Aryl פחמימנים תלוי קולטן

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

2.2.6. טיפוח של EC אנושי ראשוני

EC ראשוני אנושי (לונזה, קלן, גרמניה) תורבת במדיום בסיסי אנדותלי מלא (EBM) (לונזה, קלן, גרמניה) בתוספת של 1 ug/mL הידרוקורטיזון, 12ug/mL תמצית מוח בקר, 50ug/ ml gentamicin, 10ng/mL גורם גדילה אפידרמיס אנושי, ו-10 אחוז (o/v) סרום עגל עוברי ב-37 מעלות ו-5 אחוז CO, עד המעבר השלישי. לאחר ניתוק עם 0.05 אחוז (o/o) Trypsin/EDTA (Thermo Scientific, Schwerte, גרמניה), התאים תורבו בכלי תרבית בגודל 6 ס"מ או צלחות תרבית של 6 בארים לפחות 18 שעות לפני ההעברה או הטיפול.

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

2.2.7. טרנספקציה חולפת של EC

תאים הועברו transfected כפי שתואר קודם [65]. בקצרה, EC עבר transfected באמצעות SuperFectTransfection Reagent (Qiagen, Hilden, גרמניה) לפי הוראות היצרן. ביטוי-יתר או נוק-דאון של AhR הושג לאחר 24 או 48 שעות, בהתאמה. יעילות ההעברה לאחר ביטוי יתר הייתה כ-40 אחוזים.

2.2.8. Assay Scratch Wound של EC

לצורך חקירת יכולת הנדידה של EC, בוצעו מבחני פצעי שריטות כמתואר קודם [66]. בפירוט, פצעים הוכנסו לשכבת תאים עם מגרד תאים לאורך קו עקבות. לאחר הפציעה, הוסרו תאים לא מחוברים בכביסה עדינה.תמצית סלסה cistancheהטיפול בכורכומין בוצע ישירות לאחר היווצרות הפצע. קור-כמון הומס ב-DMSO והשתמש בו בריכוז סופי של 7.5 uM. נדידת ה-EC כמתה על ידי צביעה של התאים ב-5 ug/mL 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(Carl Roth, Karlsruhe, Germany) ב-PBS למשך 5 דקות לאחר קיבוע התאים עם 4 אחוז (v/v) paraformaldehyde למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט של Zeiss AxioVision Observer D1 (Carl Zeiss, Oberkochen, גרמניה))באמצעות 200-הגדלה. תאים שנדדו לתוך הפצע מקו העקבות נספרו אוטומטית באמצעות פונקציית ניתוח החלקיקים של Image]1.52a ]67I לאחר הפרדת גרעינים חופפים.

Cistanche יכול אנטי אייג'ינג

2.2.9. צביעה חיסונית של EC

EC תוקן עם 4 אחוז (o/v) פאראפורמלדהיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר חדירות וחסימה ב-0.3 אחוז (o/o)Triton-X 100 ו-3 אחוז (o/u) סרום עיזים נורמלי ב-PBS, תאים הודגרו עם נוגדן ארנב נגד AhR(1:100, Abcam, Cambridge, בריטניה) או Nrf2 (שיבוט D1Z9C, 1:100, Cell Signaling Technology, פרנקפורט, גרמניה) מדולל ב-1 אחוז (o/v) סרום עיזים רגיל ב-PBS למשך הלילה ב-4 C. לאחר מכן, התאים נשטפו עם PBS והודגר עם Alexa 594-מצמוד עז נגד ארנב IgG (1:500, Invitrogen, Darmstadt, גרמניה) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.גזע cistancheעבור צביעת אקטין, התאים הודגרו עם Alexa FluorTM 488 Phalloidin (1:70, Invitrogen, Darmstadt, גרמניה) למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הגרעינים נצבעו נגדי עם 0.5 ug/mL DAPI ב-PBS למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר והתאים הותקנו עם ProLong'MDiamond Antifade Mountant (Invitrogen, Darmstadt, גרמניה). תמונות פלורסנט צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט של Zeiss AxioVision Observer D1, עם הגדלה של 400× או 200×.

2.2.10. qPCR בתאים

ה-RNA התאי הכולל בודד על ידי שילוב תמוגה ב-TRIzolTM עם עיבוד במורד הזרם באמצעות RNeasy Mini Kit (Qiagen(Hilden, גרמניה)) לפי הוראות היצרן. סינתזת cDNA בוצעה באמצעות QuantiTect9 Reverse Transcription Kit （Qiagen （Hilden, גרמניה）) עם 1 ug RNA לפי הוראות היצרן. רמות התמלול היחסיות נקבעו על ידי PCR באמצעות 2x SYBR③ Green qPCR Master Mix ו-Rotor-Gene Q מחזור תרמי (Qiagen (Hilden, גרמניה)). התמליל של החלבון הריבוזמלי L32 (rpl32) שימש כהתייחסות, והביטוי היחסי חושב בשיטת AC [68]. נעשה שימוש בצמדי הפריימרים הבאים של Intron:capital (מספר גישה לגן NM_000499.5):5'-TCGCTACCTACCCAACCCTT-3',5'-TGTGTCAAACCCAGCTCCAA-3';ahr(gene מספר גישה NM_001621.5):5'-CGTGGGTCAGATGCAGTACA-3',5'ACCAGGGT-CAAAATTGGGCT3';sod2(מספר גישה לגן NM_000636.4):5'-GCCCTGGAACCTCAC ATCAA -3';5'-AGCAACTCCCCTTTTGGGTTC-3';rpl32(מספר גישה לגן NM_000994.4):5'-GTGAAGCCCAAGATCGTCAA-3',5'-TTGTTGCACATCAGCAGCAC{{ 41}}'.

2.3.עכברים

2.3.1. קווי עכבר וגידול

נקבה 8-12-בת שבוע ("צעירה") ו-18-בת חודש ("ישן") AHR חסרת B6.129-AHRtmlBra/J (Schmidt et al.,1996; עד לכאן בתור AHR-KO) גדלו עכברים כהטרוזיגוטים במתקן החיות של ה-IUF. שותפי המלטה מסוג פרא שימשו לבקרה. עכברים גדלו והוחזקו בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים במחזור אור-חושך של 12/12 שעות וקיבלו chow (sniff"MZ, SNIFF, Soest, גרמניה) סטנדרטי. 2.3.2.qPCR בעכברים

סך ה-RNA בודד מרקמות איברים של שלושה עכברים חסרי WT ושלושה AHR עם TriZol[. לאחר מכן 400 ננוגרם של RNA הועתקו לאחור באמצעות ה-Reverse transcriptase M-MLV (Promega, Madison, WI, ארה"ב) ופריימרים אקראיים של hexamer. רמות ביטוי הגנים נמדדו בשכפול עבור כל רקמת עכבר ב-Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden, גרמניה), בנפח סופי של 15 μL, המכיל 7.5 μL Rotor Gene SybrGreenTM (Biorad, Feldkirchen, Germany), 1 uM מכל פריימר ,1.5 μL מים ללא cDNA ו-RNase. יעילות פריימר הייתה בין 90 אחוז ל-146 אחוז. ראה טבלה S2 לרצפי פריימר ויעילות. רמות הביטוי כיוולו לביטוי של RPS6 כגן משק בית באותה דגימה באמצעות ה-{{13 }}שיטת CT [69].

