ilבחר
הבית / יֶדַע / תוכן

יֶדַע

אספקה ​​בתיווך CAR-נויטרופיל של ננו-תרופות מגיבות למיקרו-סביבה של גידולים עבור גליובלסטומה כימותרפיה

Nov 27, 2023

גליובלסטומה (GBM) היא אחד הגידולים המוצקים האגרסיביים והקטלניים ביותר בבני אדם. בעוד שטיפולים יעילים, כגון תאי רצפטור כימרי אנטיגן (CAR)-T וכימותרפיות, פותחו לטיפול בסוגי סרטן שונים, יעילותם בטיפול ב-GBM הופרעה במידה רבה על ידי מחסום הדם-מוח ומחסמי הדם-מוח-גידולים. נויטרופילים אנושיים חוצים ביעילות מחסומים פיזיולוגיים ומציגים חסינות אפקטורית נגד פתוגנים, אך תוחלת החיים הקצרה והעמידות לעריכת גנום של נויטרופילים ראשוניים הגבילו את היישום הרחב שלהם באימונותרפיה. כאן אנו מהנדסים גנטית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים עם CRISPR/Cas9-דפיקת גנים מתווכת כדי לבטא מבנים שונים נגד GBM CAR עם תחומי איתות ספציפיים ל-T-CD3ζ או לנויטרופילים. CAR-נויטרופילים עם הפעילות האנטי-גידולית הטובה ביותר מיוצרים על מנת לספק ולשחרר באופן ספציפי ולא פולשני תרופות ננו המגיבות למיקרו-סביבה של גידול למיקוד GBM ללא צורך בגרימת דלקת נוספת באתרי הגידול. כימותרפיה משולבת זו מציגה פעילות אנטי-GBM מעולה וספציפית, מפחיתה מתן תרופות מחוץ למטרה, ומאריכה את תוחלת החיים בעכברים נקבות הנושאות גידולים. יחד, מערכת אספקת תרופות ביו-מימטית מסוג CAR-נויטרופיל היא פלטפורמה בטוחה, חזקה ורב-תכליתית לטיפול ב-GBM ואולי במחלות הרסניות אחרות.


effects of cistance-antitumor

היתרונות של cistanche tubulosa-Antitumor

גליובלסטומה (GBM) מאופיינת בשיעור תמותה גבוה, זמן חיים קצר ופרוגנוזה גרועה עם נטייה גבוהה להישנות1,2. היעילות הטיפולית של ניתוחים ושל תרופות כימיות מפריעות בעיקר על ידי מבנה המוח העדין ומחסום הדם-מוח הפיזיולוגי (BBB) ​​או מחסום הדם-מוח-גידול (BBTB)3-5. במיוחד, העברת תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS) לטיפול בגידולי מוח היא מאתגרת מאוד:<1% of administered nanoparticle dose is found to be delivered to a solid tumor based on 376 published datasets6, and 0.8% delivered to brain cancer7. Due to their native capacity to migrate towards inflamed sites, traverse BBB/BBTB, and infiltrate solid tumors, mouse neutrophil-mediated delivery of nanoparticulated chemo drugs has been investigated to enhance targeted drug delivery to the brain tumors for improved therapeutic efficacy8–10. However, an invasive surgical resection of the tumor or tumor microenvironment priming is needed to induce additional inflammation for neutrophil recruitment before neutrophil/chemotherapeutic administration, leading to limited neutrophil recruitment in tumor sites beyond the inflamed surgical margin11. Furthermore, neutrophil-delivered chemotherapeutics were primarily enriched in the spleen, but not in the targeted brain of tumor-bearing mice. While necrosis was not observed in the major organs of experimental mice, there are still concerns regarding off-target tissue toxicity or even systemic toxicity in patients12. Previous studies also focused on mouse neutrophils. The feasibility and safety of using human neutrophils in drug delivery remain elusive since neutrophils have a short lifespan and are prone to apoptosis ex vivo. In addition, massive neutrophil extraction from pre-surgical patients for drug loading may lead to neutropenia or other risks. Thus, a safe and effective human neutrophil-mediated biomimetic drug delivery system that utilizes the natural chemo-attractive GBM microenvironment is urgently needed.

החסינות המולדת והפלסטיות של נויטרופילים נגד סוגי סרטן שונים12-16, כולל GBM, נחקרו פחות מאשר היישום שלהם כנשאי תאים במתן תרופות8-10. נויטרופילים מזרימים בדם הביתה למיקרו-סביבה של הגידול ההיפוקסי (TME), שם הם הופכים לנויטרופילים הטרוגניים הקשורים לגידולים (TANs), מרכיב חיוני של TME מדכא חיסון התורם להתקדמות הסרטן ולהתנגדות טיפולית12,17. בדומה למקרופאגים, נמצאו פנוטיפים אנטי-גידולים N1 ופרו-גידולים N2 של TAN בתוך ה-TME18-21 ההיפוקסי. פותחו אסטרטגיות טיפוליות שונות למיקוד ישירות לנויטרופילים תוך התמקדות בדלדול או עיכוב נויטרופילים12,22, מה שהוביל למספר ניסויים קליניים (למשל, מעכב CCR5 Maraviroc ב-NCT03274804). לפיכך, היישום הישיר של נויטרופילים לא מטופלים כננו-נשא עשוי להוות סיכון נוסף לחולי סרטן שבהם נויטרופילים הסוחרים בתרופות עשויים להיות מתוכנתים מחדש לפנוטיפ N2 פרו-גידולי המדכא את מערכת החיסון בתוך TME לאחר התיישנות לאתרי גידול13,23. בנוסף, יש לחקור ולהגביר את הפעילות האנטי-גידולית המהותית של נויטרופילים נאיביים כדי להשיג יעילות טיפולית מיטבית כאשר משתמשים בהם כנשא תרופה בשילוב עם כימותרפיה.

Desert ginseng—Improve immunity

היתרונות של cistanche tubulosa-לחזק את המערכת החיסונית

שינוי קולטן אנטיגן כימרי (CAR) שיפר באופן משמעותי את הפעילות האנטי-גידולית של תאי T חיסוני או רוצח טבעי (NK)24-27. עם זאת, יעילותם בגידולים מוצקים עדיין מוגבלת בין השאר בשל יכולת הסחר והחדירה הנמוכה יחסית שלהם. נוכחותם של BBB ו-BBTB פיזיולוגיים מונעת עוד יותר את היעילות של תרופות מתפתחות אלה נגד GBM במוח. השערנו שהשילוב של הנדסת CAR ונויטרופילים בעלי תנועה גבוהה עשוי לקיים את הפנוטיפ האנטי-גידולי N1 שלהם ולהניב יעילות טיפולית מצוינת בטיפול ב-GBM. נויטרופילים ראשוניים הם קצרי מועד ועמידים לעריכת גנום28, מה שמגביל את היישום שלהם באימונותרפיה מכוונת CAR. תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs), הנגישים יותר לעריכת גנים ומסוגלים להתמיין לנויטרופילים באופן מסיבי, יכולים לספק מקור בלתי מוגבל של נויטרופילים CAR איכותיים עבור אימונותרפיה ממוקדת בתנאים מוגדרים כימית, ללא קסנו29. נויטרופילים גם פגוציטים בעיקר פתוגנים מיקרוביאליים עם משטחים מחוספסים או ארוכים, כגון S. aureus ו-E. coli30, אשר יש לקחת בחשבון עבור עיצוב ננו-חלקיקים באספקת תרופות בתיווך נויטרופילים. ואכן, Safari et al. לאחרונה דווח על פגוציטוזיס מועדף של חלקיקים מוארכים הניתנים תוך ורידי, ללא שינוי פני השטח מסובך, על ידי מחזור נויטרופילים30. עיצוב כל כך קל ובעל השראה ביולוגית בננו-חלקיקים טעונים בתרופות עשוי למקסם את טעינת התרופה בניוטרופילים ולאפשר רמות טיפוליות של אספקת תרופות באתרים ממוקדים.

In this work, we design and screen four anti-GBM chlorotoxin (CLTX)-CAR constructs with T or neutrophil-specific signaling domains by knocking them into the AAVS1 safe harbor locus of hPSCs via CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination and identified an optimized CAR, composed of a 36-amino acid GBM-targeting CLTX peptide27, a CD4 transmembrane domain and a CD3ζ intracellular domain, for neutrophil-mediated tumor-killing. The resulting stable CAR-expressing hPSCs are then differentiated into CAR-neutrophils, which sustain an anti-tumor N1 phenotype and exhibit enhanced anti GBM activities under the hypoxic tumor microenvironment. A biode gradable mesoporous organic silica nanoparticle with a rough surface (R-SiO2) is synthesized and employed to load hypoxia-activated prodrug tirapazamine (TPZ) or clinical chemo-drug temozolomide (TMZ) and JNJ-64619187 (a potent PRMT5 inhibitor under clinical trial NCT03573310) into hPSC-derived CAR-neutrophils, which are unharmed by the nanoparticulated cargo and retain the inherent physiological properties of naïve neutrophils. CAR-neutrophils loaded with drug-containing SiO2 nanoparticles display superior anti-tumor activities against GBM, possibly due to a combination of CAR-enhanced direct cytolysis and chemotherapeutic-mediated tumor killing via cellular uptake and glutathione (GSH)-induced degradation of nanoparticles within the targeted tumor cells. In an in situ GBM xenograft model, hPSC-derived CAR-neutrophils precisely and effectively deliver TPZ-loaded SiO2 nanoparticles to the brain tumors without invasive surgical resection for amplified inflammation, significantly inhibiting tumor growth, and prolonging animal survival, representing a targeted and efficacious combinatory chemoimmunotherapy. Notably, Si content measurement suggests that>20% מהננו-תרופות הניתנות מועברות לגידולי מוח על ידי נויטרופילים מסוג CAR בהשוואה ל-1% על ידי ננו-תרופות חופשיות. לסיכום, מערכת אספקת התרופות הביומימטית CAR-נויטרופיל שלנו היא פלטפורמה בטוחה, חזקה ורב-תכליתית לטיפול ב-GBM ובמחלות הרסניות אחרות.

effects of cistance-antitumor (2)

היתרונות של cistanche tubulosa-Antitumor

תוצאות

סקר מבני CAR ספציפיים לנויטרופילים לפעילות אנטי גידול משופרת

To engineer CAR-neutrophils for targeted drug delivery to brain tumors (Fig. 1a–b), we first designed and tested 4 different CAR structures optimized for anti-tumor activities of hPSC-neutrophils. All CAR structures shared the same extracellular granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (GM-CSFR) signal peptide (SP), glioblastoma-targeting domain CLTX27, and IgG4 hinge29 (Fig. 2a). CAR #1 is a first-generation T cell-specific CAR that uses the CD4 transmembrane (TM) domain and CD3ζ intracellular signaling domain. CAR #2, CAR #3, and CAR #4 differ from CAR #1 in using a transmembrane domain from neutrophil-specific CD32a (or FcγRIIA), a single-chain transmembrane receptor that is highly expressed in neutrophils (30,000 to 60,000 molecules/cell31) and critical for neutrophil activation31–34. CAR #3 and CAR #4 also include an Fc domain γ-chain of CD32a, which relies on a highly conserved immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) to express and signal in neutrophils. Notably, CAR #3 contains a combo signaling domain by fusing CD32aITAM to the CD3ζ intracellular domain. Since primary neutrophils are short-lived and resistant to genome editing, we engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) with these different CARs to achieve stable and universal immune receptor expression on differentiated neutrophils by knocking CAR constructs into the AAVS1 safe harbor locus via CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (Fig. 2b). After nucleofection, single cell-derived hPSC clones were isolated and screened with puromycin for about two weeks. Genotyping identified successfully targeted hPSCs with an average CAR knock-in efficiency of >90%, ורוב השיבוטים הממוקדים הם הטרוזיגוטיים (איור משלים 1a-d). ביטוי CAR על hPSCs מהונדסים אושר עוד על ידי RT-PCR וניתוח ציטומטריית זרימה של CLTX-IgG4 (איור משלים. 1e-g). כצפוי, hPSCs המבטאים CAR שמרו על רמות ביטוי גבוהות של סמנים פלוריפוטנטיים, כולל OCT4, SSEA4 ו-SOX2 (איור משלים. 1f).

