תַקצִיר.ארבוטין הוא תרכובת טבעית המופקת מצמחים שונים, לרבות עלי דובי, שמפעילה השפעות מרובות כולל הלבנת עור ותכונות אנטי דלקתיות וחמצוניות להגנה על מתח. עם זאת, ההשפעות של ארבוטין על אוסטאובלסטים נותרו בלתי ידועות. מטרת המחקר הנוכחי הייתה לחקור את התפקוד והמנגנונים של ארבוטין על התפשטות והתמיינות של תאי מבשר אוסטאובלסטים של עכבר MC3T3-E1 במבחנה. השגשוג של תאי MC3T3-E1 שטופלו בארבוטין הוערכו באמצעות מבחן Cell Counting Kit-8 ובדיקת 5-ethynyl-2'-deoxyuridine. בנוסף, מחזור התא והאפופטוזיס נבדקו באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה. ההשפעות של ארבוטין על התמיינות אוסטאובלסטים נחקרו באמצעות צביעה אלקליין פוספטאז (ALP) ועל ידי בחינת רמות ביטוי ה-mRNA של שרשרת קולגן מסוג I 1 (COL1A1), חלבון עצם-carboxyglutamate (BGLAP) ופקטור שעתוק Sp7 (SP7). כדי לחקור עוד יותר את המנגנון המולקולרי העומד בבסיס תפקוד ארבוטין בקידום אוסטאוגנזה, רמות ביטוי ה-mRNA והחלבון של גורם שעתוק קשור ל-runx (RUNX2) ו-catenin נותחו על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית בשעתוק הפוכה ו-Western blotting. ארבוטין קידם באופן משמעותי את התפשטות תאי MC3T3-E1 והגדיל את יחס התאים בשלב ה-S. טיפול בארבוטין הגביר את פעילות ALP ואת רמות ביטוי ה-mRNA של COL1A1, BGLAP ו-SP7 בתאי MC3T3-E1. יתר על כן, רמות ביטוי החלבון וה-mRNA של RUNX2 ו-catenin עלו באופן משמעותי בעקבות טיפול בארבוטין. ביחד, הממצאים הנוכחיים הצביעו על כך ש-arbutin היה מסוגל לקדם את השגשוג וההתמיינות של תאי MC3T3-E1 באמצעות מסלול האיתות Wnt/-catenin.
על פי מחקרים רלוונטיים,cistancheהוא צמח נפוץ המכונה "עשב הנס מאריך חיים". המרכיב העיקרי שלו הואcistanoside, בעל השפעות שונות כגוןנוגד חמצון, אנטי דלקתי, וקידום תפקוד חיסוני. המנגנון בין cistanche והלבנת עורטמון בהשפעה נוגדת החמצון של גליקוזידים cistanche. המלנין בעור האדם מיוצר על ידי חמצון של טירוזין המזוזז על ידיטירוזינאז, ותגובת החמצון דורשת השתתפות של חמצן, ולכן הרדיקלים החופשיים בחמצן בגוף הופכים לגורם חשוב המשפיע על ייצור המלנין. Cistanche מכיל ציסטאנוסיד, שהוא נוגד חמצון ויכול להפחית את יצירת הרדיקלים החופשיים בגוף, ובכךעיכוב ייצור המלנין.