2.4.In Silico Analyzes

מידול הומולוגי של ה-CeAhR LBD

המודל המבני של C. elegans AhR LBD (שאריות 267-372) נוצר על ידי מידול הומולוגי. מבני הרנטגן של תחומי ה-PASB של בני משפחת bHLH-PAS ההומולוגיים החולקים את זהות הרצף הגבוהה ביותר (כ-20 אחוז) עם ה-CeAhR PASB שימשו כתבניות: מחזורי הפלט התנועה הצירקדיים kaput (שעון, PDB: 4F3L), תחום PAS עצבי המכיל חלבון 3(NPAS3, PDB:5SY7), הגורמים הניתנים להיפוקסיה 20(HIF2o, PDB:3H82,4ZP4,3F1N)ו-lo(HIFlo, PDB:4H6J). הדגם הושג עם MODELLER[70-72].יתרונות ותופעות לוואי של cistanche tubulosaהמודל האופטימלי נבחר מבין 10 שנוצרו, בהתבסס על ה-DOPE SCORE הטוב ביותר [73]. איכות המודלים הוערכה באמצעות PROCHECK [74]. מבנים משניים יוחסו על ידי DSSPcont [75]. חלל הקישור בתוך ה-LBDs המודלים אופיינו באמצעות שרת CASTp[76]. הדמיה של המודלים הושגה באמצעות PYMOL[77].

2.5.ניתוח סטטיסטי

אלא אם כן צוין אחרת, ניתוחים סטטיסטיים בוצעו ב-GraphPad Prism (גרסה 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA). עבור מבחני תוחלת חיים/בריאות, ניתוח סטטיסטי נעשה באמצעות OASIS[53]. ניתוח סטטיסטי של נתוני המיקרו-מערך בוצע ב-R (קרן R (וינה, אוסטריה)). עלילות Box נוצרו ב-GraphPad Prism (גרסה 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA) ומציגות את החציון (קו), 25-75האחוזון (תיבה) ו-10-90האחוזון (שָׂפָם).

3. תוצאות

3.1. כורכומין מקדם את טווח הבריאות בצורה תלויה ועצמאית של AhR

אובדן של ahr-1 מקדם את הבריאות ואת תוחלת החיים של C.elegans בתנאים בסיסיים[14] והוא משפיע לרעה על תכונות הקשורות לגיל בתגובה למאפננים AhR של יונקים, כגון בנזו[א]פירן (BaP), UVB אור, ומיקרוביוטה [25]. פוליפנולים תזונתיים, כגון כור-כמון, מהווים קבוצה חשובה של מאפננים AhR של יונקים עם השפעות פרו-אריכות ימים ב-C. elegans [78,79]. לכן חקרנו את ההשפעה מאריכת תוחלת החיים של כורכומין על התלות שלו ב-ahr{10}}. כורכומין האריך באופן שחזור ובאופן משמעותי את תוחלת החיים והבריאות של C. elegans באופן תלוי ב-ahr (איור 1A,B). בעבר, הראינו כי אובדן של ahr-1 מאריך גם את תוחלת החיים במודלים של מחלת הנטינגטון ופרקינסון, עם ביטוי יתר של שרירים של פוליגלוטמין (polyQ40) ו-synuclein (-syn), בהתאמה, בהתאמה. במקביל להגדיל את התוכן של אגרגטים חלבונים [25]. מעניין שטיפול בכורכומין הגדיל את מספר אגרגטים polyQ40 ו-syn באותה מידה כמו אובדן תפקוד ahr-7 (איור 1C). כורכומין גם קידם תוחלת חיים ויכולת תנועה במודלים אלה של מחלות (איור 1DE), אך ההשפעות של אובדן ahr-1 ותוספי כורכומין היו תוספים ב-PolyQbackground (איור 1D), וחושפים פונקציות הגנה בלתי תלויות של AHR-1- של כורכומין לפחות ברקע הפגוע הזה.

איור 1. כורכומין מקדם בריאות באופן-1-תלוי ובלתי תלוי ב-AHR. עקומות תוחלת חיים (A) ותוחלת בריאות (B) של נמטודות wt ו-ahr-1 שטופלו ב-DMSO או בכורכומין. עקומות הישרדות מציגות נתונים מאוחדים של 290-300 תולעים/מצב ב-5 ניסויים. מבחן סטטיסטי: מבחן-log-rank, # מובהקות לעומת DMSO,*מובהקות vs.wt, Bonferronip-value<0.05.(c) quantification="" of="" aggregates="" in="" 10-day-old="" polyq;wt="" and="" poly="" air-1="" (left="" panel)="" or="" 7-day-old="" async;wt="" and="" an;ahr-1="" (right="" panel).="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 59-111="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05><0.05 vs.dmso.(d,e)life/health="" span="" of="" polyq;wt="" and="" polyq;ahr-1.survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 180="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,significance="" vs.="" dmso,="" *="" significance="" vs.="" wt,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.2.ugt-45 מתווך את ההשפעות האנטי-אייג'ינג של כורכומין ו-ahr-1 דלדול

