תגובות ביוכימיות והיסטופתולוגיות של ביומפלריה אלכסנדרינה ל-RIPEX (מווסת צמיחה של צמחים)Ⅱ

3. תוצאות

3.1 רעילות RIPEX

תוצאות הרעילות של RIPEX ל-Biomphalaria alexandrina לאחר יום אחד הצביעו על כך שהערכים של LC50 ו-LC90 היו 39.9 5 ו-73.6 µL/L, בהתאמה. הריכוזים התת-קטליים של Te LC10 ו-LC20 היו 8 ו-16 µL/L, בהתאמה (טבלה 1 ואיור 1).

3.2 השפעת RIPEX על סמני הלחץ החמצוני

החשיפה ל-RIPEX השפיעה על פעילות SOD ו-GST ועל רמות ה-MDA בבלוטת העיכול של B. Alexandrina (טבלה 2). חלזונות שנחשפו ל-RIPEX ב-8 µL/L הראו עלייה לא מובהקת (p=0.6) בפעילות של SOD בהשוואה לחלזונות הביקורת. עם זאת, חלזונות B. alexandrina שנחשפו ל-16 µL/L למשך 7 ימים הראו ירידה משמעותית בפעילות SOD (p=0.05). פעילות GST עלתה באופן משמעותי (p פחות מ-0.001 או שווה ל-0.001) לאחר חשיפה לשני הריכוזים. העלייה הגבוהה ביותר נצפתה בחלזונות שנחשפו ל-16 μL/L למשך יום אחד (39.7±3.2 U/mg) והערך הגבוה ביותר בריכוז 8 μL/L היה (33.7±1.7 U/mg) לאחר 7 ימים, בהשוואה ל- הביקורות ב-17.1±3.6 U/mg (לאחר יום אחד) ו-22.6±1.3 U/mg (לאחר 7 ימים).

לחץ כדי למצוא יתרונות עבור טסטוסטרון

בהתאם למרווחי הזמן, חשיפה למשך 7 ימים גרמה לעלייה משמעותית (p=0.0{{20}}3). החשיפה לריכוזים שונים של RIPEX גרמה לעלייה משמעותית (p פחות או שווה ל-0.04) ברמות ה-MDA. הריכוז של 8 µL/L העלה את רמת ה-MDA (45.06±4.1) בהשוואה לביקורת (16.4±2.1). בהתאם לזמן החשיפה, רמות ה-MDA היו 45.06±4.1 ו-56.1±0.7 ננומול/ג בריכוזים, 8 ו-16 μL/L, בהתאמה, בהשוואה ל-13.5±0.7 ננומול/ג בביקורת (טבלה 2).

3.3 השפעת RIPEX על פעילות הורמוני הסטרואידים

חשיפה ל-16 µL/L גרמה לעלייה משמעותית בריכוז הטסטוסטרון (52.6±2.5 nmol/L) (p=0.002) בהשוואה לבקרה (34.6±2.3 nmol/L). בעוד שהריכוז של 8 µL/L RIPEX גרם לעלייה משמעותית (p=0.005) בטסטוסטרון לאחר 3 ימי חשיפה בהשוואה ל-16 µL/L. בהתאם למרווחי הזמן, אין משמעות למעט הירידה המשמעותית בריכוז הטסטוסטרון שהתרחשה ב-7 ימי החשיפה (19.6±2 ננומול/ליטר) (p=0.003) בהשוואה ל-3 ימים (47.3±±47.3) 6 ננומול/ליטר). לגבי אסטרדיול, הייתה עלייה משמעותית (p=0.003) בריכוז ההורמונים לאחר 3 ימים של חשיפה ל-16 µl/L (73.6±3.5 pg/mL בהשוואה לביקורת (43.3 pg/mL) ו 7 ימים של חשיפה ל-8 µL/L (56.3±1.5 pg/mL לעומת הביקורת (50.3±5.6 pg/mL) (איור 2, ב).

