4.2. ריבוי במבחנה

ריבוי במבחנה, או ריבוי מיקרו הוא גרסה של אופן הריבוי הווגטטיבי המושג באמצעות explants שמקורם בצמחים המטופחים בתנאים אספטיים במבחנה [87]. הוא מציע את האפשרות לייצר מספר רב של צמחים שניתן לחקור לצורך מיצוי של מטבוליטים יקרי ערך תוך הפחתת ניצול יתר של מינים פראיים ובסכנת הכחדה [88]. השימוש בצמחים מובחנים (צמחים מופצים במיקרו) הוא חובה כאשר המולקולה הביו-אקטיבית מיוצרת אך ורק באיברים או רקמות צמחים מיוחדים (למשל, שמנים אתריים). יתרון נוסף של השימוש בצמחים המופצים במבחנה קשור ליציבותם ולתפוקות גבוהות יותר של מטבוליטים משניים. השימוש במערכות תרבית חוץ גופית מאפשר ייצור ללא תלות באילוצים עונתיים ובידוד מהיר ויעיל של המולקולה הביו-אקטיבית הממוקדת, יחד עם האמינות והחיזוי של הייצור [25].

גליקוזיד של cistanche יכול גם להגביר את הפעילות של SOD ברקמות הלב והכבד, ולהפחית באופן משמעותי את תכולת הליפופוסצין וה-MDA בכל רקמה, תוך ניקוי יעיל של רדיקלי חמצן תגובתיים שונים (OH-, H₂O₂ וכו') ומגן מפני נזקי DNA הנגרמים על ידי OH-רדיקלים. לגליקוזידים פנילתנואידים של Cistanche יש יכולת ניקוי חזקה של רדיקלים חופשיים, יכולת צמצום גבוהה יותר מאשר ויטמין C, משפרים את פעילות ה-SOD בתרחיף זרע, מפחיתים את תכולת ה-MDA ובעלי השפעה הגנה מסוימת על תפקוד קרום הזרע. פוליסכרידים של Cistanche יכולים להגביר את הפעילות של SOD ו-GSH-Px באריתרוציטים וברקמות ריאה של עכברים מתבגרים שנגרמו על ידי D-galactose, כמו גם להפחית את תכולת ה-MDA והקולגן בריאה ובפלזמה, ולהגדיל את תכולת האלסטין. אפקט ניקוי טוב על DPPH, הארכת זמן ההיפוקסיה בעכברים מזדקנים, שיפור הפעילות של SOD בנסיוב, ועיכוב ניוון פיזיולוגי של ריאות בעכברים מזדקנים בניסוי. עם ניוון מורפולוגי תאי, ניסויים הראו כי ל-Cistanche יש יכולת נוגדת חמצון טובה ובעלת פוטנציאל להיות תרופה למניעה וטיפול במחלות הזדקנות העור. יחד עם זאת, לאכינאקוסיד ב-Cistanche יש יכולת משמעותית לנקות רדיקלים חופשיים של DPPH והוא יכול לנקות מיני חמצן תגובתיים, למנוע פירוק קולגן הנגרמת על ידי רדיקלים חופשיים, וכן יש לו אפקט תיקון טוב על נזקי אניון רדיקלים חופשיים של תימין.

