כיצד ללמוד את המגוון הגנטי של הרבה ציסטנצ'ס?
Mar 14, 2022
מחקר על המגוון הגנטי של Herba Cistanches על ידי RAPD
איש קשר:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Cui Guanghong, Chen Min, Huang Luqi*, Xiao Suping, Li Da
(המכון למטריה סינית, האקדמיה הסינית לרפואה סינית, בייג'ינג 100700)
תַקצִיר
מַטָרָה:לחקור את האוכלוסייהמגוון גנטישֶׁלCistanche deserticolaוCistanche tubulosa.
שיטות:שתי אוכלוסיות פראיות שלCistanche deserticolaוארבע אוכלוסיות פרא שלCistanche tubulosaנותחו על ידי RAPD, והמגוון גנטימהאוכלוסיות נותחו על ידי גירסת התוכנה 1.31 של POPGENE.
תוצאות:האחוז הממוצע של לוקוסים פולימורפיים שלCistanche deserticolaהיה 47.37 אחוזים, הלוקים הפולימורפיים של שתי האוכלוסיות היו 39.47 אחוזים ו-35.53 אחוזים, ומגוון הגנים הממוצע של Nei היה 0.135 8. זה של שאנון היה יותר. אינדקס מידע המצב הוא 0.207 2, ומקדם ההתמיינות הגנים Gst {{1{{20}}}}.254 6. האחוז הממוצע של לוקוסים פולימורפיים ב-Cistanche היה 27.59 אחוזים, ואחוז הלוקוסים הפולימורפיים בכל אוכלוסיה נע בין 19.54 אחוז ל-25.29 אחוז, מתוכם לאוכלוסיית אנדייר הייתה הגבוהה ביותר 25.29 אחוז, והמגוון הגנים הממוצע של Nei היה 0. { {21}}, אינדקס מידע הפולימורפיזם של שאנון הוא 0.1258, מקדם בידול גנים Gst =0.175 5.
סיכום:Cistanche deserticolaוCistanche tubulosaיש הבדל מסוים בין אוכלוסיות. המגוון גנטישל Cistanche Desert גבוה משמעותית מזה של Cistanche tubulosa והתמיין לשני סוגים אקולוגיים.
מילות מפתח: Cistanche deserticola; Cistanche tubulosa; RAPD; מגוון גנטי
[מספר סיווג הספרייה הסינית] S 567 [קוד זיהוי מסמך] A [מספר מאמר] 1001-5302 (2004) 08-0727-04
Cistanche הוא צמח טפילי השייך לסוג Cistanche ממשפחת Lidanaceae, הידוע גם בשם Dayun, שהוא חומר מרפא סיני יקר. צמחי המקור העיקריים של Cistanche deserticola בארצי הםCistanche deserticolaYCMa ו-C.tubulosa (Schenk) R.Wight[1]. הצמחים המארחים של ה-Cistanche deserticola הם Haloxylon ammodendron ו-Haloxylon ammodendron, המופצים בעיקר בליגת אלאשאן במונגוליה הפנימית, צפון שינג'יאנג, צ'ינגהאי, גאנסו ומקומות נוספים. התפוצה של Cistanche deserticola זהה לזו של הצמחים המארחים. בארצי, Cistanche cistanche מופץ רק במחוזות סביב מדבר Taklimakan מדרום להרי טיאנסאן בשינג'יאנג, והתפוצה שלו אינה מסונכרנת לחלוטין עם הטמאריקס המארח. אזורים אחרים כמו צפון שינג'יאנג, גאנסו, צ'ינגהאי, נינגשיה, מונגוליה הפנימית, שאאנשי ומקומות אחרים של צמחי תמריקס אינם Cistanche Tubula טפיליים [2]. עקב העלייה המהירה בביקוש ל-Cistanche בשנים האחרונות, וכתוצאה מכך להכחדת משאביו, הצטמצמו משאבי ה-cistanche הבר לכמה אזורי ייצור עיקריים בלבד. שניהם נרשמו כמיני צמחים מוגנים בסכנת הכחדה בארצי [3], ביניהםCistanche deserticolaנכלל בנספח CITES II [4].