3.4 השפעת RIPEX על אנזימים פוטנציאליים של מערכת החיסון

החשיפה של B. Alexandrina לשני ריכוזים של RIPEX גרמה לעלייה משמעותית בפעילות האנזים MPO (איור 3a) תלוי בזמן החשיפה לאחר 3 ימים (p=0.0{ {35}}4) ו-7 ימים (ע'=0.01). חשיפה ל-8 μL/L RIPEX, העלתה באופן משמעותי את הפעילות של MPO (55.3±4.8 mU/mg חלבון (p=0.004) בהשוואה ל-15.4±1.2 mU/mg עבור הביקורת. בעוד ש-16 μL/L נחשף חלזונות הפעילות הייתה (53.03±2.3 mU/mg חלבון ו-73.9±2.8 mU/mg חלבון, p פחות או שווה ל-0.05). כמו כן, הריכוז של 16 µL/L גרם לעלייה משמעותית (p=0 .05) בפעילות בהשוואה ל-8 μL. שני הריכוזים (8 ו-16 μL/L) הגדילו באופן משמעותי (p פחות או שווה ל-0.009) את הפעילות של ADA בהשוואה לבקרה (איור 3b) בכל הזמן נקודות. עליית הפעילות בריכוז של 16 µL/L. בהתאם למרווחי הזמן, החשיפה למשך 7 ימים רשמה עלייה משמעותית בהשוואה ליום אחד ו-3 ימים (p פחות או שווה ל-0.05). הפעילות ב-7 ימים הייתה 27.03±14 ו-74.3±1.9 U/mg חלבון

3.5 ספירת המוציטים דיפרנציאלית

בדיקה של דגימות המולימפה מחלזונות B. alexandrina הצביעה על שלושה סוגים מופרדים של המוציטים שונים; היאלינוציטים, קטנים עגולים, והמוציטים מתפשטים. היאלינוציטים מאופיינים בצורתם המעגלית, קרום התא הצלול והצפוף ויחס גרעין לציטופלזמה גדול. הוא מיוצג על ידי ספירה גבוהה בבקרה (56.3±0.5, יום אחד). תאים עגולים קטנים הם תאי ביניים עם מעט גרגירים ציטופלזמיים וללא פסאודופודיה. להמוציטים מתפשטים יש גדלים שונים, עם גרעין קטן וגרגירים ציטופלזמיים גדולים. הם תאים פגוציטים מכיוון שהם יכולים ליצור פסאודופודיה מועטה וקצרה. החשיפה לשני הריכוזים של RIPEX העלתה את ספירת ההמוציטים, ונצפתה עלייה משמעותית בגרנולוציטים של חלזונות שנחשפו ל-8 µL/L (p=0.02) ו-16 µL/L (p{{12 }}.006) למשך 1, 3 ו-7 ימים בהשוואה לבקרה. (שולחן 3). הטיפול גרם לכמה חריגות מורפולוגיות בהמוציטים כגון היאלינוציטים עם התארכות פילופודיאלית, גרנולוציטים מעוותים עם ואקוולים והתפשטות פילופודיה (איור 4).

3.6 השפעת RIPEX על ההיסטופתולוגיה של בלוטות העיכול והאבטסטיס

בלוטות העיכול של B. Alexandrina מורכבות מצינוריות, וכל צינורית מורכבת משכבה אחת של תאי אפיתל עמודים המובחנים לתאי עיכול ותאי הפרשה, המסודרים סביב לומן מרכזי (איור 5א). הצינוריות מקושרות זו לזו על ידי רקמת חיבור. חשיפת RIPEX גרמה לכמה שינויים, כגון ניוון ברקמת החיבור. חלזונות שנחשפו ל-8 μL/L הראו נוכחות של כדוריות תאים, המעידות על מוות של תאים וסתימה של הלומן. נצפה מזון לא מעוכל (איור 5b-d). חלזונות שנחשפו ל-16 μL/L, הפגינו ניוון של התאים המרופדים עם כמה סימנים פתולוגיים כמו ריקון והתרחבות של לומן. הצינורית הפכה פגומה, מעוותת ונמקית (איור 5ה, ו).

Ovotestis של חלזונות בקרה B. alexandrina מורכבים מכמה acini הצטרפו על ידי רקמת חיבור. כל אקינוס מרופד באפיתל נבט המורכב משלבים שונים של spermatogonia ואווגוניה. טיי מתמיין לביצית ראשונית, משנית ואחד או שניים בוגרים (אוגוניה). זרעונים בוגרים נמצאים בקבוצות בתוך האקינוס (איור 6א). המבנה ההיסטולוגי של האובוטסטיס של חלזונות חשופים השתנה לאחר 7 ימים של חשיפה ל-RIPEX. בחלזונות שנחשפו ל-8 µL/L, נצפתה מספר גדל והולך של זרעונים, זרעונים נמקיים וניוון. דפורמציה של gametocytes זכר או נקבה וניוון של acini היו גם בשפע. כמו כן, החשיפה ל-16 µL/L גרמה לאסיני להתנוון יותר והנמק גדל (איור 6b-e).