לחץ על מחסן cistanche Chemist

【למידע נוסף:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

כמה מחקרים הצביעו על היעילות של ריבוי במבחנה במונחים של ייצור של תרכובות ביו-אקטיביות. גויאל וחב'. (2013) מצאו כי שיבוטי אוכמניות נמוכים שהושגו באמצעות מיקרו-ריבוי הציגו תכולת פלבנואידים ופנולים גבוהים יותר בהשוואה לאלו שפותחו בשיטת הריבוי המקובלת [89]. ממצאים דומים דווחו אצל Ziziphora senior L. על ידי Dakah et al. (2014) [90]. המחברים מצאו שתמציות צמחים המופצות במבחנה של Ziziphora senior L. הראו יכולת ניקוי רדיקלית גבוהה יותר מאשר צמחי בר. הם גם הסבירו את ההבדל הבולט הזה על ידי תנאי הלחץ המתעוררים באמצעות הקמת תרבית חוץ גופית או נוכחות של מווסת צמיחה של צמחים, שיכולים להיות בעלי השפעה מעוררת על ייצור פוליפנולים [90]. Huperzia serrata, עשב מסורתי חשוב בתרבות הסינית, ידוע כמייצר תרכובת בעלת ערך, Huperzine A (HupA). תמציות Huperzia serrata שהתקבלו מצמחים המופצים במיקרו הציגו פעילות נוגדת חמצון מוגברת. עם זאת, הייצור של HupA נשאר נמוך יותר בצמחים המופצים במיקרו מאשר בצמחי הבר. תכולת היפריצין גדלה לאחר מכן בתמציות צמחים המופצות במיקרו של Hypericum hookerianum בהשוואה לתמצית שנוצרה מצמחי בר [91]. בתרבית חוץ-גופית של Salvia officinalis, אבייטן דיטרפן זוהה רק בתרביות יריות אך לא בתרחפי תאים, יבלות או שורשים שעירים [92]. למרות האמור לעיל, במקרים מסוימים, ההרכב הפנולי ופעילות נוגדת החמצון יכולים להיות נמוכים יותר בצמחים המופצים במיקרו בהשוואה לצמחי בר, ​​כמו ב-Cichorium pumilum Jacq [93], Caralluma tuberculata [94] ו-Alocasia longiloba Miq [95] .

4.3. קלוגנזה ותליית תאים

צמחים מראים פלסטיות התפתחותית ראויה לציון עבור התמיינות תאים, שכן היא המאפיין העיקרי של תאי צמחים. בשל תכונה יוצאת דופן זו, צמחים יכולים ליצור מסות תאים לא מאורגנות, המכונה יבלות, בתגובה לאילוצים סביבתיים, ככל הנראה פלישת פתוגנים או נזק פיזי [96]. הקמת תרבות קאלוס מסתמכת בעיקר על ביטול ההבחנה של תאים. ניתן להגדיר זאת כתהליך שבו תאים בוגרים או מיוחדים מאבדים את אופיים המובחן והופכים לנוער (לא מובחנים) [97].

באמצעות העברתם למדיום נוזלי, גושי תרבית קאלוס יכולים להתפרק לחתיכות קטנות, אגרגטים, או אפילו תאים בודדים, ובכך מושגות תרביות תרחיף תאים. קאלוס הוא בדרך כלל הטרוגני. תרחפי תאים הם מקור פוטנציאלי לתרכובות ביו-אקטיביות שמקורן בצמחים בעלי ערך גבוה [97,98]. השעיות תאים מקיפות אוכלוסיית תאים הומוגנית, המייצרת מווסת תזונה אחידה ומהירה לצמיחה של צמחים. הם גם מתאימים בקלות למספר אסטרטגיות ביוטכנולוגיות כגון elicitation, האכלה מבשרי, והמרה ביולוגית או ביולוגית, כמו גם ייצור המוני בביוראקטורים (הגדלה) [7]. מספר תרכובות ביו-אקטיביות חשובות שמקורן בצמח הופקו תוך שימוש בטכנולוגיות קלוגנזה והשעיית תאים, לפיהן רובן הושגו באמצעות תרחפי תאים [98]. ה-PDBCs העיקריים שיוצרו באמצעות תרחיפים של תאים הם Echinan 4 P, Acetos 10 P, Teoside 10 ו- Teupol 50 P [99,100].

מחקרים רבים דיווחו על היעילות של תרחפי תאים לייצור תרכובות ביו-אקטיביות רצויות. לדוגמה, ייצור ג'ינסנוסיד הושג באמצעות תרחפי תאי Panax quinquefolium שפותחו במדיום MS בנוכחות 1 מ"ג/ליטר של 2.4-חומצה דיכלורפנוקסיאצטית ו-0.25 מ"ג/ליטר של קינטין [1 01]. ייצור Shikonine הוערך מתרחפי תאים של Onosma bublotrichum במדיום MS בתוספת של 0.2 מ"ג/ליטר של IAA ו-2.10 מ"ג/ליטר של Kinetin עבור יבלות ובמדיום SH לתרחפי תאים [102]. השעיות תאי Glycyrrhiza uralensis הצליחו לייצר כמויות משמעותיות של פלבנואידים במדיום Murashige ו-Skoog בתוספת שילוב של 2,{12}}D, NAA ו-BA וחולקו עם מתיל יסמונט [103]. 20- הידרוקסיאקדיזון הושג מתרחפי תאי Achtranthes bidentate וגם מ-Vitex glabrata שגדלו בנוכחות גם NAA וגם 0.2 מ"ג/ליטר של BA עבור Achtranthes bidentate ונוכחות של 2,4-D ו-BA עבור Vitex גלבראטה [104].

