הערכת חסינות על ידי מדידה כמותית של נוגדני SARS-CoV-2 IgG בדגימות מקל אצבע

תַקצִיר

COVID-19 השפיע באופן ישיר או עקיף על מיליארדי אנשים ברחבי העולם. התגובה למגיפה התמקדה במניעת התפשטות המחלה ושיפור אפשרויות הטיפול. טכנולוגיות אבחון מילאו תפקיד מפתח בתגובה זו מאז תחילת המגיפה. ככל שפותחו ונפרסו חיסונים וטיפולים אחרים, גדל העניין בהבנה ובמדידה של רמת ההגנה החיסונית האישית. היסטורית, השימוש בטיטרים של נוגדנים למדידת חסינות מערכתית הוגבל על ידי הבנה לא מלאה של הקשר בין נוגדנים לחסינות, היעדר סטנדרטים בינלאומיים לריכוז נוגדנים כדי לאפשר השוואות בין מחקרים, ונתונים קליניים לא מספיקים כדי לאפשר את הפיתוח. של מודלים חזקים של נוגדנים-חסינות.

עם זאת, אילוצים אלה השתנו לאחרונה. עם הבנה מעמיקה יותר של נוגדנים, פרסום תקני נוגדנים של ארגון הבריאות העולמי ופיתוח מודלים של חסינות באמצעות מערכי נתונים מניסויי חיסונים מרובים נגד COVID-19, סוגים מסוימים של בדיקות נוגדנים כמותיות עשויים כעת לספק דרך לנטר חסינות אישית או קהילתית נגד COVID-19. באופן ספציפי, בדיקות שמכמתות את הריכוז של נוגדנים אנטי-RBD IgG - נוגדנים המכוונים לתחום הקושר לקולטן של רכיב החלבון S1 ספייק של נגיף SARS-CoV-2 - מראות הבטחה כמדד שימושי וניתן להרחבה של ה-COVID{ {6}} חסינות הן של יחידים והן של קהילות. עם זאת, כדי לקיים הבטחה זו, יש צורך בבדיקה מהירה וקלה לביצוע.

כדי לתת מענה לצורך קליני חשוב זה, Brevitest פרסה את הפלטפורמה הטכנולוגית שלה בעלת יכולת נקודת טיפול שיכולה להריץ במהירות (<15 minute), quantitative antibody test with a sample of 10 µl of whole blood from a fingerstick. The test we validated on this platform measures the concentration of anti-RBD IgG in Binding Antibody Units per milliliter (BAU/mL) per WHO Reference Standard NIBSC 20/136.

במאמר זה, אנו מציגים מחקרים המשמשים לאפיון מבחן Brevitest anti-RBD IgG ומעריכים את הביצועים הקליניים שלו, גבולות נמוכים למדידה, דיוק, ליניאריות, הפרעות ותגובתיות צולבת. התוצאות מדגימות את היכולת של בדיקה זו למדוד את ריכוז IgG נגד RBD של מטופל. מידע זה, יחד עם מודלים שפותחו מניסויים קליניים של חיסון COVID-19, יכולים לספק אמצעי להערכת רמת ההגנה החיסונית הנוכחית של אדם או קהילה מפני זיהום בCOVID-19.

לכן, בחיי היומיום שלנו, עלינו לשפר באופן אקטיבי את החסינות שלנו ולנהל אורח חיים בריא: שינה מספקת, תזונה בריאה, פעילות גופנית מתונה והימנעות מהרגלים רעים כמו עישון הם התנאים הבסיסיים לשיפור חסינות ופעילות גופנית נכונה. בנוסף, מצאנו ש-Cistanche יכול גם לשפר את החסינות, והגליקוזידים של פנילתאנואידים הכלולים ב-Cistanche יכולים לעכב את הייצור וההשפעה של גורמים מדכאים חיסוניים, ובכך לשפר את חסינות הגוף.

לחץ היכן לקנות cistanche

מבוא

נגיף קורונה חריף חריף 2 (SARS-CoV-2) הוא נגיף קורונה חדש שהתגלה כגורם למחלת הנשימה הקשה (COVID-19) בדצמבר 2019 בסין והתפשט במהירות, וגרם למגיפה עולמית . נגיף SARS-CoV-2 הוא חלק מהסוג Betacoronavirus ממשפחת Coronaviridae. חברים נוספים כוללים את תסמונת הנשימה הקשה חמורה Coronavirus 1 (SARS-CoV-1) ואת תסמונת הנשימה של המזרח התיכון (MERS-CoV).1 ההעברה הגבוהה של הנגיף הובילה להתפשטותו המהירה ברחבי העולם למרות מאמצים חסרי תקדים על ידי רשויות בריאות הציבור כדי להאט את התקדמות המגיפה, כולל נעילות, מנדטים של מסכות, קידום היגיינה ציבורית, השקעות ציבוריות בפיתוח מהיר של חיסונים וטיפולים, ואמצעים אחרים.

בדיקות אבחון לאיתור זיהום פעיל על ידי הנגיף והערכת התגובה החיסונית של הגוף לאתגר ויראלי מילאו תפקידים קריטיים במאמצים להגיב למגיפה, כמו גם להבין את המחלה והשפעותיה על הגוף. לזיהוי ישיר של הנגיף בדרכי הנשימה, פותחו שפע של מבחני הגברה של חומצות גרעין (כולל מבחני PCR) ומבחני אנטיגן נגיפי. בדיקות אלו הוכחו כמרכיבים חשובים באבחון קליני ובאסטרטגיות לניהול מחלות. עם זאת, מבחני זיהוי וכמויות נגיפי אינם מספקים מידע על ההיסטוריה החיסונית, התגובה או מצבו של הגוף, ואינם נותנים כל אינדיקציה לסיכון לזיהום עתידי או הדבקה חוזרת.

