פרק 5 שינויים בפעילות האנזים במהלך תסיסת האנזים

פרק 5 שינויים בפעילות האנזים במהלך תסיסת האנזים

 

פרוטאז, ליפאז וDistutase Superoxide (SOD)הם האנזימים התפקודיים העיקריים שלמזון בריאות אנזים מיקרוביאליו ביניהם,פרוטאזממלא תפקיד בקידום ההידרוליזה של חלבון במזוןבגוף האדם. בנוסף, זה יכול גם לפרק כמה תאים גוססים, להסיר לכלוך על פני העור ובנקבוביות, ולמלא תפקיד בפילינג, ולכן הוא נמצא בשימוש נרחב במוצרי אמבטיה. ליפאז פועל על קשר האסטר בין חומצות שומן לגליצרול, ומצע ההידרוליזה הוא בדרך כלל שמנים טבעיים. לכן זה נראה במזונות רבים ומוצרי בריאות לירידה במשקל. נשים רבות מודאגות מאוד מהנושא של ירידה במשקל, וזו הסיבה שאנזימים הפכו במהרה לפופולריים בכל העולם.אנזימים עשירים בליפאז, מה שאומר שיש להם ערך מחקר גבוה ופוטנציאלי יישום.טִפֵּשׁהוא אנזים מתכת מיוחד המזרז את תגובת הפירוק שלרדיקלי אניון סופרוקסידובכךהסרת רדיקלי אניון סופרוקסידבגוף. זהו מחסום מגן לאורגניזמים, ולכן הוא נמצא בשימוש נרחב בתחום הרפואי.
פרק זה לוקח אנזים של אפל כדוגמה. החל מהשלב הראשוני של התסיסה,פעילויות של סופר -אוקסיד דיסמוטאז, עמילאז, ליפאז, פרוטאז ותאי בקבוצת הניסוי וקבוצת הביקורת נמדדו כל 15 יום כדי לשקף באופן מקיף ושיטתי את המגמה המשתנה של פעילות האנזים במהלך כל תהליך התסיסה.

Cistanche עשבי תיבול חדשים

לחץ כדי לקבל פרטים נוספים

 

שירות תומך של WeCistanche-היצואן הגדול ביותר של Cistanche בסין:
דוא"ל: wallence.suen@wecistanche.com
WhatsApp/Tel: +86 15292862950

 

 

 

 

 

 

5.1 חומרים ושיטות

5.1.1 חומרים

(1) חומרים ניסיוניים

שוטפים תפוחים טריים במים סטריליים בתנאים סטריליים, מייבשים אותם באופן טבעי על שולחן הפעלה סטרילי, קלף אותם ופורסים אותם לשימוש מאוחר יותר. הוסף סוכר לבן ותפוחים לצנצנת זכוכית מעוקרת ביחס המוני של 1: 1. הפעל את החיידקים הנדרשים לניסוי וחינה אותם לאנזים על פי התוכנית האופטימלית (שלב פעולה זה מושמט לקבוצת הביקורת), אטום אותו ומניח אותו במקום קריר ויבש. לאחר 3 חודשים של תסיסה בטמפרטורת החדר, קח דגימה כדי להשיג את נוזל האנזים כולו המכיל את העיסה ומסנן אותו. קח את הסופר -נפט כמדגם הניסוי. לאחר שהדגימה צנטריפוגת ב 10, 000 סל"ד למשך 15 דקות בצנטריפוגה במהירות גבוהה, היא משמשת למדידת נתונים רלוונטיים. ראוי לציין כי בתהליך יצירת אנזימים, על מנת להימנע מזיהום מיותר, כל הפעולות שלנו בוצעו בתנאים סטריליים.

(2) מכשירים עיקריים
המכשירים הנדרשים לניסוי זהים ל- 3.1.1 (2).

 

5.1.2 שיטות

(1) קביעת פעילות סופרוקסיד דיסמוטאז (SOD) [66]
תמיסת פירוגולול התחממה מראש באמבט מים בטמפרטורה קבועה של 25 מעלות למשך זמן. על פי טבלה 5.1, נוספו כמות מתאימה של חיץ, מים מזוקקים ואותו נפח של חומצה הידרוכלורית או תמיסת פירוגולול. אמבט המים בטמפרטורה קבועה נקבע ל 25 מעלות למשך 2 0 דקות. לאחר שהנוזל המעורב הוחזק במהירות, הוא הוזרק מייד לקובט. ערך הספיגה A0 של הדגימה נמדד כל 30 שניות באורך גל של 325 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.