כדי לייצר CAR-נויטרופילים דה נובו, hPSCs המבטאים CAR הופנו תחילה לאבות המטופואיטיים רב-פוטנטיים ולאחר מכן מיאלואידים עם טיפול ציטוקינים ספציפי לשלב35 (איור 2c). העסקה לאחר מכן של G-CSF ואגוניסט חומצה רטינואית AM580 קידמו ייצור נויטרופילים חזק36. בדומה למקביליהם בדם היקפי (PB), נויטרופילים CLTX-CAR שמקורם ב-hPSC הציגו מורפולוגיה אופיינית של נויטרופילים וסמני שטח CD16, CD11b, MPO, CD15, CD66b ו-CD18 (איור משלים. 2). לאחר מכן, קבענו את ההשפעות של ביטוי CAR על הציטוטוקסיות האנטי-גידולית של נויטרופילים שמקורם ב-hPSC על ידי תרבות משותף עם תאי U87MG של גליובלסטומה (GBM) במבחנה. כצפוי, נויטרופילים CLTX-CAR שמקורם ב-hPSC הציגו יכולת הרג גידול משופרת בהשוואה לנויטרופילים של PB (איור 2d), בהתאם לתצפיות קודמות בתאי CLTX CAR-T27. בין ה-CARs השונים הללו, CAR #1 תיווך פעילויות מעולות להרוג גידולים ב-hPSC-נויטרופילים. יש לציין כי CAR #4 מבוסס שרשרת הוא הכי פחות יעיל בהפעלת הרג גידולים בתיווך נויטרופילים, אשר עשוי לנבוע מהעותק הנמוך של ITAM ביחידת המשנה של ζ וביטוי נמוך יותר של CARs הנושאים על פני התא28. נויטרופילים משחררים מיני חמצן תגובתיים ציטוטוקסיים (ROS) ו-tumor necrosis factor- (TNF-) כדי להרוג תאי מטרה. הייצור של ROS ו-TNF- (איור 2e, F) מנויטרופילים שונים עלה בקנה אחד עם הציטוליזה המוגברת שלהם. כצפוי, הייצור של ROS ו-TNF- מנויטרופילים שונים לאחר גידול משותף עם תאי גלייה רגילים של SVG p12 נשאר נמוך כמו קבוצת הביקורת השלילית (איור משלים. 3a, ב). בנוסף, ציטוטוקסיות מוגברת נגד גידולים של CAR-נויטרופילים נצפתה רק בדגירה משותפת עם תאי GBM, כולל U87MG, GBM43 מבוגרים ראשוניים ותאי SJ-GBM2 לילדים (איור משלים. 3c), המדגים את הספציפיות הגבוהה של CLTX שלנו. -אוטו. יש לציין כי נויטרופילים CAR הפגינו תאימות ביולוגית גבוהה עם תאי גליה רגילים של SVG p12, hPSCs ותאים שמקורם ב-hPSC (איור משלים. 3d), בהתאם לתצפית קודמת לפיה נויטרופילים ראשוניים מומתים אינם הורגים תאים בריאים16. באופן קולקטיבי, נויטרופילים CAR שמקורם ב-hPSC, במיוחד נויטרופילים CAR הנושאים CD3ζ, הציגו ציטוטוקסיות אנטי-גידולית מוגברת ויצרו יותר ROS ו-TNF-in vitro, מה שהדגיש את הפוטנציאל שלהם באימונותרפיה ממוקדת.

Fig. 1 | Schematic of enhanced anti-glioblastoma efficacy using combinatory immunotherapy of CAR-neutrophils and tumor microenvironment responsive nano-drugs. Human pluripotent stem cells were engineered with CARs and differentiated into CAR-neutrophils that are loaded with rough silica nanoparticles (SiO2 NPs) containing hypoxia-targeting tirapazamine (TPZ) or other drugs, as a dual immunochemotherapy. b Systemically administered CAR-neutrophil@R-SiO2- TPZ NPs first attack external normoxic tumor cells by forming immunological synapses and kill tumor cells via phagocytosis. After apoptosis, CAR-neutrophils could then release R-SiO2-TPZ NPs, which are overtaken by tumor cells. Afterward, nano-prodrugs respond to the hypoxic tumor microenvironment and effectively kill tumor cells. TEOS tetraethyl orthosilicate, BTES bis[3-(triethoxysilyl) propyl] tetrasulfide, TPZ tirapazamine, BTZ benzotriazinyl.


איור 1|סכימה של יעילות מוגברת של אנטי-גליובלסטומה באמצעות אימונותרפיה משולבת של CAR-נויטרופילים וננו-תרופות מגיבות למיקרו-סביבה של הגידול. תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים הונדסו עם CARs והתמיינו ל-CAR-נויטרופילים הטעונים בננו-חלקיקי סיליקה מחוספסים (SiO2 NPs) המכילים טיראפאזמין (TPZ) המכוון להיפוקסיה או תרופות אחרות, כטיפול אימונוכימותרפי כפול. b CAR-neutrophil@R-SiO2- TPZ NPs הניתנים באופן סיסטמי תוקפים תחילה תאי גידול נורמוקסיים חיצוניים על ידי יצירת סינפסות אימונולוגיות והורגים תאי גידול באמצעות phagocytosis. לאחר אפופטוזיס, CAR-נויטרופילים יכולים לשחרר R-SiO2-TPZ NPs, אשר עוקפים על ידי תאי הגידול. לאחר מכן, ננו-פרו-תרופות מגיבות למיקרו-סביבה של הגידול ההיפוקסי והורגות ביעילות תאי גידול. TEOS tetraethyl orthosilicate, BTES bis[3-(triethoxysilyl) propyl] tetrasulfide, TPZ tirapazamine, BTZ benzotriazinyl.

CAR-נויטרופילים שמרו על פעילות אנטי-גידולית מעולה במיקרו-סביבות גידול מדכא חיסון

בדומה למקרופאגים, נמצאו פנוטיפים אנטי-גידולים N1 ופרו-גידולים N2 של נויטרופילים הקשורים לגידול בתוך המיקרו-סביבת הגידול המדכא את החיסון17. נויטרופילים פרו-גידולים N2 ממלאים תפקידים קריטיים באנגיוגנזה של הגידול, גרורות ודיכוי חיסוני, אך מיקוד טיפולי של סוג תאים זה היה מאתגר.

במקום אסטרטגיית דלדול מערכתית22, כאן הערכנו את הפוטנציאל של הנדסת CAR בשמירה על הפנוטיפ האנטי-גידולי של נויטרופילים. נויטרופילים שמקורם ב-CAR hPSC ו-PB טופלו בהיפוקסיה (3% O2) ו-TGF, התורמים לדיכוי החיסון של המיקרו-סביבה של הגידול37,38, כדי להעריך את פעילותם המתמשכת של הרג הגידול. בעוד שנויטרופילים של PB הציגו ירידה משמעותית בציטוליזה כנגד תאי GBM בתנאים מדכאים חיסוניים, CAR-נויטרופילים שמרו על פעילות גבוהה של הרג גידולים (איור משלים. 4a). תצפיות דומות נעשו גם בשחרור TNF ויצירת ROS (איור משלים 4b, c) מ-PB או CAR-נויטרופילים בתנאים מדכאים ונורמליים. כדי לאשר עוד יותר את הפנוטיפ של נויטרופילים בתנאים היפוקסיים ו-TGF, מדדנו את הביטוי של N1-iNOS ספציפי ו-N2- N2-ארגינאז ספציפי על הנויטרופילים המבודדים על ידי ציטומטריית זרימה (איור משלים. 4ד–ו). בהשוואה לנורמוקסיה, היפוקסיה מדכאת חיסונית ו-TGF הפחיתו משמעותית את רמות הביטוי של iNOS והעלו את רמות הארגינאז בנויטרופילים PB, בעוד שנויטרופילים CAR שמרו על רמות ביטוי גבוהות של iNOS. מחקרים קודמים מצביעים על הפעלה של מסלול האיתות Syk-Erk מוביל לייצור ROS39-42. לכן, זיהינו והשווינו הפעלה של Syk-Erk בניוטרופילים ללא שינוי ו-CAR-נויטרופילים, והתוצאות שלנו הצביעו על הפעלה גבוהה יותר משמעותית של מסלול Syk-Erk ב-CAR-Neutrophils תחת היפוקסיה (איור משלים. 5a-d), אשר עשויה לקיים ייצור ROS ללא שינוי של CAR-נויטרופילים תחת היפוקסיה. ביחד, CAR-נויטרופילים שמרו על פנוטיפ אנטי-גידולי ושמרו על פעילות אנטי-גידולית גבוהה בתנאים מחקים של מיקרו-סביבה של הגידול במבחנה, תוך הדגשת הפוטנציאל שלהם באימונותרפיה ממוקדת.

Fig. 2 | Screening neutrophil-specific chimeric antigen receptor (CAR) structures with enhanced neutrophil-mediated anti-tumor activities. a Schematic of various CAR structures. b Schematic of CAR #1 construct and targeted knock-in strategy at the AAVS1 safe harbor locus of human pluripotent stem cells (hPSCs). The vertical arrow indicates the AAVS1 targeting sgRNA. Red and blue horizontal arrows indicate primers for assaying targeting efficiency and homozygosity, respectively. HDR: homologous recombination repair. c Schematic of optimized neutrophil differentiation from hPSCs under chemically defined conditions. d Cytotoxicity assays against U87MG glioblastoma cells were performed at different ratios of neutrophil-to-tumor target using indicated neutrophils. Data are represented as mean ± SD of five independent biological replicates, two-tailed Student's t-test. Reactive oxygen species (ROS) generation (e) and ELISA analysis of TNFα release (f) from different neutrophils after coculturing with U87MG cells were determined. n = 5 biologically independent samples. The data are represented as mean ± SD, two-tailed Student's t-test. Source data are provided as a Source Data file.