למידע נוסף:
david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
מבוא
אוסטאופורוזיס היא בעיה בריאותית וסוציו-אקונומית המאופיינת במסת עצם נמוכה והידרדרות במיקרו-ארכיטקטורת העצם, מה שמגביר את הסיכון לשברי שבריריות (1,2). באיחוד האירופי (EU), שיעור השכיחות של אוסטיאופורוזיס בקרב אנשים בני יותר מ-50 שנה נאמד ב-6.6 ו-22.1 אחוזים עבור גברים ונשים בשנת 2010, בהתאמה. מבחינה כלכלית, העלות הכוללת של אוסטאופורוזיס לאיחוד האירופי הייתה ~37.4 מיליארד אירו בשנת 2010 (3). בשל העלייה בתוחלת החיים והזדקנות האוכלוסייה הגדלה, מספר גדל והולך של אנשים עלול לסבול משברים אוסטאופורוטיים בעתיד (4). אוסטאופורוזיס נגרמת מחוסר איזון בין יצירת עצם, בתיווך אוסטאובלסטים, לבין ספיגה, בתיווך אוסטאוקלסטים (5). טיפולי אוסטאופורוזיס זמינים כוללים תרופות נגד ספיגה (כגון ביספוספונטים ודנוסומאב), קלציטונין ואסטרוגן. עם זאת, תרכובות אלה מציגות מגבלות מסוימות; בפרט, הם מפחיתים את קצב התחלופה האוסטאוגני, ועל ידי הפחתת תהליך שיפוץ העצם, הם גורמים לירידה ביצירת העצם (6). טיפול באסטרוגן אינו אידיאלי לטיפול ארוך טווח באוסטיאופורוזיס, מכיוון שרמות גבוהות של אסטרוגן עלולות לגרום לדימום רחם, סרטן שד ומחלות לב וכלי דם (7). בנוסף, תרופות נגד ספיגה אינן מסוגלות לשחזר את מבנה העצם האבוד. עם זאת, חומרים אנבוליים עשויים לעורר יצירת עצם ולהגדיל את מסת העצם (8). לכן, חשוב לזהות תרופות חדשות בטוחות ויעילות המסוגלות לקדם יצירת עצם.
ארבוטין (4-hydroxyphenyl- ‑D-glucopyranoside; איור 1) הוא נגזרת הידרוקינון הקיימת באופן טבעי (מסה מולקולרית 272 Da) הקיימת בסוגים שונים של צמחים. רמות גבוהות של ארבוטין זוהו בצמחים, כולל מיורן (Origanum majorana, Lamiaceae) ואגסים (Pyrus communis, Rosaceae) ובמיוחד במשפחת Ericaceae כגון עלי דובי (Arctostaphylos uva-ursi) (9). ארבוטין מציג פעילויות ביולוגיות שונות. לדוגמה, ניתן להשתמש בארבוטין
כחומר הלבנת עור; על ידי עיכוב פעילות טירוזינאז במלנוזומים, ארבוטין זוהה כמקדם דפיגמנטציה (10,11). מחקר קודם הראה כי ארבוטין עשוי לשמש תפקיד מגן מפני אפופטוזיס הנגרמת על ידי קרינת רנטגן על ידי הפחתת הרמות התוך תאיות של רדיקלים הידרוקסיל (12). בנוסף, ארבוטין עשוי לעכב התמיינות אוסטאוקלסטית על ידי הפחתת הרמות התוך-תאיות של סופראוקסיד ועל ידי הורדת הגורם הגרעיני של תאי T משופעלים 1 (13). עם זאת, ההשפעות של ארבוטין על תפקוד האוסטאובלסט נותרו לא ידועות. לכן, מטרת המחקר הנוכחי הייתה לחקור את ההשפעות והמנגנונים של ארבוטין על MC3T3-E1 של עכבר שגשוג והתמיינות של תאי מבשר אוסטאובלסטים.
מסלול האיתות Wnt עשוי להשפיע על אוסטאובלסט ואוסטאוקלסט, באופן ישיר ועקיף, להגביר את היווצרות העצם ולהפחית את ספיגת העצם (14). איתות Wnt קנוני עשוי לווסת את השגשוג, ההתמיינות והתפקוד של אוסטאובלסטי ברמות מרובות (15). במודלים של בעלי חיים, הפחתת הפעילות של מעכבי מסלול האיתות Wnt/-catenin על ידי שימוש בנוגדנים נגד חלבון מקורזל הקשור לחלבון 1, סקלרוסטין ו-dickkopf WNT מעכב מסלול איתות 1 (DKK1), ומעכבי מולקולות קטנות של גליקוגן סינתאז. קינאז 3 (GSK-3) עשוי להגביר את מסת העצם ולהפחית את הסיכון לשברים(16). לכן, מסלול האיתות Wnt מייצג יעד טיפולי פוטנציאלי לפיתוח תרופות חדשות לטיפול באוסטיאופורוזיס (17). במחקר הנוכחי נחקרו ההשפעות של ארבוטין על שגשוג והתמיינות תאי MC3T3-E1. בנוסף, נבדק המנגנון המולקולרי העומד בבסיס תפקוד ארבוטין בהשראת התמיינות תאי MC3T3-E1.