כדי להבין כיצד המערכת החיסונית של המטופל מגיבה לנגיף, אנו זקוקים למבחנים סרולוגיים. לפני בדיקות מולקולריות נרחבות וחיסונים, מבחני אלו שימשו לפעמים גם לאבחון זיהום על ידי SARS-CoV-2. הרציונל לגישה זו היה שניתן להשתמש בנוכחות של נוגדנים נגד נגיף חדש, במיוחד נוגדני IgM, ללא היסטוריה קודמת של זיהום, כדי לאבחן זיהום נוכחי אם שילוב עם תסמינים קליניים תואמים. עם זאת, גישה אבחנתית זו נזנחה במידה רבה בשלב מוקדם של המגיפה עם הצמיחה המהירה והזמינות הקלה של בדיקות אנטיגן וחומצות גרעין (NATs). עם זאת, בדיקות סרולוגיות עדיין מצאו כמה שימושים לניטור אפידמיולוגי ולבקרת התפרצות באוכלוסיות מסוימות.

ככל שהמגיפה התקדמה, שיתוף פעולה בין ממשלות, אנשי אקדמיה ותעשיית התרופות הוביל לפיתוח ובדיקה של מספר מועמדים לחיסון, שהגיעו לשיאו בסדרה של אישורים של רשויות הבריאות ברחבי העולם החל מסוף 2020. אמנם החיסון סיפק השפעה משמעותית על היקף וחומרת הזיהומים ברוב המקרים, צפויה דעיכה בלתי נמנעת בהגנה זו בהתבסס על ניסיון קודם עם חיסונים. עם זאת, אופי ההתפרקות ומשך ההגנה האפקטיבי משתנים מאוד בין חיסונים ליחידים, וההשפעה הקהילתית של אובדן ההגנה נותרה בלתי ידועה. בהתאם לכך, קיים ויכוח מתמשך לגבי התועלת, הצורך והתזמון של מינוני דחף של חיסונים לשמירה על ההגנה החיסונית מפני הנגיף, ויכוח שהתעצם עם הופעתן של גרסאות שונות של הזן המקורי.

כדי להבין ולהציג בצורה מדויקת את תגובתו של אדם לחיסון כדי לעזור לו לקבל החלטות אינדיבידואליות עם מיטב הידע הזמין, יש צורך בבדיקות נוגדנים כמותיות שיכולות למדוד ברגישות את רמות הנוגדנים שנוצרו על ידי החיסון, זיהום טבעי או שילוב של השניים. אך בעוד שרגישות, סגוליות וחזרה חיוניות, תוצאות מהירות וקלות מתן (כולל מטריצת הדגימה ומיקום הבדיקה) הם גם מאפיינים רצויים של כל בדיקה שצפויה להיות בשימוש נרחב.

יצרנים רבים יצרו ושיווקו מבחנים סרולוגיים. ניתן לסווג את הטכנולוגיה שמאחורי רוב מבחני החיסון הללו כבדיקות זרימה לרוחב (LFT) או מבחני חיסון מקושרים לאנזימים (ELISA). LFTs הם פשוטים לשימוש ודורשים כמות קטנה של דם אבל LFTs המדויקים ביותר דורשים ניקור ורידים כדי לקבל דגימת סרום או פלזמה לבדיקה. לאחרונה, פותחו כמה LFTs סרולוגיים שיכולים להשתמש בדגימות דם של אצבע. דוגמאות ל-LFT זמינים מסחרית הן SCoV-2 Detect IgG Rapid Test2 של InBios ו-CareStart COVID-19 IgM/IgG3 של Access Bio. למרות קלות השימוש וההחזרה המהירה של התוצאות, האתגר של LFTs הוא חוסר הכמות שלהם והרגישות הנמוכה יותר מטבעם בהשוואה ל-ELISAs במעבדה4. מגבלת הרגישות נובעת מהיעדר הגברה אנזים של האות, והיעדר שלבי שטיפה בין תגובות להפרדת הכימיקלים המגיבים. עם זאת, LFTs ממלאים תפקיד משמעותי באבחון בגלל העלות הנמוכה, המהירות וקלות השימוש שלהם.

קטגוריה מרכזית נוספת של בדיקות חיסוניות היא ELISAs. מבחני אימונוסורבנט הקשורים לאנזימים מבוצעים בדרך כלל באחת משתי שיטות:

1. ערכות מעבדה של ELISA המיועדות להפעלה במעבדות מוסמכות באמצעות 96-microplates בשילוב עם קוראי לוחות (למשל, ZEUS ELISA SARS-CoV-2 IgG Test System5; או EUROIMMUN Anti-SARS- CoV-2 ELISA (IgG)6).

2. קלטות טעונות מראש המיועדות להפעלה על מנתחי חימוניים מעבדתיים קנייניים (למשל, Roche's Elecsys Anti-SARS-CoV- 7; או Siemens ADVIA Centaur SARS-CoV-2 IgG (sCOVG)8). ELISAs אלו הן בדיקות רגישות גבוהה יותר שלעתים קרובות הן כמותיות למחצה.

למרבה הצער, שיטות אלו חסרות את המהירות וקלות השימוש של LFTs, מה שמצריך דם ניקור ורידים כדגימה הקלינית וצוות מיומן להריץ את הבדיקות במעבדה מוסמכת, שלעתים קרובות חייבת לבצע השקעות הון משמעותיות כדי להשיג רמות גבוהות של יכולת בדיקה. תפנית התוצאות היא בדרך כלל תוך מספר ימים, תלוי ביעילות פעולת הבדיקה. עם זאת, אפילו הפעולות היעילות ביותר יכולות לספק תוצאות בדיקה רק תוך מספר שעות בהתחשב במגבלות של טכנולוגיית הבדיקות החיסוניות הבסיסיות.

Brevitest Technologies, Inc. (Brevitest) פיתחה פלטפורמת בדיקות אימונו המבצעת בדיקות חיסוניות מקושרות אנזים בנקודת הטיפול תוך 15 דקות. הוא משלב את היתרונות של LFT (פשטות, נפח דגימה נמוך, עלות ומהירות) ו-ELISA (רגישות, ספציפיות, דיוק, כמות ואמינות). פלטפורמת Brevitest מורכבת מיחידת עיבוד לדוגמה (SPU) שמפעילה בדיקות בודדות על מחסניות בדיקה חד פעמיות. ה-SPU הוא מכשיר רובוטי קטן האוטומטי לחלוטין ומקיים אינטראקציה עם מערכת ניתוח ובסיס נתונים מרכזית הפועלת בענן (ה-Brevitest Cloud). הוא משתמש במחסנית קניינית המכילה ריאגנטים הנדרשים לביצוע כל שלבי ה-ELISA ומשתמש בחום ובמגנטים נעים כדי לשלוט בתהליך התגובה.