מספר מחקרים קודמים הדגישו את הפוטנציאל הגדול של יבלת ותרביות תאים בטיפול בהפרעות עור. תמצית מסיסת הידרומית שמקורה בתאי גזע Dilochos biflorus אופיינה על ידי Belmonte et al. (2014) על הכמות הגבוהה של איזופלבונים, בעיקר דאידזין, גניסטין, ונגזרות הגלוקוזידיות שלהם. המחברים מצאו שהתמצית שנוצרה הראתה פעולה מעכבת בולטת של אריתמה הנגרמת על-ידי UV, אשר הדגישה את ההשפעות המגנות של תרכובות אלה שמקורן בצמחים כנגד קרינת UV, במיוחד כנגד כוויות שמש ואריתמה סולארית [105]. מאוחר יותר, Imparato et al. (2016) השתמשו במודלים מלאכותיים לעור כדי להדגים את יכולת ההגנה מפני UV של תמציות תרבית תאי Dilochos biflorus על רכיבי ECM [106]. פעילות מגנה דרמו יוצאת דופן זו הייתה קשורה ליכולת של התמצית לנקות רדיקלים חופשיים, לעכב את ייצור הקולגנאז בדרמיס ולשמר את מבנה הקולגן עד 72 שעות לאחר חשיפה לקרינת UVA [106]. תמציות שיח פרפר (Buddleja davidii) שהתקבלו באמצעות תרביות תרחיף תאים יצרו כמויות גבוהות של verbascoside, תרכובת פנילפרופנואיד גליקוזיד הידועה בתכונות ההגנה הרב-תכליתיות שלה (נוגד חמצון, קלטור, אנטי דלקתי). חקר התכונות הדרמטולוגיות של התמציות שנוצרו הראה את יכולת תיקון העור החזקה ואת פעולת מניעת דלקת העור של תמצית זו, המיוחסת לעיכוב חזק של פעילות הקולגנאז ולדיכוי גורמים פרו-דלקתיים [107]. תמציות תרבית תאים צמחיות של קפה בנגל (Coffea bengalensis) נטולות קפאין ומציגות פוטנציאל רב לשימוש בטיפוח העור. לדוגמה, הוכח כי התמצית המסיסה בהידרו, שמקורה בתרביות תאים Coffea bengalensis, הובילה לסינתזות קולגן I ו-II בפיברובלסטים, קידמה את פעילות הליפאז ועוררה את הביטוי של גנים הקשורים להידרציה בקרטינוציטים [108].

5. גישות ביוטכנולוגיות עיקריות להגברת הייצור של תרכובות ביו-אקטיביות שמקורן בצמחים

תרבית תאים ורקמות צמחים (PCTC) מספקות כלי ביוטכנולוגי מבטיח לייצור מספר רב של פיטוכימיקלים למטרות פרמצבטיות. עם זאת, רק כמה מקרים מוצלחים זמינים בשוק בשל פרודוקטיביות פיטוכימית מינימלית, שאינה מספיקה לכיסוי עלויות התרבית [76]. לפיכך, במהלך העשור האחרון, המחקר היה מכוון לשיפור הייצור של פיטוכימיקלים בעלי ערך גבוה מבלי להגדיל את עלויות הייצור כדי להגדיל את השימוש בטכניקות של תרבית חוץ גופית כ"מפעלים כימיים" [109]. מספר אסטרטגיות, ביניהן elicitation, הנדסה מטבולית, immobilization, permeabilization ומערכות דו-פאזיות, שימשו באופן נרחב להגברת הייצור של PDBCs (איור 2) [77].