בחיפוש אחר גורמים אפשריים התלויים במורד הזרם של כורכומין, נקטנו גישות ממוקדות וחסרות פניות. בדקנו את הביטוי של גנים קלאסיים של AhR של יונקים מטרה והתמקדנו בגנים של Cyp שכן כורכומין משנה את ביטוי CyplA1 ו-CyplB1 בתאי יונקים [80,81]. עם זאת, הכימות של 47 cyps שונים ב-C.elegans על ידי PCR בזמן אמת למחצה (qPCR) גילה שרק cyp-13B1 היה מווסת בצורה משמעותית או על ידי דלדול ahr-1 או על ידי כורכומין באופן תלוי ב-ahr-1-(איור S1A-B), בעוד ששלושת ה-cyps האחרים (כלומר,cyp-13A5, cyp-13A8 ו-cyp-42A1) היו מוגבר על ידי כורכומין רק בהיעדר ahr-1(איור S1). נתונים אלה, יחד עם עבודות אחרות [25,82], מצביעים על כך ש-cyps הם כנראה לא המטרות העיקריות של CeAhR. זה נתמך גם על ידי הניתוח התעתיק שלנו במוטנטים מסוג פרא ו-ahr-1. ואכן, בהתאם לתפקיד של AHR-1 בקביעה נוירונית [37,38,40,41], השינויים בביטוי הגנים בין מוטנטים מסוג פרא ל-ahr-1 הראו העשרה בתהליכים הקשורים להתפתחות נוירונים והתמיינות וללא שינויים מהותיים בגנים קלאסיים לניקוי רעלים (איור 2A). ניתוח qPCR של כמה מהגנים המווסתים ביותר מעלה ומטה בין ahr-1(jul45) לסוג פראי (atf-2 , K04H4.2, egl-46, T20F5.4, ptr-4, dyf-7,clec-209, C01B4.6, C01B4.7, F56A4.3)בעיקר אישרו את התלות שלהם ב-ahr-1- בתנאים בסיסיים (איור 2B) אך לא UVB [25] ולא כורכומין (איור 2C) השפיעו באופן משמעותי על הביטוי של הגנים הללו. תהינו האם שינויי הביטוי בגנים הללו נשמרים מבחינה אבולוציונית והערכנו את הביטוי שלהם ברקמות שונות (כלומר, מוח, כבד, מעיים ודם) של 8- ו-18-סוג פראי בן חודש עכברי AhR KO. גנים מסוימים הראו נטייה לביטוי מוגבר בעכברים צעירים (atf-2 הומולוגים) או מבוגרים (lpr-4/5 homologs) באופן ספציפי לרקמות, אך לא היו דפוס ברור או שינויים משומרים. נצפה (איור S2). תוצאות אלו משקפות הבדלים אפשריים ספציפיים למין או פעילות שעתוק AhR ​​תלוית רקמות ביונקים שניתוח תעתיק של בעלי חיים שלמים מתעלמים מהם ב-C. elegans. בדיקה יסודית של הגנים המבוטאים בצורה הדיפרנציאלית ביותר בין C. elegans wild-type ו-ahr-1(jul45) גילתה שהביטוי של רבים מהגנים הללו מושפע ב-C.elegans במהלך ההזדקנות ועל ידי מאפננים תזונתיים של AhR של יונקים ( למשל, quercetin ו-resveratrol)[25], ובכך מציע תפקיד של AHR-1 בביטוי גנים מווסת פוליפנול. בהתאם לתרחיש זה, נתוני המיקרו-מערך הראו שרוב הגנים המובעים באופן דיפרנציאלי בטיפול בכורכומין אכן מוסדרים באופן תלוי ב-ahr (איור 2D; טבלה 1).תמצית cistanche tubulosaמתוך 47 גנים שהשתנו על ידי כורכומין בסוג הבר (43 מווסתים כלפי מעלה ו-4 מטה), רק 5 נגרו גם על ידי כורכומין ב-ahr-1(ju145). בין הגנים המווסתים על ידי כורכומין באופן-1-תלוי AHR היו אנזימים Phase Il ומעניין, חלקם (ugt-9 ו-ugt-29), היו מווסתים באותו כיוון על ידי כורכומין אובי אובדן של ahr-1 (טבלה 1). לפיכך, בדקנו את הביטוי שלהם ושל ugts(ugt-45 ו-ugt-57 נוספים שבאו לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בעת יישום ניתוח סטטיסטי פחות מגביל שלא תוקן עבור השוואות מרובות. מבין הגנים שנבדקו, ugt-45 גדל ב-ahr-1(ijul45)ועל ידי טיפול בכורכומין (איור 3A,B). כמו כן, ראינו שינויים בביטוי של כמה גנים לניקוי רעלים בין סוג פרא לגנים. עכברי AhR KO באופן תלוי רקמות. הביטוי הדיפרנציאלי של גנים אלה היה הגבוה ביותר במוח, כאשר Ugt2a3 (ugt-9 וugt-29 ב-C.elegans) היו למטה- ו-Hpgds (gst-4 ב-C. elegans) היה מווסת למעלה (איור S3A). לא היה שינוי בביטוי של אף אחד מהגנים שנבדקו בדגימות הכבד של עכברים (איור S3B). בהתאם לנתוני C,elegans, ההומלוג העכברי ugt-45 Ugt3a2 הראה נטייה לביטוי יתר ב- מעיים של עכברי Ahr KO (איור S3C). יש לציין ש-ugt-45 RNAi מנע את ההשפעות המועילות על תוחלת החיים והבריאות שקודמה על ידי דלדול כורכומין (איור 3C,D) או ahr-1 (איור 3E,F), מה שמצביע על כך ששתי ההתערבויות עשויות להסתמך על איתות מווסת במשותף במורד הזרם כדי לעורר את פעילות האנטי-אייג'ינג שלהם.

איור 2. גנים המווסתים באופן דיפרנציאלי על ידי כורכומין מוסדרים בעיקר באופן תלוי ב-ahr-1-.(A)העשרה של אונטולוגיה של גנים (GO) לתהליכים ביולוגיים לאחר היתוך מונח GO ב-ahr-1 לעומת wt. (ב, ג) הביטוי של הגנים החזקים ביותר עם וויסות מטה ומעלה בין wt ו-ahr-1 [25] הוערך על ידי qPCR ב-wt vs.ahr-1(B) ו-DMSO-vs . נמטודות שטופלו בכורכומין (C). עלילות קופסאות מציגות נתונים מ-3 ניסויים. הביטוי מוצג ביחס ל-wt שטופל ב-DMSO (קו מקווקו). מבחן סטטיסטי:1-דרך ANOVA עם מבחן ההשוואות המרובות של Tukey,*p-value<0.05 vs.wt.="" (d)venn="" diagram="" of="" differentially="" expressed="" genes="" on="" the="" microarray.="" the="" number="" of="" genes="" that="" were="" differentially="" up-or="" down-regulated="" between="" the="" indicated="" conditions="" is="" shown="" in="" red="" and="" blue,="" respectively.="" the="" numbers="" in="" the="" interchanges="" refer="" to="" the="" genes="" that="" occurred="" in="" both="" comparisons.="" the="" values="" in="" the="" lower="" right="" corner="" show="" the="" number="" of="" genes="" on="" the="" array="" that="" were="" not="" differentially="">

איור 3.ugt-45 נדרש להארכת תוחלת החיים של מוטנטים של כורכומין ו-ahr-1. (A, B) ביטוי גנים הוערך על ידי qPCR ב-wt vs.ahr-1(A) ו-DMSO- לעומת נמטודות wt שטופלו בכורכומין (B). עלילות קופסאות מציגות נתונים מ-3 ניסויים. הביטוי מוצג ביחס ל-wt שטופל ב-DMSO (מסומן כקו מקווקו). מבחן סטטיסטי: 2-דרך ANOVA עם מבחן ההשוואות המרובות של Sidak, *p-value<0.05vs.wt,><0.05 vs.="" dmso.="" (c,d)effect="" of="" ugt-45="" rnai="" on="" the="" curcumin-mediated="" life/health="" span="" extension="" in="" the="" wt.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" "significance="" vs.="" dmso,*="" significance="" vs.control="" rnai,="" bonferroni=""><0.05.(e,f)effect of="" ugt-45="" rnai="" on="" ahr-1-mediated="" life/healthspan="" extension.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,#="" significance="" vs.="" wt,*="" significance="" vs.="" control="" rnai,="" bonferroni=""><>

3.3. AHR-1 וכורכומין מגנים באופן עצמאי מפני מתח חמצוני

התכונות המועילות של פוליפנולים מיוחסות לרוב ליכולתם להגן מפני מיני חמצן תגובתיים (ROS)|83,84]. מכיוון ש-AhR מעורב בתהליכים המתווכים בלחץ חמצוני [85-87], תהינו האם כורכומין עשוי להשפיע על הפיזיולוגיה של בעלי חיים באמצעות תגובות נוגדות חמצון מווסתות AhR. ראינו שמוטנטים ahr-1 מייצרים יותר מיטוכונדריאלי(mt)ROS ויש להם פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי מופחת (איור 4A,B), שני פרמטרים המתואמים עם אריכות ימים [88,89]. בעוד שעולה בקנה אחד עם פרדיגמת המיטוהורמזיס ahr-1(jul45) מייצרים מעט יותר mtROS וחיים יותר, בעלי חיים אלו היו רגישים יותר ללחץ חמצוני מאשר מסוג הבר. באופן ספציפי, ההשפעות המזיקות שנגרמו על ידי Juglone ו-H2O2 על קפיצות, תנועתיות והישרדות של החיות היו חזקות יותר באופן משמעותי ב-ahr-1(jul45) בהשוואה לסוג הבר (איור 4C-F). נתונים אלה מצביעים על כך שלדלדול AHR-1 יש השפעות מוטוריות מוטוריות בתנאים בסיסיים, בעוד שהנוכחות שלו נדרשת להגנה על מתח חמצוני, ובכך מנתקת שני פרמטרים הקשורים לעתים קרובות לגיל, כלומר תוחלת חיים ועמידות ללחץ. במקום זאת, כורכומין שיפר משמעותית את ההתנגדות ל-H,O וה-juglone במוטנטים מסוג פרא וגם ב-ahr-1 (איור 4E,F), מה שמרמז על כך שכורכומין מעורר תגובה נוגדת חמצון עצמאית של ahr-1-. בהתאם לוויסות הבלתי מזווג של תוחלת החיים ועמידות ללחץ חמצוני, השתקת ugt-45 לא השפיעה על הרגישות ללחץ חמצוני לא עבור מוטנטים של ahr-1 או בעלי חיים שטופלו בכורכומין (איור 4G).ביקורות על cistanche tubulosaלפיכך, לכורכומין יש השפעות פרו-אריכות ימים באמצעות ahr-1 ו-ugt-45, אך מגן מפני עקה חמצונית באמצעות מנגנונים בלתי תלויים של ahr-1-.