איור 2|סקר מבנים של קולטן לאנטיגן כימרי (CAR) ספציפיים לנייטרופילים עם פעילות אנטי-גידולית מתווכת באמצעות נויטרופילים. סכימה של מבני CAR שונים. ב סכימה של בניית CAR #1 אסטרטגיית דפיקה ממוקדת במוקד הנמל הבטוח AAVS1 של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs). החץ האנכי מציין את ה-sgRNA המיקוד AAVS1. חיצים אופקיים אדומים וכחולים מציינים פריימרים לבדיקת יעילות מיקוד והומוזיגוסטיות, בהתאמה. HDR: תיקון רקומבינציה הומולוגית. ג סכימה של בידול נויטרופילים אופטימלי מ-hPSCs בתנאים מוגדרים כימית. ד מבחני ציטוטוקסיות כנגד תאי גליובלסטומה U87MG בוצעו ביחסים שונים של יעד נויטרופילים לגידול באמצעות נויטרופילים מסומנים. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SD של חמישה שכפולים ביולוגיים עצמאיים, מבחן t של סטודנט דו-זנב. יצירת מיני חמצן תגובתיים (ROS) (e) וניתוח ELISA של שחרור TNF (f) מנויטרופילים שונים לאחר גידול משותף עם תאי U87MG נקבעו. n=5 דגימות בלתי תלויות ביולוגית. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SD, מבחן t של תלמיד דו-זנב. נתוני מקור מסופקים כקובץ נתוני מקור.

הכנה ואפיון של hPSC CAR-נויטרופילים עמוסים בננו-חלקיקי SiO2 המכילים טיראפזאמין (TPZ)

נויטרופילים מסוג PB שימשו כנשאים תאיים כדי להעביר תרופות הדמיה וטיפוליות לגידולי מוח8-10, אם כי חדירת נויטרופילים ממוקדת דורשת דלקת הנגרמת על ידי ניתוח או אור ומתן תרופות מחוץ למטרה עשויות להוות דאגה11. כדי לשפר עוד יותר את הפעילות האנטי-גידולית של CAR-נויטרופילים, הכנו חלקיקי סיליקה (SiO2-NP) עם משטח מחוספס או חלק כדי להעמיס תרופות כימותרפיות או קרינה לנויטרופילים. תמונות של מיקרוסקופ אלקטרונים בהעברה (TEM) הדגימו כי שני חלקיקי SiO2 היו מפוזרים היטב והציגו מורפולוגיה כדורית בגודל אחיד (איור 3a, איור משלים. 6a). ניתוח התפלגות הרכב באמצעות סריקת TEM (STEM) עם ספקטרוסקופיה של קרני רנטגן מפוזרת באנרגיה (EDS) הראה שאלמנט הגופרית (S) היה מופץ באופן שווה בתוך כל חלקיקי SiO2 המחוספסים (R-SiO2) (איור 3b). באמצעות איזותרמיות ספיחה-פיזור חנקן (N2) וניתוח התפלגות גודל הנקבוביות התואם, נמדדו גודל הנקבוביות של R- ו-SSiO2 NPs כ-25 ננומטר ו-35 ננומטר (איור 3c, איור משלים. 6b), בהתאמה. בהתחשב בשטח הפנים הגבוה ובגודל הנקבוביות הגדול, ניתן להטעין תרופות טיפוליות ביעילות הן ל-R-ו-S-SiO2 NPs, כפי שמודגם על ידי ה-Tirapazamine (TPZ) פרו-תרופתי המגיב להיפוקסיה (איור 3d, איור משלים 6c) . לאחר טעינת TPZ, שינויים משמעותיים לא נצפו בפיזור, במורפולוגיה ובגודל של R-SiO2-TPZ באמצעות TEM וניתוח פיזור אור דינמי (איור משלים. 6d, ה). קשרי הטטרה-סולפיד המשולבים ב-R-SiO2 NPs רגישים לסביבות רדוקטיביות ויכולים להתפרק במהירות על ידי הכמות הגדולה של גלוטתיון (GSH) הקיימת בתאי הגידול43. לאחר מכן קבענו את הפירוק המגיב ל-GSH של R-SiO2-TPZ NPs בנוכחות 10 mM, 1 mM ו-10 μM GSH, שהיו זהים לתנאים התוך-תאיים של תאים סרטניים, תאים נורמליים וסביבות חוץ-תאיות43, בהתאמה. לאחר טיפול של 10 מ"מ GSH, המבנה הכדורי הראשוני של R-SiO2-TPZ NPs נהרס קשות לאחר 24 שעות (איור משלים. 6f, גרם). הננו-חלקיקים התפרקו לחלוטין לפסולת קטנה לאחר 48 שעות, וכתוצאה מכך שחרור TPZ באופן מגיב ל-GSH (איור 3ה). הפסולת של R-SiO2 NPs לא גרמה לציטוטוקסיות משמעותית לתאים שנבדקו במבחנה (איור משלים. 6h), מה שמצביע על הבטיחות היחסית של R-SiO2 NPs.

Desert ginseng—Improve immunity (2)

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

לחץ כאן לצפייה במוצרי Cistanche Enhance Immunity

【בקש עוד】 דוא"ל:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

לאחר מכן הערכנו את ההיתכנות של שימוש ב-SiO2-TPZ NPs כדי לטעון תרופות טיפוליות לתוך CAR-נויטרופילים כטיפול כימותרפי משולב להשגת יעילות טיפולית מוגברת. לאחר צנטריפוגה, מדדנו את הספיגה התאית של SiO2-TPZ NPs על ידי נויטרופילים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וניתוח ציטומטריית זרימה (איור 3f, g), וזיהינו קליטה תאית משמעותית יותר של R-SiO2-TPZ NPs מאשר S-SiO2- TPZ NPs על ידי נויטרופילים. תכולת Si תאית בנויטרופילים נמדדה כ-11.3 ו-19.1 ng Si/ug חלבון עבור SiO2 NPs@TPZ חלק ומחוספס (איור 3h), בהתאמה, על ידי ספקטרומטריית מסה פלזמה בשילוב אינדוקטיבי (ICP-MS). בהתחשב ביכולת הטעינה הגבוהה שלהם בניוטרופילים, NPs R-SiO2-TPZ הועסקו לניסויים הבאים. לאחר מכן ביקשנו לבדוק את התפקודים הפיזיולוגיים של נויטרופילים CAR לאחר טעינת R-SiO2-TPZ NPs. לא נצפו שינויים בכדאיות התא (איור 3i, איור משלים. 6i), יכולת נדידת מעבר הבאר (איור 3j), כימוטקסיס ובמהירות המתאימה (איור 3k, l) של CAR-נויטרופילים לפני או אחרי טעינת R-SiO2 -TPZ NPs, המדגימים את התאימות הביולוגית הגבוהה שלהם. בוצעה גם ניתוח טעינת ננו-תרופות תלוי בזמן ותכולת הטעינה המקסימלית הושגה שעה אחת לאחר הדגירה של התא-NP (איור משלים. 7a). יותר מ-95% CAR-נויטרופילים הוטענו בהצלחה עם R-SiO2-TPZ NPs (איור משלים. 7b). רמת הביטוי של CD11b, חלבון משטח נויטרופילים שמתווך פונקציית הידבקות ונדידה לאחר גירוי מולקולה דלקתית, לא שונתה ב-CAR-נויטרופילים עם או בלי טעינת R-SiO2-TPZ (איור משלים. 7c, ד). סופראוקסיד או מיני חמצן תגובתיים (ROS) משתחררים מנויטרופילים פעילים כדי להרוג חיידקים ותאי גידול44. כצפוי, יצירת ROS על ידי CAR-נויטרופילים גדלה באופן משמעותי לאחר טיפול ב-N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP), ולא נצפו הבדלים משמעותיים בייצור ROS על ידי CAR-נויטרופילים לפני ואחרי טעינת R-SiO2- TPZ (איור 3 מ'). יחד, הנתונים שלנו הוכיחו שנויטרופילים CAR טעוני R-SiO2-TPZ שמרו על הפעילות הפיזיולוגית של נויטרופילים מסוג פרא ויכולים לנדוד באופן פעיל לעבר גירויים דלקתיים, מה שמדגיש את הפוטנציאל שלהם בכימותרפיה ממוקדת לסרטן.

CAR-נויטרופילים טעונים בננו-חלקיקי R-SiO2-TPZ הורגים ביעילות תאי גליובלסטומה

בשלב הבא הערכנו את ההשפעה של R-SiO2-TPZ על יכולת הרג הגידולים של CAR-נויטרופילים. אינטראקציה אינטימית של אפקטור-מטרה הייתה תנאי מוקדם לציטוליזה בתיווך נויטרופילים. כצפוי, CAR-neutrophils@R-SiO2-TPZ יצרו סינפסות חיסוניות עם תאי גידול תוך 2 שעות והציגו מספרי אינטראקציה של אפקטור-מטרה דומים ל-CAR-נויטרופילים נטולי תרופות (איור 4a, איור משלים. 8) . יש לציין שלא נמצאו אינטראקציות נצפות בין CAR-neutrophils@RSiO2-TPZ לבין תאים סומטיים לא סרטניים (איור משלים. 8), המדגישים את הספציפיות של CLTX-CAR נגד גידולי מוח. יתר על כן, NPs R-SiO2-TPZ שוחררו מנויטרופילים למצע התרבות (איור משלים. 9a, ב) 12 שעות לאחר תרבית משותפת ונכנסו לתאי הגידול הנותרים (איור 4a). 24 שעות לאחר דגירה משותפת של נויטרופילים CAR טעוני SiO2-TPZ עם תאי גידול, עד 95% מתאי הגידול הכילו NPs R-SiO2-TPZ (איור 4a, איור משלים. 9c), מה שמצביע על הצלחה מוצלחת. מפל תחבורה הכולל נויטרופילים נשאים המפעילים את תפקוד תאי האפקטור שלהם ועוברים אפופטוזיס, ובכך משחררים באופן פסיבי R-SiO2-TPZ NPs לתאי הגידול של המטרה45. כמו כן אימתנו את התפקוד התגובה להיפוקסית ואת הציטוטוקסיות של TPZ פרו-תרופתי בתוך תאי גידול על ידי ניתוח ספקטרוסקופיה של תהודה פרמגנטית אלקטרונית (EPR) של יצירת רדיקלים מ-TPZ (איור משלים. 9d) וניתוח ציטומטריית זרימה של TOPRO-3 בגידול תאים (איור משלים. 9e) תחת היפוקסיה ונורמוקסיה. כדי לקבוע את הציטוליזה של נויטרופילים מסוג CAR טעוני R-SiO2-TPZ, יישמנו מודל מאתגר של גידול נורמוקסיה-היפוקסיה במבחנה (איור 4ב). 24 שעות לאחר תרבות משותף נורמוקסית, CAR-נויטרופילים שהוטענו ב-R-SiO2-TPZ NPs או לא הפגינו ציטוטוקסיות אנטי-גידולית דומה (איור 4c), ושניהם היו גבוהים יותר מזו של PB-נויטרופילים הטעונים ב-R -SiO2-TPZ NPs או לא ו-R-SiO2- TPZ NPs לבד. הציטוטוקסיות המוגברת נובעת בעיקר מהיכולת המוגברת של מיקוד גידולים של נויטרופילים לאחר הנדסת CAR. לאחר תרבות נוספת של 12 ו-24-שעות היפוקסיות עם תאי גידול, R-SiO2--TPZ NP-עמוסי CAR-נויטרופילים הראו יכולת אנטי-גידול מעולה בהשוואה לקבוצות אחרות (איור 4ד, ה). בנוסף, נויטרופילים CAR עמוסים ב-R-SiO2-TPZ NPs הציגו ציטוליזה מצוינת כנגד תאי גידול טריים שנזרעו מחדש (איור 4f), מה שמצביע על היכולת האנטי-גידולית של R-SiO2-TPZ המשוחרר ננו-חלקיקים לאחר אפופטוזיס נויטרופילים.