לאחר השלמת התגובות, ה-SPU מודד את השינוי בצבע במגיב האינדיקטור הנובע מהשלב האחרון של תהליך ה-ELISA. הקריאות האופטיות הגולמיות מועברות בצורה מאובטחת לענן Brevitest לצורך ניתוח ועיבוד לפני שהתוצאה זמינה למטופל ולרופא בזמן אמת. פרסמנו בעבר את השימוש בפלטפורמה זו כדי לזהות נוכחות של IgA מפריש נגד SARS-CoV-2 ברוק. 9

Brevitest פיתחה ואימתה בדיקה לכימות נוגדני SARS-CoV-2 anti-RBD IgG בדם מקל אצבע תוך פחות מ-15 דקות בפלטפורמה הקניינית שלה. בדוח זה, אנו מציגים נתונים ממחקרי האימות ודנים בשימושים הקליניים והאפידמיולוגיים הפוטנציאליים של הבדיקה.

חומרים ושיטות

חומרים, מכשירים וריאגנטים: פלטפורמת הבדיקות Brevitest כוללת שלושה מרכיבים: יחידת עיבוד דגימות (SPU), מחסנית טעונה מראש ותוכנה אנליטית מבוססת ענן (Brevitest Cloud). (ראה איור 1.) ה-SPU הוא מכשיר רובוטי אוטומטי מלא ממוזער עם אלמנטים מכניים, אופטיים ותרמי ויסות. ה-SPU משתמש במגנטים קבועים כדי לשלוט בתנועה של מיקרוספרות מגנטיות על פני מספר תאים בתוך המחסנית ומניע את המגנטים בכל תא באמצעות דפוסי ערבוב קנייניים.

בכל תא מתרחש שלב בודד של תגובת ELISA רב-שלבית על פני השטח של המיקרוספירות הללו. התגובה הסופית גורמת לייצור של תרכובת צבעונית הנמדדת כאות אופטי והקריאות הגולמיות נשלחות לענן Brevitest לניתוח. ישנם מספר אמצעי הגנה מובנים בפלטפורמה כדי להבטיח שהמחסנית מוכנסת כראוי, שהבדיקה הנכונה מתבצעת, שהמחסנית לא עברה את תאריך התפוגה שלה, תוצאות הבדיקה תקפות ומידע מזוהה של המטופל אינו בסיכון.

המחסנית נטענת מראש עם הריאגנטים הדרושים להפעלת מבחן COVID-19 IgG של Brevitest. המחסנית אינה מכשיר מיקרופלואידי, מכיוון שאין תנועה של ריאגנטים בתוך המחסנית; במקום זאת, מרכיבי המפתח של ELISA - אנטיגן, נוגדן לכידה ונוגדנים נותבים - קשורים למיקרוספרות מגנטיות המועברות בין בארות מגיב. האנטיגן שנלכד בו נעשה שימוש הוא ה-Receptor Binding Domain (RBD) של חלבון S1 מנגיף SARS-CoV-2. לאחר מכן, ה-IgG שנלכד מזוהה באמצעות IgG אנטי-אנושי המקושר למולקולת חזרת פרוקסידאז (HRP). שינוי הצבע הסופי מתרחש בתא המכיל TMB, שמשתנה מחסר צבע לכחול בנוכחות HRP. כל מחסנית מוגדרת להריץ 3 תגובות ELISA בו זמנית בערוצים נפרדים. שני ערוצים מכילים את הדגימה בדילול גבוה ונמוך, בהתאמה, וערוץ אחד טעון בריכוז ידוע של anti-SARS-CoV-2 Spike S1 IgG לבקרת איכות. חומרי הבדיקה, הכוללים את ה-SPU והמחסניות, פותחו ב-Brevitest Technologies, Inc. ויוצרו במעבדה המוסמכת CLIA שלהם.

דגימות נאספו מהנבדקים על פי פרוטוקול מאושר IRB לאחר הסכמה עם טופס הסכמה מדעת שאושרה על ידי IRB. הדגימות כוללות דם מקלות אצבע שהתקבל על פי נהלים סטנדרטיים עם אמצעי זהירות מתאימים. כדי לאסוף את דם מקל האצבע עבור מבחן Brevitest, נעשה שימוש בלאנסט חד פעמי 28G, ולאחר מכן איסוף עם צינורית מיקרו-קפילרית חד פעמית בנפח קבוע של 10 μl. נתוני היצרן עבור הצינור המיקרוקפילרי מצביעים על כך שנפח הדגימה משתנה<1% on clinical tests. The clinical history of the subjects was collected in a questionnaire and recorded before taking their sample.

אימות קליני: דגימות מקל אצבע (107 דגימות) התקבלו מאנשים שהגיבו לקריאה להשתתף במחקר הקליני שנערך במעבדה המוסמכת CLIA של Brevitest ביוסטון, טקסס. תשעים (90) דגימות התקבלו מאלה עם היסטוריה מדווחת של זיהום ב-SARS-CoV-2 ו/או מאלה שקיבלו לפחות מנה אחת מכל אחד משלושת החיסונים, והן סווגו כ"חיוביות". 17 (17) דגימות התקבלו מאנשים שלא היו להם היסטוריה רפואית של זיהום ב-SARS-CoV-2 ודווחו כי מעולם לא קיבלו חיסון נגד COVID-19, והן סווגו כ"שליליות".

דיוק: הדיוק של הבדיקה אופיינה במחקר בהנחיית CLSI EP05-A3. במחקר זה נבדקו שלוש דגימות המייצגות את ספקטרום הריכוזים שנתגלו בפעולות קליניות שגרתיות. הדגימות נבדקו בשכפולים של שניים במשך שלושה ימים בשני חלקים שונים ביום (בסך הכל שש חלקות) ושלושה מנתחים. התוכנה Analyse-it שימשה לחישוב התוצאות.