3.4. Nrf2/SKN-1 מתווך את ההשפעות העצמאיות של AhR של כורכומין

כדי להעריך עוד יותר את ההצלבה של AhR-curcumin בתכונות נוספות הקשורות לגיל, מדדנו את יכולת הנדידה ב-EC העיקרי של האדם - סימן היכר לתפקוד כלי הדם, שיורד עם הגיל [90] ומופחת על ידי הפעלת AhR [14]. בהתאם לפעילות האנטי-אייג'ינג של דיכוי ahr-1 ושל כורכומין, ביטוי יתר של AhR עוכב באופן משמעותי, בעוד שהכורכומין הגדיל את יכולת הנדידה של EC אנושי ראשוני (איור 5A). ראוי לציין, השראת יכולת הנדידה על ידי כורכומין הייתה דומה בתאים ריקים שעברו וקטור ביטוי AhR או AhR (איור 5A). עם זאת, ההגירה של תאים שטופלו בכורכומין הופחתה באופן משמעותי על ידי ביטוי יתר של AhR: כורכומין משרה בתאים ריקים שעברו וקטור עד 60 תאים נדדו לכל שדה הספק גבוה, בעוד שב-AhR ביטוי יתר של תאים רק עד 25 תאים לכל שדה הספק גבוה (איור 5א). נתונים אלו מצביעים על כך שהאפקט הפרו-נדידה של כורכומין מווסת על ידי מנגנונים בלתי תלויים ב-AHR אך אולי גם על ידי הפחתה בפעילות AhR. לאחר מכן קבענו את התפלגות AhR תוך תאית ואת הביטוי של cVplal ב-EC אנושי שטופל בכורכומין, כורכומין לא השפיע על טרנסלוקציה של AhR-גרעינית (איור 5B) או על ביטוי cyplal (איור 5C). בחיפוש אחר מסלולים מווסתים על ידי כורכומין באופן בלתי תלוי AhR, חזרנו לפרופילי תעתיק נמטודות כדי למצוא גורמי שעתוק המווסתים גנים המווסתים באופן משמעותי על ידי אובדן ahr-1 או על ידי טיפול בכורכומין בבעלי חיים מסוג בר (טבלה 1 ). זה בחיפוש סיליקו זיהה את גורם שעתוק החיזור SKN-1, האורתולוג של Nrf2 האנושי (גורם גרעיני אריתרואיד 2-קשור גורם 2), שהפעלתו על ידי כורכומין [91] מדווחת לעתים קרובות כמתווך אפשרי של פעילות נוגדת החמצון שלו [92,93]. בהתאם לכך, אב הטיפוס C.elegans Nrf2/SKN-1-הגן התלוי, gst-4, בא לידי ביטוי יתר במוטאנט alhr-1 [25] ומושרה על ידי כורכומין בסוג פראי ואף יותר במוטציות ahr-1 (איור 5D). יתר על כן, כורכומין הגביר את הייצוב והטרנסלוקציה הגרעינית של Nrf2 ב-EC אנושי ראשוני (איור 5E) וגרם לביטוי של מנגן סופראוקסיד דיסמוטאז (Sod2) - גן מטרה קלאסי Nrf2 - בתאים שהועברו בוקטור ריק או בתאים שבהם AhR מושתק על ידי shRNA (איור 5F). היעדר השראת Sod2 על ידי AhR shRNA ב-EC עשוי לנבוע מהפחתה חלקית (50 אחוז) בביטוי (איור S3D), אשר עשוי שלא להספיק כדי להפעיל את ההפעלה של Nrf2 או של גורם שעתוק נוסף (TF), אשר , ב-C.elegans, עשוי להסכים להשראת ה-gst-4 [94]עם דלדול מוחלט של AhR. מעניין לציין ש-Hpgds, הומולוגית של C.elegans gst-4, גדלה באופן משמעותי במוח של עכברי AhR KO (איור S3A) אך הוא אינו יעד של Nrf2. ראיות נוספות לאיתות בלתי תלוי אפשרי של Nrf2/SKN-1 שהופעל על ידי דלדול ahr-1 היא שהפעלת ה-gst-4 על ידי כורכומין מדוכאת לחלוטין על ידי עור-7 RNAi ב- C.elegans פראי, בעוד מוטציות ahr-1 עדיין מעוררות gst-4 למרות דלדול העור-1 (איור 5G, H). עם זאת, RNAi-1 של העור הפחית את העמידות ללחץ חמצוני הן בסוג הבר והן ב-ahr-1(ju145)(איור 5I). באופן בלתי צפוי, השתקת העור-1 לא השפיעה על עמידות הג'גלונים של בעלי חיים שטופלו בכורכומין (איור 5I). הנתונים שלנו חושפים תרחיש מורכב לפיו כורכומין מקדם תכונות אנטי-אייג'ינג שונות בהסתמך על איתות תלויי AhR או בלתי תלויים ב-AhR אך תלוי Nrf2/SKN-1-(ונוספים).

איור 4. AHR-1 וכורכומין מגנים באופן עצמאי מפני עקה חמצונית. (א) תמונות מייצגות (משמאל) וכימות עוצמת DSRed (מימין) בנמטודות עם MitoSOX מוכתמות wt או ahr-1. עלילות קופסאות מציגות נתונים מאוחדים מ-129-135 תולעים/תנאים בשלושה ניסויים. (ב) פוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה הוערכה על ידי צביעה TRME בנמטודות בגילאים המצוינים. מוצגות תמונות מייצגות (משמאל) והכימות של הקרינה TMRE (מימין). עלילות קופסאות מציגות נתונים מאוחדים משלושה ניסויים.(C,D) פעילות שאיבה של הלוע(C) ותנועתיות(D) של מוטציות wt ו-ahr-1 לאחר טיפול ב-H2O2. עלילות קופסאות מציגות נתונים מאוחדים של 39-54(C) או 35-36 תולעים/מצב (D) ב3-4ניסויים.*p-value<0.05 vs.wt,$=""><0.05 vs.control="" treatment,="" statistical="" test:="" 1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (e)pharyngeal="" pumping="" of="" curcumin-treated="" nematodes="" after="" h,="" o,="" treatment.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 32="" worms/conditions="" in="" 2experiments.="" *=""><0.05><0.05cur vs.="" dmso="" treatment,="" $=""><0.05 h2o2="" vs.="" control="" statistical="" test:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.(f)influence="" of="" curcumin="" on="" juglone-induced="" toxicity.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 500="" worms/condition="" in="" 20="" experiments.="" *significance="" alhr-1="" vs.wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05.(g) effect="" of="" ugt-45="" rnai="" in="" curcumin-fed="" wt="" and="" ahr-1="" worms.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 150="" worms/condition="" in="" 6experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05. no="" statistical="" significance="" was="" observed="" in="" ugt-45="" vs.="" control="" rnai-treated="">

