חומצה אסקורבית מווסתת את החסינות, נוגד חמצון ואפופטוזיס ב-Abalone Haliotis Discus Hannai Ino חלק 1

תַקצִיר: המחקר הנוכחי נערך כדי לחקור את התפקידים של חומצה אסקורבית (AA) בתגובה חיסונית, נוגד חמצון ואפופטוזיס באבלון (Haliotis discus hannai Ino). שבע דיאטות מטוהרות למחצה עם רמות מדורגות של AA (0, 50, 100, 200, 500, 1000 ו-5000 מ"ג/ק"ג) הוזנו לאבלון (ראשוני משקל: 12.01 ± 0.001 גרם, אורך מעטפת ראשוני: 48.44 ± 0.069 מ"מ) למשך 100 ימים. ההישרדות, שיעור העלייה במשקל והעלייה היומית באורך המעטפת לא הושפעו מ-AA תזונתיים. תכולת AA בזימים, בשרירים ובבלוטות העיכול של אבלון גדלה באופן משמעותי על ידי AA תזונתי. מבחינת חסינות, AA בתזונה שיפר משמעותית את ספירת ההמוציטים הכוללת, התפרצות נשימתית ופעילות פגוציטית בהמולימפה ופעילות ליזוזים בהמולימפה ללא תאים (CFH). בבלוטת העיכול, מסלולי האיתות התלויים TLR-MyD88-ו-TLR-MyD88-דוכאו על ידי תוספת AA בתזונה. רמות ה-mRNA של -defensin ו- arginase-I בבלוטת העיכול עלו באופן משמעותי על ידי AA תזונתיים. בזימים, רק מסלול האיתות התלוי TLR-MyD88- היה מדוכא על ידי AA תזונתיים כדי להפחית את הדלקת באבלון. רמת יצירת המיתוסים 6 בזימים הווסרה משמעותית על ידי AA תזונתי. לאחר זיהום Vibrio parahaemolyticus, מסלול האיתות TLR בבלוטת העיכול דוכא על ידי AA תזונתיים, שהפחית את הדלקת באבלון. במונחים של נוגד חמצון, פעילויות סופראוקסיד דיסמוטאז, גלוטתיון פרוקסידאז וקטלאזות, כמו גם יכולת אנטי-חמצון כוללת ותכולת גלוטתיון מופחתת ב-CFH, היו מווסתים באופן משמעותי. תכולת המלונדיאלדהיד הייתה מווסתת משמעותית על ידי AA בתזונה. היכולת האנטי-אוקסידטיבית שופרה על ידי הפעלת מסלול Keap1-Nrf2 באבלון. במונחים של אפופטוזיס, AA תזונתיים יכול לשפר את יכולת האנטי-אפופטוזיס באמצעות מפל האיתות JNK-Bcl-2/Bax באבלון. לסיכום, תזונתית AA הייתה מעורבת בוויסות חסינות, נוגד חמצון ואפופטוזיס באבלון.

גליקוזיד של cistanche יכול גם להגביר את הפעילות של SOD ברקמות הלב והכבד, ולהפחית באופן משמעותי את תכולת הליפופוסצין וה-MDA בכל רקמה, תוך ניקוי יעיל של רדיקלי חמצן תגובתיים שונים (OH-, H₂O₂ וכו') ומגן מפני נזקי DNA הנגרמים על ידי OH-רדיקלים. לגליקוזידים פנילתנואידים של Cistanche יש יכולת ניקוי חזקה של רדיקלים חופשיים, יכולת צמצום גבוהה יותר מאשר ויטמין C, משפרים את פעילות ה-SOD בתרחיף זרע, מפחיתים את תכולת ה-MDA ובעלי השפעה הגנה מסוימת על תפקוד קרום הזרע. פוליסכרידים של Cistanche יכולים להגביר את הפעילות של SOD ו-GSH-Px באריתרוציטים וברקמות ריאה של עכברים מתבגרים שנגרמו על ידי D-galactose, כמו גם להפחית את תכולת ה-MDA והקולגן בריאה ובפלזמה, ולהגדיל את תכולת האלסטין. אפקט ניקוי טוב על DPPH, הארכת זמן ההיפוקסיה בעכברים מזדקנים, שיפור הפעילות של SOD בנסיוב, ועיכוב ניוון פיזיולוגי של ריאות בעכברים מזדקנים בניסוי. עם ניוון מורפולוגי תאי, ניסויים הראו כי ל-Cistanche יש יכולת נוגדת חמצון טובה ובעלת פוטנציאל להיות תרופה למניעה וטיפול במחלות הזדקנות העור. יחד עם זאת, לאכינאקוסיד ב-Cistanche יש יכולת משמעותית לנטרל רדיקלים חופשיים של DPPH ובעל יכולת לנקות מיני חמצן תגובתיים ולמנוע פירוק קולגן הנגרמת על ידי רדיקלים חופשיים, וכן יש לו אפקט תיקון טוב על נזקי אניון רדיקלים חופשיים של תימין.