תגובתיות צולבת והפרעה: כדי לבדוק תגובתיות צולבת במבחן Brevitest, פאנל של דגימות הידוע שליליות ל-SARS-CoV-2 וחיוביות לנוגדני IgG לנגיפים הבאים התקבל מ-BioIVT: שפעת A , שפעת B, HBV, HCV, HIV, Haemophilus influenzae, אלפא וירוסים 229E, ו-NL63, בטא וירוסים OC43 ו-HKU1, RSV, Parainfluenza ודלקת ריאות Mycoplasma. דגימות אלו נבדקו במבחן Brevitest, ואלה עם תוצאות מתחת לגבול הגילוי (LOD; 6.2 BAU/mL) סווגו כלא-תגובתיות.

הפרעות נפוצות נרכשו מ-Sun Diagnostics כדי להעלות דגימות ולקבוע את השפעתן על הבדיקה. ארבע דגימות מקל אצבע שלא הכילו את המפריע (דגימות SARS-CoV-2 IgG נמוך וגבוהות) סופקו בהמוליזט (1000 מ"ג/ד"ל), ליפופרוטאינים עשירים בטריגליצרידים (500 מ"ג/ד"ל) ובילירובין מצומד (40 מ"ג). /dL). אחוז ההפרש למדגם הביקורת חושב עבור כל מדגם עם ספייק ונבדקו הפרשנויות של התוצאות.

ביצועים אנליטיים של המבחן: יכולות הזיהוי של המבחן, כולל הגבול של ריק (LOB) ו-LOD, נקבעו על סמך הנחיות מ-CLSI EP{{0}}A2. כדי להשיג את ה-LOB, נבדקו 4 דגימות ריקות של מקל אצבע בשכפולים של 2 למשך 3 ימים ב-2 מנות ו-3 מנתחים. LOD נקבע על ידי בדיקת 4 דגימות ברמה נמוכה בשכפולים של 2 במשך 3 ימים ב-2 מנות ו-3 מנתחים. 4 הדגימות ברמה נמוכה נוצרו על ידי ערבוב של דגימות שליליות מאושרות עם כמות ידועה של תקן WHO (0.17 μl של תקן 1000 BAU/mL). גבול הכמותיות (LOQ) חושב כריכוז הנמוך ביותר שנבדק גבוה מה-LOD בתוספת פי 4.5 סטיית התקן שנצפתה במחקר ה-LOD שלנו. הניתוח הסטטיסטי נערך עם התוכנה Analyse-it. מדריך מחקר של CLSI EP06-A בוצע כדי לקבוע את הליניאריות. דגימות ריקות סופקו עם תקן WHO הבינלאומי (WHO Reference Standard NIBSC 20/136) כדי להכין 10 דגימות בריכוז ידוע. הדגימות נבדקו ב-4 שכפולים באמצעות מנת ריאגנטים אחת.

תוצאות

נתונים דמוגרפיים: להלן פירוט הדמוגרפיה של האוכלוסייה הנבדקת (טבלה 1).

ביצועים קליניים: בשל חוסר המעשיות של קבלת דגימות טרום-COVID של דם מלא במקל האצבע והיעדר בדיקת התייחסות למקל האצבע למדידה כמותית של נוגדני COVID-19 IgG, בוצע מחקר הסכם קליני המבוסס על היסטוריה קלינית. דגימות נאספו בסך הכל מ-107 נבדקים. נתוני היסטוריה קלינית התקבלו גם מנבדקים אלה; כל הנתונים דווחו בעצמם ואימות הנתונים בוצע במידת האפשר.

בהתבסס על נתוני ההיסטוריה הקלינית שדווחה עצמית, 17 נבדקים מעולם לא סבלו מהדבקה סימפטומטית ב-COVID-19 ומעולם לא חוסנו. 90 הנבדקים האחרים נדבקו, חוסנו או שניהם. נבדקים שלא חוסנו ולא נדבקו צפויים ללא נוגדנים ניתנים לזיהוי (כלומר מתחת לגבול הגילוי) והם אופיינו כשליליים. לשאר הנבדקים היו רמות ניתנות לזיהוי של נוגדנים (כלומר מעל גבול הגילוי) ואופיינו כחיוביים.

התוצאות הראו הסכמה כללית של אחוז חיובי (PPA)/רגישות של 97.8 אחוז (95 אחוז CI: 92.42 אחוז - 99.40 אחוז ) והסכמה כללית של אחוז שלילי (NPA)/ספציפיות של 100 אחוז (95 אחוז CI : 79.61 אחוז - 100 אחוזים ). ראה טבלה 2.

במחקר הליניאריות הוכנו תמיסות בריכוזים ידועים ונבדקו במכשיר Brevitest כדי להשוות בין הערכים שהתקבלו. ליניאריות הודגמה על פני מרווח המדידה האנליטי של 22.2 עד 2000 BAU/mL (ראה איור 2). מתוך 10 הדגימות שנבדקו, 2 נקודות, 0 BAU/mL ו-4000 BAU/mL הוסרו מהטווח הליניארי (ראה טבלה 5). בהתחשב בהערכות של LOB, LOD, LOQ וליניאריות, מרווח המדידה האנליטי הוא בין 22.2 ל-2000 BAU/mL.

תגובתיות צולבת והפרעות: הערכנו את המבחן לגבי נוגדנים בעלי פוטנציאל תגובה צולבת. כמה דגימות HCV (2), דגימות HIV (1) וכל דגימות הקורונה היו מעל גבול הזיהוי עבור בדיקת SARS-CoV-2 IgG. שאר הדגימות היו מתחת ל-LOD (ראה טבלה 6).

דִיוּן

לעתים קרובות אומרים שזיהום הוא מלחמה בין הפתוגן למארח. במלחמה ההיא, המרכיב המרכזי של ההגנה שלנו - בין אם מפני זיהום אינדיבידואלי או מגיפה עולמית - הוא מערכת החיסון האנושית.

ברמה הבסיסית ביותר, מערכת החיסון מורכבת מתאים, חלבונים ומולקולות אחרות הפועלות יחד כדי לזהות פתוגנים, למנוע זיהום, ואם זיהום יתפוס, לחסל את הפתוגן הפולש או להגיע ל"קיפאון" בר קיימא עם זה.