Tab.5.1 הוסף את כמות המגיב הסמוך לבנזן שלוש פנול לקביעת שיעור האוטוקסידציה

 

השיטה לקביעת פעילות SOD זהה למעשה לפעולה שלעיל. ההבדל היחיד הוא שלפני הוספת pyrogallol, {{0}}. 5 מ"ל של פתרון מדגם אנזים של ריכוזים שונים צריך להוסיף תחילה. במקביל, מתווסף אותו נפח של מים מזוקקים. הספיגה הנמדדת היא ASOD. שיעור העיכוב ופעילות האנזים SOD מחושבים על פי הנוסחה 5.1 ונוסחה 5.2: שיעור עכבה (%)=(△ A 0- △ ASOD)/△ A 0 × 100 (5.1) פעילות אנזים (u/ml) {}}}}} utiution ×} ×} × utiution ×} × ducition × utiution × ud utipuit (5.2) איפה: V1 הוא הנפח הכולל של הפתרון, מ"ל; V2 הוא נפח תמיסת הדגימה לאנזים, ML; △ A0 הוא קצב החמצון האוטומטי של פירוגולול; △ ASOD הוא קצב השינוי של ערך ספיגת הדגימה; N הוא הקביעה של דילול (2) קביעת פעילות עמילאז מחקר זה השתמש בשיטה הקולורימטרית של היוד-קארם כדי לקבוע את פעילות העמילאז. שלבי הניתוח הספציפיים מתייחסים ל"הליך הפעולה הלאומי למעבדה הקלינית "[67]. הוא מחולק בעיקר לשתי הנקודות הבאות:

 

① הכנת הפיתרון
Buffered starch solution ({{0}}.4g/L): Accurately weigh 9g of sodium chloride, 22.6g of anhydrous disodium hydrogen phosphate, and 12.5g of anhydrous potassium dihydrogen phosphate, dissolve them in 500mL of distilled water, and heat until the solution רתיחה; שוקל במדויק 0.4 גרם עמילן מסיס, ממיס אותו ב -10 מ"ל מים מזוקקים, מתערבבים באופן שווה והסתגלו לעיסה; הזרקו את תמיסת העמילן המותאמת לעיסה לתמיסת הרתיחה לעיל, ושטפו את הכוס שוב ושוב עד שהעמילן מועבר לחלוטין לתמיסת המים הרותחת. לאחר ערבוב באופן שווה עם מוט זכוכית, קריר לטמפרטורת החדר, מוסיפים 5 מ"ל של תמיסת פורמלדהיד של 37%, ומדללים ל 1L עם מים מזוקקים. ערך ה- pH של הפיתרון הוא 7.0 ± 0.1 והוא ממוקם במקרר לשימוש.
פתרון מלאי יוד (0. 1 מול/ל): שוקל במדויק 1.7835 גרם אשלגן יוד ו 22.5 גרם אשלגן יוד ב 500 מ"ל נקי
כוס, מוסיפה לאט ושווה באופן שווה 4.5 מ"ל חומצה הידרוכלורית מרוכזת, תוך ערבוב רציף במהלך תהליך התוספת, מדללים לסולם במים מזוקקים ומערבבים באופן אחיד. הכניסו אותו למקרר לשימוש ואחסנו אותו בבקבוק מגיב חום.
פתרון יישום יוד ({{0}}. 01mol/l): קח כמות מסוימת של תמיסת מלאי יוד (0.1 מול/ל), לדלל אותו 10 פעמים במים מזוקקים, הכניסו אותו למקרר לשימוש ואחסון אותו עד חודש.

② שלבי פעולה ניסיוניים
קח את תמיסת האנזים ומדלל אותו 10 פעמים במי מלח פיזיולוגי ופעל לפי טבלה 5.2. מערבבים היטב, אורך הגל של הספקטרופוטומטר הוא 660 ננומטר, ונתיב האור של כוס הקולורימטרית הוא 10 מ"מ. אפס עם מים מזוקקים וקרא את הספיגה של כל צינור. חשב את פעילות העמילאז בהתבסס על נוסחת החישוב הבסיסית 5.3.