לחץ על Cistanche Tubulosa

【למידע נוסף:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

מילות מפתח: אבלון; חומצה אסקורבית; חֲסִין; אנטי חמצון; אפופטוזיס

1. הקדמה

חומצה אסקורבית (AA), הידועה גם בשם ויטמין C, ידועה כמיקרו-נוטריינט חיוני המשמש כקו-פקטור הקשור להגברת פעילותם של אנזימים אנושיים מרובים ותורם לתגובה חיסונית ולהתפתחות מערכת העצבים בבני אדם [1,2 ]. בשל היכולת המוגבלת של AA להישמר באורגניזם, יש צורך בצריכה סדירה ומספקת למניעת מחסור ב-AA. AA נדרש בכמויות עקבות ממקורות אקסוגניים לצמיחה ממוצעת, פעילויות פיזיולוגיות, רבייה ובריאות ברוב היונקים [3-5]. לגבי תפקודים חיסוניים, AA תורם לשמירה על שלמות המחסום החיסוני וריפוי פצעים [1]. זה יכול להגביר את תפקודם של פגוציטים, כגון שיפור תנועתיותם, כימוטקסיס, פגוציטוזיס והרג חיידקים [6-9]. מחקרים קודמים דיווחו על השפעות חיסוניות שונות של AA על תאי B, תאי T ותאי NK ביונקים [10-12]. בינתיים, AA קשור גם לאפופטוזיס. זה מעכב אפופטוזיס שריר הלב על ידי מניעת Bax (חלבון X הקשור ל-BCL-2) ומגביר את היכולת של Bcl-2 (רגולטור אפופטוזיס bcl-2) לעכב שחרור ציטוכרום-C מהמיטוכונדריה אל הציטופלזמה ובהמשך מפחית את הקספאז-3, שמתחיל אפופטוזיס [13]. כנוגד חמצון טבעי, AA מפחית מיני חמצן תגובתיים (ROS) ומיני חנקן תגובתיים (RNS) על ידי הקניית אלקטרונים ומניעת חמצון של תרכובות אחרות [14-17]. AA יכול גם לאפשר למולקולות נוגדות חמצון אחרות, כגון גלוטתיון (GSH), -קרוטן, אורט ו-טוקופרול, להתחדש מהרדיקלים החופשיים שלהם [18,19].

בניגוד לבעלי חיים יבשתיים, קיימים מעט דיווחים יחסית על תגובה חיסונית ואפופטוזיס בחיות מים. כמויות מתאימות לתזונה של AA יכולות לייעל צמיחה, בריאות ועמידות בפני מתחים בבעלי חיים מים [20]. רוב המחקרים על AA בחיות מים מתמקדים בהערכת דרישות ה-AA המינימליות לצמיחה מקסימלית וגיבוש דיאטה זולה ביותר. דרישות ה-AA משתנות בין המינים, הגודל, התזונה ותנאי החקלאות. הכמות המומלצת של AA תזונתי נעה בין 10 ל-10,000 מ"ג/ק"ג [21]. הדרישה המינימלית של AA תזונתי כדי לתמוך בקצב הגדילה המקסימלי (WG) הייתה 53-186 מ"ג/ק"ג באמנונת הנילוס (Oreochromis niloticus), 1200 מ"ג/ק"ג בטונה כחולת סנפיר פסיפית (Thunnus orientalis) ו-5000-1000 מ"ג/ק"ג ב שרימפס קורומה (Marsupenaeus japonicas) [22–24]. עם זאת, ה-WG או קצב הגדילה הספציפי (SGR) לא הושפעו באופן משמעותי מ-AA תזונתיים בכמה מיני דגים, כגון חדקן סיבירי (Acipenser baerii), דניס אדום (Pagrus major) וצלופח יפני (Anguilla japonica) [25–27 ].