לאחר מספר שנים של מחקר, המחקר על גידול מלאכותי של Cistanche הצליח, והוא נמצא בשלב של קידום ושתילה בקנה מידה גדול. עם זאת, כיצד למנוע את הדעיכה של מיני Cistanche במהלך הייצור התעשייתי, כיצד לשקם את אוכלוסיית הבר המוגבלת בהקדם האפשרי, ולשמור על משאבי נבט פראי יקרים, הם המפתחות להשגת השימוש בר-קיימא שלה. באשר למורשת המוגנת של Cistanche [תאריך קבלת], 2004-03-11 [פרויקט הקרן] פרויקט הרווחה החברתית של משרד המדע והטכנולוגיה (2001.109); פרויקט "תכנית החומש העשירית" של משרד המדע והטכנולוגיה (2001BA701A09a) [המחבר המקביל] * Huang Luqi, טל:( 010) 64014411-2955, דואר אלקטרוני: huangluqi @263.net חקר השידור עדיין רֵיק. מחקר זה משתמש בטכנולוגיית RAPD כדי לחקור 2 אוכלוסיות פרא שלCistanche deserticolaו-4 אוכלוסיות פרא שלCistanche tubulosa, ולנתח את שניהם ההבדל במגוון גנטיצפוי לספק בסיס גנטי ניסיוני חשוב להגנה על Cistanche, תרופה סינית יקרת ערך.
1. חומר ושיטות
1.1 חומרים
Cistanche deserticolaנאסף ממחוז ג'ימסר בשינג'יאנג ומאזור ג'ילנטאי של ליגת אלקסה העתיקה במונגוליה הפנימית. אוכלוסיות Cistanche נאספו ממחוז מינפנג וממחוז יוטיאן, שינג'יאנג. מחוז Minfeng הוא כיום האזור עם התשואה הגדולה ביותר של Cistanche Cistanche, עם הצפיפות הגבוהה ביותר וקהילות שלמות יחסית של יערות טבעיים. נקודות הדגימה Andil, Sawuzek, Yatongguz ו- Daheyan ממחוז יוטיאן הם אזורי הייצור העיקריים, הממוקמים בנהר האנדיר, נהר Yeyike, Yatongguzi ו-Kelania בחלקים התחתונים של הנהר, המרחק בין האוכלוסיות הוא יותר מ 50 ק"מ. כל אוכלוסייה נדגמה באופן אקראי 19-30 פרטים. הדגימות יובשו במהירות בסיליקה ג'ל ושימשו למיצוי DNA (טבלה 1).
טבלה 1 דגימת אוכלוסיות ואזורי ייצור של Cistanche deserticola ו- Cistanche tubulosa
1.2 מיצוי DNA
שיטת מיצוי ה-DNA הכולל משתמשת בשיטת מלח גבוה, pH נמוך [5]. דגימת ה-DNA הועברה לספקטרופוטומטר כדי לזהות את ריכוז תבנית ה-DNA, ולאחר מכן נעשה שימוש באלקטרופורזה של 1 אחוז אגרוז ג'ל, צביעה EB, תצפית וצילום באור אולטרה סגול, אלקטרופורזה DNA עם פסים ברורים ופחות זנב לניתוח RAPD.
1.3 הקרנה של פריימרים RAPD
מאז הניסוי מצא כי לאותו פריימר יש השפעה לא מספקת על ההגברה בו זמנית של שניהםCistanche deserticolaו- Cistanche tubulosa, הפריימרים נבדקו באופן עצמאי. 150 פריימרים אקראיים (10 bp), מערכת תגובה של 25 μL של Shanghai Shenggong Biotechnology Co., Ltd. שימשו להגברה והקרנה; כל פריימר השתמש ב-2 תבניות אוכלוסיות ו-1 מים מזוקקים כפולים מעוקרים כבקרה ריקה, והשיג 10 פריימרים להגברה של Cistanche deserticola עם פסים ברורים, פולימורפיזם חזק וחזרה טובה: S490, S1 101, S{{ 8}}, S1 137, S1 165, S1 218, S1 222, S2 015, S2 112, S{{15 }}; 10 פריימרים שלCistanche tubulosa: S1 141, S1 146, S1 183, S1 208, S1 500, S2 032, S2 042, S2 052, S2 059, S2 155.