לאחר מכן ביצענו ניתוח רצף RNA (RNA-seq) על תאי גידול כדי להבהיר את המנגנון המולקולרי הפוטנציאלי העומד בבסיס הציטוליזה האנטי-גידולית המוגברת של נויטרופילים על ידי ביטוי CAR ו-R-SiO2-TPZ NPs. ניתוח ביטוי גנים הראה שבהשוואה לבקרה ו-R-SiO2-TPZ NPs, CAR-נויטרופילים הטעונים עם או בלי R-SiO2-TPZ NPs הפחיתו באופן משמעותי את הביטוי של גנים ציטופלזמה וממברנה בתאי גידול ( איור משלים 10a, איור 4g), תומך עוד יותר בפאגוציטוזה שלהם של תאי גידול לאחר תרבות משותף. בעוד שכל קבוצות הניסוי הגבירו את הלחץ החמצוני הסלולרי בתאי הגידול, CAR-נויטרופילים טעוני R-SiO2-TPZ הפגינו ביצועים טובים יותר מקבוצות אחרות בהפעלת איתות של מתח חמצוני. בנוסף, ניוטרופילים CAR טעוני R-SiO2-TPZ קידמו באופן משמעותי אפופטוזיס והפחיתו את השגשוג בתאי הגידול. כדי להבין יותר את הפעילות האנטי-גידולית המוגברת של CAR-נויטרופילים טעוני R-SiO2-TPZ, השתמשנו ב-Phagocytosis inhibitor cytochalasin D וסוג חמצן תגובתי (ROS) מסוג N-acetyl-cysteine ​​(NAC) ו מעכב ROS GSK2795039 לתרבות המשותפת של גידולים-נויטרופילים. ציטוליזה של תאי גידול על ידי CAR-נויטרופילים הופחתה באופן משמעותי על ידי 5 מיקרומטר ציטוכלסין D, 5 מ"מ NAC ו-100 ננומטר GSK2795039 (איור משלים. 10b, ג), מה שמצביע על התפקיד הבולט של פגוציטוזיס ו-ROS בתיווך גידולים באמצעות נויטרופילים מסוג CAR. הֶרֶג. שאר 40%-50% תמוגת תאי הגידול בנוכחות נויטרופילים ו-NAC או GSK2795039 מצביעים על מעורבות של מנגנון בלתי תלוי ROS בהרג גידולים בתיווך נויטרופילים ששווה חקירה נוספת.

Fig. 3 | Preparation and characterization of hPSC CAR-neutrophils loaded with tirapazamine (TPZ)-containing SiO2 nanoparticles. a–e Transmission electron microscope (TEM) (a) and energy dispersive spectroscopy (EDS) elemental mapping images (b) of rough SiO2 nanoparticles are shown. c Nitrogen adsorption-desorption isotherm of rough SiO2 nanoparticles along with Barrett-JoynerHalenda (BJH) pore size distribution plot is shown. Biological triplicates were performed independently. TPZ loading content in SiO2 nanoparticles (d) and glutathione (GSH)--responsive TPZ release (e) were measured at the indicated time. n = 3 biologically independent samples. One-way analysis of variance (ANOVA) for (e). Fluorescence images (f) and flow cytometry analysis (g) of neutrophils loaded with smooth and rough SiO2-TPZ. Biological triplicates were performed independently. h Cellular SiO2 content in hPSC-derived CAR-neutrophils was measured. n = 5 biologically independent samples, two-tailed Student's t-test. Cellular viability (i), n = 3 biologically independent samples, transmigration (j), n = 5 biologically independent samples, chemoattraction abilities (k, l), n = 20 biologically independent samples, and ROS generation ability (m) of hPSC-derived CAR-neutrophils loaded with or without rough SiO2-TPZ were shown, n = 5 biologically independent samples, two-tailed Student's t-test. PMA: phorbol myristate acetate. All data in this figure are represented as mean ± SD. Source data are provided as a Source Data file.


איור 3|הכנה ואפיון של hPSC CAR-נויטרופילים עמוסים בננו-חלקיקי SiO2 המכילים טיראפזאמין (TPZ). מוצגות תמונות של מיקרוסקופ אלקטרונים להעברה (TEM) (א) ופיזור אנרגיה (EDS) תמונות מיפוי יסודות (ב) של ננו-חלקיקי SiO2 מחוספסים. ג איזותרמית ספיחה-ספיחה של חנקן של ננו-חלקיקי SiO2 מחוספסים יחד עם עלילת חלוקת גודל הנקבוביות של Barrett-JoynerHalenda (BJH). השלשות ביולוגיות בוצעו באופן עצמאי. תוכן טעינת TPZ בננו-חלקיקי SiO2 (d) וגלוטתיון (GSH) --שחרור TPZ מגיב (e) נמדד בזמן המצוין. n=3 דגימות בלתי תלויות ביולוגית. ניתוח שונות של שונות (ANOVA) עבור (ה). תמונות פלואורסצנטיות (f) וניתוח ציטומטריית זרימה (g) של נויטרופילים הטעונים ב-SiO חלק ומחוספס2-TPZ. השלשות ביולוגיות בוצעו באופן עצמאי. h נמדדה תכולת SiO2 הסלולרית ב- CAR-נוטרופילים שמקורם ב-hPSC. n=5 דגימות בלתי תלויות ביולוגית, מבחן t של תלמיד דו-זנב. כדאיות תאית (i), n=3 דגימות בלתי תלויות ביולוגית, טרנסמיגרציה (j), n=5 דגימות בלתי תלויות ביולוגית, יכולות כימותרפיה (k, l), n=20 דגימות בלתי תלויות ביולוגית, ו הוצגה יכולת יצירת ROS (מ') של נויטרופילים CAR שמקורם ב-hPSC, טעונים עם או בלי SiO2-TPZ מחוספס, n=5 דגימות בלתי תלויות ביולוגית, מבחן t של סטודנט דו-זנבתי. PMA: פורבול מיריסטאט אצטט. כל הנתונים באיור זה מיוצגים כממוצע ± SD. נתוני מקור מסופקים כקובץ נתוני מקור.

הערכה תפקודית של CAR-נויטרופילים עמוסים בתרופות ננו באמצעות מודלים ביו-מימטיים גליובלסטומה במבחנה

כדי להעריך עוד יותר את הפעילויות של CAR-נויטרופילים טעוני R-SiO2-TPZ NP, יישמנו מודל גידול מבוסס דם-מוח (BBB) ​​באמצעות תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים אנושיים (איור 5a, איור משלים). .11א). כצפוי, ניוטרופילים CAR טעוני R-SiO2-TPZ NP הפגינו יכולת העברה מצוינת על פני מודל BBB חוץ-גופני (איור 5b), והרגו ביעילות תאי גידול ממוקדים לאחר העברה בתנאים נורמוקסיים והיפוקסיים כאחד (איור 5c). , ד), ושחרור ציטוקינים דלקתיים נוספים (איור 5ה) שעשויים למשוך תאי אפקטור אחרים להרוג את תאי הגידול. בנוסף, נויטרופילים מסוג CAR לא השפיעו באופן משמעותי על הכדאיות של תאי אנדותל לאחר מעבר (איור משלים. 11b). R-SiO2-TPZ NP-עמוסי CAR-נויטרופילים שמרו על יכולת העברה מצוינת במהלך ניסוי ההעברה השני (איור 5f) ויכולת אנטי-גידול מעולה בהשוואה לקבוצות אחרות (איור 5g). לאחר מכן הופעל מודל ספרואיד גידול תלת מימדי (3D) כדי להעריך את יכולת החדירה של הגידול של ניוטרופילים CAR טעוני R-SiO2-TPZ NP (איור 5h). CAR-נויטרופילים נדדו בהדרגה לכיוון מרכז הספרואיד הגידול והתפזרו באופן אחיד בספירואיד לאחר 8 שעות של דגירה (איור 5i). נצפתה מידה גבוהה של שיתוף-לוקליזציה בין נויטרופילים CAR ו-R-SiO2-TPZ NPs (איור משלים. 12a-c), מה שמוכיח ש-R-SiO2-TPZ NPs הוכנסו ביציבות ב-CAR -נויטרופילים במהלך חדירת הגידול לפני הציטוליזה שלהם. ללא משלוח בתיווך נויטרופילים, R-SiO2-TPZ NPs נמצאו רק בשכבה החיצונית של כדוריות הגידול. בהשוואה ל-R-SiO2-TPZ NPs ו-CAR-neutrophils, נויטרופילים CAR טעוני R-SiO2-TPZ NP הפגינו ציטוליזה אנטי-גידולית מעולה במודל הגידול התלת-ממדי (איור 5j). ניתן להשתמש ב-CAR-neutrophils@R-SiO2 NPs גם כדי להעביר תרופות אחרות, כולל טמוזולומיד קליני (TMZ) ו-JNJ- 64619187, לתוך מודלים של גידולים תלת-ממדיים ולהרוג ביעילות תאי GBM (איור משלים. 12d-f). ביחד, הנויטרופילים והתרופות הננו המשולבות של CAR הציגו פעילויות אנטי-גידוליות מצוינות במיקרו-סביבה של גידול ביומימטי המחקים מצבים במבחנה, והדגישו את הפוטנציאל הטיפולי של כימותרפיה קומבינטורית מבוססת נויטרופילים.

Desert ginseng—Improve immunity (9)

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

הפצה in vivo של ננו-חלקיקי R-SiO2-TPZ המועברים על ידי נויטרופילים מסוג CAR

In addition to improving the direct tumor-killing ability, we hypothesize that CAR engineering of hPSC-neutrophils will significantly enhance their targeted delivery of therapeutic drugs without additional surgery- or light-induced inflammation11. To test this hypothesis, we employed a mouse xenograft model of glioblastoma and an in vivo imaging system to determine the trafficking and biodistribution of R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrophils. We fluorescently labeled SiO2 NPs with a near-infrared dye Cyanine 5 (Cy5) and then performed fluorescence imaging 3 h and 24 h after systemic administration (Fig. 6a). Three hours after intravenous injection, R-SiO2-TPZ NPs traveled to the whole body of tumor-bearing mice and emitted strong fluorescence with or without neutrophil-mediated delivery (Fig. 6b). CAR-neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs accumulated in the brain tumor site within 24 h, whereas free R-SiO2-TPZ NPs were still evenly distributed across the whole body (Fig. 6b). To further quantify the biodistribution of R-SiO2-TPZ NPs in various organs, inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) analysis of Si content was performed on the harvested organs 24 h post-injection. CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs were significantly enriched in the mouse brain (Fig. 6c), although a low-level delivery to the liver and spleen was observed. Si content measurement also demonstrated that >20% מהננו-תרופות שניתנו הועברו לגידולי מוח על ידי CAR-נויטרופילים, לעומת 1% על ידי ננו-תרופות חופשיות, דבר העולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים6. מסירה ממוקדת של R-SiO2-TPZ NPs למוח המארח על פני BBB על ידי CAR-נויטרופילים אושרה גם על ידי ניתוח היסטולוגי (איור 6ד). להיפך, R-SiO2-TPZ NPs לבד הצטברו בעיקר בכבד ובטחול. ביחד, הנתונים שלנו הדגימו אספקה ​​ממוקדת משופרת של R-SiO2-TPZ NPs על ידי נויטרופילים CAR ללא צורך לעורר דלקת נוספת באתר הגידול, והדגישו את היתכנות ובטיחות של כימותרפיה מבוססת נויטרופילים בטיפול בסרטן.