הוכח כי תוספת AA תזונתית משפרת את תפקודי החיסון, כגון פעילות פגוציטוזיס ופעילות ליזוזים במיני דגים רבים [28-30]. הישרדות מוגברת לחשיפה לפתוגנים (למשל, חיידקים וטפילים) דווחה באמנונת הנילוס, שפמנון אסייתי (Clarias batrachus) ושרימפס לבן פסיפיק (Litopenaeus vannamei) לאחר צריכת AA בתזונה [31-34]. מחסור ב-AA הפחית את פעילות הליזוזים (LZM), משלים רכיב 3 (C3) ותכולת C4 בקרפיון דשא (Ctenopharyngodon idella) [35]. זה יכול גם להפחית את רמות הפפטידים האנטי-מיקרוביאליים, כגון -defensin והpcidin, וציטוקינים אנטי דלקתיים כולל אינטרלוקין (IL) 4/13A, IL-10 וגורם גדילה מתמרן (TGF) 1/2; תוך הגברה של ציטוקינים פרו-דלקתיים, כולל IL-1 וגורם גרעיני κB (NF-κB) בקרפיון עשב [35]. בנוסף, מחסור ב-AA הגביר את גורם ההפעלה של פרוטאז אפופטוטי-1, קספאז-3 וקספאז-7-9 כדי להחמיר אפופטוזיס של תאים בקרפיון עשב [35,36].

אבלון הוא אחד המינים המסחריים החשובים ביותר בסדר הארכיאוסטרופודה של הרכיכות. זהו חיית מודל חשובה לחקר הביולוגיה האקולוגית וההתפתחותית של גסטרופודים (Mollusca) [37,38]. מבין מיני האבלונים המעובדים, אבנית האוקיינוס ​​השקט (H. discus hannai Ino) היא המין החקלאי המועדף ביותר בסין. Mai דיווחה שתוספי תזונה של AA מ-0 עד 8000 מ"ג/ק"ג לא השפיעו באופן משמעותי על ה-SGR או שיעור ההישרדות (SR) של אבלון צעיר [39]. וו וחב'. דיווח כי תזונתית AA השפיעה על ביטוי גנים הקשורים לתגובות נוגדות חמצון בבלוטת העיכול של אבלון כדי לשפר את עמידות המתח שלו [40]. בנוסף, התפרצות מחלות עלולה לגרום להפסדים כלכליים אדירים לתעשיית האבלונים [41,42]. רכיכות חסרות חסינות הסתגלותית ומסתמכות על חסינות מולדת [43]. לפיכך, מטרת המחקר הנוכחי הייתה לחקור את תפקידיו של AA בוויסות חסינות, נוגד חמצון ואפופטוזיס באבלון H. discus hannai ויספק הדרכה מדעית לוויסות בריא של ניסוח תזונתי באבלון.

2. חומרים ושיטות

2.1. הצהרה אתית

כל הליכי הטיפול והטיפול בבעלי חיים שבוצעו במחקר הנוכחי אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת אוקיינוס ​​בסין (אישור מס' SPXY2020012).

