פרק 2: פרוקסיזומים צינוריים כלייתיים ניתנים לחלוקה לתפקוד כליות תקין

לקבלת מידע נוסף. איש קשרtina.xiang@wecistanche.com

דיון

שפע גבוה של פרוקסיזומים בצינורית הפרוקסימלית יחד עם נוכחות של הפרעות כלייתיות בחולים עם ZSD הציעו מאוד תפקיד חשוב של פרוקסיזומים בכליה. יתר על כן, ביטוי ספציפי לכליות של מספר אנזימים פרוקסיסומליים תמך ברעיון שלפרוקסיזומים כלייתיים עשויים להיות תפקודים ביולוגיים הנבדלים באופן חלקי מאלו שברקמות אחרות(15). כדי לבחון את ההשערות הללו, בחנופונקציה כלייתיתבעכברים נטולי פרוקסיזומים במיוחד בצינורית הכליה. מבין מודלים שונים של עכברים המשמשים לחקר תפקידם של פרוקסיזומים, בחרנו בעכברים המאפשרים השבתה גנטית מותנית של פקטור הביוגנזה Pex5 המקודד פרוקסיזום PEX5 החיוני להיווצרות פרוקסיזומים. מודל זה נבחר מכיוון ש-(i)Pex5-null עכברים מפגינים הפרעות ביוכימיות ותפקודיות מרובות המזכירות את אלה שנצפו בחולים עם ZSD(11) ו-(i) נותחו ספקטרום גדול של מודלים של עכברים עם אבלציה ספציפית לרקמות של Pex5(16), ובכך מאפשרים לנו להשוות את ההשלכות התפקודיות של מחסור פרוקסיסומלי בצינורית הכליות עם אלה שנצפו ברקמות אחרות. כפי שהודגם על ידי Baes et al., עכברי Pex5-null הפגינו פיגור גדילה תוך רחמי, מום במוח והיפוטוניה חמורה ומתו במהלך 72 השעות הראשונות לחייהם (11). ניתוחים ביוכימיים חשפו מספר סימני היכר של ZSD, כולל דלדול של פלזמלוגנים בכבד ובמוח ועלייה חזקה ברמות הפלזמה של VLCFA. לא נמצאו ציסטות כליות בקליפת המוח בכליה של עכברי Pex5-null ב-P0.5, אך נצפה פיגור בהבשלה התוך רחמית של גלומרולי. נוכחותם של מרבצי סידן אוקסלט לא נחקרה.