4 דיון

קיים שימוש נרחב ב-PGRs בפרקטיקות חקלאיות. לחומרים אלה יש השפעות מזיקות רבות על אורגניזמים חיים. המחקר הנוכחי נועד להעריך את ההשפעות הטוקסיקולוגיות של RIPEX (חומר הדברה אורגנו-זרחן המכיל אתפון המכיל 48 אחוז אתפון כמרכיב הפעיל בתוספת 52 אחוז מרכיבים אינרטיים). מבחני רעילות של RIPEX עם B. Alexandrina הצביעו על כך שערכי 1-יום LC50 ו-LC90 היו 39.95 ו-73.6 µl/L, בהתאמה.

תוצאות אלו נתמכו על ידי [54] שהדגימו את ערך EC50 עבור אתפון נגד עוברי דפניה מגנה (125 מ"ג/ליטר לאחר 48 שעות של חשיפה). חומר ההדברה הזה נראה רעיל יותר לביומפלריה מאשר פורמולציות אחרות של תרכובות זרחן אורגניות כגון כלורפיריפוס (LC50 9.6 מ"ג/ליטר; [30] ופרופנופוס (LC50 1.10 מ"ג/ליטר; [10]) .

הומאוסטזיס קיים בין יצירת רדיקלים חופשיים של חמצן לבין ייצור מולקולות נוגדי חמצון בתנאים פיזיולוגיים נורמליים [23]. חוסר איזון בין מערכות נוגדי החמצון והחמצון ידוע כלחץ חמצוני [32]. בשני אוקריוטים וגם בפרוקריוטים, סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) וגלוטתיון S-טרנספראזות הם אנזימים נוגדי חמצון חיוניים שעלולים להסיר יותר מדי חמצן מרדיקלים חופשיים ולהגן על האורגניזם מפני נזק חמצוני [34, 38].

הם גם משתתפים בניקוי רעלים של מספר קסנוביוטיקה [8, 15]. המחקר הנוכחי חשף שחשיפה של חלזונות B. alexandrina לריכוזים תת-קטליים של RIPEX 48 אחוז EC הפריעה את הפעילות נוגדת החמצון של החלזונות החשופים. חשיפה חריפה (24 שעות) נוטה להפחית את פעילויות SOD ו-GST הכוללות בחלזונות, ואחריה עלייה לאחר 3 ימי חשיפה ועיכוב חד לאחר 7 ימי חשיפה.

רמות MDA היו גבוהות משמעותית בחלזונות חשופים בהשוואה לביקורות לאחר כל תקופות החשיפה. תוצאות אלו מצביעות על מצב של עקה חמצונית בחלזונות שנגרמה כתוצאה מחשיפה ל-RIPEX. החלזונות חוו ירידה פתאומית בפעילות האנזים לאחר יום אחד של חשיפה וניסו לפצות על ידי ייצור יתר של אנזימים לאחר 3 ימי חשיפה. עם זאת, עד היום ה-7 לחשיפה, החלזונות לא הצליחו להתגבר על ייצור עודף של מיני חמצן תגובתיים, כפי שמתבטא בעלייה ברמות ה-MDA (פרוקסידציה של שומנים), מה שהוביל לעיכוב ייצור האנזים נוגדי החמצון. MDA הוא בין ההשפעות העיקריות של חמצון שומנים ויש לו את הכוח לשבש את חילופי היונים בממברנת התא, לשנות את חדירות היונים ולהשפיע על תפקוד האנזים [9].

המנגנון של RIPEX 48 אחוז מתח חמצוני המושרה על ידי EC ב-Biomphalaria עשוי להיות שונה מחומרי הדברה אורגנו-זרחן אחרים. זה גרם לעיכוב אנזים רק לאחר 7 ימי חשיפה. עם זאת, chlorpyrifos, למשל, גרם לעלייה בפעילות SOD ולהפחתה בפעילות GST ב-B. Alexandrina זמן קצר לאחר יום אחד של חשיפה [30]. טסטוסטרון ואסטרדיול ממלאים תפקיד מכריע בהתרבות של חלזונות B. alexandrina [20, 45]. שינויים בהורמונים אלה יכולים לשמש כנקודת קצה של רעילות כימית [14]. RIPEX 48 אחוז EC גרם להפרעה הורמונלית בחלזונות B. alexandrina.