הטיפול הכימותרפי המשולב של CAR-נויטרופילים וננו-חלקיקי R-SiO2-TPZ הפגינו פעילות אנטי גליובלסטומה מצוינת in vivo

כדי לקבוע את היעילות הטיפולית של נויטרופילים CAR טעוני R-SiO2-TPZ NP, הוקם מודל xenograft באתרו של גליובלסטומה בעכברי NOD.Cg-RAG1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ (NRG) תוך שימוש בתאי לוציפראז המבטאים U87MG. עכברים נושאי גידול קיבלו תוך ורידי 5 × 106 נויטרופילים מדי שבוע (איור 7a), ונטל הגידול במארחים נמדד וכומת (איור 7b, c). בהשוואה לעכברים שטופלו ב-PBS או PB-neutrophils, טיפול ב-CAR-neutrophils ו-CAR neutrophil@R-SiO2-TPZ NPs האט ביעילות את צמיחת הגידול. CAR neutrophils@R-SiO2-TPZ NPs הציגו ציטוטוקסיות אנטי-גידולית גבוהה בהרבה מכל קבוצת ניסוי אחרת. להיפך, PB-נויטרופילים קידמו באופן משמעותי את צמיחת הגידול במוח, וכתוצאה מכך למותם של עכברים נושאי גידול כבר ביום 23 (איור 7d), מה שמצביע על כך שנויטרופילים לא מהונדסים עשויים להוות סיכונים נוספים. בשלב הבא מדדנו שחרור ציטוקינים אנושיים בפלזמה של קבוצות עכברים ניסיוניות שונות (איור 7ה). כל קבוצות הניסוי שאינן PBS ייצרו TNF ו-IL-6 ניתנים לזיהוי בפלזמה מהיום ה-5 עד היום ה-26, דבר המצביע על הפעלה של נויטרופילים אנושיים לאחר גירוי הגידול. בהתאם לקצב צמיחת הגידול הגבוה שנצפה, נויטרופילים ללא שינוי שחררו בהדרגה יותר IL-6 ו-TNF, מה שעלול להוביל לתסמונת שחרור ציטוקינים בחולים ולדרוש מחקרי בטיחות מעמיקים יותר עם חוסמי IL-646,47 . יש לציין כי CAR-neutrophils@RSiO2-TPZ NPs הראו ירידה ביכולת ייצור ציטוקינים בנקודות זמן מאוחרות יותר (יום 19 ויום 26), מה שמצביע על סיכון נמוך פוטנציאלי לתסמונת שחרור ציטוקינים בחולים שטופלו בכימותרפיה מבוססת CAR-נויטרופילים. התאימות הביולוגית של CAR-נויטרופילים משולבים ו-R-SiO2-TPZ NPs הוערכה באמצעות מדידה שבועית של משקלי גוף וניטור של שינויים פתולוגיים באיברים עיקריים של עכברים. לא נצפה הבדל במשקלי הגוף בין עכברים שטופלו ב- CAR neutrophils@R-SiO2-TPZ NP לבין כל קבוצת ניסוי אחרת (איור 7f), מה שמצביע על רעילות מערכתית מינימלית ותאימות ביולוגית מעולה של CAR-neutrophils@ R-SiO2-TPZ NPs בתוך 28 ימי טיפול. ניתוח היסטולוגי על איברים עיקריים שנחתכו מעכברים ביום 30 הראה שעכברים שטופלו ב-CAR-neutrophils@R-SiO2-TPZ NP לא גרמו לאי תקינות ניכרת או לנזק לאיברים בלב, בכבד, בטחול, בריאה ובכליה (איור משלים. 13), המאשר עוד יותר את הבטיחות של CAR-נויטרופילים משולבים ו-R-SiO2-TPZ NPs.

Fig. 4 | CAR-neutrophils loaded with R-SiO2-TPZ nanoparticles effectively kill glioblastoma cells. Representative images of immunological synapses indicated by polarized F-actin accumulation at the interface between CAR-neutrophils and tumor cells at 6, 12, and 24 h were shown. R-SiO2-TPZ nanoparticles released from CAR-neutrophils upon tumor cell phagocytosis were up-taken by tumor cells. Triplicates were performed independently. b Schematic of neutrophil-mediated anti-tumor cytotoxicity assay. Cytotoxicity against U87MG glioblastoma cells was performed at different ratios of neutrophil-to-tumor target using indicated neutrophils at 24 h (c), 36 h (d), 48 h (e), and 72 h (f). n = 3 biologically independent samples. Data are represented as mean ± SD, one-way analysis of variance (ANOVA). g Bulk RNA sequencing analysis was performed on U87MG cells under various conditions. Heatmap shows expression levels of selected cytoplasm, membrane, oxidative stress, apoptosis, and proliferation-related genes in the indicated glioblastoma cells. n = 2 biologically independent samples. Source data are provided as a Source Data file.

איור 4|CAR-נויטרופילים הטעונים בננו-חלקיקי R-SiO2-TPZ הורגים ביעילות תאי גליובלסטומה. הוצגו תמונות מייצגות של סינפסות אימונולוגיות שצוינו על ידי הצטברות F-actin מקוטבת בממשק בין CAR-נויטרופילים ותאי גידול ב-6, 12 ו-24 שעות. ננו-חלקיקי R-SiO2-TPZ ששוחררו מ-CAR-נויטרופילים לאחר פגוציטוזיס של תאי גידול נקלטו על ידי תאי הגידול. טריפליקטים בוצעו באופן עצמאי. ב סכימה של בדיקת ציטוטוקסיות אנטי-גידולית בתיווך נויטרופילים. ציטוטוקסיות כנגד תאי גליובלסטומה מסוג U87MG בוצעה ביחסים שונים של יעד נויטרופילים לגידול באמצעות נויטרופילים מצוינים ב-24 שעות (ג), 36 שעות (ד), 48 שעות (ה) ו-72 שעות (ו). n=3 דגימות בלתי תלויות ביולוגית. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SD, ניתוח חד כיווני של שונות (ANOVA). ניתוח רצף RNA בתפזורת בוצע על תאי U87MG בתנאים שונים. מפת חום מציגה רמות ביטוי של ציטופלזמה נבחרה, ממברנה, עקה חמצונית, אפופטוזיס וגנים הקשורים לשגשוג בתאי הגליובלסטומה המצוינים. n=2 דגימות בלתי תלויות ביולוגית. נתוני מקור מסופקים כקובץ נתוני מקור.

Fig. 5 | Functional evaluation of CAR-neutrophils loaded with R-SiO2-TPZ nanoparticles using biomimetic glioblastoma (GBM) models in vitro. a Schematic of our in vitro tumor model of GBM with blood-brain-barrier (BBB), which is composed of endothelial cells on the cell insert membrane and tumor cells in the bottom of the same transwell. b Transwell migration analysis of neutrophils at 12 h is shown. Anti-GBM cytotoxicity of indicated neutrophils at 24 h (c) and 36 h (d) was measured and quantified. e ELISA analysis of IL-6 and TNFα released from indicated neutrophils at 36 h was performed. f Second migration of different neutrophils at 48 h is shown. g Anti-GBM cytotoxicity of indicated neutrophils at 60 h was measured and quantified. h–j Schematic of neutrophil-infiltrated three-dimensional (3D) tumor model in vitro was shown in (h). Representative fluorescent images of infiltrated neutrophils in the 3D tumor models were shown. DAPI was used to stain the cell nuclear and CD45 was used to stain neutrophils. Scale bars, 200 μm. Biological triplicates were performed independently. j The corresponding tumor-killing ability of indicated neutrophils was measured and quanti- fied using a cytotoxicity kit. Data are represented as mean ± SD of five independent biological replicates, one-way analysis of variance (ANOVA). Source data are provided as a Source Data file.


איור 5|הערכה תפקודית של CAR-נויטרופילים הטעונים בננו-חלקיקי R-SiO2-TPZ תוך שימוש במודלים של גליובלסטומה ביומימטית (GBM) במבחנה. סכימה של מודל הגידולים במבחנה שלנו של GBM עם מחסום דם-מוח (BBB), המורכב מתאי אנדותל על קרום החדרת התא ותאי גידול בתחתית אותו טרנסוול. ב מוצג ניתוח נדידת Transwell של נויטרופילים ב-12 שעות. ציטוטוקסיות אנטי-GBM של נויטרופילים מסומנים ב-24 שעות (ג) ו-36 שעות (ד) נמדדה וכומתה. בוצע ניתוח ELISA של IL-6 ו-TNF ששוחררו מנויטרופילים מסומנים לאחר 36 שעות. מוצגת הגירה שנייה של נויטרופילים שונים ב-48 שעות. g ציטוטוקסיות אנטי-GBM של נויטרופילים מסומנים לאחר 60 שעות נמדדה וכומתה. h–j סכמטי של מודל גידול תלת מימדי (3D) חודר נויטרופילים במבחנה הוצג ב (h). הוצגו תמונות פלורסנט מייצגות של נויטרופילים שחדרו במודלים של גידול תלת מימד. נעשה שימוש ב-DAPI כדי לצבוע את גרעיני התא ו-CD45 שימש לצביעה של נויטרופילים. פסי קנה מידה, 200 מיקרומטר. השלשות ביולוגיות בוצעו באופן עצמאי. j היכולת המתאימה להרוג גידולים של נויטרופילים מסומנים נמדדה ונכמתה באמצעות ערכת ציטוטוקסיות. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SD של חמישה שכפולים ביולוגיים עצמאיים, ניתוח חד כיווני של שונות (ANOVA). נתוני מקור מסופקים כקובץ נתוני מקור.

בעוד CAR-neutrophil@R-SiO2-TPZ NPs האטו משמעותית את צמיחת הגידול בעכברי xenograft, ההבדל בהישרדות בעלי חיים בקבוצות ניסוי של CAR-נויטרופילים, SiO2-TPZ NPs ו-CAR-neutrophil@R-SiO2-TPZ NPs אינו משמעותי (p > 0.05), הנובעת אולי ממות נויטרופילים קצרי מועד במהלך הכנת התא והזרקה. לאחר מכן התמקדנו בשלוש הקבוצות הללו וקבענו אם מופחת זמן הכנת התא ומינונים מוגברים של CAR-נויטרופילים ותרופות ננו יעשו הבדל כלשהו בהישרדות בעלי חיים (איור 7g). במתן מערכתית 6 פעמים, CAR-neutrophil@R-SiO2-TPZ NPs עלו על שתי הקבוצות האחרות בהארכת תוחלת החיים של עכברים נושאי גידול (איור 7h), בעוד שההבדל בהישרדות בעלי חיים בקבוצות של CAR-נויטרופילים ו-SiO2- TPZ NPs נותרו חסרי משמעות. בעוד שעקומת הישרדות דומה של קבוצת R-SiO2- TPZ נצפתה בין שני מחקרים עצמאיים אלה בבעלי חיים, הפחיתה את הזמן בבידוד תאים ובהכנה להזרקה מ-4 שעות בסך הכל לשעה אחת במהלך 4 הנויטרופילים הראשונים מינונים הובילו לשיפור ההישרדות של בעלי חיים בקבוצות CAR-נויטרופילים לפני היום ה-32. ביחד, הנתונים שלנו הוכיחו את החשיבות של הכנת נויטרופילים ואופטימיזציה של מינון ביישומים קליניים עתידיים של תרופות נויטרופילים.

