מתח ריסוס היונים ופרמטרים ספציפיים אחרים של MS מוצגים בטבלה 2.

ניתוח סטטיסטי

Statistical analysis was performed using the SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). The data plots were generated using GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). Partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of SIMCA-P+13.0 (Umetrics, AB, Umeå, Sweden) and Principal Components Analysis (PCA) were used to assess normalized GC-MS spectral data. Variable Influence on Projection (VIP) values were used to identify significant variables with VIP values >1.0 ועמ'< 0.05.="" these="" significant="" variables="" were="" used="" to="" identify="" the="" spectral="" peaks.="" the="" student's="" t-test="" was="" used="" to="" analyze="" differences="" between="" two="" groups="" of="" data.="" the="" taxonomic="" rank="" differential="" between="" groups="" was="" determined="" using="" student's="" test="" (v3.1.2;="" r="" programming="" language).="" the="" correlation="" between="" genera="" abundance="" and="" mouse="" behavior="" was="" calculated="" using="" spearman="" correlation="" coefficients="" (r="" language).="" p="" <="" 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" the="" data="" are="" presented="" as="">