איור 5. כורכומין מפעיל את Nrf2/SKN-1 ללא תלות ב-AhR.(A) Assay Scratch Wound ב-ECC אנושי ראשוני שטופל בכורכומין (cur) או ב-DMSO שעבר טרנסfected עם וקטור ריק (EV) או וקטור ביטוי עבור אנושי AhR. פאנל עליון: תמונות מייצגות; הקו המקווקו מייצג את התחלת ההגירה. סרגל קנה מידה: 100 אום. פאנל תחתון: כימות; עלילות קופסאות מציגות נתונים של 4-6ניסויים. מבחן סטטיסטי:1-דרך ANOVA,*p<0.05><0.05 ys.dmso.(b,c)human="" primary="" ec="" were="" treated="" with="" cur="" or="" dmso.="" (b)representative="" immunostainings:="" ahr="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin="" (green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control="" (-con),="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.scale="" bar:50="" um.(c)="" relative="" capital="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr.="" mean="" expression="" in="" the="" dmso-treated="" controls="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" from="" 7="" experiments.="" (d)pgst-4:gfp="" expression="" in="" dmso-and="" curcumin-treated="" (cur)wt="" and="" alr-1="" worms.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 118-138="" worms/conditions="" in4=""><0.05><0.05 vs.="" dmso="" treatment,="" statistical="" test:1-way="" anova.(e)representative="" immunostaining="" images="" of="" human="" primary="" ec="" treated="" with="" cur="" or="" dmso:="" nrf2="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin(green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control(-="" con)="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.="" scale="" bar:="" 50="" um.(f)="" human="" primary="" ec="" was="" transfected="" with="" an="" empty="" vector(ev)or="" an="" expression="" vector="" for="" an="" shrna="" targeting="" the="" human="" ahr="" transcript="" (shahr).="" relative="" sod2="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr,="" and="" mean="" expression="" in="" the="" ev="" transfected="" cells="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" of="" 7experiments.=""><0.05 vs.="" respective="" control.="" (g,h)="" post-4:gfp="" expression="" in="" dmso-or="" cur-treated="" wt="" and="" ahr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skin-1="" rnai.="" representative="" images(g)="" and="" gst-4-driven="" gfp="" quantification(h)="" are="" shown.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 103-189="" worms/conditions="" in="" 4="" experiments.="" (i)="" juglone="" stress="" survival="" in="" curcumin-="" or="" dmso-treated="" wt="" and="" alhr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skn-1="" rnai.="" kaplan="" meier="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 100="" worms/condition="" in="" 4="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,="" #significance="" curcumin="" vs.="" dmso,="" $="" significance="" skn-1="" vs.="" con="" rnai,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.5. כורכומין ופרו-אוקסידנטים מציגים השפעות הפוכות על פעילות AHR-1

בהתאם להשפעה האנטי-אייג'ינג של מופחתת AhRexpression/פעילות, הנתונים שלנו מראים שכורכומין עשוי להאריך את תוחלת החיים של C.elegans על ידי דיכוי מסלולים מווסתים של AHR-1- באמצעות הפחתת ביטוי/פעילות של AHR-1 או פעולה על מסלולי איתות נפוצים במורד הזרם. לפיכך, ניסינו לכמת את פעילות AHR-1 ב-C.elegans, אך ניסיונות רבים להעריך ביטוי AHR-1 ולוקליזציה תת-תאית באמצעות נוגדנים (נגד AhR יונקים או נוגדנים מותאמים אישית נגד CeAhR) או תיוג פלואורסצנטי כתבים (OP562, UL1709, ZG93) לא נתנו ראיות משמעותיות. בהתחשב בכך ש-AHR-1 נקשר ל-XREs במבחנה [35], חשבנו להשתמש בביטוי גנים מונע XRE כקריאה לפעילות AHR-1. לפיכך, פנינו לתאי Cos7 שמקורם בקוף, שאינם מבטאים AhR אנדוגני ולכן אינם מציגים פעילות AhR אנדוגנית [95,96] וניתן לנצל אותם לניטור אינדוקציה מונעת של לוציפראז על ידי XRE כקריאה עבור AHR-1 פעילות (Larigot וחב'; הוגשה יחד עם מחקר זה). כאשר תאי Cos7 הועברו במשותף עם וקטורים המבטאים C.elegans AhR/alr-1, ARNT/aha-1 ופרוטור המכיל XRE המכיל לוציפראז של הגן האנושי CYPIA1 [64] AHR{ {27}} הראה פעילות נמוכה בתנאים בסיסיים (מטופלים ברכב). יש לציין, טיפול בכורכומין או חומרים תזונתיים אחרים המקדמים הזדקנות בריאה ב-C.elegans, כגון לוטאין [97] ורזברטרול [98,99], דיכא באופן משמעותי את פעילות AHR-1 (איור 6A-C). במקום זאת, BaP ולפלונומיד, מפעילי AhR ידועים ביונקים, לא השפיעו על פעילות AHR-1 (איור 6A,B) בריכוזים שבהם השתמשנו. יש לציין שפעילות AHR-1 בוטלה בתאי Cos7 שהועברו עם וקטור המבטא את האלל ahr-1(jul45) במקום האלל מסוג פראי (איור 6A-C), מה שמצביע על כך ש-jul45 הוא אמיתי אלל אובדן תפקוד וכי עוצמת הלוציפראז הנמדדת נובעת מ-AHR פונקציונלי-1.