2.2. דיאטה נסיונית

התזונה הבסיסית (AA{{{{10}}}}) נוצרה ממרכיבים מטוהרים כדי להכיל כ-30 אחוזים של חלבון תזונתי ו-3.5 אחוזים של שומנים בתזונה (טבלה 1). קזאין (ללא ויטמינים) וג'לטין שימשו כמקורות החלבון, ושמן סויה ושמן דגי מנהאדן (1:1) שימשו כמקורות שומנים, שיכולים להספיק כדי לשמור על צמיחה מיטבית של H. discus hannai [44–46 ]. רמות מדורגות של AA (0, 50, 100, 200, 500, 1000 ו-5000 מ"ג/ק"ג) נוספו לתזונה הבסיסית כדי לגבש את שבע הדיאטות הניסיוניות. ה-AA התווסף לתזונה בצורה של L-ascorbyl-2-מונופוספט. דיאטות אלו סומנו כ-AA0, AA50, AA100, AA200, AA500, AA1000 ו-AA5000, בהתאמה. התוכן המנותח של AA בתזונה היה 0.00, 47.31, 78.25, 189.05, 451.73, 919.99 ו-4821.17 מ"ג/ק"ג, בהתאמה. השיטה של ​​כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים שימשה לניתוח תכולת AA בתזונה [40]. החלבון הגולמי בתזונה, השומנים הגולמי והאפר נמדדו לפי השיטות הסטנדרטיות של איגוד הכימאים האנליטיים [47].

2.3. בדיקת שטיפה

השטיפה של AA תזונתי הוצגה כיעילות השמירה (RE). דיאטות הניסוי עם שלושה עותקים הוטבעו במי הים ב-23.0 ± 0.5 ◦C. הדיאטות הטבולות הוצאו בזמן קצוב (1, 3, 6 ו-12 שעות, בהתאמה) ועברו ליופילציה לצורך ניתוח תוכן AA.

RE ( אחוז )=(AA נשמר בתזונה לאחר הטבילה)/(AA הכלול בתזונה לפני הטבילה) × 100.

2.4. משפט האכלה

צעירי אבלון הושגו מחברת דיג בפוז'ו (פוג'יאן, סין) והתאקלמו לתנאי מעבדה במשך שבועיים, עם התזונה הבסיסית, במערכת מים חוזרת עם מיכלים (10{{1{{21 }}}} × 50 × 40 ס"מ). לאחר מכן, אבלון בגודל דומה (משקל התחלתי: 12.01 ± 0.001 גרם, אורך מעטפת ראשוני: 48.44 ± 0.069 מ"מ) הוקצו באקראי ל-21 מכלים (45 אבלון לכל מיכל). כל שלושה טנקים נחשבו לטיפול אחד. כל הטנקים נשמרו באור עמום עם וילונות פלסטיק שחורים. האבלונים הוזנו ביד פעם ביום בשעה 17:00. הצואה והדיאטות שלא נאכלו הוסרו בשעה 8:00 מדי בוקר. במהלך 100-ניסוי האכלה ביום, טמפרטורת המים הייתה 23.0 ± 0.5 ◦C, המליחות הייתה 30-33‰, ה-pH היה 7.4-7.9 והחמצן המומס היה גדול או שווה ל-7.0 מ"ג/ליטר.

2.5. מבחן אתגר Vibrio Parahaemolyticus

לאחר ניסוי ההאכלה, 15 אבלונים מכל מיכל שימשו לבדיקת האתגר עם V. parahaemolyticus הפתוגני. אבאלונים אותגרו ב-100 µL של V. parahaemolyticus (1.2 × 106 cfu/mL) על ידי הזרקת שרירים in vivo. בלוטת העיכול נאספה ב-0, 6, 12, 24, 48 ו-72 שעות, בהתאמה, ואוחסנה ב-80 ◦C לניתוח qPCR.

2.6. אוסף דוגמאות

בסיום ניסוי ההאכלה צמו האבלונים במשך שלושה ימים לפני ספירה ושקילה. כל האבלונים הורדמו עם 5 אחוז אתילי אלכוהול לפני הדגימה. המולימפה נאספה מארבעה אבאלונים בכל מיכל כדי לנתח את ספירת המוציטים הכוללת (THC), התפרצות נשימה (RB) ופעילות פגוציטית (PA). כדי לנתח את פעילות האנזים בהמולימפה נטולת תאים (CFH), ההמולימפה נאספה מעשרה אבלונים נוספים בכל מיכל ובוצעה בצנטריפוגה (3000×g ב-4 ◦C) למשך 10 דקות; ה-CFH אוחסן ב-80 ◦C עד לשימוש. בלוטת העיכול, הזימים, השריר והמעטפת נדגמו מעשרה אבלון שנלקחו המולימפה לכל מיכל ואוחסנו ב-80 ◦C עד השימוש.