1.4 הגברה של PCR וזיהוי מוצר
הפריימרים שנבחרו שימשו להגברת ה-DNA של התבנית שלCistanche deserticolaוCistanche tubulosaעל ידי PCR. DNA גנומי דולל ל-50 ng·μL -1 בהתאם לריכוז הנמדד כתבנית. נפח התגובה הכולל הוא 25 μL, מתוכם 10 × מאגר PCR 2.5 μL, Mg2 בתוספת 1.5 μL, Taq (5 U·μL -1) 0.2 μL, תערובת dNTP (כל אחד 2.5 mM) 1 μL, 5 μM פריימר 1 μL, תבנית DNA 1 μL, מים מזוקקים כפולים 18.8 μL, פתרון הגברה של PCR לעיל הוא תוצר של שנחאי סנגון. ההגברה בוצעה במחזור תרמי PTC-100. תוכנית ההגברה הייתה 94 מעלות טרום דנטורציה למשך 5 דקות ולאחר מכן 40 מחזורים. כל מחזור כלל 94 מעלות 45 שניות, 34 מעלות 1 דקה, 72 מעלות 1 דקות 30 שניות, ולבסוף הארכה ב-72 מעלות למשך 5 דקות. התוצרים המוגברים עברו אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז 2.0 אחוז (המכיל EB) במאגר 1×TAE ונצפו וצולמו תחת מערכת הדמיה ג'ל SYNGENE.
1.5 סטטיסטיקה וניתוח נתונים
בספקטרום האלקטרופורזה, המיקום המתאים של תוצר התגובה על הג'ל מושווה לפי תקן המשקל המולקולרי, ומשקל המולקולרי של המוצר המוגבר מוערך. הלהקה עם הלהקה מוקלטת כ-1, והלהקה ללא הלהקה מוקלטת כ-0, ויוצרות גרף מטריצת 0/1 ומזינות למחשב, באמצעות POPGENE32 כדי לחשב את אחוז האתרים הפולימורפיים (PPL) של כל אוכלוסיה, אינדקס גיוון הגנים של Nei (H), אינדקס מידע הפולימורפיזם של שאנון (I), מקדם ההתמיינות הגנים (Gst), מגוון הגנים (Ht),מגוון גנטי(Hs), זהות גנטית (I) והמרחק הגנטי (D) של Nei (1978) בתוך אוכלוסייה, וניתוח אשכולות בוצע בשיטת UPGMA.
2. תוצאות וניתוח
2.1 מגוון גנטי של Cistanche
כל הדגימות קיבלו פסים עם משקל מולקולרי שנע בין 200 ל-2 200 bp (איור 1, 2). בסך הכל התגלו 76 לוקוסים ב-60 דגימות מ-2 אוכלוסיות שלCistanche deserticola, 36 מהם היו לוקוסים פולימורפיים, מהווים 47.37 אחוזים , H=0.135 8, I=0.207 2. ביניהם, ה-PPL של Jimsar הוא 39.47 אחוזים, ו-Gilanty של 35.53 אחוזים. H הוא 0. 0 95 3 ו-0.1 070 בהתאמה, ואני 0.15 12 ו-0.163 7 בהתאמה. בסך הכל זוהו 87 לוקוסים ב-{{20}} פרטים מ-4 אוכלוסיות של Cistanche, 24 מהן היו לוקוסים פולימורפיים, המהווים 27.59 אחוז , H=0.084 8, I=0.1278. ה-PPL הגבוה ביותר היה Andil עם 25.29 אחוזים, בעוד שה-PPL היה נמוך יותר בסאבוזק ו-Yatungusi (שניהם ב-19.54 אחוזים). H הוא 0.062 1 -0.080 0, I הוא 0.095 0 -0.116. הגודל של H ו-I תואם את מגמת הגודל של ה-PPL של כל אוכלוסייה, והמקדמים הם הגדולים באנדייר, ואחריו דיין. במקרה של אותו PPL, H=0 של Savuzek.{{40}} הסכום I=0.097 0 גבוה מעט מה-0.{{44 }} ו-0.095 0 של Yatunguska (טבלה 2).