חומרים ושיטות
כימיקלים. ארבוטין (טוהר, גדול מ-98 אחוזים או שווה לו) נרכש מ-Dalian Meilun Biotech Co., Ltd. (Dalian, סין), מומס ב-dimethyl sulfoxide (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, גרמניה), ואוחסן ב- ריכוז של 0.5 M. DKK1 אנושי רקומביננטי נרכש מ-PeproTech, Inc. (Rocky Hill, NJ, ארה"ב; מס' קטגוריה 120-30).
תרבית תאים. MC3T3-E1 פרה-אוסטאובלסטים של עכברים קלווריאליים נרכשו ממרכז משאבי התא של מכוני שנגחאי למדעי הביולוגיה של האקדמיה הסינית למדעים (שנחאי, סין), ותופחו ב-Minimum Essential Medium (-MEM; HyClone; GE Healthcare Life Sciences, Logan, UT, ארה"ב) בתוספת של 10 אחוז סרום בקר עוברי (FBS; ביולוגי תעשיות, קיבוץ בית העמק, ישראל), 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ו-100 U/ml פניצילין (HyClone; GE Healthcare Life Sciences). התאים נשמרו באינקובטור של תרבית תאים עם 5 אחוז CO2 ב-37 מעלות צלזיוס. המדיום הוחלף כל יומיים. תאים ב-80 אחוז מפגש נזרעו מחדש לצלוחיות של תרבית רקמה לאחר טיפול ב-0.25 אחוז טריפסין (HyClone; GE Healthcare Life Sciences) למשך 1-2 דקות ב-37°C. עבור ניסויי התמיינות אוסטאובלסטית, תאים טופלו בתוסף אוסטאוגני המכיל 50 מיקרוגרם/מ"ל L-ascorbic acid (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) ו-10 mM -glycerophosphate disodium salt hydrate (Sigma-Aldrich) 3 Days KG Merck. ˚C. עבור מחקרים מכניסטיים, תאי MC3T3-E1 טופלו מראש עם DKK1 (0.5 מיקרוגרם/מ"ל) במשך 6 שעות ב-37°C ולאחר מכן טופלו בארבוטין (100 µM) במשך 3 ימים ב-37°C.
התפשטות תאים. ערכת ספירת תאים{{0}} (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc., Kumamoto, יפן) שימשה להערכת ההשפעות של ארבוטין על התפשטות תאים. תאים נזרעו בצלחות של 96-באר בצפיפות של 5x103 תאים/באר למשך 24 שעות ב-37°C. לאחר מכן, תאים טופלו בארבוטין בריכוזים שונים (0, 10, 50 ו-100 מיקרומטר). לאחר 24, 48 או 72 שעות, התאים טופלו בתמיסת CCK-8 של 9.1 אחוז המכילה 10 µl CCK-8 ו-100 µl ‑MEM למשך 1-2 שעות ב-37˚C. ערך הצפיפות האופטית של כל באר נמדד באמצעות קורא microplate (ELx808; BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, ארה"ב) באורך גל של 450 ננומטר. הכדאיות הסלולרית היחסית חושבה כיחס בין הספיגה הממוצעת של הדגימה והביקורת.
בדיקת תיוג 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU). ההשפעה של ארבוטין על התפשטות התאים נמדדה באמצעות ערכת הדמיה חוץ-גופית EdU Apollo®567 (Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Guangzhou, סין). תאים חוסנו בצלחת 96-באר בצפיפות של 1x103 תאים/באר והודגרו ב-MEM המכילה 10 אחוז FBS עם 0, 10, 50 או 100 µM ארבוטין. לאחר דגירה של 72- שעות, נוספה EdU לכל באר בריכוז של 50 µM לפני דגירה נוספת למשך 2 שעות ב-37˚C. תאים נשטפו פעמיים עם PBS וקובעו עם PBS המכיל 4 אחוז פרפורמלדהיד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לאחר שטיפה עם גליצין (2 מ"ג/מ"ל) ו-PBS, תאים חולרו עם Triton X-100 (0.5 אחוז) למשך 10 דקות ב-RT. תאים הודגרו עם 1X נוזל תגובת צביעה אפולו ב-RT למשך 30 דקות בחושך. גרעיני תאים נצבעו נגד 1X Hoechst 33342 למשך 30 דקות ב-RT. תאים חיוביים ל-EdU הוצגו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (הגדלה, x200; Eclipse Ti; Nikon Corporation, טוקיו, יפן) בחמישה שדות שנבחרו באקראי.