לאחר מכן ביקשנו לחקור אם כורכומין מפחית את הפעילות של AHR-1 על ידי כריכה ישירה או אפנון עקיף. עד כה, לא זוהו ליגנדים של C.elegans AHR-1, ומכיוון שאין מידע זמין על ה-LBD שלו, ביצענו ניתוח בסיליקו כדי לאפיין אותו. שני האיזופורמים AHR-1, la ו-1b, היו מיושרים ולמרות שהם שונים באורכם, רצף תחום ה-PASB שלהם זהה. רצף זה יושר לאחר מכן לתחום ה-PASB של Drosophila melanogaster, ולאלו של שני AhRs מבעלי חוליות שעבורם נוצרו בעבר מודלים מבניים, כלומר עכבר (Mus musculus)[100], ודג זברה (Danio rerio)[101](איור 6D). היישור הראה הבדלים ברורים בין מינים עם המוזרות העיקרית של חסרי חוליות חושפים מחיקות רצף באזור המשתנה ביותר בתחום ה-PAS, התואם לאזור הגמיש, כולל הצרור הסלילי (C , D , E helices) והלולאות הקצרות המקשרות אלמנטים אלה (איור 6D,E). מחיקות אלה עשויות לצמצם את המקום הפנוי בחלל הקישור של AhRs אלה. לאחר מכן יצרנו מודל תלת-ממדי של AHR-1 PASB על ידי מידול הומולוגי. דגם זה מציג את קיפול PAS טיפוסי, אך עם סליל Do קצר יותר בהשוואה ל-AHRs אחרים. עם זאת, לחלל הפנימי יש כמה מוזרויות; הוא מכיל יותר שאריות הידרופוביות והוא קטוע לשניים על ידי כמה שרשראות צד פנימיות. בפרט, H365 ו-H274 מתמודדים ויכולים ליצור קשר מימן באמצע החלל; יתר על כן, שרשראות הצד Y332, L363 ו-L302 עלולות לחסום את החלל, ולהקטין את החלל הפנימי הזמין לליגנדים (איור 6E). חלל קטן וקטום זה, ככל הנראה, אינו מאפשר קישור של ליגנדים גדולים (למשל, TCDDor כורכומין). בדומה למודל המבני AHR-1, מודל של דג הזברה zfAhRla הראה שחלל ה-LBD קטוע בהשוואה לפרלוגים המחייבים TCDD zfAhR1b ו-zfAhR2 [101]. ליגנדים קטנים וגמישים, כגון Leflunomide, נקשרים ומפעילים את ה-zfAhRla, אך ריכוז הלפלונומיד שבדקנו לא הפעיל AHR-1 במערכת התאים Cos7 שלנו (איור 6B). לאחר מכן תהינו האם מוטציות בחומצות אמינו האחראיות לחלל הקטן של ה-LBD עשויות לאפשר לליגנדים קלאסיים להפעיל את CeAhR. שארית ה-CeAhR L363 (איור 6D) תואמת ל-A375 ב-mAhRb-I ו-V375 במדריד, ולשאריות זה יש השפעה גדולה על קישור ליגנד [102]. באופן דומה, T386 של zfAhRla(איור 6D), תואם ל-A375 ב-mAhRb-1 ו-A386 ב-zfAhR1b ו-zfAhR2, תורם לחוסר הקישור ל-TCDD של zfAhRla, וכאשר עובר מוטציה לאלנין, הרגישות משחזרת גם כאשר YTC29 6. הוצג [101]. חומצת האמינו Y296 היא כבר היסטידין ב-C.elegans(H274). לפיכך, ביצענו מוטציה רק ​​של לאוצין במיקום L363 בווקטור CeAhR לאלנין (L363A) (איור 6D,E מסומן בחץ). יתרה מכך, שיצרנו מוטציה של ההיסטידין הסמוך בעמדה H365 לגלוטמין (H365Q), שהוא Q377 בעכברים (איור 6D, E מסומן בחץ) מאחר וסביר להניח שהוא יוצר קשר מימן עם H274 ועשוי לתרום לחלל הקטן של AHR{ {49}} (איור 6E). לאחר מכן בדקנו האם ליגנדים AhR של יונקים משפיעים על פעילות AHR-1 כאשר L363 ו-H365 עוברים מוטציה. עם זאת, שינויים אלה, במקום לשחזר תגובה לליגנדים קסנוביוטיים כמו בדג הזברה [101], ביטלו אפילו את פעילות AHR-1 הבסיסית, בדומה לאלל ju145 (איור 6F). תוצאות אלו מראות הבדלים ברורים בין ה-LBDs של C.elegans ודג הזברה, אך מראות שה-LBD הוא בסיסי לפעילות AHR-1 בסיסית. יחד עם מחקרים קודמים [35,38,82], התוצאות שלנו מצביעות על כך ש-AHR-1 לא סביר להיות מעורב בתגובת הטרנסאקטיבציה הקלאסית הנגרמת על ידי קסנוביוטיקה, ולכן עשויה להיות לא רלוונטית ל-ahr-1-. הזדקנות פיזיולוגית. במקום זאת, תרכובות שמקורן בצמח עשויות להפעיל השפעות משומרות לפחות בחלקן באמצעות דיכוי של מסלולים מווסתים של AHR-1-. המודל התלת-ממדי שלנו מציע שכורכומין אינו מווסת את פעילות AHR-1 על ידי קשירת ה-LBD שלו. לפיכך, דיכוי פעילות AHR-1 על ידי כורכומין יכול לנבוע מהשפעתו נוגדת החמצון. בהתאם לאפשרות זו, ולרגישות המוגברת של המוטנטים של C.elegans ahr-1 ללחץ חמצוני, מצאנו שפעילות AHR-1 אכן מוגברת על ידי חומרים מעוררי ROS. כלומר, תאי Cos7 שטופלו ברוטנון פרו-אוקסידנט הציגו פעילות מוגברת של AhR כאשר הועברו עם C.elegans או AhR של עכבר, אך לא כאשר הועברו עם האלל jul45 או האלל עם מוטציות LBD (איור 6G,H).

בסך הכל, בעוד שהפעלת CeAhR מגינה מפני עקה חמצונית בשלב מוקדם בחיים, הביטוי המופחת שלו נוגד את ההזדקנות ומתווך את ההשפעה האנטי-אייג'ינג המיטיבה של כורכומין (איור 7). כורכומין עשוי, אם כן, לסייע באיזון הפעלת חיזור TF באופן תלוי הקשר וזמן ולהעדיף דיכוי AhR ישירות באמצעות השפעתו נוגדת החמצון ו/או באמצעות ההפעלה של Nrf2/SKN-1 (או TF אחר), אשר עשוי במקביל לתווך את פעילות האנטי אייג'ינג של הכורכומין.

איור 6. לכורכומין ולפרו-אוקסידנטים יש השפעות הפוכות על פעילות AHR-1. (AC) הערכה של פעילות AHR-1 לאחר טיפול בתרכובות המצוינות בתאי Cos7 שהועברו עם wt AHR-1(wt) או AHR-1 הנושאים את המוטציה נקודת ju145 (ju145) ו AHA-1 וכן לוציפראז הניתן להשראת XRE. עלילות קופסאות מציגות נתונים של 3-5ניסויים.* p-value<0.05><0.05 vs.="" dmso/etoh,="" statistical="" test:="" 2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (d)="" alignment="" of="" the="" lbds="" from="" c.elegans,="" drosophila,="" and="" zebrafish="" ahrs.="" the="" color="" scheme="" for="" residues:="" red,="" acidic;="" blue,="" basic;="" purple,="" polar;="" yellow,="" cys;="" brown,="" aromatic;="" green,="" hydrophobic;="" orange,="" ser,="" thr;="" gray,="" pro;="" white,="" gly.="" (e)="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" to="" the="" ceahr="" pasb="" are="" indicated="" on="" top(light="" gray="" bars="" for="" helices="" and="" dark="" gray="" bars="" for="" β-strands)="" and="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" asterisks="" mark="" the="" amino="" acids="" likely="" contributing="" to="" the="" inability="" of="" ceahr="" to="" bind="" big="" ligands.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" the="" investigation="" of="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).i3dmodels="" of="" the="" ceahr="" (left)="" and="" the="" mahr="" (right)="" pasb="" domains="" were="" obtained="" by="" homology="" modeling,="" shown="" in="" a="" cartoon="" representation.="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" are="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" the="" colored="" internal="" area="" (blue="" for="" ceahr="" and="" yellow="" for="" mahr)defines="" the="" molecular="" surface="" of="" the="" binding="" cavity="" identified="" by="" castp.="" in="" the="" car="" model,="" the="" amino="" acids="" protruding="" into="" the="" binding="" cavity="" (asterisks="" in="" panel="" d)="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" blue="" sticks.="" the="" mahr="" amino="" acids="" corresponding="" to="" those="" displayed="" in="" the="" ceahr="" model,="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" yellow="" sticks.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" studying="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).="" (f)="" ahr="" activity="" in="" bap-or="" mnf-treated="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" an="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365o="" mutations="" (lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr),="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt,"=""><0.05 vs.dmso.(g)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" ahr-1(either="" wt="" or="" ju145)="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.*=""><0.05vs.wt, #=""><0.05 vs.="" dmso.(h)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365q="" mutations(lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr).boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt/ahr-1,="" #="" p-value=""><0.05 vs.="">

איור 7. מודל מוצע של מסלול האיתות AHR-1 בתגובה של C.elegan לנוגדי חמצון ופרו-אוקסידנטים. בתנאים "נורמליים" (חלונית אמצעית), AHR-1 מופעל על ידי ROS תוך תאי. זה מוביל לנשירה של המלווה מ-AHR-1 ציטוסולית ולטרנסלוקציה הגרעינית של AHR-1 שלאחר מכן. בגרעין, AHR-1 יוצר הטרודימר עם הטרנסלוקטור הגרעיני של AHR (AHA{ {7}}) ונקשר ל-XREs של גני מטרה, מה שמוביל בתורו להפחתה ברמות ROS תוך תאיים. בתנאים אלה, אובדן תפקוד ahr-1 מוביל לתוחלת חיים מוגברת. בנוכחות נוגדי חמצון (פאנל שמאל), ריכוזי ה-ROS התוך-תאיים נמוכים ומובילים ל-AHR-1 השוכן בציטופלזמה, קשור לקופקטורים שלו. העיכוב של פעילות AHR הבסיסית-1 מוביל לתוחלת חיים מוגברת. בנוכחות פרו-אוקסידנטים (חלונית ימין) AHR-1 מופעל על ידי ROS מוגזם, מה שגורם לטרנסלוקציה הגרעינית שלו, להיווצרות ההטרודימר של AHR-1-AHA-1 ולהתחיל של שעתוק גן מטרה. ב-ahr-1 KO, הירידה בסילוק הרעלים של ROS באמצעות גני מטרה המושרים על-ידי AHR-1- מובילה להצטברות של ROS והופכת את ahr-1 KO רגיש.