2.7. תכולת חומצה אסקורבית

תכולת ה-AA ב-CFH, בשריר, במעטפת, בזימים ובבלוטת העיכול זוהה באמצעות ערכת בדיקת אסקורבט להפחתת ברזל (BioVision, Milpitas, CA, ארה"ב). ניתן להשתמש ב-CFH ישירות למדידת תכולת AA בהתאם להוראות היצרן. דגימות 0.1 גרם של שריר, מעטפת, זימים ובלוטת העיכול הומוגגו ב-1 מ"ל של מים מזוקקים מקוררים מראש. תכולת ה-AA נמדדה על ידי ספיגה ב-593 ננומטר.

2.8. פרמטרים חיסוניים בהמולימפה

ההמולימפה עורבבה ביסודיות תוך שימוש בנפח שווה של נוגד קרישה מקורר מראש (100 mmol/L EDTA Na2, 450 mmol/L NaCl, 10 mmol/L KCl, 10 mmol/L HEPES, pH 7.3, 850 mOs mol/kg) לדלל את ההמולימפה.

THC נספר באמצעות המוציטומטר מתחת למיקרוסקופ (CX31, OLYMPUS, טוקיו, יפן).

ההפחתה של nitroblue tetrazolium (NBT) בהמוציטים, אשר ניתן לייצוג על ידי פעילות RB, נמדדה לפי השיטות של Anderson וחב', עם כמה שינויים [48]. בקצרה, ההמולימפה הותאמה ל-5 × 106 תאים/מ"ל באמצעות נוגדי קרישה ובוצעה בצנטריפוגה ב-3000×g ב-4 ◦C למשך 10 דקות. משקע התא נצבע ב-100 μL של 1 μg/mL PMA (פורבול מיריסטאט אצטט, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, ארה"ב) מומס על ידי DMSO (דימתיל sulfoxide, Solarbio, בייג'ינג, סין) והודגרה ב-37 ◦C עבור 30 דק. לאחר הדגירה, נוספו לתאים 100 μL של 0.3 אחוז NBT המומס על ידי תמיסת המלח המאוזנת של האנק (Solarbio, בייג'ינג, סין) והודגרו ב-37 ◦C למשך 30 דקות לפני צנטריפוגה (560×g ב-4 ◦C למשך 10 דקות) . הסופרנטנט הוסר בעדינות, והתגובה הופסקה באמצעות 200 μL מתנול למשך 10 דקות. לאחר מכן, התא נשטף שלוש פעמים עם 70 אחוז (v/v) מתנול לפני ייבוש באוויר. גביש הפורמזן הכחול הומס באמצעות 120 µL של 2 M KOH ו-140 µL של DMSO. הצפיפות האופטית (OD) נקראה בספקטרופוטומטר ב-630 ננומטר כנגד ריק KOH/DMSO.

ה-PA של המולימפה נקבע בעקבות השיטות שתוארו קודם לכן של Xue et al. [49]. בקצרה, 50 μL של המולימפה מדוללת הונח על שקופית זכוכית והודגרה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי לקדם הידבקות. לאחר מכן, 50 μL של שמרים (Saccharomyces cerevisiae) עם 1 × 106 תאים/מ"ל נוספו לשכבת המוציטים המונוציטים לפני הדגירה (25 ◦C למשך 30 דקות). השקופית נשטפה בעדינות פעמיים עם מי מלח חיץ פוספט מעוקר (PBS) וקובעת עם מתנול למשך 5 דקות. לאחר מכן, השקופית הוכתמה בתמיסת Giemsa למשך 20 דקות. התאים נספרו תחת עדשת טבילה בשמן. הקצב הפגוציטי הצביע על פעילות פגוציטית.