ניתוח מחזור התא ואפופטוזיס. תאי MC3T3-E1 נזרעו בצלחות שש בארות בצפיפות של 2x105 תאים/באר. לאחר דגירה של 24- שעות, התאים טופלו בארבוטין בריכוזים של 0, 10, 50 ו-100 µM. תאים נקצרו לאחר 3 ימים ב-RT וקובעו עם 70 אחוז אתנול למשך 12 שעות ב-4 מעלות צלזיוס. תאים נשטפו שלוש פעמים עם PBS והוצבעו בתמיסת צביעה של propidium iodide (PI) (מכון ביוטיים לביוטכנולוגיה, היימן, סין) למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס בחושך. תכולת ה-DNA נמדדה באמצעות ציטומטר זרימה FACSCalibur (BD Biosciences, סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב) עם תוכנת CellQuest Pro (גרסה 5.2; BD Biosciences) ותוכנת ModFit LT (גרסה 3.0; Verity Software House, Inc., Topsham, ME, ארה"ב). לצורך ניתוח אפופטוזיס, תאים שטופלו בארבוטין נקצרו והוצבעו ב-Annexin-V ו-P I (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) המסומנים ב-Fluorescein ב-RT בחושך למשך 15 דקות. קצב האפופטוטי התא הוערך באמצעות ציטומטר זרימה FACSCalibur (BD Biosciences) עם תוכנת CellQuest Pro (גרסה 5.2; BD Biosciences).
בדיקת צביעה אלקליין פוספטאז (ALP). אוסטאובלסטים נזרעו בצלחות באר {{0}} בצפיפות של 5x104 תאים/באר הודגרו ב-MEM המכיל תוסף אוסטאוגני וטופלו ב-0 (ביקורת), 10, 50 או 100 µM ארבוטין. לאחר 9 ימים ב-37 מעלות צלזיוס, התאים נשטפו שלוש פעמים עם PBS וקובעו ב-4 אחוז פרפורמלדהיד ב-RT למשך 10 דקות. תאים נשטפו שלוש פעמים במים מזוקקים ולאחר מכן נצבעו באמצעות 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitro blue tetrazolium chloride ALP ערכת פיתוח צבע ALP (Beyotime Institute of Biotechnology) למשך 2 שעות ב-RT. תאים מוכתמים צולמו באמצעות מיקרוסקופ אור (הגדלה, x40; Eclipse Ti; Nikon Corporation).
תגובת שרשרת פולימראז (RT-qPCR) בשעתוק הפוך. תאים נזרעו ב6-צלחות באר בצפיפות של 2x105 תאים/באר. לאחר טיפול בארבוטין בריכוזים שונים במשך 3 ימים ב-37 מעלות צלזיוס, RNA כולל מופק מתאי MC3T3-E1 באמצעות ריאגנט RNAiso Plus (Takara Biotechnology Co., Ltd., Dalian, סין). בסך הכל, 1 מיקרוגרם RNA הועתקו לאחור ל-cDNA באמצעות ערכת ריאגנטים PrimeScript RT עם gDNA Eraser (Takara Biotechnology Co., Ltd.), לפי הוראות היצרן. תנאי התגובה היו כדלקמן: 42˚C למשך 2 דקות, 37˚C למשך 15 דקות, ו-85˚C למשך 5 שניות. qPCR בוצע באמצעות כמויות שוות של cDNA מכל דגימה בנפח כולל של 20 μl עם ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, ארה"ב) באמצעות SYBR premix Ex Taq II (Takara) ביוטכנולוגיה ושות' בע"מ). נעשה שימוש בתנאים התרמו-מחזוריים הבאים: דנטורציה ראשונית ב-95˚C למשך 30 שניות, ולאחר מכן 40 מחזורים של 95˚C למשך 5 שניות ו-60˚C למשך 34 שניות. הספציפיות של ההגברה הוערכה על ידי ניתוח עקומת התכה, ו-actin שימש בקרה פנימית. רמות ביטוי גנים יחסיות נותחו באמצעות שיטת 2-ΔΔCq (18). הרצפים של הפריימרים שבהם נעשה שימוש היו הבאים: גורם שעתוק קשור ל-RUNX (RUNX2), קדימה 5'-CCAACCGAGTCATTTAAGGCT-3', הפוך 5'-GCTCACGTCGCTCATCTTG-3'; שרשרת קולגן מסוג I 1 (COL1A1), קדימה 5'-GCCTCCCAGAACATC ACCTA‑3', הפוך 5'-GCAGGGACTTCTTGAGGTTG-3';עֶצֶם חלבון carboxyglutamate (BGLAP), קדימה 5'-CGCTACCTTGGAGCCTCAGT-3', הפוך 5'-AGGCGGTCTTCAAGCCATAC-3'; גורם שעתוק Sp7 (SP7), קדימה5'‑AAGGGTACGGCAAGGCTTC‑3', הפוך 5'-CGTCAGAGCGAGTGAACCTC‑3'; -קטנין, קדימה 5'-ATGGAGCCGGACAGAAAAGC-3', הפוך 5'-CTTGCCACTCAGGGAAGGA‑3'; -אקטין, קדימה 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3', הפוך 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'.