5.1. גירוש

elicitation הוא אחד ההליכים היעילים ביותר המיושמים בימינו כדי לשפר את הייצור הביוטכנולוגי של PDBCs. העלאה דורשת שימוש בתרכובות ספציפיות, הידועות בדרך כלל כ-elicitors, כדי להניע את ההגנה על הצמח ולעורר ביוסינתזה וייצור של מטבוליטים משני [110]. ניתן להבחין בין שני סוגים שונים של מעוררים: מעוררים אביוטיים וביוטיים. מעוררים אביוטיים אוספים את כל החומרים הלא ביולוגיים, כגון תרכובות אנאורגניות, למשל, יוני מתכת או מלחים (סידן כלורי, כסף חנקתי, מגנזיום גופרתי, כספית כלוריד, קובלט כלוריד, יוני אבץ וכו'), הידועים כממריצים ייצור של חומרים ביו-אקטיביים באמצעות התאמת חילוף החומרים המשני הצמחי שלהם [43]. בניגוד למעוררים אביוטיים, למעוררים ביוטיים יש מקור ביולוגי. הם משמשים כתמציות גולמיות או כפתוגן מטוהרים חלקית או כמוצרים שמקורם בצמחים. הם יכולים להיות מהרכב מורכב, כגון תמציות פטריות ושמרים, או מהרכב ספציפי כגון גליקופרוטאינים, כיטוזן מטוהר, אלגינט, קסנתן, פוליסכרידים וכו' [111]. מספר פרמטרים, ביניהם סוג המעורר, הריכוז, זמן החשיפה, סוג התרבית, הרכב המדיום, קו התא, השלב והגיל של התרבית, הם הגורמים העיקריים המשפיעים על היעילות של הליך ההעלאה בייצור PDBC [112] .

elicitation נמצא בשימוש נרחב להגברת ייצור PDBC in vitro. מספר דוחות הדגישו את היעילות של שיטה זו. העלאת תאי ההשעיה Pueraria cannoli באמצעות חומצה סליצילית הגבירה ייצור והצטברות איזופלבונואידים, ליתר דיוק, khwakhurin, daidzein, puerarin ו- genistin, שהן מולקולות המציגות תכונות אנטי-אייג'ינג נהדרות [57]. ב-Solanum xanthocarpum, העלאת תרבית קאלוס באמצעות אור כחול הביאה לייצור שיא של מתיל-קפאאט, אסקולטין, חומצה קפאית וסקופולטין. מולקולות אלו ידועות בפעילות נוגדת החמצון, האנטי דלקתית, האנטי-סוכרתית והאנטי-אייג'ינג הנהדרת שלהן [113]. יישום המלח המושרה על ידי NaCl בקאלוס מתורבת (Cynara cardunculus L. var altilis) העלה את תכולת הפנולים והנוגדי חמצון הכוללים, מה שהביא לעלייה בייצור פרו-קולגן ואקוופורין בתאי עור, ובכך להגביר את הייצור של ביו-אקטיביים. תרכובות שניתן להשתמש בהן לניסוחים קוסמטיים [114]. הוצאת מתיל יסמונט שהושמה על תרביות שורש שעירות של Isatis indigotica הוכיחה תוצאות יוצאות דופן בייצור של ליגננים. זה גם איפשר גילוי של TFs AP2/ERFs שהיו מעורבים בייצור של מחלקה זו של תרכובות ביו-אקטיביות, כמו גם גנים ביו-סינתטיים מווסתים, מה שמדגיש את החשיבות של העלאת בזיהוי מנגנוני ויסות מרכזיים שניתן להשתמש בהם עבור הנדסה מטבולית תרביות במבחנה [115]. דוגמאות אחרות ליעילות של גירוי של ייצור PDBC מוצגות בטבלה 3.

5.2. האכלה מבשר וחומרי תזונה

הזנת קדם היא אסטרטגיה ביוטכנולוגית התלויה ביכולתם של צמחים ותרביות תאי צמחים להמיר מבשרים (בתוספת של תרבית המדיה) למוצרים רצויים באמצעות אנזימים קיימים [135,136]. טכנולוגיה זו הופעלה באופן נרחב כדי להפעיל ייצור של תרכובות ספציפיות. לדוגמה, דיווחים רבים הוכיחו את היעילות של האכלה מקדים בגירוי סינתזת PDBC. תרביות שורש שעירות של אלבום לינום שניזונו עם מבשר ידוע של לינאן, אלדהיד מחטני, הביאו לעלייה ניכרת בייצור פינורסינול, לריצירזינול ופודופילוטוקסין [137]. בקאלוס ותליית תאים שמקורם בעלים Centella asiatica, הצטברות אסיאטיקוסידים הושגה על ידי הוספת חומצות אמינו לאמצעי התרבות, ליתר דיוק, לאוצין [138]. קרפינן וחב'. (2007) דיווחו על ממצאים דומים לייצור היפרפורין מתרביות יריות Hypericum perforatum. לדוגמה, המחברים מצאו כי מתן איזולאוצין ואלין לתרבות היריות אחראי לייצור היפרפורין. על ידי מעקב אחר החדרת איזולאוצין ואלין באמצעות צורות מסומנות של חומצות אמינו אלו, המחברים גילו ששתי חומצות אמינו אלו שולבו בשרשרת הצדדית של האציל של היפרפורין והיפרפורין כאחד [138].