4. דיון

AhR התגלה במקור ביונקים בשל פעילות התגובה הקסנוביוטית שלו הנגרמת בעקבות קישור של חומרים רעילים סביבתיים או ליגנדים אנדוגניים, אך קיימים גם מאפננים שאינם מסתמכים על קישור ליגנד אך נחקרים הרבה פחות. C.elegans מייצג אורגניזם מודל ייחודי לחקור פעילויות AhR ללא תלות בתגובת הקסנוביוטיקה הקלאסית שלו, מכיוון ש-CeAhR אינו קושר ליגנדים של אב-טיפוס AhR [35,39]. באמצעות מודל זה, זיהינו פונקציה שנשמרה אבולוציונית עבור AhR בתהליך ההזדקנות [14] והראינו שחלק ממופני AhR של יונקים (כלומר, חיידקים, Bal ו-UVB) משפיעים על פרמטרי הזדקנות באמצעות AHR-1 ב- אופן תלוי הקשר [25]. כאן, עקבנו אחר הממצאים הקודמים שלנו עם חקירה מכניסטית יותר של תכונות הזדקנות מווסתות AhR על פני מינים על ידי כורכומין פוליפנול בתזונה. הניתוחים המשולבים שלנו in vivo, in vitro ו-siliko חשפו תרחיש חדש ומורכב: בעוד כורכומין מקדם תכונות אנטי-אייג'ינג בנמטודות וב-EC העיקרי של האדם לפחות בחלקו באופן תלוי AhR, ההשפעות נוגדות החמצון שלו בשני המינים מסתמכות על במנגנונים תלויי AhR אך בעיקר Nrf2/SKN-1.

הראינו לראשונה שכורכומין עיכב את ההזדקנות הפיזיולוגית של C.elegans באופן-1-תלוי AHR. בחיפוש אחר גורמים אפשריים התלויים ב-ahr-1- במורד הזרם של כורכומין, השתמשנו בגישות ממוקדות וחסרות פניות ומצאנו שרוב הגנים המווסתים באופן דיפרנציאלי בטיפול בכורכומין מוסדרים באופן תלוי AHR. יתרה מכך, רבים מהגנים הללו הציגו דפוס ביטוי דומה בבעלי חיים מדוללים ומטופלים בכורכומין, מה שמצביע על כך שכורכומין מקדם הארכת תוחלת חיים באמצעות דיכוי פעילות AHR-1. למרבה ההפתעה, לא הניתוח הממוקד ולא ה-transcriptomic לא הצביעו על תפקיד מרכזי עבור ג'ני יעדי AhR קלאסיים כגון כוסות, שבמקום זאת נמצאו במידה רבה חסרי ביטוי בנוירונים (Larigot וחב'; הוגשו יחד עם מחקר זה). באופן מעניין, ממצאים אלה עשויים להצביע על תעתיק של בעלי חיים שלמים עשויה להסוות את ההשפעות הספציפיות לנוירונים של AhR, במקרה הספציפי הזה באמצעות גנים של cps. מצאנו שבין הגנים המבוטאים בצורה דיפרנציאלית, רבים שייכים לאנזימי ניקוי רעלים בשלב II, כגון מעיים-45, אשר הוגבר על ידי דלדול -1 של ahr (ובמוח של עכברי AhR KO) וטיפול בכורכומין לתווך הארכת תוחלת החיים שלהם. במקום זאת, טיפול בכורכומין ודלדול ahr-1 הגבירו את הביטוי של אנזים ניקוי רעלים שלב II אחר, GST-4, באמצעות מנגנונים שונים: הראשון מסתמך על, בעוד שהאחרון אינו תלוי בעיקר ב- Nrf2/ SKN-1, חיזור TF קלאסי הגורם ל-GST-4 בלחץ חמצוני ב-C.elegans [103]. יתרה מכך, בעוד שכורכומין גורם לתגובות תלויות Nrf2/SKN-1- בביטוי C.elegans (GST-4) וב-EC העיקרי של האדם (ביטוי Sod2 ויכולת נדידה), הוא גם מגן על C.eleans מפני עקה חמצונית ב באופן עצמאי-1- של SKN. ב-C.elegans, כורכומין אינו יכול להאריך את תוחלת החיים בעור החולה מאוד-1(zu67) מוטנטים [104], בעוד ש-GST-4 יכול להיות מושרה באופן עצמאי-1-SKN על ידי איתות EGF [94] והצלבה בין מסלול ה-EGF ל-AhR דווח ביונקים [105].

מעניין, ובניגוד לזן הפראי, צפינו בהשפעה בלתי תלויה של AHR-1- של כורכומין על תוחלת הבריאות במודלים של נמטודות עבור מחלת הנטינגטון ופרקינסון, בהתאמה. בזנים אלה, טיפול בכורכומין העלה את מספר אגרגטים חלבונים באותה מידה כמו מחסור ב-AHR-1, מה שמצביע על אפקט מגן של צבירת החלבון עצמה ו/או הפעלת כורכומין של מסלולים המגנים מפני צבירת חלבון ללא תלות ב-/ שעה-1 דלדול. השפעתו של כורכומין על צבירת חלבונים שנויה במחלוקת: הוכח שהוא מעכב יצירת סיבים, אך גם קושר מינים פרה-פיבריריים/אוליגומריים של חלבונים עמילואידוגניים, ובכך מאיץ את צבירה שלהם ומפחית את הרעילות העצבית הכוללת [106]. יש לציין, קפאין, המגן גם מפני תכונות של הזדקנות קרדיווסקולרית [66,107], מונע גם שיתוק המושרה על ידי A מבלי להפחית את צבירי A אלא באמצעות הפעלת המסלול התלוי Nrf2/SKN{10}}המגן [108]. יהיה חשוב להעריך האם ההשפעה המגנה המושרה על ידי כורכומין או כל דלדול-1 במודלים של מחלת C.elegans מתווכת על ידי מנגנונים המקדמים הסרה של מינים אוליגומרים/פרה-פיברילריים לתוך אגרגטים פחות רעילים ו/או על ידי הפעלה של מנגנונים אחרים, כגון Nrf2/SKN-1, שעשויים להגן במקביל מפני פרוטאוטוקסיות. יש לציין, אנזימי ניקוי רעלים עשויים להכיל גם XRE וגם ARE (אלמנטים מגיבים נוגדי חמצון), ותואר משחק גומלין בין איתות מווסת Nrf2/ARE ו- AhR/XRE [109]. לכן יהיה מעניין להבהיר כיצד כורכומין מקדם את ההשפעות האנטי-אייג'ינג המועילות השונות שלו באמצעות האיזון בין Nrf2 לאיתות מווסתת AhR.