בהמשך לאנלוגיה של המלחמה, למערכת החיסון יש יכולת "אינטליגנציה" נרחבת המשתמשת בקולטנים משטח התא, ציטוקינים, כימוקינים, תאים דנדריטים, אימונוגלובולינים, קומפלקסים היסטמין עיקריים ואלמנטים אחרים כדי לזהות רעלים, חיידקים, פטריות, טפילים ווירוסים. , ולשלוח התראות לחלקים אחרים של מערכת החיסון על כך שאיום זוהה ונדרשת פעולה.

בתגובה, מערכת החיסון מגייסת מגוון רחב של "נשק" כדי לנטרל ולחסל את האיום, לרבות, אך לא רק מיני חמצן תגובתיים, פפטידים אנטי-מיקרוביאליים, תאי אפקטור B, תאי פלזמה, תאי CD4 T, תאי T CD8. , תאי NK, מקרופאגים, נויטרופילים, ומגוון יוצא דופן של אימונוגלובולינים חופשיים, או נוגדנים. ניתן לראות את הרכיבים הללו כמרכיבים של שלוש תת-מערכות עיקריות - חסינות מולדת, חסינות רירית וחסינות הומורלית - אך הקישוריות והאינטראקציה של תת-מערכות אלו הן נרחבות, ומוסיפות הן יתירות והן מורכבות למערכת החיסון הכוללת. 10

נוגדנים הם גורמים חשובים לחסינות הרירית וההומורלית, אך גם משתתפים בתהליכי זיהוי ופתוגנים. שני מצבי האפקטור העיקריים שלהם הם נטרול ואופסוניזציה, כאשר לנטרול יש חשיבות מיוחדת כאשר מאותגרים עם פתוגן ויראלי. חוקרי ומפתחי חיסונים הקדישו תשומת לב מיוחדת לנטרול נוגדנים בגלל יכולתם למנוע כניסת RNA ויראלי לתאי מאכסן, ובכך לעכב את תהליך השכפול הנגיפי שהוא מרכיב הכרחי בכל זיהום רציני.

התפקיד המגן של נוגדנים הוכח ב-COVID-19 הן בסרום הבראה והן בנוגדנים חד שבטיים טיפוליים, אשר הוכחו כמועילים במיוחד לאנשים עם רמות נמוכות של נוגדנים אנדוגניים.11,12 ה-FDA אישר נוגדנים חד שבטיים מבחינה טיפולית באנשים שאובחנו לאחרונה עם נגיף הקורונה-19 ובאופן מניעתי אצל אנשים שאינם מסוגלים ליצור תגובה חיסונית נגד SARS-CoV-2.13

עם זאת, בעוד שלנוגדנים יש תפקידים ביולוגיים חשובים כמשפיעים של חסינות, הם יכולים להיות בעלי תפקידים קליניים ואפידמיולוגיים חשובים עוד יותר כאינדיקטורים לחסינות.

תפקידים אלה מבולבלים לעתים קרובות; אנו שומעים באופן קבוע ש"חסינות היא יותר מנוגדנים" כסיבה לא לבדוק רמות נוגדנים. התבוננות זו, כמובן, נכונה. נדרש יותר מנוגדנים כדי ליצור תגובה חזקה, מיותרת ומהירה הנדרשת להישרדות המין האנושי בסביבה העוינת שבה אנו חיים.

אבל השאלה היא לא האם רמות נוגדנים הן שם נרדף לחסינות; השאלה היא אם רמות הנוגדנים נמצאות בקורלציה עם חסינות.

מנקודת מבט קלינית, המדד החשוב ביותר להגנה חיסונית כוללת הוא הפחתה בסיכון לזיהום סימפטומטי בהשוואה לאוכלוסייה הכללית. (זיהומים אסימפטומטיים עשויים להיות רלוונטיים לשאלות אפידמיולוגיות מסוימות, אך בדרך כלל הם אינם נחשבים למצב מחלה בעל חשיבות קלינית.) מדד זה נמצא בשימוש נרחב להערכת היעילות של חיסוני COVID-19.14

לניסויי חיסונים, למשל, יש נקודת סיום ראשונית של "יעילות החיסון", שהיא הפחתת שיעור הזיהום בזרוע הפעילה (החוסנה) ביחס לזרוע הביקורת (פלצבו).

עם זאת, מכיוון ששיעורי ההידבקות בדרך כלל נמוכים למדי, בניסויי חיסונים יש מספר גדול מאוד של נבדקים. משך הזמן והעלות (הן בכסף והן בסיכון לבריאות האדם) של ניסויים כאלה היו עניין של דאגה משמעותית לקובעי המדיניות והתעשייה, מכיוון שהם מגבילים תגובות להתפרצויות ויראליות הנעות במהירות שעלולות להפוך למגיפות עולמיות. כתוצאה מכך, קיים כבר זמן רב רצון למצוא סמן ביולוגי פונדקאי שיוכל לשמש להערכת המצב החיסוני של פרטים ואוכלוסיות, ובכך להנחות הן את פיתוח החיסון והן את ניהול התגובה למגפה.

בקיצור, אנחנו רוצים דרך קלה למדידת חסינות.

בהתחשב במה שאנו יודעים על אופן פעולת המערכת החיסונית, נוגדנים הם קטגוריית מדידה ברורה שיש לקחת בחשבון עבור תפקיד זה. הם מעורבים הן בתגובה המוקדמת לאתגר פתוגן (באמצעות יצירת IgM פנטאמרי ו-IgA מפריש דימרי) והן בחסינות ארוכת טווח דרך תאי זיכרון B שמתמיינים לתאי פלזמה מייצרי נוגדנים כאשר פתוגן מופיע מחדש ומייצרים חיסון משני תגובה.15

עם זאת, השימוש בנוגדנים כמתאם של חסינות הפריע בגלל היעדר תשובות לשתי שאלות בסיסיות:

ההופעה האחרונה של תקן בינלאומי לריכוז נוגדנים הייתה צעד ראשון חשוב בתשובה לשתי השאלות הללו. ללא תקן כזה, ההשוואה של מערכי נתונים של בדיקות נוגדנים נעה בין קשה לבלתי מעשית לבלתי אפשרית. תקן ההתייחסות של WHO NIBSC 20/13616 הוקם בדצמבר 2020 והוא פיתוח מכריע ומבורך המבטיח להאיץ באופן דרמטי את היכולת שלנו למצוא ולהפיץ תובנות מעניינים מדענים, קלינאים וקובעי מדיניות.