 

TAB.5.2 שלבי פעולה לקביעת עמילאז

 

(3) קביעת פעילות ליפאז

שיטת הקביעה בוצעה בהתאם ל- QB/T {{0}} [68]. הוכן פיתרון לבדיקת אנזים של 2% עם 0. 0 25 מול/ליטר חיץ פוספט (pH 7.5), פנולפתילין שימש כמחוון, וחומצות שומן הועברו עם תמיסת נתרן הידרוקסיד סטנדרטית. פעילות הליפאז חושבה על סמך נפח נתרן הידרוקסיד שנצרך בניסוי. הכלל הוא: בחומציות של 7.5 וטמפרטורת הסביבה של 40 מעלות, 1 מ"ל של תמיסת אנזים נוזלי הידרוליזה ליפאז למשך דקה לייצור 1 מיקרומול של חומצה שומן, שהיא יחידת פעילות ליפאז אחת, המתבטאת כ- U/ml. לאחר מכן, פעילות הליפאז חושבה על פי פורמולה 5.4: פעילות אנזים (U/ML)=(BA) × C/0.05 × 50 × 1/15 × N=200/3 × (BA) × C × N (5.4) כאשר: B הוא הנפח של נוצרי נוצרי נוצרת, ML, ML) × C × N (5.4) כאשר ואז B הוא, B, B, BA CLOOD, ML (B, צורך, BA) A הוא נפח הפתרון הסטנדרטי של נתרן הידרוקסיד הנצרך בקבוצת הביקורת הריקה, ML; C הוא ריכוז התמיסה הסטנדרטית של נתרן הידרוקסיד, Mol/L; 0.05 הוא גורם ההמרה לריכוז התמיסה הסטנדרטית של נתרן הידרוקסיד; 50 הוא תכולת חומצות השומן של תמיסת נתרן הידרוקסיד; 15 דקות הוא זמן התגובה; N הוא הכפיל לדילול.

(4) קביעת פעילות הפרוטאז

עיין ב- GB/T 23527-2009 [69] עם שינויים קלים.
① הכנת עקומה סטנדרטית
קח 1 מ"ל של פתרון סטנדרטי של טירוזין עם ריכוזי מסה שונים, שהם 0, 1 0, 20, 30, 40 ו- 50mg/L, והוסיפו 5 מ"ל של תמיסה של 0.4 מול/ליטר נתרן קרבונט ו -1 מ"ל של תמיסת מגיב פולין. הגיבו למשך 20 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות. לאחר השלמת התגובה, הסר את תמיסת התגובה ומדוד את ערך הספיגה של הפתרון באורך גל של 680 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. צייר עקומה סטנדרטית של טירוזין עם ריכוז טירוזין כציר האופקי וערך הספיגה כציר האנכי.

ציסטן עשבי תיבול חדשים עם כוח נוגד חמצון חזק

② קביעת פעילות הפרוטאז
קבוצת ניסוי: קח 1 מ"ל מתמיסת הקזאין עם ריכוז של 10 גרם/ל 'ומערבב אותו באופן שווה עם 1 מ"ל מתמיסת הדגימה שיש לבדוק, והגיב למשך 10 דקות בטמפרטורה סביבתית של 40 מעלות; סנן וקבל את הפילטר לאחר העמידה, קח 1 מ"ל מהסינון, 5 מ"ל של תמיסת נתרן פחמתי ו -1 מ"ל של מגיב פולין, מערבבים באופן שווה ומגיב למשך 20 דקות בטמפרטורה סביבתית של 40 מעלות; השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את ערך הספיגה של הפתרון באורך גל של 680 ננומטר.
קבוצת ביקורת ריקה: קח 1 מ"ל מתמיסת הדגימה שיש לבדוק, הוסף חומצה טריכלורו -אצטטית, הגיב באופן מלא כדי להפעיל את הפרוטאז, ושיטות פעולה אחרות זהות לקבוצת הניסוי.

חשב את פעילות הפרוטאז לפי פורמולה 5.5:
פעילות פרוטאז (u/ml)=ak × 4/10 (5.5) איפה: A הוא ספיגת תמיסת האנזים בקבוצת הניסוי; K הוא כמות הטירוזין כאשר הספיגה שווה ל -1; 4 הוא הנפח הכולל של תמיסת התגובה, ML; 10 הוא זמן התגובה, דקות.