לחצו כאן כדי להכיר את היתרונות של צמחי מרפא ציסטנצ'ה

בעכברי cKOm, אבלציה של ביוגנזה פרוקסיסומלית בצינורית הכליה לא גרמה לשום סוג פנו גדול, למעט ירידה ב-KW וב-BW בעכברי cKOm פעוטים וירידה ביחס KW/BW בעכברי cKOm בוגרים. בעכברי cKOf, כריתה לא מלאה של אלל Pex5 מטושטש יחד עם ההשפעה המתונה בהרבה של מחיקת Pex5 על תעתיק הכליות והמטבולום הציעו כי חלק מהפרוקסיזומים השיוריים עשויים להישאר בצינורית הכליה. עם זאת,מיןלא ניתן לשלול גם ספציפיות של תפקודים פרוקסיסומליים בכליה. לא מצאנו הבדל מורפולוגי משמעותי בכליות של עכברי cKOm שיכול להסביר את היחס הנמוך יותר של KW או KW/BW. עם זאת, הנטייה לירידה ברוחב התא הפרוקסימלי עשויה להיות סיבה אפשרית להבדל זה. חשוב לציין שהפונקציה ההומאוסטטית הכליתית נשמרה בעכברי cKOm למרות שינויים ניכרים ברמות הביטוי של תעתיקים המקודדים חלבונים המעורבים בהובלה טרנס-פיתליאלית של יונים, מים, חומצות אמינו, אניונים וקטיונים אורגניים, פוספט, אוראט, ובמסלול האנדוציטי הרב-שכבתי בתיווך מגלין. יש לציין כי רוב התעתיקים המקודדים כלפי מטה מקודדים טרנספורטרים המבוטאים בצינורית הפרוקסימלית, בעוד שרוב התעתיקים המווסתים למעלה מקודדים טרנספורטרים המבוטאים בחלקים דיסטליים יותר של הנפרון. לדוגמה, ביטוי מוגבר של תעתיקי Nkcc2, Clc-Kb, Ncc ו-βENaC הציע ויסות מפצה בספיגה מחדש של נתרן פוסט-פרוקסימלי. הניתוח המשולב של תעתיק הכליות והמטבולום חשף שינויים עמוקים במגוון מסלולים תאיים הקשורים לחילוף החומרים התאי, להרכב ממברנת השומנים ולהומאוסטזיס של חמצון-חיזור. בכליות של עכברי cKOm, כ-8% מהתעתיק וכ-24% מהמטבוליטים שזוהו הציגו רמות שונות בהשוואה לעכברי Ctrl. כצפוי, רבים מהתעתיקים והמטבוליטים הללו היו קשורים לתפקוד פרוקסיסומלי. ירידה דרמטית נצפתה בשפע של פלסמולוגנים פוספוליפידים של אתר המסונתזים בפרוקסיזומים (כ-67% בעכברי cKOm וכ-50% בעכברי cKOf, סכום לא משוקלל של כל מיני הפלזמלוגן שזוהו). פלזמלוגנים הם פוספוליפידים עיקריים של קרום התא עם מספר גדל והולך של תפקודים מיוחסים, כולל שלמות הממברנה, איתות תאי והגנה נוגדת חמצון. בכליות, פלסמולוגנס מייצגים כ-20% מכלל הפוספוליפידים(17), מה שמרמז על כך שלפחות 10% מהרכב הפוספוליפידים היה שונה בכליות של עכברי cKOm ו-cKOf מהבקרות המתאימות. הידלדלות הפלזמלוגנס פוצתה באופן פוטנציאלי על ידי שפע מוגבר של פוספטידילתנולאמינים דומים מבחינה מבנית (PEs) ועל ידי פוספטידילכולינים (PCs), שהפגינו העשרה משמעותית בכליות של עכברי cKOm ו-cKOf. יש לציין כי עלייה מפצה דומה של PEs ומחשבים אישיים נצפתה בכליות של חולים עם ZSD (17).

חילוף החומרים של הצינורית הפרוקסימלית מסתמך בעיקר על חמצון חומצות שומן, המאופיין בדור גבוה של ROS המיוצר הן במיטוכונדריה והן בפרוקסיזומים. בעכברי cKO, מסלולים הקשורים לפירוק/ביוסינתזה של חומצות שומן הוגדלו באופן משמעותי, מה שעשוי להצביע על שיפור מפצה של ייצור אנרגיה מיטוכונדריאלית ממצעים אלה. מאחר שאחד הפונקציות העיקריות של פרוקסיזומים הוא ניקוי רעלים של ROS, שיערנו שאבלציה של ביוגנזה פרוקסיזומית תגרום לביוגנזה של פרוקסיזומים תשרהעקה חמצוניתבכליות של עכברי cKO. עם זאת, ניתוחים מולקולריים לא חשפו שינויים ביכולת נוגדת החמצון ובסמנים הביולוגיים של עקה חמצונית. האתגר עם HFD לא גרם לשינויים בפנוטיפ התפקודי, למעט עלייה קלה בנפח השתן והפרשה בשתן של סידן ו urate בעכברי cKOm. ניתוח משולב של תעתיק ומטבולום אפשרו לזהות את מסלול הגלוטתיון כמנגנון מפצה אפשרי לשמירה על היכולת נוגדת החמצון הכוללת בתאי צינורית פרוקסימליים כלייתיים חסרי חמצן.

מחיקה מותנית של Pex5 בכבד העוברי(12), בתאי β בלבלב(18), ובסוגי תאים שונים של מערכת העצבים המרכזית (שנסקרה ב- ref.16) גורמת להידרדרות תפקודית משתנה אך בעיקר חמורה הספציפית לאיברים. זה לא היה המקרה בכליה. במחקר זה זיהינו מספר מנגנונים כלייתיים פנימיים שעשויים לאפשר התמודדות עם המחסור בפרוקסיזומים. מכיוון שהכליה היא האיבר המציג שיעור זילוף דם גבוה, אפשרות נוספת טמונה במקור החוץ-רנלי של לפחות חלק מהמטבוליטים שהכליה אינה מייצרת בהיעדר פרוקסיזומים אך נדרשים לתפקוד כלייתי תקין. באופן קולקטיבי, הנתונים שלנו מצביעים על כך שפרוקסיזומים צינוריים כלייתיים ניתנים לחלוקה לתפקוד כלייתי תקין וכי שינויים פתופיזיולוגיים בכליות של חולים עם ZSD הם ממקור חוץ-רנאלי.