התפתחות חשובה נוספת לאחרונה שהעצימה באופן דרמטי את הפוטנציאל למדידת חסינות הוא המספר וההיקף חסרי התקדים של ניסויי חיסונים שבוצעו במהלך 12 החודשים האחרונים. כאשר נתוני הניסויים הללו פורסמו ונותחו, עלו שתי תובנות חשובות מאוד:

א. נוגדנים מנטרלים נמצאים בקורלציה גבוהה עם חסינות נגד COVID-19.17 מתחילת המגיפה, החוקרים התמקדו בחלבון הספייק של וירוס SARS-CoV-2.

ההתמקדות הזו זכתה לתגמול וחוזק על ידי נתונים מניסויי חיסון mRNA, שהראו כי נוגדנים נגד חלבון הספייק שנוצר על ידי החיסון היו מגנים מאוד.

ב. בדיקות נוגדנים מסוימות הן מתאם טוב להגנה מפני נגיף הקורונה-19. 18 בהתבסס על התובנה שלעיל, אין זה מפתיע שמבחני נטרול - הן סוגי וירוסים חיים והן סוגי פסאודו-וירוס - הם מתאמים טובים לחסינות נגד COVID-19 ולהפחתת חומרת המחלה. עם זאת, מבחני נוגדנים מנטרלים הם קשים (ובמקרה של מבחני וירוסים חיים, מסוכנים) לביצוע, ובכך מגבילים את זמינותם למספר הגדרות קליניות בלבד. עם זאת, מחקר נוסף מצא כי נוגדנים קושרים נגד תחום ה-RBD נמצאים גם בקורלציה חזקה עם הגנה מפני COVID-19, אולי בשל ההשפעה המנטרלת של קשירת נוגדנים תחרותית המפריעה לקשירה של חלבון הספייק ל-ACE{ קולטן {5}}.

כל ההתפתחויות האחרונות הללו - הופעת תקן בינלאומי, זיהוי של נוגדנים מנטרלים כמתאמים מצוינים של הגנה, והרחבת המתאם הזה לבדיקות נוגדנים אחרות, נגישות יותר - יצרו את התנאים לשיפור דרמטי בניהול הקליני של COVID-19 באמצעות בדיקות נוגדנים כמדריך. אבל כדי ליישם את השיפור הזה, דרושה טכנולוגיית בדיקה שיכולה לספק תוצאות כמותיות ביחידות סטנדרטיות של BAU/mL עם דיוק מספיק בנקודת הטיפול ממדגם נוח וידידותי למטופל בטווח זמן מהיר.

Brevitest Quantimmune™ COVID-19 IgG Antibody Test היא בדיקה כמותית המציגה את התוצאות ב-BAU/mL, לפי WHO Reference Standard NIBSC 20/136 לנוגדן אנטי-SARS-CoV-2. בפיתוח בדיקה זו, נמדדו וחושבו ה-LOB, LOD, LOQ, השחזור והלינאריות. ה-LOD חושב להיות 6.2 BAU/mL, וה-Lwas OQ היה 22.2 BAU/mL. המחקרים לקביעת ערכים אלה נערכו על דגימות מקל אצבע של חולים שלא נדבקו או חוסנו בעבר. דגימות ממטופלים תואמו גם ברמות נמוכות של תקני WHO כדי ליצור רמות נמוכות של דגימות ששימשו בחישובים. כדי לבדוק ליניאריות, מדגם שלילי זכה לרמות ידועות של תקן הייחוס של WHO. בהתבסס על התוצאות, הטווח הניתן לכימות של הבדיקה נקבע בין 22.2 ל-2000 BAU/mL. מחקרים מדויקים הוכיחו דיוק בתוך החלקה של 13.8 אחוזים וניתנות לשחזור של 23.4 אחוז קורות חיים. תגובתיות צולבת והפרעות נבדקו גם כדי לקבוע אם דגימות או חומרים פוטנציאליים יכולים להשפיע על תוצאת הבדיקה.

Brevitest מודד נוגדנים כנגד חלק ה-RBD של חלבון הספייק, שהם קורלטיביים מאוד לפעילות מנטרלת.19 במחקר שפורסם לאחרונה, חוקרים ניתחו את הקשר בין ריכוז נוגדנים מסוימים לבין הגנה מפני SARS-CoV-2 כפי שנכמת כ יעילות החיסון, כלומר הפחתה בשיעור ההדבקה הסימפטומטית עבור נבדקים מחוסנים לעומת לא מחוסנים. 18 במחקר, נוגדנים קושרים ומנטרלים ב-28 ימים לאחר המנה השנייה נמדדו אצל מקבלי חיסון נגועים ולא נגועים, כאשר ריכוזי נוגדנים דווחו באמצעות תקן הייחוס של WHO. יעילות חיסון של 50 אחוז כנגד זיהום סימפטומטי עם וריאנט אלפא (B.1.1.7) ברובו של SARS-CoV-2 הושגה בביטחון של 95 אחוז (VE50@95) בריכוז של נוגדנים אנטי-RBD של 109 BAU/mL.18

במבחן Brevitest, המספר הזה שימש לקביעת הפרש החיתוך בין "נמוך" ל"גבוה", עם ערכים מתחת ל-LOD שדווחו כ"לא זוהה". איור 3 מציג את החתכים של מבחן Brevitest. לפיכך, ניתן להשתמש בתוצאות של Brevitest Quantimmune™ COVID-19 IgG Antibody Test כדי להעריך את רמת ההגנה בסביבה קלינית.