איור 1 RAPD מוגבר להקות של כמה דוגמאות של מדברCistanche deserticola, פריימר S490 1-10. דגימות אחריות; 11-20. Jimpster דוגמת M-DNA Marker (200 - 2 000 bp)
איור 2 פסים מוגברים של RAPD של כמה דגימות של Cistanche Tubulosa, פריימר S2 042 1-20. דגימת סמן M-DNA של Xinjiang Andier (200 - 2 000 bp)
טבלה 2 המגוון גנטישֶׁלCistanche deserticolaוCistanche tubulosaאוכלוסיות
2.2 ניתוח וריאציה גנטית של Cistanche
לפי רמתמגוון גנטיבאוכלוסיות (Hs), בידול בין אוכלוסיות (Dst), ושיעור ההבדלים הגנטיים בין אוכלוסיות בסך ההבדלים הגנטיים (Gst), ניתן לראות שהמגוון הגנטי הכולל של Cistanche deserticola Ht=0.{{ 1}}, כאשר Hs=0.101 2, Gst =0.254 6. Cistanche Ht=0.082 2, מתוכם Hs=0.067 8, Gst=0.175 5 (טבלה 3). התוצאות לעיל מצביעות על כך שקיימת מידה מסוימת של שונות גנטית בין האוכלוסיות. השונות בין אוכלוסיות המדבר של Cistanche deserticola היווה 25.46 אחוזים מסך השונות, והשונות של אוכלוסיות Cistanche tubulosa היווה 17.55 אחוזים מסך השונות.
טבלה 3 ניתוח וריאציה גנטית שלCistanche deserticolaוCistanche tubulosa.
2.3 ניתוח מרחק גנטי ואשכול בקרב אוכלוסיות Cistanche deserticola
המרחק הגנטי של שתי האוכלוסיות שלCistanche deserticolaהוא {{0}}.080 0, והזהות הגנטית היא 0.9231. המרחק הגנטי של ארבע האוכלוסיות של Cistanche היה 0.012 0-0.031 5, והזהות הגנטית הייתה 0.9690-0.988 1 (טבלה 4) . התקבצות של פרטי Cistanche deserticola ו- Cistanche tubulosa מראה שניתן לקבץ את Cistanche deserticola לשתי קבוצות נפרדות לפי האוכלוסייה, בעוד שהפרטים השונים של Cistanche tubulosa לא יכולים להתקבץ לפי אוכלוסיה, מה שמצביע גם על ההתמיינות הגנטית בין Cistanche deserticola אוכלוסיות גבוהות יחסית. גדול, אבל הבידול הגנטי בין אוכלוסיות של Cistanche tubulosa קטן.
טבלה 4 זהות גנטית (משמאל למטה) ומרחק גנטי (מימין למעלה) שלcistanche tubulosa.
3. דיון
3.1 מגוון גנטי של Cistanche
הרמה שלמגוון גנטישל צמחים בלתי נפרד מהמאפיינים הביולוגיים שלהם, מבתי הגידול, המקור והאבולוציה שלהם. ביניהם יש את ההשפעה הגדולה ביותר למערכת הרבייה, טווח התפוצה, צורת החיים ושיטות פיזור האבקה והזרעים [6]. על פי התוצאות הסטטיסטיות של נתוני אלוזימים של 499 מיני צמחים ב-165 סוגים מאת Ge Song et al. [7], הפולימורפיזם של Cistanche ברמת המין צריך להיות בערך 50 אחוזים, והפולימורפיזם ברמת האוכלוסייה צריך להיות בערך 40 אחוז. בסביבות 0.17. רמות הפולימורפיזם שהתקבלו בניסוי זה כולן נמוכות מהערכים הממוצעים הללו. יחד עם זאת, בהשוואה לרמות הלוקוסים הפולימורפיים המתקבלים בשיטות RAPD עבור מספר צמחים נפוצים בסכנת הכחדה, כגון 32 אחוזים מהמין בסכנת הכחדה סילבר אשוח[18], 22.5 אחוז מהאדמונית הננסית ו-27.6 אחוז מהאדמונית הסגולה. [9] ] ניתן לראות כי המגוון הגנטי שלCistanche deserticola הוא מעט נמוך מהרמה הממוצעת, בעוד שהמגוון הגנטי של Cistanche tubulosa כבר נמוך ביותר.
3.2 סיבות למגוון גנטי נמוך של Cistanche
Cistanche הוא צמח טפילי ספציפי, המופץ באזורים מדבריים צרים בו-זמנית. לכן, אורח החיים הייחודי ואזור המגורים הצר יחסית עשויים להיות הסיבה הטבועה לכךמגוון גנטישל Cistanche הוא בדרך כלל נמוך מזה של צמחים רגילים.
ההבדל במגוון גנטיבין Cistanche deserticola ל-Cistanche tubulosa עשוי להיות קשור להבדל בטווח התפוצה של השניים והאם הם מסונכרנים עם התפלגות המארח. אזור התפוצה של Cistanche tubulosa קטן משמעותית מזה של Cistanche deserticola, והתפוצה שלו מאוד לא מסונכרנת עם הצמח המארח. מחקרים הראו כי קיים שפע של מגוון בין מיני תמריקס. לדוגמה, Zhang Juan et al. דיווח כי המגוון הגנטי של Tamarix sibiricus היה גבוה עד 98.7 אחוזים [10], בעוד שהמגוון הגנטי של Cistanche הוא דל ביותר, מה שמעיד על האבולוציה ארוכת הטווח. Cistanche tubulosa אולי חוו צווארי בקבוק רציניים בהיסטוריה, וכתוצאה מכך אובדן של כמות גדולה שלמגוון גנטי.
יחד עם זאת, על פי חקירות, נמצא כי אף אחת מהןCistanche deserticolaבטווח של 20 ק"מ מהיישובים האנושיים ניתן לחשוף ולפרוח כרגיל. הבורות הגדולים והקטנים של הסיסטאנצ'ה נחפרו, במיוחד באזורי הייצור העיקריים של פרח צינור הסיסטאנצ'ה. לכן, הוא נגרם על ידי כמות גדולה של חפירה. היעדר מוצא והרס של בית גידול עשויים להיות הסיבות העיקריות מעשה ידי אדם לנמוךמגוון גנטישל Cistanche.
3.3 בידול גנטי של Cistanche
בשל המרחק הגיאוגרפי בין שינג'יאנג למונגוליה הפנימית, הבידוד הגיאוגרפי גרם להבדל ולבידוד ביןCistanche deserticolaאוכלוסיות, ושתי האוכלוסיות יצרו סוגים אקוטיים שונים גנטית בשל הסתגלותן לתנאי בית הגידול המקומיים. בגלל טווח התפוצה הצר שלו וחילופי גנים תכופים בין אוכלוסיות, ההתמיינות הגנטית בין אוכלוסיות קטנה מזו של Cistanche deserticola.
3.4 המלצות להגנה על Cistanche
מגוון גנטיהוא תנאי מוקדם להישרדותם ארוכת הטווח של מינים כדי למנוע הכחדה. ההפחתה שלמגוון גנטייקטין את יכולתן של אוכלוסיות להסתגל לשינויים סביבתיים הן בטווח הקצר והן בטווח הארוך [11]. לכן, הגנה על המגוון הגנטי של Cistanche חשובה מאוד להגנה על רפואה סינית נדירה ויקרה זו. היות ו-Cistanche הוא מין בעל סוג אקולוגי מיוחד, יש להגן עליו בעיקר באתרו, ולהקים את בסיס ההגנה הטבעי של Cistanche בהתאם למגוון הגנטי שלו. למשל, עבורCistanche tubulosa, מכיוון שהמגוון הגנטי מגיע בעיקר מתוך האוכלוסייה, אוכלוסיות בעלות מגוון גנטי גדול יהיו אובייקטי ההגנה העדיפים [12], כגון Angier של Minfeng ו-Daheyan של Yutian. זה רשום כבסיס הגנה טבעי עבור Cistanche. בנוגע לCistanche deserticola, האוכלוסיות של מונגוליה הפנימית ושינג'יאנג עברו שינויים משמעותיים, ולכן יש לחזק עוד יותר את המחקר הניסיוני כדי לקבוע את האוכלוסיות המועדפות להגנה. במקביל, בצעו מחקר בסיסי על ביולוגיית הרבייה ואקולוגיה ההאבקה של Cistanche כדי לספק מידע להגנה נוספת עליה.
הפניות
[1] He Yanping, Yin Zhezhu, Tu Pengfei, et al. זיהוי שלCistancheוחקירה של חומרים רפואיים מסחריים. חומרים לרפואה סינית, 1997, 20(3):117.
[2] ליו מינגטינג. מחקר מקיף ויישום כללי של צמחי תמריקס. Lanzhou: Lanzhou University Press, 1995.
[3] פו גוולי. הספר האדום של צמחים סיניים. Beijing: Science Press, 1992.
[4] משרד הניהול של היבוא והיצוא של מינים בסכנת הכחדה של הרפובליקה העממית של סין, הוועדה המדעית של מינים בסכנת הכחדה של הרפובליקה העממית של סין. אמנה בדבר סחר בינלאומי במינים בסכנת הכחדה של חיות בר וצמחים (CITES), נספח II. 2003.41.
[5] Zou Yuping, Wang Xiaoquan, Lei Yiding, et al. מיצוי וזיהוי של DNA הכולל של מספר צמחים בסכנת הכחדה וקרוביהם. Acta Botany, 1994, 36:528.
[6] וואנג הונגשין, הו ג'יאנג. מערכת גידול צמחים, מבנה גנטי והגנה עלמגוון גנטי. המגוון הביולוגי, 1996, 4(2): 92.
[7] צ'ן ג'יאקואן, יאנג ג'י. ביולוגיה אבולוציונית של צמחים. ווהאן: הוצאת אוניברסיטת ווהאן, 1994.
[8] Wang Xiaoquan, Zou Yuping, Zhang Daming, et al. ניתוח RAPD של המגוון הגנטי של אשוח כסף. סינית מדע (C), 1997, 40(2): 145.
[9] Pei Yanlong, Zou Yuping, Yin Zhen, et al. דוח ראשוני על ניתוח RAPD של אדמונית ננסית ואדמונית סגולה. Journal Chinese Journal of Plant Taxonomy, 1995, 33(4): 350.
[10] ג'אנג חואן, ין לינקה, ג'אנג דאויואן. מחקר ראשוני עלמגוון גנטישל אוכלוסיות טבעיות של תמריקס אזמל. Yunnan Botanical Research, 2003, 25(5):557.
[11] Ellstrand NC, Elam D R. השפעות גנטיקה של אוכלוסיה של גודל אוכלוסיה קטן: השלכות על שימור צמחים. סקירה שנתית אקולוגיה וסיסטמטיקה, 1993, 34:217.
[12] ליו ז'נלין, ג'או גויפאנג. עקרון גנטיקה של אוכלוסיות ויישומו בהגנה על צמחים נדירים ובסכנת הכחדה. המגוון הביולוגי, 1999, ז(4): 340.
מתוך: China Journal of Chinese Materia Medica; כרך א. 29, גיליון 8 באוגוסט 2004