2.9. פרמטרים ביוכימיים ב-CFH

פעילויות האנזים נוגדות החמצון (כגון SOD, Catalase (CAT) וגלוטתיון פרוקסידאז (GPX)), היכולת האנטי-אוקסידטיבית הכוללת (T-AOC) והתכולה של מלונדאלדהיד (MDA) ו- GSH ב-CFH נקבעו באמצעות ערכות בדיקה מסחריות (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, קטלוג: T-AOC, A015-2-1; SOD, A001-3-2; CAT, A007- 1-1; GSH, A006-2-1; GPX , א005-1-2; מד"א, א003-1-2). ה-T-AOC התבסס על יצירת רדיקלים ירוקים של ABTS (2, 20 -אזינו-ביס (3-ethylbenzothiazoline-6-סולפוני חומצה)) כאשר ה-ABTS היה חמצון. ה-SOD, GSH ו-GPX נמדדו על ידי ספיגה ב-450 ננומטר, 405 ננומטר ו-421 ננומטר, בהתאמה, באמצעות ספקטרופוטומטר אולטרה סגול (Ultrospec 2100 pro, Biochrom, Holliston, MA, ארה"ב). ה-CAT וה-MDA נקבעו בשיטות אמוניום מוליבדאט ו-TBA (חומצה תיוברביטורית) [50,51].

פעילות LZM והתכולה של C3 ו-C4 ב-CFH נמדדו באמצעות ערכות בדיקה מסחריות (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, סין. קטלוג: LZM, A050-1-1; C3, E032-1-1; C4 , ה033-1-1). ה-LZM נמדד על ידי שידור ב-530 ננומטר. ה-C3 וה-C4 נקבעו ב-340 ננומטר.

2.10. מיצוי RNA כולל ו-PCR כמותי בזמן אמת

ה-RNA הכולל מבלוטת העיכול והזימים הוצא באמצעות ערכת בידוד RNA כוללת של רקמות (Vazyme, Nanjing, סין) וריאגנט TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, ארה"ב) בהתאם להוראות היצרן. הריכוז והטוהר של ה-RNA הכולל המופק נקבעו באמצעות Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב). ה-DNA המשלים (cDNA) סונתז באמצעות ערכת שעתוק לאחור (PrimeScript® RT reagent Kit עם gDNA Eraser, Takara, יפן).

כל הפריימרים תוכננו באמצעות Primer Premier 6.0 (טבלה משלימה S1) וסונתזו על ידי Sangon Biotech (שנחאי, סין). תגובת ההגברה בוצעה בנפח כולל של 25 μL, המכיל 0.5 μL של פריימרים קדימה ואחורה, 12.5 μL של 2 × SYBR Green Realtime Master Mix (Vazyme), 1 μL של cDNA ו-10.5 μL של ddH2O מעוקר. התנאים התרמו-מחזוריים הבאים שימשו לקביעת פרופילי הביטוי עבור כל גן: 95 ◦C למשך 30 שניות; 40 מחזורים של 95 ◦C למשך 10 שניות ו-60 ◦C למשך 30 שניות; עם דגירות עוקבות ב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ו-95 מעלות צלזיוס למשך שניות כדי לזהות פלואורסצנטיות. רמות הביטוי של גן המטרה נורמלו לזו של השילוב של שני גני ההתייחסות היציבים ביותר (-actin ו- gapdh), אשר אושרו באמצעות geNorm ו-NormFinder [52,53]. ביטויי הגנים היחסיים חושבו בשיטת 2−∆∆CT [54].

2.11. כתם מערבי

החלבון הכולל של בלוטת העיכול והזימים הופק בשיטת RIPA (Solarbio) [55] עם קוקטיילים מעכבי פרוטאז ופוספטאז (רושה, באזל, שוויץ). על פי המדריך, החלבון הגרעיני של בלוטת העיכול והזימים הופץ באמצעות ערכת מיצוי חלבון גרעיני וציטופלזמי (ביוטיים, שנגחאי, סין). ריכוז החלבון נמדד באמצעות ערכת כימות חלבון BCA (Vazyme, נאנג'ינג, סין), וכל דגימות החלבון דוללו לריכוז שווה ערך של 1.5 מיקרוגרם/מיקרוליטר באמצעות ריאגנט RIPA. דגימות חלבון מבלוטת העיכול והזימים הופרדו באמצעות SDS-PAGE והועברו לאחר מכן לממברנה של 0.45 מיקרומטר PVDF. ה-PVDF נחסם באמצעות אבקת חלב ללא שומן של 5 אחוזים (Beyotime, שנחאי, סין) כהכנה ל-TBST בטמפרטורת החדר למשך שעה. הממברנה נשטפה שלוש פעמים עם TBST לפני הדגירה באמצעות נוגדן ראשוני למשך הלילה ב-4 ◦C ב-60 סל"ד. לאחר מכן, הממברנה המודגרת נשטפה שלוש פעמים עם TBST והודגרה באמצעות נוגדן משני מצומד עם חזרת עיזים נגד ארנבת (Beyotime, שנחאי, סין) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. קרום PVDF הוצג באמצעות ערכת כימילומינסנציה ECL (Vazyme, נאנג'ינג, סין). ה-GAPDH (1:500, AB-P-R001, Goodhere Biotechnology, Hangzhou, סין) ולמין B (1:500, WL01775, Wanleibio, Shenyang, סין) שימשו כחלבוני ייחוס. נוגדני המטרה העיקריים היו תגובה ראשונית של מיאלואיד 88 (MyD88, 1:500, WL02494, Wanleibio, Shenyang, סין), c-Jun N-terminal kinase (JNK, 1:500, WL01295, Wanleibio, Shenyang, China), בשל -IL-1 (1:500, WL00891, Wanleibio, Shenyang, סין), NF-κB p65 (1:500, WL01980, Wanleibio, Shenyang, China), ECH דמוי קלץ המקשר חלבון 1 (Keap1, 1 :1000, WL03285, Wanleibio, Shenyang, סין) ו-cleaved-caspase3 (1:500, WL02117, Wanleibio, Shenyang, סין). הכימות של הכתם המערבי חושב באמצעות ImageJ (גרסה 1.53, וויין רסבנד ותורמים, המכון הלאומי לבריאות, Bethesda, MD, ארה"ב).

2.12. חישובים וניתוח סטטיסטי

תוכנת SPSS 24 (IBM, Armonk, NY, ארה"ב) שימשה לניתוחים סטטיסטיים. ANOVA חד כיווני יושמה עם מבחן הטווחים המרובים של Tukey לאיתור הבדלים סטטיסטיים בין קבוצות אלו ברמת המובהקות של 0.05. כל הנתונים הובאו כממוצע ± SE (שגיאת תקן).

ה-SR, WGR (שיעור עלייה במשקל) ו-DISL (תוספת יומית באורך המעטפת) חושבו באופן הבא:

SR ( אחוז )=(מספר אבלון ששרדו/מספר אבלון ראשוני) × 100;

WGR ( אחוז )=[(משקל סופי (g) - משקל התחלתי (g))/משקל ראשוני (g)] × 100;

DISL (מיקרומטר ליום)=[אורך מעטפת סופי (מ"מ) - אורך מעטפת התחלתי (מ"מ)]/ימים × 1000.

3. תוצאות

3.1. יעילות שימור של חומצה אסקורבית בתזונה

ה-RE של AA תזונתי במרווחים שונים הטבולים במי ים מוצג באיור משלים S1. באופן כללי, ה-RE של AA בתזונה ירד עם משך הטבילה במי ים. במהלך ניסוי ההאכלה, הדיאטה נשארה במי הים במשך כ-12 שעות. לכן, ניסוי השטיפה נמשך 12 שעות במי ים באותם תנאי האכלה. לאחר טבילה של 3 שעות, ה-RE של AA בדיאטות נע בין 95.25 אחוז ל-97.43 אחוז. ה-RE של AA נשמר על יותר מ-95 אחוז בטבילה של 6 שעות. לאחר טבילה של 12 שעות, ה-RE של AA ב-AA50, AA100, AA200, AA500, AA1000 ו-AA5000 היה 89.78 אחוז , 90.88 אחוז , 89.38 אחוז , 91.03 אחוז , 87.44 אחוז , 87.44 אחוז , בהתאמה.

3.2. ביצועי גדילה ופיזור חומצה אסקורבית ברקמות

The SR and growth performance of abalone-fed gradient levels of AA supplementation are shown in Table 2. The SR (%), WGR (%), and DISL (µm/day) were not significantly affected by dietary AA levels (p>0.05). ה-SR נע בין 80.74 אחוז ל-88.15 אחוז, וה-WGR ו-DISL נעו בין 29.32 אחוזים ל-31.52 אחוזים ו-17.92 עד 20.01 מיקרומטר ליום, בהתאמה.

The AA distribution in tissues, including CFH, muscle, mantle, gill, and digestive gland, is shown in Figure 1. No significant differences in AA content in CFH and mantle of abalone after dietary AA were observed (p>0.05). תכולת AA ב-CFH ובמעטפת נעה בין 2.89 מיקרוגרם/מ"ל ל-4.52 מיקרוגרם/מ"ל ו-81.63 מיקרוגרם/גרם ל-103.08 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאמה. תכולת ה-AA של השריר, הזימים ובלוטת העיכול גדלה באופן משמעותי (עמ'<0.05) and reached their peak at the AA5000 group. The AA content in the muscle, gill, and digestive gland was 64.88–128.20 µg/g, 308.98–382.19 µg/g, and 130.08–206.09 µg/g, respectively.

3.3. פרמטרים חיסוניים של המולימפה

ה-THC, RB ו-PA של המולימפה מוצגים בטבלה 3. ה-THC עלה משמעותית עם העלייה של AA תזונתי, נע בין 1.07 × 107-1.65 × 107 תאים/מ"ל, והגיע לשיאו בקבוצת AA1000.

ה-RB בהמוציט של אבלון גדל באופן משמעותי והגיע לרמה הגבוהה ביותר שלו בקבוצת AA10{{10}}{{20}} (0 .35 OD630/107 cells·mL−1 ). כאשר התוסף של AA תזונתי עלה מ-189.05 מ"ג/ק"ג ל-919.99 מ"ג/ק"ג, ה-RB גדל באופן משמעותי מ-0.20 OD630/107 תאים·mL−1 ל-0.35 OD630/107 תאים·mL−1 (p <0.05). AA תזונתי יכול להשפיע על ה-PA בהמוציטים של אבלון (p <0.05). ה-PA של אבלון בקבוצת AA1000 ו-AA5000 היה גבוה משמעותית מזה בקבוצות AA0, AA50 ו-AA100 והשיג את המקסימום שלו (48.92 אחוזים) בקבוצת AA5000.

הפרמטרים הקשורים למערכת החיסון ב-CFH של אבלון, כולל תוכן LZM, C3 ו-C4, מוצגים בטבלה 4. פעילות ה-LZM עלתה באופן משמעותי (p < 0.{{10} }5) והגיע לרמות הגבוהות ביותר בקבוצת AA1000, שבה הפעילות שלה הייתה 56.25 U/mL. הנתונים לא חשפו השפעות מובהקות על תוכן C3 בין כל הטיפולים (p>0.05); עם זאת, תכולת C3 נותרה עלייה עם תוספת של AA תזונתיים. תכולת ה-C4 ​​לא הושפעה באופן משמעותי מ-AA תזונתיים (p>0.05).

3.4. פרמטרים נוגדי חמצון ב-CFH

פעילות האנזים נוגדת החמצון ב-CFH של אבלון המכיל SOD, CAT ו-GPX, כמו גם קיבולת ותכולת T-AOC של MDA ו-GSH מוצגות בטבלה 5. AA תזונתיים השפיעו באופן משמעותי על הפעילויות של SOD, CAT, ו-GPX, וה-T-AOC והתוכן של GSH ו-MDA. הפעילויות של SOD, CAT ו-GPX, ותוכן ה-T-AOC וה-GSH היו מווסתים באופן משמעותי (p < 0.05), בעוד שתוכן ה-MDA ירד משמעותית באבלון (p < 0.05 ). לא נצפו הבדלים משמעותיים בפרמטרים נוגדי חמצון אלו ב-CFH של אבלון בין קבוצות AA1000 ו-AA5000.

【למידע נוסף:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】