הזמינות של סרולוגיה מהירה וכמותית בסביבה נקודתית באמצעות מקל אצבע שיכולה להעריך את רמת ההגנה החיסונית על בסיס אינדיבידואלי וקהילתי היא חסרת תקדים ועשויה להשפיע עמוקות על התגובה למגיפות כמו COVID{{ 2}}. לדוגמה, במתן מאיץ חיסונים, פקידי בריאות הציבור ומפתחי חיסונים המליצו בדרך כלל על חיזוק לאחר זמן מסוים. ההמלצה הנוכחית לחיסוני mRNA, למשל, היא לקבל דחף לאחר 6 חודשים. עם זאת, גישת "זמן מאיץ קבוע" זו יכולה להיות לא אופטימלית עבור מטופלים (במיוחד קשישים) אשר נוטים לאבד את חסינותם מהר יותר מ-6 חודשים. בנוסף, עבור אנשים רבים חיסון נגד COVID-19 מעניק הגנה של 12 חודשים או יותר. עבור פלח זה של האוכלוסייה המחוסנת, זה יכול להיות אופטימלי לדחות חיזוק עד שהחסינות שלהם תרד מתחת לסף. לדחייה כזו יכולה להיות יתרונות מרובים: היא יכולה להאריך את תקופת ההגנה הכוללת עבור אותו מטופל, אולי ליצור תגובה משנית חזקה וספציפית יותר, ולאפשר שימוש טוב יותר באספקת חיסונים מוגבלת.

איור 4 מציג נתונים שנלקחו ממחקר האימות הקליני של Brevitest, המראה רק נבדקים שקיבלו חיסון mRNA (Moderna או Pfizer-BioNTech). בעוד שמערך הנתונים קטן יחסית (n=73), יותר מ-12 אחוז מהנבדקים היו מתחת לרמת VE50@95 של 109 BAU/mL לפני 6-תאריך החיזוק המומלץ לחודש, מה שמצביע על כך שיכול להיות שיש להם פער ההגנה אם יחכו להגביר. מצד שני, ליותר מ-31 אחוזים מהנבדקים היו רמות נוגדנים מעל VE50@95, מה שמרמז על כך שעדיין הייתה להם חסינות שיורית, לפחות נגד וריאנט B.1.1.7, ועשויים להאריך את תקופת ההגנה החיסונית שלהם על ידי דחיית מאיץ. . למרות שהחלטות כאלה תמיד צריכות להיעשות בהתייעצות עם רופא, גישה זו יכולה להיות מדריך מועיל עבור אלה המנסים לנהל את חסינות המטופל.

מקרה שימוש קליני שני עשוי להיות הערכת התגובה החיסונית לאחר זיהום או חיסון. הספציפיות של המרת סרוק משתנים בין אנשים בהתאם לגיל, מבנה גנטי, מחלה בסיסית, תרופות וגורמים אחרים. אנשים שמתחסנים מייצרים סוגים וריכוזים שונים של נוגדנים, ומאפיינים אלה משתנים עם הזמן. מידע על ריכוז הנוגדנים הנוכחי של המטופל יכול להנחות את החלטות אורח החיים על-ידי התחשבות בסיכונים הקשורים לרמות ההגנה ולחשיפה אפשרית של ויראלית בסביבות שונות.

שימוש שלישי יכול להיות בהקרנה ובניטור של חולים העוברים טיפול נוגדנים, שכן החלטות יכולות להיות מושפעות מרמות הנוגדנים שזוהו. לדוגמה, הוכח שטיפולי הבראה בפלזמה ונוגדנים חד שבטיים טיפוליים יעילים יותר עבור חולים ללא נוגדנים לעומת חולים שיש להם נוגדנים אנדוגניים נגד SARS-CoV-2. 11,12 לפיכך, מידע זה יכול לשמש גם כדי לזהות חולים שירוויחו יותר ממתן נוגדנים חד שבטיים, טיפולית או מניעתית, ולסייע לספקי שירותי בריאות בניהול מתן הטיפולים הללו.

לבסוף, ניתן לשפר מאוד מחקרי שכיחות סירו-שכיחות על ידי שימוש בבדיקת נוגדנים כמותית להערכת חסינות העדר. בין אם נעשה ברמת הקהילה או במסגרות מתאימות אחרות כגון משרדים, מפעלי ייצור או בתי ספר, מודלים אפידמיולוגיים וקבלת החלטות בבריאות הציבור ישתפרו מאוד עם בדיקה מדויקת יותר וקלה לניהול, במיוחד כזו ש הוא מחובר לענן ובכך מסוגל לראות "מעוף הציפור" של חסינות על ידי שילוב תוצאות נוגדנים בזמן אמת לתוך מערכת תוכנת מיקום ומיפוי גיאוגרפי.

סיכום

מחקרים אחרונים הראו שבדיקת נוגדנים כמותית נגד RBD IgG היא מתאם שימושי להגנה חיסונית מפני COVID-19. כדי למקסם את ההשפעה של תובנה חשובה זו, בדיקה מהירה (<15 minutes) and precise, requiring only a fingerstick sample of blood, and capable of running in a point-of-care setting is needed.

מבחן Brevitest יכול לכמת את כמות נוגדני SARS-CoV-2 IgG בדגימות מקל אצבע ב-BAU/mL, לפי תקן WHO Reference 20/136. מאפייני הביצועים שלו מוצגים בעבודה זו. במבחני אימות המבחן, הגבולות התחתונים של מדידה, דיוק, ליניאריות, הפרעות ותגובתיות צולבת נקבעו והוערכו.

בין השימושים האפשריים, בדיקה זו יכולה להוות כלי רב ערך לייעל את העיתוי של חיזוק חיסון, לאמת המרת סרוק בקבוצות סיכון חיסוניות וקבוצות סיכון אחרות, לייעל את השימוש הטיפולי והמניעתי בנוגדנים חד שבטיים, ובאופן רחב יותר, להעריך את הפרט והאוכלוסייה. תגובות חיסוניות, במיוחד ייצור של נוגדני IgG, המופעלות על ידי SARS-CoV-2 או החיסון. מידע על מספר הנוגדנים ל-SARS-CoV-2 הקיימים בדגימה של אדם בזמן נתון עשוי להיות בעל ערך, מכיוון שהוא יכול להנחות החלטות טיפוליות, מניעה או סגנון חיים שיכולים למנוע או לנהל את COVID-19 .