(5) קביעת פעילות התא [70]

הפעילות של התאית באנזימים באה לידי ביטוי בדרך כלל בכמות הגלוקוז שמשתחררת על ידי כמות מסוימת של תמיסת אנזים לכל זמן יחידה. העיקרון של השימוש בשיטת נייר המסנן למדידת פעילות התאית הוא כי תאית יכולה לפרק תאית בנייר המסנן כדי לייצר מטבוליטים משניים כמו גלוקוז, וגלוקוז יכול להגיב עם 3, 5- חומצה דיניטרוזילית ליצירת מתחם צהוב. צבע התגובה הזו הוא בהיר יחסית, מה שיכול לקבוע היטב את כמות הגלוקוז וסוכרים אחרים המפחיתים אחרים המיוצרים.

 

①3, 5- חומר קולורמטרי של חומצה דיניטרוזיאליקה
Accurately weigh 10g of 3,5-Dinitrosalicylic acid with a melting point of 168-169 degree , dissolve it with distilled water, add 20g of sodium hydroxide and 200g of potassium sodium tartrate, continue heating until the solid is completely dissolved, dilute to 500mL with distilled water, add 2g of redistilled פנול ו -0.5 גרם נתרן סולפיט נטול מים, מערבבים ברציפות במהלך תהליך התוספת עד שהוא מומס לחלוטין, הפסיקו לחימום לאחר התערבבות באופן שווה, קרירים לטמפרטורת החדר, מעבירים את הכל לבקבוק נפחי של 1000 מ"ל, מדללים לסימן עם מים מזוקקים, מניחים בטמפרטורת החדר למשך שבוע, להשיג את העל -סופר -נמרץ, ומחסן בבקבוק חום.הידרוליזה אנזימטית
במדויק פיפטה {{0}}, 0. 5, 1. 0, 1.5, 2.0 מ"ל של פתרון מדגם אנזים ל -2 מ"ל של חומצה אצטית-אצטט אצטט מאגר עם ערך pH של 4.5. לאחר 5 דקות של אמבטיית מים בטמפרטורה קבועה תוך 40 מעלות, הוסיפו 6 חתיכות נייר פילטר כרומטוגרפיה עם שטח של 1 × 1 ס"מ 2 בהתאמה, והתחילו מייד לתזמון כדי להפוך את זמן התגובה למדויק ל 60 דקות. מעבירים מייד לאמבט מים רותחים לתגובה למשך 10 דקות, והתא מאבד את פעילותו.

 

 

③ תגובת צבע
קח את תמיסת הדגימה של האנזים, הוסף 3 מ"ל של 3, 5- חומר קולורמטרי של חומצה דיניטרוזיליקילית שהוכן ב- ①, חום באמבט מים רותח למשך 15 דקות, הוצא, מתקרר לטמפרטורת החדר, הוסף 10 מ"ל מים מזוקקים, מערבב באופן שווה, השתמש בספקטרופומטר באורך אורך הגל של 550 ננומטר, כוונו את הקבוצה והביקורת שלו.
④ רישום של עקומת סטנדרט גלוקוזית
הכן פיתרון סטנדרטי לגלוקוז עם ריכוז של 1 mg/ml במדויק, והשתמש במים מזוקקים כדי להפוך את הפיתרון הסטנדרטי לגלוקוז עם נפח של 0, 0. 2, 0. 4, {{6}. של 3, 5- חומר קולורמטרי של חומצה דיניטרוסליצילית שהוכן ב ① לביצוע תגובת פיתוח צבע. תורם את העקומה הסטנדרטית עם ריכוז הגלוקוז כציר האופקי והספיגה כציר האנכי.
Conculation
השתמש בערך הספיגה A לאחר פיתוח צבע עם תמיסת אנזים, ואז חישב את כמות השחרור של הגלוקוז M בהתאם לעקומת הסטנדרט הגלוקוזית, וחשבו לפי הנוסחה 5.6:
פעילות תאית (u/ ml)=m/ (t · m) (5.6) איפה: M הוא כמות השחרור של הגלוקוז, UG; T הוא זמן ההידרוליזה האנזימטית, דקות; M הוא תוכן האנזים בתגובה, ug/ml.