חלזונות שנחשפו ל-16 µL/L הראו עלייה משמעותית בטסטוסטרון לאחר 3 ימי חשיפה. עם זאת, RIPEX הפחית את רמות ההורמונים בחלזונות שנחשפו ל-8 µL/L לאחר 1 ו-3 ימים של חשיפה. לגבי אסטרדיול, ההורמון נוטה לעלות בחלזונות חשופים. עם זאת, העלייה הבולטת ביותר נצפתה בחלזונות שנחשפו ל-16 µL/L לאחר 3 ימי חשיפה. לפיכך, ל-RIPEX עשויה להיות השפעה משבשת אנדוקרינית על חלזונות B. alexandrina. ממצאים דומים דווחו גם על ידי איברהים וחוסין [30], שדיווחו על עלייה משמעותית ברמות הטסטוסטרון והאסטרדיול גם לאחר חשיפה של B. Alexandrina לריכוזים תת-קטליים של כלורפיריפוס ב-48 אחוז EC. עם זאת, כימיקלים אגרוכימיים אחרים, כגון קוטל העשבים אוקסיפלורפן (24 אחוזים EC), הפחיתו את רמות הטסטוסטרון ו17-אסטרדיול ב-B. Alexandrina לאחר שבועיים של חשיפה [31]. Myeloperoxidase (MPO), אשר הופך H2O2 לחומצה היפו-כלורית (HOCl), אנטיביוטיקה חזקה, נחשבת לעתים קרובות כאבן הפינה של ציטוטוקסיות מתווכת ROS, ויש ראיות חזקות לכך שלהמוציטים מולוסקניים יש פעילות MPO דומה לזו של פגוציטים יונקים [22] , 44, 49]. Adenosine deaminase (ADA) ממלא תפקיד חשוב במערכות החיסון של בעלי חוליות וחסרי חוליות, כולל חלזונות Biomphalaria [51].

החסר שלו קשור למחלת כשל חיסוני משולבת [25]. חשיפה של B. Alexandrina ל-8 ו-16 µL/L RIPEX גרמה לעלייה משמעותית בפעילות של אנזימי MPO ו-ADA בבלוטות העיכול של חלזונות לאחר 3 ו-7 ימים של חשיפה. העלייה בפעילות האנזים נראית תלויה בזמן ובקונצרציה. בלוטות העיכול הן האתר העיקרי לחילוף החומרים של מזהמים כימיים בגסטרופודים [46]. העלייה באנזימים אלה מרמזת על תגובה אימונולוגית של B. Alexandrina לרעילות RIPEX שכן MPO, למשל, יכול להמיר מזהמים לרדיקלים חופשיים באמצעות הפשטות אלקטרונים בודדים [41], מה שעלול לגרום לאירועי חיזור מחזורי המייצרים אוקסירדיקלים ואולי ליזום חמצון שומנים [36].

חלזונות מסתמכים בעיקר על ציטוטוקסיות מתווכת תאים כדי להיפטר מחפצים פולשים [5, 53]. תאי ההגנה הנחקרים ביותר בחלזונות הם המוציטים. המוציטים מתקדמים מתאי קטן, מעוגלים, אגרנוריים לתאים גדולים, גרגירים ומתפשטים דרך שלבי ביניים [6, 53]. המוציטים גרנוריים פגוציטים בעיקר חומרים זרים [28]. החשיפה לשני ריכוזים של RIPEX 48% EC הגדילה את ספירת ההמוציטים. ההיאלינוציטים הופיעו עם ואקוולים בדגימות שנאספו מחלזונות חשופים. נצפתה עלייה משמעותית בגרנולוציטים, המעידה על עלייה בתגובה החיסונית התאית של החילזון לאתגר רעילות RIPEX. איברהים וחוסין [30] הראו שלחשיפה של B. Alexandrina לכלורפיריפוס הייתה השפעות שליליות על המורפולוגיה ועל ספירת ההמוציטים הכוללת של חלזונות חשופים.