הגישות המשולבות שלנו הראו שכורכומין מעכב פעילות AHR-1. ביונקים, הוצע כי ההשפעה המעכבת AhR של כורכומין מתווכת על ידי קישור ישיר של LBD [110] או עיכוב של חלבון קינאז C המזרחן AhR[79]. מחקר אחר הצביע על כך שפעילות התעתיק של ה-AhR תלויה במצב החיזור הסלולרי ובמבנה הכרומטין, אשר שניהם מושפעים מכורכומין[111]. בעוד AHR-1 אינו קושר את TCDD, הוא קושר XRE במבחנה[36] אך מחקרים שיטתיים, העוסקים בפוטנציאל של פחמימנים פוליארומטיים, או ליגנים אחרים של יונקים AhR לווסת AHR-1, חסרים בעיקר בשל היעדר כלים מתאימים להעריך זאת. המחקרים שלנו מנסים למלא את הפער הזה, ולנצל תאי Cos7 המבטאים AHR-1 בשילוב עם מבחני לוציפראז (Larigot וחב'; שהוגשו יחד עם מחקר זה) ובמודל סיליקו של C. elegans LBD, גילו שכורכומין מדכא AHR פעילות -1, אך סביר להניח שלא על ידי כריכת LBD ישירה. הבדיקה החוץ-גופית ששימשה במחקר שלנו אישרה ש-CeAhR אינו מופעל באמצעות איתות קסנוביוטיקה קלאסית. עם זאת, הוא לא יחשוף פעילויות עקב קישור AhR לרצפי DNA מלבד ה-XRE ה"קלאסי" שנמצא ב-CYP1A1 כגון XRE המגיב לפוליפנול (קוורצטין) שנמצא ב-PON1 [112,113]. צביעת אימונו ב-EC ראשוני אנושי טוענת גם נגד כורכומין הגורם לטרנסלוקציה גרעינית של AhR, אשר יחד עם ההשפעה המעודדת של יכולת הנדידה בתאים המבטאים יתר של AhR, עשויה גם להצביע על כך שכורכומין מדכא את פעילות AhR.

אנו מציעים שהאפקט המעכב של כורכומין, במקום להסתמך על קישור AhR, כרוך ביכולת נוגדת החמצון שלו, שאכן עשויה להיות קשורה או אפילו תלויה בהפעלה של Nrf2/SKN-1. AhR של יונקים מופעל על ידי ROS באמצעות שינוי חמצוני בלתי תלוי ב-LBD [85], אך הנתונים שלנו מראים שהשראת פעילות AHR-1 על ידי פרו-אוקסידנט רוטנון דורשת את ה-LBD. מנגנון עקיף של הפעלת AhR בתיווך ROS הוא היווצרות של ליגנד AhR החזק FICZ[114]. עם זאת, FICZ היא מולקולה מישורית גדולה שלפי המודל שלנו בסיליקו, לא תתאים ל-AHR-1 LBD. למרות שהמנגנון המדויק שבאמצעותו פעילות AHR-1 מקודמת על ידי ROS ומעוכבת על ידי כורכומין (בין אם באמצעות כיבוי ROS ישיר או בעקיפין באמצעות הפעלה של Nrf2 או גנים מווסתים נוגדי חמצון אחרים), זה נתמך מאוד על ידי שלנו ממצאים: AHR-1 מופעל על ידי רוטנון, ומוטנטים ahr-1 מציגים יותר mtROS, פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי מופחת ורגישים יותר ל-H, O ו-juglone כמו גם ל-UVB ו-BaP [25] , שניהם מייצרים ROS[115,116]. בהקשר זה, מעניין לציין שמוטנטים של ahr-1 מציגים שינוי קל בתפקוד המיטוכונדריאלי, הדומים לאלו של מיטו-הורמזיס [117. זה מצביע על כך שכל-1 הדלדול (והכורכומין האפשרי על ידי עיכוב AHR-1) עשויים לקדם טווח בריאותי באמצעות מתח מיטוכונדריאלי קל, הידוע כמאריך את תוחלת החיים של C.elegan באמצעות גנים לניקוי רעלים המווסטים באופן דומה באחר-1 {20}} מוטציות [118,119]. יתרה מכך, האם Nrf2/SKN-1 ומיטוכונדריה ממלאים תפקיד בוויסות פעילות AHR-1 בטיפול בכורכומין היא אפשרות מעניינת שנותר לאמת.

בסך הכל, תוך ניצול התכונות המרובות שמציעה הנמטודה C.elegans עבור מחקרים in vivo, אנו מציעים שתפקוד אבותיו של ה-AhR עשוי להיות בוויסות של אנזימים שלב-ll הקשורים לנוגדי חמצון ולא לתגובות קסנוביוטיות. בניגוד להשפעות המזיקות הנגרמות על ידי רמות גבוהות של ROS, ההשפעות המועילות המקודמות על ידי מחסור ב-AHR עשויות להיות מתווך על ידי לחץ מיטוכונדריה קל ו/או ייצור ROS מתון (מיטו-הורמזיס), אשר מסתמכים גם על Nrf2/SKN-1. אנו גם מספקים ראיות חזקות לאינטראקציה בין כורכומין ל- AhR. עיכוב כורכומין של איתות AhR נשמר מבחינה אבולוציונית וסביר להניח שהוא אינו מתווך על ידי קישור ל- AhR LBD, אלא באמצעות מאפייני ה-ROS של כורכומין או הפעלה של Nrf2/SKN-1. מסלול האיתות Nrf2 אכן יכול להיות מופעל על ידי כורכומין בדרכים שונות [91]. לבסוף, הנתונים שלנו הראו שכורכומין מקדם השפעות אנטי-אייג'ינג גם באופן עצמאי הן ב-C.elegans (התבטאות מוגברת של GST-4 ועמידות ללחץ חמצוני) והן ב-EC העיקרי של האדם (מוגברת ביטוי Sod2 ויכולת נדידה ), מה שיכול גם להסביר את ההשפעות התוספות של כורכומין ואובדן תפקוד AHR-1 על טווח הבריאות של בעלי חיים המבטאים polyQ.

5. מסקנות

לסיכום, באמצעות שילוב מקורי של גישות סיליקו, מבחנה ו-in vivo, הראינו שבעוד שהפעלת CeAhR מגינה מפני עקה חמצונית בשלב מוקדם בחיים, הביטוי המופחת שלו נוגד את ההזדקנות ומתווך את ההשפעה האנטי-אייג'ינג המיטיבה של כורכומין (איור 7) . כורכומין עשוי, אם כן, לסייע באיזון הפעילות של גורמי שעתוק שונים המעורבים בתגובות ניקוי רעלים/נוגדי חמצון (מדכאים AhR ומפעילים Nrf2) בתנאים שבהם הם משתנים (הגדלת AhR והפחתת Nrf2/SKN-1), כגון הזדקנות או הפרעות הקשורות לגיל. העבודה שלנו מוסיפה רמה נוספת של מורכבות לפעילויות הרב-תכליתיות וההקשר הספציפיות העצומות ממילא של AhR, עם השלכות חשובות על בריאות האורגניזמים ועל תוחלת החיים. יתרה מכך, הוא פותח את הדלת למחקרים נוספים, תוך שימוש במערכת הנמטודות כדי לגלות ולחקור פונקציות אבותיות של ה-AhR, שסבירות נמוכה יותר להיות מזוהים ביונקים.

מאמר זה מופק מ- Antioxidants 2022, 11, 613. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants