מצומד חומצה כרומון-ליפואית: חומר מגן עצבי בעל עיכוב מקובל של בוטירילכולין אסטראז, נוגדי חמצון ופעילות קלציית נחושת

למידע נוסף:ali.ma@wecistanche.com

תַקצִיר

מַטָרָהמחלת אלצהיימר(AD) היא מחלה נוירודגנרטיבית רב-גונית. לכוון בו-זמנית למספר תהליכים פתולוגיים המעורבים במחלת אלצהיימר,תרכובות ממקור טבעי בעלות מאפיינים ייחודיים הן פיגומים מבטיחים לפתח תרכובות מרובות מטרות חדשות בטיפול במחלות ניווניות שונות, במיוחדמחלת אלצהיימר. במחקר זה, הוכנו כלאיים חדשים של חומצה כרומון-ליפואית כדי למצוא מבנה עופרת רב-תכליתי חדש לטיפול ב-AD. שיטות היברידיות של חומצה כרומון-ליפואית הוכנו באמצעות תגובת קליק ופעילותם של הגנה עצבית ואנטיכולינאסטראז הוערכה במלואה. הפעילות האנטי-עמילואידית, נוגדי החמצון והקלציה של מתכות של התרכובת הטובה ביותר נחקרה גם היא בשיטות סטנדרטיות כדי למצוא סוכן רב תפקודי חדש נגד AD. תוצאות ההקרנה הביולוגית העיקרית הראתה שלכל התרכובות הייתה פעילות הגנה עצבית משמעותית נגד נזק לתאים המושרה על ידי H2O2- בתאי PC12. תרכובת 19 כמעכבת הבוטירילכולינאסטראז (BuChE) החזק ביותר (IC50=7.55 מיקרומטר) בעלת פעילות הגנה עצבית משמעותית ברמה של תרופת ייחוס נבחרה להערכות ביולוגיות נוספות. מחקרים עגינה וקינטיים חשפו עיכוב לא-תחרותי מסוג מעורב של BuChE על ידי תרכובת 19. זה יכול להפחית באופן משמעותי את היווצרות מיני החמצן התגובתי התוך-תאי (ROS) והראה כוח הפחתה מצוין (85.57 mM Fe פלוס 2), בהשוואה לקוורצטין ו- חומצה ליפואית. זה יכול גם לעכב באופן מתון את צבירת A ולעשות chelate סלקטיבית עם יוני נחושת ביחס של 2:1 M.

מסקנה ניתן להתייחס לתרכובת 19 כגורם רב-תכליתי מלא תקווה לקידום התפתחות נוסף של AD, בשל הפעילות הנוירו-פרוקטיבית ואנטי-BuChE המקובלת, פעילות אנטי-A אגרגציה מתונה, פעילות נוגדת חמצון יוצאת מן הכלל ויכולת קלציית נחושת סלקטיבית.

Leili Jalili-Baleh1 & Hamid Nadri2 & Hamid Forootanfar3 & Tuba Tüylü Küçükkılınç4 & Beyza Ayazgök4 & Mohammad Sharifzadeh5 & Mahban Rahimifard6 & Maryam Baeeri6 & Mohammad Abdollahi6 & Alireza Foroumadi Khoobi

קבוצת ביו-חומרים, מרכז מחקר פרמצבטי, המכון למדעי התרופות (TIPS), אוניברסיטת טהראן למדעי הרפואה, טהראן 1417614411, איראן 2 הפקולטה לרוקחות ומרכז מחקר מדעי הפרמצבטיקה, אוניברסיטת שאהיד סדוגי למדעי הרפואה, יזד, איראן 3 המחלקה לתרופות ביוטכנולוגיה, הפקולטה לרוקחות, אוניברסיטת קרמן למדעי הרפואה, קרמן, איראן 4 הפקולטה לרוקחות, המחלקה לביוכימיה, אוניברסיטת Hacettepe, אנקרה, טורקיה 5 המחלקה לפרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה, הפקולטה לרוקחות, טוקסיקולוגיה ומרכז מחקר הרעלות, אוניברסיטת טהראן של מדעי הרפואה, טהראן, איראן 6 קבוצת טוקסיקולוגיה ומחלות, מרכז המחקר למדעי התרופות (PSRC), המכון למדעי התרופות (TIPS), אוניברסיטת טהראן למדעי הרפואה (TUMS), טהראן, איראן

מבוא

מחלת אלצהיימר(AD), מחלה נוירודגנרטיבית רב-גונית ובלתי הפיכה, היא הגורם העיקרי לדמנציה, ואחד האתגרים הגדולים ביותר של מחקר התרופות הנוכחי [1]. במהלך העשורים האחרונים, למרות מאמצים משמעותיים לגלות את המנגנונים הפתוגניים שלמחלת אלצהיימר, האטיולוגיה המדויקת של מחלה זו עדיין מורכבת. הגורמים הפתולוגיים הממלאים תפקיד יוצא דופן בהתפתחות AD הם מחסור ברמת נוירוטרנסמיטורים כולינרגיים במוח, הצטברות של רובדים סניליים במיוחד כמשקעי עמילואיד (A) חוץ-תאיים, הצטברות τ-חלבון היפר-פוספוריל [2], דיסהומאוסטזיס של ביו-מתכות, עקה חמצונית, ודלקת עצבית [3]. למרות כל הניסיונות שבוצעו למצוא פתרונות חדשניים לשלוט בסימני ההיכר של המחלה כמו טיפול גנטי ותאי גזע, טיפול מסוג זה הוא עדיין שיטה פרוספקטיבית לטיפול ב-AD, ועדיין ישנן בעיות רבות שלא נפתרו לפני שניתן יהיה להשתמש בהן ביישומים קליניים [ 4, 5]. השיטה הטיפולית הזמינה כיום מבוססת ברובה על ההולכה העצבית הכולינרגית הגוברת, באמצעות מעכבי אצטילכולין אסטראז (AChEI). כמו AChE, butyrylcholinesterase (BuChE) כמווסת משנה של פירוק ACh, הוא אנזים חשוב המעורב בהולכה עצבית [6]. תפקידו של BuChE בפתולוגיה של AD אינו ידוע, אך מחקרים in vivo גילו של-BuChE הקשור לפלאקים A יש תפקיד מפתח בהבשלת רובד AD [7, 8]. כדי להשלים את הגישות הסימפטומטיות, יש צורך למקד בו-זמנית למספר תהליכים פתולוגיים המעורבים ב-AD [9, 10].

לחץ ל- Cistanche DHT למחלת אלצהיימר

נכון לעכשיו, אסטרטגיית הליגנד הרב-מטרה המכוון (MTDL) התקבלה לחלוטין כאסטרטגיה העיקרית לתכנון וגילוי התרופות ב-AD, המבוססת על שילוב של קבוצות פרמקפוריות מתאימות במולקולה אחת המספקת תגובות פרמקולוגיות יעילות לקולטנים פוטנציאליים שונים. או מטרות אנזימטיות [11]. בשנים האחרונות, סוכנים רב-תכליתיים פוטנציאליים רבים תוכננו בהתבסס על אסטרטגיית MTDL נגד AD [12-16]. יתר על כן, כמות לא קטנה של מוצרים ממקור טבעי משמשת כתרופות משווקות או כמקטעים מולקולריים ביו-אקטיביים בפיתוח תרופות היברידיות כדי להילחם בגורמי הסיכון העיקריים שצוינו לעיל המעורבים בפתוגנזה של AD [17]. כרומונים נמצאים בכל מקום בצמחים וידועים כפיטוכימיקלים בעלי מבנה בנזו- -פירון, בעל מגוון טווחים של השפעות פרמקולוגיות [18]. מחקרים אחרונים גילו כי תרכובות מבוססות כרומון היו יעילות נגד דמנציה באמצעות ניקוי רדיקלים חופשיים וקולציה של יוני מתכת [19-22]. כרומונים הראו גם אנטיכולינאסטראז [23, 24], תכונות נוירו-הגנה [25, 26], אנטי דלקתיות [27], ויכולים לשבש ביעילות את הצטברות העמילואיד [28, 29]. פרננדז-באצ'ילר ועמיתיו הציגו היברידיות כרומון טקרין בעלות שיפור מעכבי ChE, כמו גם אי-אקטיבציה נוגדת חמצון בהשוואה לטקרין [30]. חומצה ליפואית (LA), כנוגד חמצון המופיע באופן טבעי בבעלי חיים, בני אדם וצמחים פועלת כקו-פקטור חיוני במסלולים ביוכימיים רבים [31]. מגוון רחב של תכונות פרמקולוגיות דווח על אורגנוגופרית זה. זה יכול לשלוט בפתוגנזה או בהתקדמות של AD על ידי הגדלת רמת האצטילכולין וכן הפחתת מתח חמצוני, דלקת ויצירת פלאק A [32-34]. Apocrine הוא הכלאה של LA ו-tacrine שהוצג על ידי Rosini כמועמד לתרופה יעילה נגד AD בשל תכונותיו הביולוגיות המרובות, כגון פעילות עיכוב AChE ו-BChE, עיכוב של AChE-A aggregation-induced והגנה על תאים מפני ROS [35].

ג' נסי ואח'. בשילוב rivastigmine עם LA וכרומון. הם מצאו שהשילוב הוביל להוספת נוגדי חמצון ותכונות צבירת אנטי-עמילואיד של LA ופיגומי כרומון לפעילות האנטיכולינאסטראז של rivastigmine כתרופות בשימוש כיום, והביא להיווצרות התרכובת הרב-תכליתית לטיפול ב-AD [28] ]. בהתבסס על הממצאים לעיל, פיגום כרומון הוא פרמקפורה חשובה שיש לו תפקיד גדול בעיכוב ChEs עם פעילויות נוגדות חמצון וקלציה של מתכות. LA הוא גם מבנה העופרת המבטיח המשפר את פעילות עיכוב BuChE, עוצמת הגנה עצבית, צבירה אנטי-עמילואיד, נוגדי חמצון ופעילויות קלציית מתכות (איור 1). מאפיינים ייחודיים אלה של כרומון ו-LA הפכו אותם לפיגומים מבטיחים לפתח תרכובות מרובות מטרות חדשות בעלות יעילות טיפולית משופרת בטיפול בהפרעות ניווניות שונות, במיוחד AD [36-42]. בהתחשב בהשפעות הביולוגיות המועילות של פיגומי כרומון ו-LA והיעילות של גרעין הטריאזול כפרמקפור אטרקטיבי לחיבור חומרים פעילים טיפולית שונים [43-45], בעבודה זו, עודדנו להצמיד פרמקפורים יקרי ערך אלה זה לזה ולהעריך את יעילותם מול מטרות שונות. שתי סדרות של נגזרות כרומון מצומדות עם LA סונתזו באמצעות תגובת קליק (איור 1, תרכובות 9-17 ו-18-20) והפעילות הנוירו-פרוטקטיבית ופעילות עיכוב ChEs של כל התרכובות הוערכו. כמו כן, הוערכו נוגדי החמצון, קלציית מתכות ואנטי עמילואיד של התרכובת שנבחרה. למיטב ידיעתנו, זוהי העבודה הראשונה המדווחת על סינתזה של היברידי כרומון-LA ופעילותם הביולוגית נגד AD.

תוצאות ודיון

כימיה כפי שהודגם בסכימה 1, תרכובת 3 הופנתה בתחילה באמצעות תגובה של אצטופנון 2'-הידרוקסי מוחלף עם 4-מתוקסי בנזלדהיד באמצעות תגובת חמצון דומינו אלדול-מייקל המזוזת על ידי פירולידין ויוד בדימטיל סולפוקסיד (DMSO). תרכובת 3 הומרה ל-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-chrome-4-נגזרות המקבילות (4a-d) על ידי BBr3 בדיכורומתאן. תרכובת 5 הוכנה גם בשלב אחד מהתגובה של 2,4- dihydroxyacetophenone וטריאתיל אורתופורמט בנוכחות 70 אחוז חומצה פרכלורית שהובילה ליצירת מלח פרכלוראט אשר לאחר מכן עבר הידרוליזה כדי להגיע לתרכובת היעד (5) . תוצרי הביניים 6a-i ו-8a-c הוכנו לאחר מכן באמצעות התגובה של 4a-d או 5 עם הכמות המתאימה של דיברומואלקנים בתמיסת אצטון של K2CO3 נטול מים בתנאי ריפלוקס למשך 4 שעות. תרכובת 7 סונתזה בנפרד באמצעות תגובת האמידציה בין LA ופרופרגילמין בנוכחות 4- דימתיל אמינופירידין (DMAP) ו-N, N ′ - דיציקלוהקסילקרבודימיד (EDCI).

תרכובות המטרה 9-20 הוכנו לבסוף באמצעות תגובה תלת-רכיבית בסיר אחד בין תרכובות 6a-i או 8a-c, נתרן אזיד ותרכובת 7 המזוזת על ידי נחושת (II). בדיקה ביולוגית בעיקר, פעילויות הגנה עצבית ומעכבות כולין אסטראז של כל תרכובות המטרה 9-20 הוערכו כדי למצוא את התרכובת החזקה הטובה ביותר למחקרים נוספים. עוצמת ההגנה העצבית מפני נזק לתאי PC12 המושרה על ידי נזק חמצוני ונוירוטוקסיות שנוצרה על ידי H2O2 נחשבת לגורם החשוב ביותר השולט על התקדמות הפרעה נוירודגנרטיבית [60]. לכן, פעילות הגנה עצבית של מצומדי כרומון-LA המוכנים 9-20 נבדקה בריכוזים שונים של 1, 5, 10, 20 ו-50 מיקרומטר באמצעות מבחן MTT. כל התרכובות, בכל הריכוזים, יכולות להגביר באופן משמעותי את כדאיות התא של תאי PC12 בהתאם למינון, אפילו בריכוז נמוך של 1 מיקרומטר (טבלה 1, p <>

מעניין לציין שתרכובות 15, 16 ו-17 בעלות אורכי שרשרת של חמישה פחמנים (n=5) הפגינו פעילות נוירו-פרוקטיבית גבוהה יותר מזו של קוורצטין כתרופה התייחסות בכל הריכוזים. בהשוואה בין תרכובות 9, 11 ו-15 הנושאות 2-פניל-4H-כרומן-4-פשוט אחד ואורך שרשרת פחמן שונה (n=3, 4 ו-5 עבור תרכובות 9, 11 ו- 15, בהתאמה), ניתן לרמוז שהגדלת גודלו של המקשר יכול להגביר את פעילות ההגנה העצבית של תרכובות המטרה (טבלה 1). אותה התנהגות נראתה גם עבור תרכובות 18-20 כמו 4H-chromene-4-1 נגזרת שהוחלפה ב-7 עמדות. יש לציין כי לנגזרות הכרום הבלתי-מוחלפות הייתה פחות פעילות נוירו-פרוקטיבית על מוות תאים המושרה ב-H2O2- מאשר אנלוגים מוחלפים בהילה (השווה את תרכובת 9 עם תרכובת 10, תרכובת 11 עם תרכובות 12-14, ותרכובת 15 עם תרכובות 16 ואפילו 17 בריכוזים גבוהים במיוחד). פעילות מעכבת כולינסטראז נחקרה פעילות מעכבת AChE ו-BuChE של כל מצומדי כרומון-LA 9-20. טבלה 2 מציגה את ערכי ה-IC50 של התרכובות בהשוואה לתרופה הסטנדרטית דונפזיל. לא נצפתה השפעה משמעותית נגד AChE ב-100 מיקרומטר עבור רוב התרכובות, למעט 7-נגזרות פלואורו (13) עם פעילות מתונה (IC50=56.50 מיקרומטר). התוצאות גילו כי הפעילות של הנגזרות המוחלפות בעמדה 7- (18–20) מול BuChE הייתה טובה יותר מהנגזרים המוחלפים במיקום 2- (9–17).

בין 7-הנגזרים המוחלפים, רק תרכובות 18 ו-19 עם 3 או 4 אורכי שרשרת אטומים הראו פעילות אנטי-BuChE מתאימה (IC50=15.32 ו-7.55 מיקרומטר, בהתאמה). תרכובת 20 עם 5 פחמן מרווח (n=5) לא גילתה שום פעילות נגד BuChE המאשרת את ההשפעה הגדולה של המקשר והגודל של המולקולה לכבוש את האתר הפעיל של האנזים. לכן, להארכת המקשר אין השפעה חיובית על העוצמה המעכבת BuChE. כאשר תחליף הלוגן נושא טקרין היה מצומד ל-LA על ידי 3 spacer פחמן, פעילויות עיכוב AChE ו-BuChE, במיוחד פעילות AChEI, השתפרו בהשוואה לטקרין [35]. המחקר אישר את התפקיד החשוב של אורך ה-crosslinker על פעילות עיכוב ChEs של תרכובות המטרה. מחקר קודם גילה גם שהכלאה של טקרין עם פיגום כרומון משפרת את פעילות עיכוב BuChE יותר מזו של AChEI, מה שעולה בקנה אחד עם השגת התוצאות שלנו [30]. אותה תוצאה נצפתה גם כאשר שולבו פרמקפורים ידועים אחרים. התקשרות של LA ו/או כרומון ל-rivastigmine הביאה לפעילות עיכוב BuChE גבוהה יותר מאשר עיכוב AChE [28]. נראה כי LA יכול לשפר את פעילות עיכוב BuChE של פיגום האם יותר מאשר פעילות עיכוב AChE. בהתבסס על התוצאות, נראה שקבוצות תורמות אלקטרונים על פיגום כרומון וגם שימוש במרווח מתאים למניעת קיפול מולקולרי עשויות להקל על אינטראקציות נאותות עם האנזים ההופך את תרכובות המטרה למעכבים חזקים יותר.