בעקבות אותו עיקרון כמו האכלה מבשר, האכלה תזונתית שואפת להגדיל את התשואה של PDBCs על ידי התאמת הגורמים הפיזיים והכימיים של מדיית התרבות. אסטרטגיה זו הוכחה כיעילה לשיפור ביומסה וייצור ג'ינסנוסיד מתרבויות שורש ג'ינסנג. כפי שדווח ב-[139], ייצור ביומסה וכמויות ג'ינסנוסיד גדלו כאשר התרבית התחדשה במצע תרבות שהוכן טרי. ממצאים דומים דווחו גם לגבי ייצור תוצרי לוואי של קפאי מתרביות שורשים ספורות של Echinacea purpurea [140] וייצור טקסול מתרחפי תאי Taxus chinensis [141].

5.3. הנדסה מטבולית

הנדסה מטבולית מוגדרת כייצור של חומרים או מולקולות ספציפיות, כגון תרופות, כימיקלים, דלקים ותרופות, על ידי שיבוש המסלולים המטבוליים בתאים [142]. זה נותן נקודת מבט חדשה לגמרי כדי להבין טוב יותר את מסלולי הביוסינתזה של PDBC באמצעות מחקרי ביטוי יתר. זה יכול גם לרמוז על הדחקה של מסלולים אחרים (מסלולים תחרותיים) כדי לשפר את הזרימה המטבולית של מתווכי מסלול הביוסינתזה הספציפיים כדי להבטיח ייצור מוגבר [143]. המטרה העיקרית של אסטרטגיה זו היא להניע פעילות סלולרית באמצעות מניפולציה של תפקודי התא באמצעות טכנולוגיית DNA רקומביננטי. עד כה, מספר אסטרטגיות, כגון החדרת גנים מבודדים מאותו מין או מאורגניזמים שונים, פרומטורים המגבירים את ביטוי גן המטרה (ביטוי מכונן של גנים ממוקדים באמצעות מקדם 35S, למשל), או ביטוי משבש של גנים או גנים ממוקדים (אנטי-סנס). , הפרעות RNA או טכנולוגיות CRISPR/Cas9), שימשו להשגת מטרה זו [144]. הדוגמה הנפוצה ביותר למניפולציה גנטית היא השימוש בטרנספורמציה גנטית בתיווך Agrobacterium tumefacient, שיכולה לאפשר את החדרת הגן הרצוי.

ההפרעה הגנטית של תוצרי ביניים של מסלול ביו-סינתזה יכולה להתבצע גם באמצעות שיטות טרנספורמציה אלטרנטיביות אחרות כגון טרנספורמציה של פרוטופלסטים, ביולוגיות (הפצצת מיקרו-פרויקטילים), טרנספורמציה בתיווך ליפוזום או מסלולי אבקה [143]. הנדסה מטבולית מציעה יתרונות רבים להגדלת הייצור של תרכובות ביו-אקטיביות על ידי ביטוי יתר של גנים (האחראים לייצור אנזימים מווסתים) המעורבים במסלולים הביוסינתטיים שלהם [145]. עם זאת, לאור המורכבות של תהליך הרגולציה בתאי הצמח והנוכחות של אנזימים קריטיים ומגבילים קצב האחראים לוויסות המשוב של שפע התרכובות הביו-אקטיביות, הייצור של PDBCs באמצעות הנדסה מטבולית מוגבל. לפיכך, נדרשות חקירות נוספות לזיהוי שלבי הגבלת התעריפים והסדרתם [146,147].

5.4. Immobilization

אימוביליזציה היא אחת מאסטרטגיות המפתח שניתן ליישם כדי לשפר את הייצור של PDBCs במערכות PCTC. הוא מסתמך על שימוש במטריצת ג'ל המאפשרת לכידת תאים. במקביל, תאים נחשפים לריכוז גבוה של יונים כדי לנטרל את ההשפעה הלא רצויה על חילוף החומרים בתאים. אסטרטגיה זו משכה מדענים וחוקרים ברחבי העולם מכיוון שהיא מאפשרת להגדיל את הכדאיות והיציבות של התא של התרכובות הביו-אקטיביות המיוצרות, בנוסף לעלייה בייצור של מולקולות רצויות [148]. עבור לכידת תאים או אימוביליזציה, ניתן להשתמש במספר כימיקלים, כגון אגרוז, אלגינט, אגר ופוליאקרילאמיד בשילוב עם אלגינט, כמטריצת הג'ל. פולימרים של אלגינט הם החומרים הנפוצים ביותר המשמשים לקיבוע תאים, מכיוון שהם מראים את התוצאות הטובות ביותר מבחינת תשואות ייצור PDBC. לדוגמה, לכידה של תאי Eurycoma longifolia עם 2.5 אחוזים של פולימר אלגינט במשך שלושה שבועות הובילה לעלייה ניכרת בייצור של 4H-imidazol-4-one, can thill-6-one ו-strictosidine-synthase בהשוואה לתאים שאינם מגובשים [149]. לייצור chitosanase מ-Gongronella sp. תאים, הייצור הגבוה ביותר הושג באמצעות אימוביליזציה של תאים עם ג'ל סידן אלגינט (E404) בשילוב עם קצף פוליאוריטן ב-pH 5.5 [150]. ב-Juniperus chinensis, Premjet et al. (2007) מצאו שייצור פודופילוטוקסין גדל ב-96-98 אחוז בתאים הכלואים באמצעות פולימר אלגינט [151]. תאים שקועים ב-Plumbago Rosea באמצעות E404 הביאו לעלייה פי 3 בייצור הפלומבאגין, התרכובת הביו-אקטיבית החשובה המדווחת במין צמח זה, בהשוואה לתאים שאינם כלואים [152,153]. ניתן להסביר את ההשפעות המועילות של אימוביליזציה של תאים על ידי העובדה שמטריצת הג'ל (פולימר) מייצרת שיפוע דיפוזיה מתאים על פני התאים המשובשים, מה שמשפר את התקשורת הביוכימית. מטריצות פולימריות מעוררות אוטומטית את הקמת אגרגטים של תאים, ובכך מפחיתות את התלות של התאים במדיה התרבותית, וכתוצאה מכך תשואה גבוהה יותר של PDBCs [148]. למרות שקיעת תאים מגבירה את ייצור ה-PDBC, תרכובות ביו-אקטיביות נלכדות לעתים קרובות ומאוחסנות בתוך תאים ואקוולים. לפיכך, תהליך אי-מוביליזציה וייצור התא תלויים כלכלית ביכולת של התא להפריש את התרכובות הביו-אקטיביות הרצויות למדיום הסמוך, דבר שיכול להתרחש באופן טבעי באמצעות מנגנוני הפרשה טבעיים (פאסיביים ופעילה) או מלאכותיים (אסטרטגיית פרמיביליזציה) [135].

5.5. חלחול

כפי שהוזכר לעיל, PDBCs בדרך כלל לכודים באיברים מיוחדים או מבני תאים, בדרך כלל ב-vacuoles של התא. לפיכך, שחרור PDBC לתוך מדיום התרבות יחד עם הליך טיהור מתאים יכול לאפשר התאוששות של תרכובות רצויות. אסטרטגיית החדירה מסתמכת על שימוש בגישות כימיות או פיזיקליות להגברת החדירות של ממברנות תאי צמחים. ניתן ליישם בקלות את החדירה בתיווך הכימי באמצעות ממיסים אורגניים, כגון דימתיל סולפוקסיד [DMSO] ואיזופרופנול, ופוליסכרידים כגון כיטוזן [135]. טקסול, הקסדקן, דיבוטיל פתלאט או דקנול שימשו להגברת חדירות תרבית תאי Taxus chinensis [141]. ניתן ליישם שיטות חדירות אחרות, כגון שדות חשמליים וקוליות, כדי לשחזר PDBCs מ-vacuoles בתאים [135]. שים לב כי הצטברות PDBCs יכולה להשתנות או על ידי ויסות המשוב (עיכוב) של סינתזת המוצר או על ידי הפירוק של תרכובות ביו-אקטיביות במדיה. ניתן להימנע ממכשול זה באמצעות הסרת מוצר באתרו, הכוללת הפרדה ישירה של נוזל-נוזל או נוזל-מוצק [154], כאשר האחרון הראה תוצאות טובות יותר ממערכת התרבית הנוזל-נוזל. עבור מערכות מוצק-נוזלי, נעשה שימוש נפוץ בשרף XAD4, XAD7 ופחם פעיל. לדוגמה, הוכח בעבר שהשימוש ב-XAD7 שיפר את הייצור של אג'מליצין וסרפנטין ב-C. roseus, פלומבגין ב-Pityriasis rosea, אלקלואיד ב-Eschscholzia californica, ו-Taxuyunnanine C ב-Taxus chinensis [155-158]. XAD4 יושם בהצלחה לייצור אנתרקינונים מ- Morinda elliptica [159].

6. ייצור חומרים נוגדי חמצון לתכשירים קוסמטיים באמצעות ביוטכנולוגיה

טכניקות PCTC בשילוב עם גישות ביוטכנולוגיות שונות שמטרתן לייצר כמויות גבוהות של PDBCs הובילו לפיתוח של מספר מוצרים קוסמטיים עם פעילות אנטי אייג'ינג והגנה דרמו. על חלקם נרשמו פטנט, וכמה מוצרי קוסמטיקה פותחו על ידי חברות מובילות בתעשיית הקוסמטיקה. להלן מספר דוגמאות לפטנטים שנרשמו בעשור האחרון. הם נבחרו באקראי כדי להציג יישומים קונקרטיים של ביוטכנולוגיה, בעיקר טכניקות תרבית רקמות צמחיות, לניסוח של מוצרים גלניים וקוסמטיים:

• פטנט שנרשם בארצות הברית על ידי Blum et al. בשנת 2012, קשור לפיתוח של תאי צמחים לא מובחנים מפירות Malus domestica cv Uttwiler Spaetlauber והשימוש בהם בניסוח תכשירים קוסמטיים כדי להבטיח הגנה של תאי גזע מפני גורמי דחק פנימיים וחיצוניים כאחד, קידום שגשוג תאי גזע ומניעה של אפופטוזיס של תאים (פטנט US 8,580,320 B2). מתרחפי תאים אלו פותחו תכשירים קוסמטיים שונים, ביניהם קרמים נעלמים, מזור נוזלי, מסכות אינטנסיביות לשיער וקרמי עיניים. יעילות התכשירים הקוסמטיים שפותחו נבדקה על תאי גזע שמקורם בחבל הטבור, זקיקי שיער ופיברובלסטים.

• תאי צמחים Syringa vulgaris נוצרו בהצלחה מהתרבית חוץ-גופית של רקמות צמחים בתנאים אספטיים במיכלי גידול בתוספת מווסתים ספציפיים לגידול צמחים על ידי צוות איטלקי (Dal Monte et al., 2006; מספר פטנט: US 7,718,199 B2). מיצוי מימי בוצע על תרחפי תאים שמקורם בקאלוס. פרופיל HPLC חשף נוכחות של כמויות משמעותיות של verbascoside ו-verbascoside. התמציות שמקורן בתליית התאים הראו פעילות נוגדת חמצון חזקה וניקוי נגד רדיקלים חופשיים. יתרה מכך, התמציות שפותחו הציגו תכונות נהדרות נגד נשירת שיער בשל יכולתן לעכב 5-אלפא רדוקטאז וליפוקסיגנאז. התמציות שנוצרו הראו גם פעילות אנטי-טירוזינאז חזקה ותכונות בולטות להלבנת עור.

• תאים לא מובחנים של צמחי איריס (Iris pallida, Iris germanica ו-Iris florentina) נוצרו על ידי ברטון ו-Gueniche בשנת 2001. תכשירים גלניים פותחו מהתאים שנוצרו. בעקבות טענות הממציאים, התכשירים שפותחו כללו מסנני קרינה, עם חומרים פעילים שהבטיחו את ההגנה על חלבוני המטריצה ​​החוץ-תאיים, כמו קרינת UV, באמצעות עיכוב אנזימטי של חלבוני MMP (ברטון וגוניצ'ה ב-2001, מספר פטנט: EP 1 174 120 B1).