שיטות

חיות. ההליכים ששימשו ליצירת עכברי Pex5a/la/Pax8-ntTA/LC-1 Cre תוארו קודם לכן (13). שלושת קווי העכברים ששימשו במחקר זה הם זנים גזעיים, שגודלו על הרקע הגנטי של עכבר C57BL/6J (מעבדת ג'קסון). לפני כל הניסויים, העכברים הותאמו למחזור חשוך של 12 שעות/12 שעות. כל הניסויים בוצעו בזמן הביולוגי ZT3 (ZT0 הוא הזמן שבו האור נדלק, ו-ZT12 הוא הזמן שבו האור כבוי).

Pex5bxlo/Pax8-rtTA/LC1 משולשים של עכברים זכרים או נקבות מהונדסים (המכונים cKOm ו-cKOf) ועכברים Pex5l/a (המכונים Ctrl או Ctrl) שימשו. רקומבינציה של Pex5 בתינוקות בוצעה על ידי תוספת של 0.2% DOX ו-2% סוכרוז במי השתייה של נקבות עכברים הרות במשך שבועיים, החל מיום ההיריון ה-14 שלהן. עבור רקומבינציה של Pex5 בעכברים בוגרים, DOX וסוכרוז נוספו למי השתייה של עכברים בני 8 שבועות. מבנה הכליות ותפקודו הוערכו 4 שבועות לאחר סיום הטיפול ב-DOX בעכברים פעוטים בני 4 שבועות או בעכברים בוגרים בני 14 שבועות. לאחר הגמילה שלהם בגיל 3 שבועות, העכברים הוזנו בדיאטת בקרה סטנדרטית המכילה 4.2% מהשומן (דיאטת בקרת שומן של Sniff) או כאשר הוזכרה, במשך 4 שבועות עם HFD תואם המכיל 20.7% מהשומן (בעיקר LCFAs).

כלובים מטבוליים וכימיה של דם ושתן. עכברים שוכנו בכלובים מטבוליים בודדים (Tecniplast). איסוף השתן בוצע לאחר תקופת הסתגלות של 3 ימים. כימיה של שתן ודם נותחו כפי שתואר קודם לכן (19). הרכב הפלזמה והשתן נמדד ב-Laboratoire Central de Chimie Clinique, בית החולים האוניברסיטאי האוניברסיטאי וודואז (לוזאן, שוויץ).

מיקרוסקופיית אלקטרונים. דגימות כליות נחתכו לחתיכות סביב 1 מ"מ³ וקובעו בתמיסת גלוטארלדהיד (EMS)2.5% במאגר פוספט (PB,0.1 M pH7.4)(MilliporeSigma) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT). לאחר מכן, הם נשטפו 3 פעמים, 5 דקות כל אחד, במאגר PB ולאחר מכן לאחר מכן הונחו על ידי תערובת טרייה של אוסמיום טטרוקסיד 1%(EMS) עם 1.5% של אשלגן פרוציאניד (MilliporeSigma) ב- PB במשך שעתיים ב- RT. לאחר מכן נשטפו הדגימות 3 פעמים במים מזוקקים והתייבשו בתמיסת אצטון (MilliporeSigma) בריכוזים מדורגים(30% 90 דקות;70%90 דקות;100%120 דקות;100%240 דקות). לאחר מכן חלו חדירה לשרף Epon (MilliporeSigma) בריכוזים מדורגים(Epon/acetone [1/3; v/v] 4 שעות; Epon/acetone [3/1;v/v] 4 שעות, Epon/acetone [1/1;v/v] 8 שעות; Epon/acetone [1/1; v/v] 24 שעות)ולבסוף פילמור למשך 48 שעות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס בתנור. מקטעים אולטרה-דקים של 50 ננומטר נחתכו על גבי חתך Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH) ונלקחו על רשת חריצי נחושת, 2×1 מ"מ (EMS), מצופה בסרט פוליסטירן (MilliporeSigma). הקטעים הוכתמו באורניל אצטט (MilliporeSigma)2% ב-H, O במשך 10 דקות, נשטפו מספר פעמים עם H, O ואחריו ריינולדס עופרת ציטראט במשך 10 דקות, ונשטפו מספר פעמים עם H, O.