יתר על כן, מיקרוסקופ אור גילה שלחלק מההיאלינוציטים היו גרעינים מכווצים, חלוקת תאים לא מלאה והיווצרות פסאודופודיה. להשפעות אלו על ספירת ההמוציטים והמורפולוגיה של B. Alexandrina יש השלכה שלילית על חסינות החלזונות, שכן אורגניזמים אלו תלויים במידה רבה בהמוציטים להגנה שלהם מפני מפגשים זרים. חקירות היסטופתולוגיות של בלוטות העיכול של B. Alexandrina הראו שחשיפה ל-RIPEX במשך 7 ימים גרמה לכמה שינויים פתולוגיים כגון ניוון של רקמת חיבור, סתימות תאי וניוון של תאים מרופדים בלומן. צינוריות העיכול נפגעו, מעוותים ונמקים. היסטופתולוגיה היא נקודת קצה חשובה בהערכת השינויים הפתולוגיים בבעלי חיים מימיים שנחשפו למזהמים [33].

הרגישות הגבוהה של בלוטות העיכול מיוחסת ישירות לתפקידה בהומאוסטזיס, ספיגת מזהמים, עיכול, חילוף חומרים ותהליך ניקוי הרעלים [24]. ההשפעות שנצפו עשויות לנבוע מהצטברות ישירה של RIPEX בתאי בלוטת העיכול או בעקיפין באמצעות נזק חמצוני הנגרם על ידי ייצור מיני חמצן תגובתיים (ROS). אכן, עקה חמצונית קיצונית נקשרה לנזק לרקמות הכולל מגוון תהליכים פיזיולוגיים ומשתנים סביבתיים, כולל מוות של תאים נמקיים ואפופטוטיים [19]. יתרה מכך, חשיפה לשני ריכוזים שונים של RIPEX במשך 7 ימים שינתה את המבנה ההיסטולוגי של אובוטסטיס עם עלייה במספר הזרעונים הנמקיים, ניוון, דפורמציה של גמטוציטים זכריים או נקבים וניוון של ה-acini. שינויים אלו עשויים להפחית את פוטנציאל הרבייה של חלזונות, ולכן, את כושרם במערכת המים.

5. מסקנה

לריכוזים תת-קטליים של RIPEX 48 אחוז EC הייתה השפעה רב-גונית על חלזונות Biomphalaria alexandrina. בחלזונות, חשיפה כרונית ל-RIPEX הפחיתה את ייצור האנזימים נוגדי החמצון SOD ו-GST תוך הגברת ייצור ה-MDA, המעידה על מצב עקה חמצונית. יתר על כן, הייתה לו השפעה משבשת אנדוקרינית על חלזונות, כפי שמעידה עלייה כללית ברמות ההורמונים הסטרואידים. נראה שמערכת החיסון של החילזון פגיעה לחשיפה ל-RIPEX. זה גרם לעלייה משמעותית בפעילות של אנזימי MPO ו-ADA בבלוטות העיכול של חלזונות לאחר 3 ו-7 ימים של חשיפה, וכן לעלייה משמעותית בגרנולוציטים בקבוצות חלזונות חשופים. חריגות פתולוגיות בבלוטות העיכול של חלזונות חשופים ובאובוטסטיס היו גם סימנים לשינויים היסטופתולוגיים שנגרמו כתוצאה מחשיפה ל-RIPEX. ממצאים אלו מראים כי RIPEX פוגע בבעלי חיים מימיים, כולל ב. אלכסנדרינה. Tus, חלזונות Biomphalaria יכולים לשמש כאינדיקטורים ביולוגיים לזיהום סביבתי עם מווסת צמיחה של צמחים.

המנגנון של Cistanche מגביר את אפקט הטסטוסטרון

נמצא כי Cistanche מגביר את רמות הטסטוסטרון בכמה דרכים. ראשית, הוא מכיל תרכובות הידועות בשם echinacoside ו-acteoside, אשר הוכחו כמגבירות את הייצור של הורמון luteinizing (LH) בבלוטת יותרת המוח. LH מגרה את תאי ליידיג באשכים לייצר טסטוסטרון. Cistanche מכיל גם פוליסכרידים וגליקוזידים פנילתנואידים, אשר הוכחו כבעלי תכונות נוגדות חמצון ואנטי דלקתיות. זה יכול לסייע בהפחתת מתח חמצוני ודלקת באשכים, מה שעלול לפגוע בייצור הטסטוסטרון בנוסף, נמצא כי Cistanche מגביר את הביטוי של גנים המעורבים בסינתזה של טסטוסטרון ומפחית את הפעילות של אנזימים המפרקים טסטוסטרון, כגון {{1} }אלפא-רדוקטאז. באופן כללי, השילוב של מנגנונים אלה נחשב לתרום להשפעות מגבירי הטסטוסטרון של Cistanche.