• תאים לא מובחנים Leontopodium alpinum שהתקבלו באמצעות תרביות תאים חוץ גופיות שימשו לניסוח תכשירים קוסמטיים על ידי ממציאים צרפתים (Gracioso וחב'). התגלית פורסמה כפטנט על ידי הממציאים בשנת 2016 (תצהיר פטנט בשנת 2015, מספר פטנט: WO 2016/113659 A1). המוצר שפותח הוצע כטיפול קוסמטי לשיקום הומאוסטזיס של תאים בגיל העור והגברת חילוף החומרים בתאים ופעילות אנרגטית.

• תאים לא מובחנים של Marrubium vulgare שימשו כחומר גלם לפיתוח תכשירים קוסמטיים על ידי Ringenbach et al. עבור חברת קוסמטיקה ידועה. הפטנט נרשם בשנת 2016. לפטנט זה הוכן הרכב קוסמטי מתאי צמחים המתקבלים בתהליך תרבית תאים חוץ גופית. הממציאים הציעו תכשיר קוסמטי זה לטיפולים מקומיים לשיפור מצבו הכללי של העור, מראהו ותוספי העור, ליתר דיוק, למיצוק נקבוביות ולפגמי עור. מהחומר הפעיל שהתגלה פותחו פורמולציות גלניות שונות, ביניהן קרמים, סרומים, מסכות רקמות ותחמי ניקוי (מספר פטנט: WO 2017/163174 A1).

• תכשיר קוסמטי פותח על ידי צוות איטלקי (טיטו וחב') בשנת 2016. ההמצאה המכוסה בפטנט זה מתמקדת בשימוש בעוברים סומטיים של שלושה מיני צמחים: לוטוס ג'פוניקוס, הדר לימון ורוזה גרדניה. התמציות שנוצרו הראו פעולה נהדרת נגד פגמים בהזדקנות העור ומכילות תכונות הצערת רקמות העור (מספר פטנט: WO 2016/173867 A1).

• מוצר קוסמטי בעל יכולת להגן על העור מפני ייבוש ו/או מניעת נזקי קרינת UV פותח ממיצוי תאי גזע של Camellia sinensis var assamica dedifferentiated על ידי Berry et al. המוצר שפותח זכה לפטנט בשנת 2017. יעילות ההמצאה נבדקה בפיברובלסטים עוריים של בני אדם בוגרים. לדברי הממציאים, תמציות התה שנוצרו הציגו תכונות אנטי דלקתיות, מנעו ייבוש תאי עור והגנו על תאי העור מפני קרינת UV (מספר פטנט: WO 2017/178238 A1).

7. מסקנות

הזדקנות העור היא אחת הבעיות הדרמטולוגיות השכיחות ביותר המשפיעות על עור האדם ועל המראה שלו, וכתוצאה מכך כשל בתיקון הפצעים, התפתחות קמטים ואובדן גוון וגמישות העור. מספר מוצרים המבוססים על כימיקלים פותחו במהלך השנים כדי למנוע את תהליך האנטי-אייג'ינג של העור ולהפחית את השפעתו. עם זאת, עם השימוש במוצרים כימיים, נוצרו מספר בעיות, בעיקר קשורות לרגישות לתאים, אלרגיות ותופעות הלוואי של חלק מהמוצרים והחומרים הכימיים. כחלופה, הוצעו מוצרים טבעיים וצמחיים בהתבסס על המאפיינים הבולטים שלהם. עם זאת, הפיתוח של מרכיבים ביו-אקטיביים שמקורם בצמח תלויה מאוד בחומר צמחי, אשר יכול להיות מושפע מגורמים פנימיים וחיצוניים כאחד. טכניקות תרבית רקמות צמחיות יכולות לספק כמויות עצומות של חומר צמחי הומוגני ללא תלות בגורמים הללו כדי להבטיח ייצור מספיק של תרכובות ביו-אקטיביות. בנוסף, ניתן לייצר PDBCs באמצעות אסטרטגיות ביוטכנולוגיות כגון elicitation, הנדסה מטבולית, האכלה של חומרים מזינים ומבשרים, immobilization ו-permeabilization. עבודה זו הציגה סקירה מקיפה של הטכניקות הביוטכנולוגיות המשמשות לייצור תרכובות ביו-אקטיביות, תוך התמקדות בנוגדי חמצון המציגים תכונות אנטי-אייג'ינג. כמה דוגמאות לטכניקות של תרבית רקמות צמחיות המשמשות בייצור מוצרים קוסמטיים מטופלות גם כדי להדגיש את החשיבות של כלים ביוטכנולוגיים לייצור בר-קיימא של PDBCs.

【למידע נוסף:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】