סטריאולוגיה. לצורך ניתוח סטריאולוגיה נותחו 3 חתיכות קליפת הכליות לכל עכבר, 15 מיקרוגרפים לכל דגימה בגודל פיקסל של 4.08 ננומטר, באמצעות דגימה אקראית אחידה שיטתית עם מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (פיליפס CM100, Thermo Fisher Scientific) במתח האצה של 80 קילו-וולט עם מצלמה דיגיטלית TVIPS TemCam-F416 (TVIPS GmbH).

ניתוח תעתיק. כל נתוני הריצוף זמינים לציבור באמצעות NIH Gene Expression Omnibus (מספר גישה GSE179202). ספריות RNA-Seq הוכנו תוך שימוש ב-200 ננוגרם של סך כל הרנ"א של הכליות כפי שתואר ב-Nikolaeva et al. (19). Illumina TruSeq SR Cluster Kit v4 ריאגנטים שימשו. נתוני הריצוף עובדו באמצעות Mus musculus. GRCm38.86 ביאור גנים, ניתוח סטטיסטי בוצע ב- R (גרסה 3.4.0). תעתיקים עם ספירות נמוכות סוננו לפי הכלל של ספירה אחת למיליון (CPM) במדגם אחד לפחות. גודלי הספרייה הוגדלו באמצעות נורמליזציה של TMM והפכו את יומן הרישום ל-CPM באמצעות voom (20). ניתוח הרכיבים העיקריים הראה שונות קטנה בין דגימות משוכפלות. ביטוי דיפרנציאלי בין עכברי cKO ל-Ctrl חושב למבחן 1 F באמצעות ליימה (21). ערכי P הותאמו כמתואר (22) לערכי FDR שיש לקחת בחשבון עבור השוואות מרובות, תוך שימוש בתוצאות של כל התעתיקים אצל זכרים ונקבות או תוצאות של טרנספורטרים נבחרים או תעתיקים הקשורים לפרוקסיסומלים אצל זכרים בלבד. תמלילים עם FDR<5% were="" considered="" significant.="" comparisons="" of="" expression="" levels="" were="" done="" using="" the="" mean="" fc="" of="" cpm="" in="" cko="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" individual="" values="" were="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" a="" weighted="" gsea="" was="" performed="" using="" the="" unfiltered="" transcript="" list="" ranked="" by="" signed="" p-value="" (product="" of="" p-value="" and="" sign="" of="" the="" fc).="" the="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" gsekegg="" function="" from="" the="" r="" package="" cluster="" profile(version="" 3.16.1)(23).="" kegg="" pathway="" collections="" were="" restricted="" to="" gene="" sets="" with="" minimum="" and="" maximum="" sizes="" of="" 10="" and="" 500,="" respectively.="" the="" enrichment="" scores="" were="" normalized="" by="" gene="" set="" size,="" and="" their="" statistical="" significance="" was="" assessed="" by="" permutation="" tests="" (n="">

אנליזה מטבולית. מטבוליטים מדגימות כליות קפואות זוהו על ידי ספקטרוסקופיית מסות כרומטוגרפיה-טנדם בעלת ביצועים גבוהים במיוחד וכומתו באמצעות AUC (Metabolon Inc). ערכים גולמיים הומרו ביומן ונורמלו במונחים של ספירת שטחים גולמיים. בדיקות הניגוד הדו-כיווניות של ANOVA שימשו לזיהוי ביוכימיקלים שהיו שונים באופן משמעותי בין עכברי cKO ו-Ctrl משני המינים. ערכי P הותאמו כמתואר (22) לערכי FDR שיש לקחת בחשבון עבור השוואות מרובות, ומטבוליטים עם FDR<5% were="" considered="" significantly="" modulated.="" for="" log2fc="" calculation,="" missing="" values,="" if="" any,="" were="" replaced="" with="" the="" minimum="" observed="" value="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="" compound.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" normalized="" values="" were="" divided="" by="" the="" median="" value="" obtained="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="">

ניתוח תעתיק-מטבוליזם משותף. ניתוח מסלולים מטבוליים משולב המשלב תוצאות שהתקבלו ממחקרי ביטוי גנים ומטבולומיקה נערך באמצעות מודול ניתוח מסלולים משותפים באתר MetaboAnalyst 5.0(24). שם מורכב של מטבוליטים וסמל גן רשמי של תעתיקים נפוצים יותר או פחות באופן משמעותי (FDR<0.05), along="" with="" their="" respective="" fcs="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice,="" were="" inputs.="" the="" integration="" was="" performed="" using="" kegg="" metabolic="" pathways="" with="" default="" settings(hypergeometric="" test="" for="" overrepresentation="" analysis,="" degree="" centrality="" for="" pathway="" topology="" analysis,="" and="" tight="" integration="" by="" combining="" queries).="" pathways="" with=""><0.1 were="" considered="" significantly="" affected="" in="" ckom="">

כתמים. כתמים של מבנה הכליות העולמי, משקעי סידן אוקסלט או תצהיר שומנים ניטרליים בוצעו על פרוסות כליות רוחביות בעובי של 5 מיקרומטר. למעט צביעת שומנים ניטרליים, עכברים היו מורדמים, והכליה השמאלית שלהם הוחדרה דרך אבי העורקים הבטני עם תמיסת פרפורמלדהיד של 4% לפני קצירת הרקמות. לצורך ניתוח מבנה הכליות העולמי, פרוסות הכליה המשובצות בפרפין עברו דפאראפין, התייבשו מחדש, הוכתמו ב-H&E, התייבשו והורכבו ב-ROTI Histokitt (Carl Roth GmbH). שומנים ניטרליים הוכתמו בפרוסות כליות שהוטבעו בתרכובת OCT (Tissue-Tek) באמצעות תמיסת שמן אדום O. מרבצי סידן אוקסלט הוכתמו על פי השיטה שתוארה על ידי Pizzolato (25). בקצרה, פרוסות כליות שהוטבעו בפרפין הוטבעו והתייבשו מחדש, ואז הוטבעו בתמיסה של 1:1 של כסף חנקתי 5% w/v ומי חמצן 30% והונחו מתחת לנורת 60 W במשך 30 דקות. המגלשות נשטפו ביסודיות במים מזוקקים והודבקו באדום גרעיני מהיר (MilliporeSigma), ואז התייבשו לפני שהרכיבו פנימהROTI Histokitt. פרוסות כליה אורכיות מעכבר שטופל בדיאטה הנגרמת על ידי סידן אוקסלט נפרופתיה (1.5% סידן+1.5% הידרוקסיפרולין מעורבב בצ'או רגיל במשך 3 שבועות) שימשו כבקרה חיובית על משקעי הכליות של סידן אוקסלט. התוצאות נותחו באמצעות סורק שקופיות Zeiss AxioScan.Z1 בהגדלה מקורית של 100× או 200×.

ELISA ו-Trolox assay.4-HNE נמדדו באמצעות ערכת בדיקה של ליפידים(4-HNE) מבית Abcam (ab238538). היכולות הכוללות והלא-ניוזימטיות של נוגדי החמצון הוערכו על ידי ערכת בדיקה של Trolox מבית Abcam (ab65329).

סטטיסטיקה. כל הנתונים מבוטאים כממוצע ± SEM. מבחנים סטטיסטיים וסף למובהקות מתוארים במקרי איורים או בסעיפי שיטות מתאימים. הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות חבילות R או תוכנת GraphPad Prism גרסה 8.2.1. כל בדיקות ה- t היו 2 זנב.

אישור המחקר. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו על ידי ההנחיות השווייצריות לטיפול בבעלי חיים, התואמות את ההנחיות של המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול בבעלי חיים, ואושרו על ידי הקנטונל השוויצרי (קנטון דה ווד) והרשויות הווטרינריות הפדרליות (אישור 31827 ל- DF)(Direction genérale de P'agriculture, de la viticulture et des affairs vetérinaires, Epalinges, שוויץ).

פרסום מוקדם: חלק מעבודה זו הוגש כתקציר למפגש השנתי 2021 של האגודה האמריקאית לנפרולוגיה (4 בנובמבר 2021.https://www.asn-online.org/education/kidney-week/2021/program-abstract.aspx?controlId=3605774).