דִיוּן

נויטרופילים של עכברים הוכחו כנשא רב עוצמה המספק ננו-תרופות ביעילות לגידולי מוח מודלקים לאחר ניתוח8,9. ובכל זאת, ההיתכנות והבטיחות של שימוש בניוטרפילים אנושיים במתן תרופות נותרו חמקמקות. הכמות הגדולה של נויטרופילים עכברים (גבוהה פי 10 מהמספר הכולל של נויטרופילים במחזור בעכברים11) המשמשת במחקרים אלה להשגת תועלת טיפולית עשויה לעכב עוד יותר את התרגום הקליני שלהם שכן מיצוי של מספר גדול של נויטרופילים מחולי סרטן עלול להוביל לנויטרופניה ולפוזה. סיכונים אחרים. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, רתמנו את הכוח של חידוש עצמי של hPSCs בהשגת נויטרופילים אנושיים דה נובו בלתי מוגבלים29. פיתחנו מערכת אספקת תרופות בתיווך נויטרופילים רבת עוצמה עם CAR-engineering29 והשתמשנו בניוטרופילים CAR מהונדסים כננו-נשאים עם פעילות אנטי-גידולית בולטת. NPs של SiO2 מחוספסים עובדים טוב יותר מאשר NPs של SiO2 חלקים בנשאי CAR-נויטרופילים, בהתאם לתצפיות קודמות לפיהן נויטרופילים מעדיפים פגוציטים לפתוגנים מיקרוביאליים גסים30. דווח כי נויטרופילים מקדמים את השגשוג וההתקדמות של תאי גליומה48. ראינו אפקט פרו-גידולי דומה של נויטרופילים ללא שינוי במחקר שלנו בבעלי חיים, והדגיש את הצורך בהנדסת CCAR או שינויים אחרים בניוטרופילים כדי להבטיח את בטיחותם במתן תרופות ויישומים טיפוליים אחרים. יש לציין, אספקת התרופות בתיווך CAR-נוטרופילים שלנו תלויה אך ורק ביכולת המשיכה הכימית של GBM, אך לא באותות הדלקתיים המוגברים לאחר הניתוח, מה שמצביע על הספציפיות הגבוהה והפוטנציאל הטיפולי של מערכת מתן התרופות שלנו במיגור גליומות שחדרו עמוק. שלא ניתן להסיר בניתוח. מכיוון שכריתה כירורגית וכימותרפיה/רדיותרפיה משלימה הם ההתערבויות הקליניות העיקריות עבור GBM12, טיפול משולב עם ננו-נשאי נויטרופילים CAR וניתוח/רדיותרפיה עשוי להשיג יעילות טיפולית מיטבית ושווה בדיקה נוספת. מבני CAR ספציפיים לתאי T ו-NK כבר היו בשימוש נרחב כדי לשפר את הפעילות האנטי-גידולית של תאי T ו-NK, אך CARs ספציפיים לנויטרופילים המשפרים את הפונקציות האנטי-גידוליות של נויטרופילים לא תוארו. בעבר דווח כי קולטני חיסון כימריים CD4ζ ו-CD4 מגבירים את הציטוליזה של נויטרופילים כנגד תאים שעברו העברת HIVenv במבחנה. ובכל זאת, יעילות התמוגה הייתה רק ~10% ביחס של גורם למטרה (E:T) של 10:128. Fc RIIA (CD32a) הוא קולטן חוצה-ממברנה חד-שרשרת בעלת זיקה נמוכה ל-IgG מונומרי שבא לידי ביטוי גבוה בנויטרופילים (30,000 עד 60,000 מולקולות/תא31), והקשירה שלו גורמת ל-Fc - פונקציות תלויות בנויטרופילים, כגון שחרור תוכן גרגירים, ניוד Ca2+, ציטוטוקסיות אנטי-גידולית ופגוציטוזיס49. בהתחשב בתפקיד הבולט של CD32a בהפעלה ובתפקוד של נויטרופילים, תכננו ובדקנו מבני CAR מבוססי CD32a. עם זאת, התוצאות שלנו הוכיחו ש-CD3ζ מתווך ציטוליזה טובה משמעותית מ-CD32a כאשר היא מתבטאת בניוטרופילים שמקורם ב-hPSC, מה שעשוי להיות בחלקו בשל העותקים הגבוהים יותר של ITAMs ב-CD3ζ מאשר CD32a: שלושה עותקים ואחד, בהתאמה, ורמות ביטוי גבוהות יותר של ζ מאשר על פני התא של נויטרופילים28. כמו CD32a, Fc RIII (CD16b) הוא עוד קולטן בעל זיקה נמוכה ל-IgG מונומרי ומתבטא ברמה הרבה יותר גבוהה מ-CD32a על נויטרופילים31. בעוד שקישור צולב של CD16b רק גורם לגיוס Ca2+ ודגרנולציה, אך לא פגוציטוזיס וציטוליזה בניוטרופילים28,50, עדיין יהיה עניין במחקרים עתידיים לבצע השוואה שיטתית על היכולות של CD3ζ- ו-CD16b -CARs בהפעלה ושיפור פונקציות אנטי-גידוליות של נויטרופילים.

imageFig. 6 | In vivo distribution of CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ nanoparticles (NPs). a Schematic of intravenously administered Cy5-labeled CAR neutrophil@R-SiO2 NPs and R-SiO2 NPs for in vivo cell tracking study. 5 × 105 luciferase (Luci)-expressing U87MG cells were stereotactically implanted into the right forebrain of NRG mice. After 4 days, mice were intravenously treated with PBS, 5 × 106 Cy5-labeled CAR neutrophil@R-SiO2 NPs and R-SiO2 NPs. b Time-dependent biodistribution of Cy5+ neutrophils in the whole body, brain, and other organs was determined and quantified by fluorescence imaging at the indicated hours. c Biodistribution of CAR neutrophil@R-SiO2 NPs and R-SiO2 NPs in mice at 24 h post-injection was analyzed by inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) based on Si element, and data was expressed as the percentage of injected dose per gram of tissue (%ID/g). n = 5 biologically independent samples. Data are represented as mean ± SD. Source data are provided as a Source Data file. d Representative fluorescence images of CD45 and SiO2 in the indicated glioblastoma xenografts isolated from tumor-bearing mice were shown. Scale bars, 100 μm. Biological triplicates were performed independently.

איור 6|הפצה in vivo של ננו-חלקיקי R-SiO2-TPZ (NPs) המועברים על ידי נויטרופילים מסוג CAR. סכימה של Cy5- המסומן תוך ורידי CAR neutrophil@R-SiO2 NPs ו-R-SiO2 NPs למחקר מעקב אחר תאים in vivo. תאי U87MG המבטאים 5 × 105 לוציפראז (Luci) הושתלו באופן סטריאוטקטי במוח הקדמי הימני של עכברי NRG. לאחר 4 ימים, עכברים טופלו תוך ורידי ב-PBS, 5 × 106 Cy5- שסומנו CAR neutrophil@R-SiO2 NPs ו-R-SiO2 NPs. ב הפצה ביולוגית תלוית זמן של נויטרופילים Cy5+ בכל הגוף, המוח ואיברים אחרים נקבעה וכומתה על ידי הדמיית פלואורסצנציה בשעות המצוינות. c חלוקה ביולוגית של CAR neutrophil@R-SiO2 NPs ו-R-SiO2 NPs בעכברים ב-24 שעות לאחר ההזרקה נותחה על ידי ספקטרומטריית פליטה אופטית פלזמה משולבת אינדוקטיבית (ICP-OES) המבוססת על אלמנט Si, והנתונים הובאו כאחוז של מינון מוזרק לגרם רקמה (%ID/g). n=5 דגימות בלתי תלויות ביולוגית. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SD. נתוני מקור מסופקים כקובץ נתוני מקור. ד הוצגו תמונות קרינה מייצגות של CD45 ו- SiO2 ב-xenografts glioblastoma המצוינים מבודדים מעכברים נושאי גידול. מוטות קנה מידה, 100 מיקרומטר. השלשות ביולוגיות בוצעו באופן עצמאי.

Fig. 7 | In vivo anti-tumor activities of combinatory CAR-neutrophils and R-SiO2-TPZ nanoparticles (NPs) were assessed via intravenous injection. a Schematic of intravenously administered PBS, PB-neutrophils, CAR-neutrophils, and CAR-neutrophil@ R-SiO2-TPZ NPs for in vivo tumor-killing study. 5 × 105 luciferase (Luci)-expressing U87MG cells were stereotactically implanted into the right forebrain of NRG mice. After 4 days, mice were intravenously treated with indicated neutrophils weekly for a month. Time-dependent tumor burden was determined (b) and quantified (c) by bioluminescent imaging (BLI) at the indicated days. Data are mean ± SD for mice in (b) (n = 5), one-way analysis of variance (ANOVA). d Kaplan-Meier curve demonstrating survival of indicated experimental groups (n = 5) was shown. Released human tumor necrosis factor-α (TNFα) and IL-6 in the peripheral blood (e) and body weight (f) of different mouse groups were measured at the indicated days. Data are mean ± SD, n = 5 biologically independent samples. g, h Anti-tumor activity of increased dosage frequencies of CAR-neutrophils and RSiO2-TPZ NPs was assessed. g Schematic of intravenously administered CAR-neutrophils, R-SiO2-TPZ NPs, and CAR-neutrophil@ R-SiO2-TPZ NPs for in vivo tumor killing study. h Kaplan-Meier curve demonstrating survival of indicated experimental groups was shown (n = 5). Kaplan–Meier curves were analyzed by the log-rank test. Source data are provided as a Source Data file.


איור 7|פעילויות אנטי-גידוליות של CAR-נוטרופילים משולבים וננו-חלקיקי R-SiO2-TPZ (NPs) הוערכו באמצעות הזרקה לווריד. סכימה של PBS, PB-נויטרופילים, CAR-neutrophils ו-CAR-neutrophil@ R-SiO2-TPZ NPs הניתנים תוך ורידי למחקר הרג גידולים in vivo. תאי U87MG המבטאים 5 × 105 לוציפראז (Luci) הושתלו באופן סטריאוטקטי במוח הקדמי הימני של עכברי NRG. לאחר 4 ימים, עכברים טופלו תוך ורידי בניוטרופילים מסומנים מדי שבוע במשך חודש. נטל הגידול תלוי בזמן נקבע (ב) וכומת (ג) על ידי הדמיה ביולוגית (BLI) בימים המצוינים. הנתונים הם ממוצע ± SD עבור עכברים ב-(ב) (n=5), ניתוח חד כיווני של שונות (ANOVA). ד הוצגה עקומת קפלן-מאייר המדגימה הישרדות של קבוצות ניסוי מסומנות (n=5). גורם נמק של גידולים אנושיים (TNF) ו-IL-6 ששוחררו בדם ההיקפי (e) ומשקל הגוף (f) של קבוצות עכברים שונות נמדדו בימים המצוינים. הנתונים הם ממוצע ± SD, n=5 דגימות בלתי תלויות ביולוגית. g, h פעילות אנטי-גידולית של תדרי מינון מוגברים של CAR-נויטרופילים ו-RSiO2-TPZ NPs הוערכה. g סכימה של CAR-neutrophils, R-SiO2-TPZ NPs ו-CAR-neutrophil@ R-SiO2-TPZ NPs הניתנים תוך ורידי למחקר הרג גידולים in vivo. h הוצגה עקומת קפלן-מאייר המדגימה הישרדות של קבוצות ניסוי מצוינות (n=5). עקומות קפלן-מאייר נותחו על ידי מבחן ה-log-rank. נתוני מקור מסופקים כקובץ נתוני מקור.