הפניות

1 Lu, R., Zhao, X., Li, J., Niu, P., Yang, B., Wu, H., ... & Tan, W. (2020). אפיון גנומי ואפידמיולוגיה של נגיף קורונה חדש לשנת 2019: השלכות על מקורות הנגיף וקשירת הקולטן. The Lancet, 395(10224), 565-574.

2 מנהל המזון והתרופות האמריקאי. InBios International Inc. EUA210368 מכתב הרשאה, 24 באוגוסט 2021.

3 מנהל המזון והתרופות האמריקאי. Access Bio Inc. EUA201309 מכתב הרשאה, 06 באוגוסט 2021.

4 Trombetta, BA, Kandigian, SE, Kitchen, RR, Grauwet, K., Webb, PK, Miller, GA, ... & Suliman, S. (2021). הערכה של מבחני זרימה לרוחב סרולוגיים עבור וירוס קורונה של תסמונת נשימה חריפה חריפה-2. מחלות זיהומיות של BMC, 21(1), 1-14.

5 מנהל המזון והתרופות האמריקאי. ZEUS Scientific Inc. EUA201833 מכתב הרשאה, 12 במאי 2021.

6 מנהל המזון והתרופות האמריקאי. מכתב הרשאה של EUROIMMUN US Inc., 4 במאי, 2020.

7 מנהל המזון והתרופות האמריקאי. Roche Diagnostics EUA200514 מכתב הרשאה, 19 במאי 2021.

8 מנהל המזון והתרופות האמריקאי. Siemens Healthcare Diagnostics Inc. EUA202670 מכתב הרשאה, 17 ביוני 2021.

9 Varadhachary, A., Chatterjee, D., Garza, J., Garr, RP, Foley, C., Letkeman, A., ... & Linbeck III, L. (2020). רוק anti-SARS-CoV-2 IgA כסמן ביולוגי נגיש של חסינות רירית נגד COVID-19. MedRxiv.

10 Janeway, C. (2001). אימונוביולוגיה: מערכת החיסון בבריאות ובמחלות. זֵר.

11 Hamilton, FW, Lee, TC, Arnold, DT, Lilford, R., & Hemming, K. (2021). האם פלזמה להחלמה חסרת תועלת ב-COVID-19? ניתוח מחדש בייסיאני של הניסוי האקראי מבוקר RECOVERY. כתב העת הבינלאומי למחלות זיהומיות.

12 Horby, PW, Mafham, M., Peto, L., Campbell, M., Pessoa-Amorim, G., Spata, E., ... & Landray, MJ (2021). Casirivimab ו-imdevimab בחולים שאושפזו בבית החולים עם COVID-19 (RECOVERY): ניסוי אקראי, מבוקר, פתוח, פלטפורמה. medRxiv.

13 Deb, P., Molla, MMA, & Rahman, KSU (2021). עדכון לנוגדן החד שבטי כאופציה טיפולית נגד COVID-19. בטיחות ביולוגית ובריאות.

14 Bernal, JL, Andrews, N., Gower, C., Robertson, C., Stowe, J., Tessier, E., ... & Ramsay, M. (2021). היעילות של החיסונים Pfizer-BioNTech ואוקספורד-AstraZeneca על תסמינים הקשורים לקוביד-19, אשפוזים בבית חולים ותמותה בקרב מבוגרים באנגליה: מחקר שלילי של מקרה-ביקורת. BMJ, 373.

15 פרהם, פ' (2014). מערכת החיסון. מדע גרלנד.

16 ארגון הבריאות העולמי. (2020). הקמת התקן הבינלאומי ופאנל ההתייחסות של ארגון הבריאות העולמי לנוגדנים נגד SARS-CoV-2. ועדת מומחים לתקינה ביולוגית, ז'נבה, 9-10.

17 Khoury, DS, Cromer, D., Reynaldi, A., Schlub, TE, Wheatley, AK, Juno, JA, ... & Davenport, MP (2021). רמות נוגדנים מנטרלים מנבאות מאוד הגנה חיסונית מפני זיהום SARS-CoV-2 סימפטומטי. רפואת טבע, 1-7.

18 Feng, S., Phillips, DJ, White, T., Sayal, H., Aley, PK, Bibi, S., ... & Voysey, M. (2021). מתאמים של הגנה מפני זיהום SARS-CoV-2 סימפטומטי ואסימפטומטי. רפואת טבע, 1-9.

19 Dolscheid‐Pommerich, R., Bartok, E., Renn, M., Kümmerer, BM, Schulte, B., Schmithausen, RM, ... & Hartmann, G. (2021). מתאם בין אנטי-SARS-CoV-2 IgG ELISA כמותי ופעילות ניטרול. Journal of Medical Virology, 94(1), 388-392.

Javier T. Garza1*, Jacob Quick1*, Dev Chatterjee1*, Robert P. Garr1, Atul Varadhachary1, Leo Linbeck III1* 1Brevitest Technologies, Inc., Houston, TX. *מחברים אלה תרמו במידה שווה

מחברים מקבילים:

Javier Garza: javierg@fannininnovation.com

Dev Chatterjee: dev@fannininnovation.com

אינטרסים מתחרים:

JTG, JQ, DC, AV ו-LL הם עובדים של Brevitest Technologies, Inc.

תמיכה במחקר:

פיתוח של פלטפורמת Brevitest נתמך על ידי המכון הלאומי לניצול סמים (NIDA) והמכון הלאומי לבריאות מיעוטים ובריאות (NIMHD) במכון הלאומי לבריאות (NIH), מספרי מענק: 1 R43 DA{{2} }; 1 R43 MD013409-01A1; 1 R43 DA043325-01, 2 R44 DA043325-02, 5 R44 DA043325-03; 3 R43 DA041966-01S1, קרן Vijay and Marie Goradia ו-Fanin Innovation Studio.

תרומות מחבר:

כל המחברים תרמו לתפיסה, עיצוב או ביצוע של העבודה. כל המחברים בחנו את כתב היד בצורה ביקורתית ונתנו אישור סופי לכתב היד.

For more information:1950477648nn@gmail.com