הצגנו כאן גם פלטפורמת אספקת תרופות נויטרופילים מודולרית ורב-תכליתית של hPSC שעשויה להיות מתוכננת מחדש ומכווננת בעתיד כדי לתמוך במאמצים אחרים מבוססי נויטרופילים לטיפול במחלות אנושיות אחרות. ראשית, הנדסת CAR נגישה יותר ב-hPSCs מאשר בתאי T חיסוניים ראשוניים ובנויטרופילים. זה דורש רק עריכת גנום חד פעמית כדי להשיג ביטוי יציב והומוגני של CARs שונים29. בנוסף ל-CLTX CARs, בנינו גם קווי hPSC יציבים המבטאים אנטי-פלואורסצין אוניברסלי (FITC)51 או אנטי-PD-L1 CAR52, את שניהם ניתן לרתום כדי להשיג ננו-נשאי CAR-נוטרופילים אוניברסליים המכוונים לגידול מוצק. שינויים גנטיים אחרים, כגון פיברוזיס המכוונים נגד FAP CARs53, יכולים להתבצע גם כדי להפנות ננו-נשאי נויטרופילים לטיפול במחלות ניווניות קטלניות, כולל טראומה מוחית ופיברוזיס לבבי. יתר על כן, hPSCs המבטאים CAR יכולים להיות מותאמים בקלות לייצור תאי CAR-T או CAR-NK29, ושילובים של טיפולים אימונותרפיים אלה עם ננו-נשאי CAR-נויטרופיל עשויים להשיג יתרונות טיפוליים אופטימליים נגד גידולים. לבסוף, מערכת הננו-תרופות המגיבה לגידול גלוטתיון (GSH) שלנו היא פלטפורמה מודולרית ורב-תכליתית לטעינת תרופות כימותרפיות או רדיואקטיביות מבטיחות ל-CAR-נויטרופילים למתן תרופות ממוקדות, כפי שמדגים TMZ קליני, JNJ64619187 ו-TPZ פרו-תרופה. מחקרים עתידיים על בדיקת ננו-חלקיקים אחרים עשויים להניב טעינת תרופות אופטימלית בנייטרופילים ולהשיג יעילות טיפולית מירבית in vivo.

בעוד שהדגמנו את התפיסה הטיפולית של שימוש ב-CAR-נויטרופילים כדי לספק באופן ספציפי ויעיל תרופות כימיות לגידולי מוח ברחבי BBB, ישנן מספר מגבלות במחקר זה. ראשית, ייתכן שחיסון תאי גידול ביום 4-לא יהיה מספיק כדי לבסס גידולים המחקים את התרחיש הקליני לחקירה טיפולית, ועבודה עתידית עם תקופות חיסון שונות של גידולים נחוצה כדי לשחזר את השלבים השונים של התפתחות גליובלסטומה והתגובה הטיפולית בשונות חולים54,55. שנית, העכברים הסובלים מחסר חיסוני בהם השתמשנו כאן חסרים חסינות אדפטיבית, ומודלים פרה-קליניים אחרים עם מערכת חיסון שלמה, כמו כלבי מחמד עם גליומה ספונטנית56, נחוצים כדי להעריך טוב יותר את הבטיחות והיעילות של CAR-נויטרופילים המיוצרים במבחנה. במיוחד, יש צורך בפרופיל רעילות מחוץ למטרה של CAR-נויטרופילים עם או בלי העמסת תרופות ננו בבעלי חיים מוזלפים, כולל תסמונת שחרור ציטוקינים, נוירוטוקסיות ורעילות מחוץ לגידול מחוץ למטרה שנצפו בתאי CAR-T57, למרות תוחלת החיים הקצרה. של נויטרופילים. בעוד שגישות אפשריות, כגון הנדסת תורם אוניברסלי היפואימוניגני hPSCs58-61 וספריות hPSC הומוזיגוטיות של אנטיגן לויקוציטים אנושיים (HLA)62, זמינות בקלות כדי למנוע את הסיכון הפוטנציאלי למחלת שתל מול מארח (GvHD), מודלים של בעלי חיים פרה-קליניים עם עדיין יש צורך במערכת חיסונית שלמה כדי להעריך את פוטנציאל התרגום של תרופות הנויטרופילים שלנו. לבסוף, נצפתה ציטוטוקסיות מוגבלת נגד גידולים והארכת תוחלת החיים של בעלי חיים של תרופות ננוטרופיליות מסוג CAR-נויטרופיל. לכן, חקירה עתידית של תרופות כימותרפיות יעילות יותר או חומרי רגישות לרדיו, וטיפולים משולבים עם CAR-T קלאסי וכריתה כירורגית חיונית להשגת יעילות מירבית נגד גידולים של תרופות CAR-נויטרופילים. לדוגמה, מחקר שנערך לאחרונה על תכנון מבוסס מנגנון הוביל לתרופה יעילה יותר KL-50 שמתגברת על עמידות נרכשת כפי שנצפתה בתרופת TMZ קלינית 63 ובכך יכולה להיות משולבת בפלטפורמת הננו-נוטרופילים המודולרית שלנו CAR-נוטרופילים עבור פוטנציאל יעילות טיפולית טובה יותר. הארכת חיי המדף של נויטרופילים ל-5 ימים באמצעות טיפול ב-CLON-G (קספאזות-פרמיביליזציה של קרום ליזוזומלי-חמצון-נקרופטוזיס בתוספת גורם מגרה מושבה גרנולוציטים64) ו/או שימוש במערכת שחרור תרופות מבוקרת לטווח ארוך יותר ב-CAR-נויטרופילים. להשיג יעילות אנטי-גידולית מתמשכת in vivo לאחר אפופטוזיס נויטרופילים. ביחד, הממצאים שלנו הוכיחו בבירור שנויטרופילים CAR טעוני R-SiO2-TPZ יכולים לקיים את הפנוטיפ האנטי-גידולי N1 ולהרוג ביעילות תאי גידול בתנאים שונים דמויי נישה של הגידול במבחנה. CAR-נויטרופילים פונקציונליים יכולים להיות מיוצרים בכמויות גדולות מ-hPSCs מהונדסים כדי לספק במדויק תרופות ננו המגיבות למיקרו-סביבה לגידול למיקוד GBM in vivo, מה שמוביל לכימותרפיה כימותרפית משולבת עם פעילויות אנטי-GBM חזקות וספציפיות ואספקת תרופות מינימלית מחוץ למטרה. תוחלת חיים ממושכת בעכברים נושאי גידול.

הפניות

1. Yang F. et al. אימונותרפיה סינרגטית של גליובלסטומה על ידי מיקוד כפול של IL-6 ו-CD40. נאט. Commun. 12, 3424 https://doi.org/ 10.1038/s41467-021-23832-3 (2021).

2. Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C. & Weller, M. מצב נוכחי של אימונותרפיה לגליובלסטומה. נאט. כומר קלינ. אונקול. 15, 422–442 (2018).

3. Agliardi, G. et al. אספקת IL-12 תוך-גידולית מעצימה אימונותרפיה של תאי CAR-T במודל פרה-קליני של גליובלסטומה. נאט. Commun. https://doi.org/10.1038/s41467-020-20599-x (2021).

4. Németh, T., Sperandio, M. & Mócsai, A. Neutrophils כמטרות טיפוליות מתעוררות. נאט. Rev. Drug Discov. https://doi.org/10.1038/ s41573-019-0054-z (2020).

5. Subhan, MA & Torchilin, VP Neutrophils כיעד טיפולי מתפתח וכלי לטיפול בסרטן. Life Sci. https://doi.org/ 10.1016/j.lfs.2021.119952 (2021).

6. Cheng, YH, He, C., Riviere, JE, Monteiro-Riviere, NA & Lin, Z. מטה-אנליזה של משלוח ננו-חלקיקים לגידולים תוך שימוש בגישת מודלים וסימולציה פרמקוקינטית מבוססת פיזיולוגית. ACS Nano 14, 3075–3095 (2020).

7. Wilhelm, S. et al. ניתוח של משלוח ננו-חלקיקים לגידולים. נאט. כומר מאטר. 1, 1–12 (2016).

8. Xue, J. et al. מתן תרופות אנטי סרטניות בתיווך נויטרופילים לדיכוי הישנות גליומה ממאירה לאחר ניתוח. נאט. ננו-טכנול. 12, 692–700 (2017).

9. Wu, M. et al. מעקב הדמיית MR של נויטרופילים מהונדסים הניתנים להפעלה של דלקת לטיפול ממוקד בגליומה שטופלה בניתוח. נאט. Commun. 9, 1–13 (2018).

10. Chu, D., Dong, X., Zhao, Q., Gu, J. & Wang, Z. תחול פוטוסנסיטיזציה של מיקרו-סביבות גידול משפר את האספקה ​​של ננו-תרפיה באמצעות חדירת נויטרופילים. עו"ד מאטר. 29, (2017).

11. Osuka, S. & Van Meir, EG טיפול בסרטן: תנועה של נויטרופילים בננו-תרופות לסרטן. נאט. ננו-טכנול. 12, 616–618 (2017).

12. Lin, YJ, Wei, KC, Chen, PY, Lim, M. & Hwang, TL תפקידים של נויטרופילים בגליומה וגרורות במוח. חֲזִית. אימונול. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.701383 (2021).

13. פרידלנדר, ז' ואח'. קיטוב של פנוטיפ נויטרופילים הקשור לגידול על ידי TGF-beta: "N1" לעומת "N2" TAN. תא סרטן (2009).

14. Blaisdell, A. et al. נויטרופילים מתנגדים לקרצינוגנזה של אפיתל רחם באמצעות פירוק של תאי גידול היפוקסיים. תא סרטן 28, 785–799 (2015).

15. Mahiddine, K. et al. הקלה על היפוקסיה של הגידול משחררת את הפוטנציאל של קוטל הגידולים של נויטרופילים. ג'יי קלין. Invest 130, 389–403 (2020).

16. Yan, J. et al. נויטרופילים פולימורפו-גרעיניים אנושיים מזהים באופן ספציפי תאים סרטניים והורגים אותם. Oncoimmunology 3, e950163 (2014).

17. Jaillon, S. et al. מגוון נויטרופילים ופלסטיות בהתקדמות הגידול ובטיפול. נאט. Rev. Cancer 20, 485–503 (2020).

18. לי X. et al. התקדמות מחקר על תאי גזע גליומה במיקרו-סביבה החיסונית של גליומה. חֲזִית. פרמקול. https://doi.org/10. 3389/fphar.2021.750857 (2021).

19. Gieryng A., Pszczolkowska, D., Walentynowicz, KA, Rajan, WD & Kaminska, B. Immune microenvironment of gliomas. מַעבָּדָה. תחקור. https://doi.org/10.1038/labinvest.2017.19 (2017).

20. יונג E. et al. פלסטיות של תאי גידול, הטרוגניות ועמידות בנישות מיקרו-סביבתיות חיוניות בגליומה. נאט. Commun. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21117-3 (2021).

21. Dunn GP et al. אימונותרפיות מתפתחות לגליומה ממאירה: מאימונוגנומיקה לטיפול בתאים. נוירו. אונקול. (2020). https://doi.org/10.1093/neuonc/noaa154

22. Yee PP et al. פרופטוזיס הנגרמת על ידי נויטרופילים מעודדת נמק גידול בהתקדמות גליובלסטומה. נאט. Commun. 11, (2020).

23. שגיב, JY et al. גיוון פנוטיפי ופלסטיות בתת-אוכלוסיות נויטרופילים במחזור בסרטן. Cell Rep. 10, 562–573 (2015).

24. Li, Y., Hermanson, DL, Moriarity, BS & Kaufman, DS תאי רוצח טבעיים שמקורם ב-iPSC מהונדסים עם קולטני אנטיגן כימריים משפרים פעילות אנטי-גידולית. Cell Stem Cell 23, 181–192.e5 (2018).

25. Kim, GB et al. תאי CAR T ממוקדי אינטרלוקין-13 בעלי זיקה גבוהה, משפרים את האספקה ​​של ננו-חלקיקים ניאון-ביולוגיים מתכלים לגליובלסטומה. ביואקט. מאטר. 5, 624–635 (2020).

26. Nguyen, V. et al. מערכת חדשנית לאספקת ליגנדים להמחשה לא פולשנית ולניצול טיפולי של הסמן הביולוגי מוגבל הגידול IL13R 2. נוירו. אונקול. 14, 1239–1253 (2012).

27. Wang D. et al. תאי CAR T מכווני כלורוטוקסין למיקוד ספציפי ואפקטיבי של גליובלסטומה. Sci. תרגום Med. 12, (2020).

28. Roberts, MR et al. ציטוליזה ספציפית לאנטיגן על ידי נויטרופילים ותאי NK המבטאים קולטנים חיסוניים כימריים הנושאים תחומי איתות זטה או גמא. J. Immunol. 161, 375–384 (1998).

29. Chang, Y. et al. הנדסת נויטרופילים קולטן אנטיגן כימרי מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים עבור אימונותרפיה ממוקדת לסרטן. נציג תא 40, 111128 (2022).

30. Safari H. et al. נויטרופילים מעדיפים phagocytose חלקיקים מוארכים הזדמנות למיקוד סלקטיבי במחלות דלקתיות חריפות. Sci. עו"ד 6, (2020).

31. Wang, Y. & Jönsson, F. ביטוי, תפקיד וויסות של קולטני Fc נויטרופילים. חֲזִית. אימונול. https://doi.org/10.3389/fimmu. 2019.01958 (2019).

32. Németh T. et al. חשיבות הקולטן ל-fc-שרשרת ITAM טירוזינים בהפעלת נויטרופילים ודלקת מפרקים אוטואימונית in vivo. חֲזִית. אימונול. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.00252 (2019).

33. תפקיד הצורות הפולימורפיות של נויטרופילים Fc RIIa (CD32) ו-Fc RIIIb (CD16) בפאגוציטוזיס של חיידקים ואריתרוציטים אנושיים מסוג IgG1- ו-IgG3-. עירוי. Med. Rev. https://doi.org/10.1016/ s0887-7963(05)80094-x (1995).

34. Tsuboi, N., Asano, K., Lauterbach, M. & Mayadas, TN קולטני Fc נויטרופילים אנושיים מתחילים וממלאים תפקידים מיוחדים שאינם מיותרים במחלות דלקתיות המתווכות בנוגדנים. חֲסִינוּת. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2008.04.013 (2008).

35. Chang, Y. et al. יצירה מוגדרת כימית של אנדותל המוגני אנושי ותאי אבות המטופואטיים סופיים. Biomaterials 285, 121569 (2022).

36. Brok-Volchanskaya, VS et al. יצירה יעילה ומהירה של נויטרופילים פונקציונליים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים באמצעות ETV2-mRNA שונה. נציג תאי גזע 13, 1099–1110 (2019).

37. Emami Nejad A. et al. תפקידה של היפוקסיה במיקרו-סביבה של הגידול ופיתוח תאי גזע סרטניים: גישה חדשה לפיתוח טיפול. Cancer Cell Int. https://doi.org/ 10.1186/s12935-020-01719-5 (2021).

38. Lequeux A. et al. השפעת המיקרו-סביבה של הגידול ההיפוקסי והפלסטיות של תאי הגידול על הביטוי של נקודות ביקורת חיסוניות. סרטן Lett. (2019). https://doi.org/10.1016/j.canlet.2019.05.021 39. Takano, T., Sada, K. & Yamamura, H. תפקידו של חלבון-טירוזין קינאז Syk באיתות מתח חמצוני בתאי B. אות חיזור נוגדי חמצון. https://doi.org/10.1089/15230860260196335 (2002).

40. Zhang J. et al. איתות סלולרי בתיווך ROS ו-ROS. אוקסידאט. Med. תָא. אֲרִיכוּת יָמִים. https://doi.org/10.1155/2016/4350965 (2016).

41. Kawakami Y. et al. מסלול הפעלת Ras תלוי בזרחון Syk של protein kinase C. Proc. נאטל. אקד. Sci. ארה"ב. https://doi.org/10.1073/pnas.1633695100 (2003).

42. Mócsai, A., Ruland, J. & Tybulewicz, VLJ The SYK טירוזין קינאז: שחקן מכריע בתפקודים ביולוגיים מגוונים. נאט. כומר אימונול. https://doi.org/10.1038/nri2765 (2010). 43. Liu B. et al. ננו מרוכב מגיב לגידולים-מיקרו-סביבה עבור גז מימן גופרתי וטיפול דינמי באנזים משופר טרימודאלי. עו"ד מאטר. https://doi.org/10.1002/adma. 202101223 (2021).

44. Nguyen, GT, Green, ER & Mecsas, J. Neutrophils to the ROScue: מנגנונים של הפעלת NADPH אוקסידאז ועמידות חיידקים. חֲזִית. תָא. לְהַדבִּיק. מיקרוביול. https://doi.org/10.3389/fcimb.2017. 00373 (2017).

45. Che J. et al. נויטרופילים מאפשרים משלוח ליפוזום מקומי ולא פולשני לשריר השלד המודלק וללב איסכמי. עו"ד מאטר. 32, (2020).

46. ​​Le, RQ et al. סיכום אישור ה-FDA: tocilizumab לטיפול בתסמונת שחרור ציטוקינים חמורה או מסכנת חיים של קולטן אנטיגן כימרי הנגרמת על ידי תאי T. אונקולוג 23, 943–947 (2018).

47. מוריס, EC, Neelapu, SS, Giavridis, T. & Sadelain, M. תסמונת שחרור ציטוקינים ונוירוטוקסיות קשורה באימונותרפיה של סרטן. נאט. כומר אימונול. 22, 85–96 (2022).

48. Liang, J. et al. נויטרופילים מקדמים את הפנוטיפ הגליומה הממאיר דרך S100A4. קלינ. Cancer Res. 20, 187–198 (2014).

49. Nagarajan S. et al. ויסות ספציפי לתא, תלוי הפעלה של תפקוד קושר ליגנד נויטרופילים CD32A. דם https://doi.org/ 10.1182/blood.v95.3.1069.003k14_1069_1077 (2000).

50. Fanger, MW, Shen, L., Graziano, RF & Guyre, PM ציטוטוקסיות המתווכת על ידי קולטני Fc אנושיים ל-IgG. אימונול. היום. https:// doi.org/10.1016/0167-5699(89)90234-X (1989).

51. Lee, YG et al. ויסות רעילות דמוית תסמונת שחרור ציטוקינים בתיווך תאי CAR T באמצעות מתאמים במשקל מולקולרי נמוך. נאט. Commun. 10, 2681 (2019).

52. Kagoya, Y. et al. קולטן אנטיגן כימרי חדש המכיל תחום איתות JAK-STAT מתווך השפעות אנטי-גידול מעולות. נאט. Med. 24, 352–359 (2018).

53. Aghajanian H. et al. מיקוד לפיברוזיס לבבי באמצעות תאי T מהונדסים. טֶבַע. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1546-z (2019).

54. Zhang C. et al. ErbB2/HER2-תאי NK ספציפיים לטיפול ממוקד בגליובלסטומה. J. Natl. סרטן אינסט. https://doi.org/10.1093/jnci/ djv375 (2016).

55. Akhavan D. et al. תאי CAR T לגידולי מוח: לקחים והדרך קדימה. אימונול. Rev. https://doi.org/10.1111/imr.12773 (2019).

56. עומר, נ.ב. ואח'. נתוני בטיחות והישרדות ביניים לאחר מתן תוך גולגולתי של M032, HSV אונקוליטי מהונדס גנטית המבטא IL-12, בכלבי מחמד עם גליומות ספורדיות. נוירוכירורג. פוקוס 50, 1–11 (2021).

57. Larson, RC & Maus, MV התקדמות ותגליות אחרונות במנגנונים ובפונקציות של תאי CAR T. נאט. כומר סרטן 21, 145–161 (2021).

58. Wang, B. et al. יצירת תאי T היפואימונוגניים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מהונדסים גנטית אלוגניים אנושיים. נאט. ביומד. Eng. 5, 429–440 (2021).

59. Deuse, T. et al. נגזרות היפואימונוגניות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים מתחמקות מדחייה חיסונית אצל נמענים אלוגניים בעלי יכולת חיסונית מלאה. נאט. ביוטכנולוגיה. 37, 252–258 (2019).

60. האן X. et al. יצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים היפואימוניים אנושיים. https://doi.org/10.1073/pnas.1902566116

61. Kwon YW et al. עריכת גנום HLA DR עם TALENs ב-iPSCs אנושיים יצרה תאים דנדריטים עמידים למערכת החיסון. Stam Cells Int. https://doi.org/10.1155/2021/8873383 (2021).

62. Morizane A. et al. התאמת MHC משפרת את ההשתלה של נוירונים שמקורם ב-iPSC בפרימטים לא אנושיים. נאט. Commun. https://doi. org/10.1038/s41467-017-00926-5 (2017).

63. Lin, K. et al. תכנון מבוסס מנגנון של תרופות המכוונות באופן סלקטיבי לגליומה עמידה לתרופות. Sci. (80-.) 377, 502–511 (2022).

64. אוהד י' ואח'. התמקדות במספר מסלולי מוות של תאים מאריכה את חיי המדף ומשמרת את תפקודם של נויטרופילים של בני אדם ועכברים לעירוי. Sci. תרגום Med. 13, (2021).

65. Chang Y. et al. אינדיקטורים פלורסנטיים לדיווח רציף וספציפי לשושלת של שלבי מחזור התא בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. ביוטכנולוגיה. ביואנג. bit.27352. https://doi.org/10.1002/bit. 27352 (2020).

66. יונג, ג' ואח'. הדור מוגדר כימית של תאי גזע ואב ההמטופואטיים אנושיים. STAR פרוטוק. 4, 101953 (2023).

אולי גם תרצה