ניתוח כתם מערבי. תאי MC3T3-E1 נזרעו ב6-צלחות באר בצפיפות של 2x105 תאים/באר. תאים טופלו בארבוטין בריכוזים שונים במשך 3 ימים ונשטפו שלוש פעמים עם PBS קר כקרח. סך החלבון הסלולרי הופק מתאי MC3T3-E1 באמצעות חיץ תמוגה של בדיקת רדיואימוניות (Beyotime Institute of Biotechnology) המכיל 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride. חלבונים בודדו לאחר צנטריפוגה ב-13,800 xg למשך 15 דקות ב-4°C. ריכוז החלבון הוכמת באמצעות ערכת בדיקת חלבון חומצה bicinchoninic (מכון ביו-טיים לביוטכנולוגיה). כמויות שוות של חלבון (20-30 מיקרוגרם) בכל דגימה הופרדו על ידי 10 אחוז SDS-PAGE למשך 2 שעות במתח קבוע (110 V) והועברו על גבי ממברנת פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) (EMD Millipore, Billerica, MA, ארה"ב). ממברנות נחסמו ב-TBS בתוספת Tween-20 (TBST; 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7.5 ו-0.1% Tween-20) המכילים 5% חלב ללא שומן ב-RT למשך 2 שעות ולאחר מכן הודגרו למשך הלילה בשעה 4˚C עם נוגדנים ראשוניים מתאימים. הנוגדנים שבהם נעשה שימוש היו הבאים: ארנב חד שבטי אנטי- -קטנין (1:5,000; מס' קטגוריה ab32572; Abcam, Cambridge, MA, ארה"ב), ארנב polyclonal anti-RUNX2 (1: 1,000; מס' קטגוריה ab23981; Abcam) ואנטי-- -אקטין רב-שבטי של עכברים (1:1,000; מס' קטגוריה AF0003; ביוטיים המכון לביוטכנולוגיה). לאחר מכן, הממברנות נשטפו שלוש פעמים עם TBST, וממברנות ה-PVDF הודגרו עם אימונוגלובולין G של עז נגד ארנבת מצומד חזרת פרוקסידאז (HRP) (IgG; 1:10,000; מס' קטגוריה ZB{{ 52}}; OriGene Technologies, Inc., בייג'ין, סין) או IgG של עז נגד עכבר מצומד HRP (1:10,000; מס' קטגוריה ZB-2305; OriGene Technologies, Inc.) ב-RT למשך 2 שעות . חלבונים הוצגו באמצעות ריאגנטים משופרים כימילומינסצנציה (Thermo Fisher Scientific, Inc.) וזוהו באמצעות מערכת זיהוי כימי-אור (Amersham Imager 600; GE Healthcare Life). חלבונים נמדדו באמצעות תוכנת ImageJ (גרסה 1.52; המכון הלאומי לבריאות, Bethesda, MD, ארה"ב). לאחר נורמליזציה, רמות ביטוי חלבון יחסי חושבו עם -אקטין כבקרה פנימית.
ניתוח סטטיסטי. כל הניסויים חזרו על עצמם באופן עצמאי לפחות שלוש פעמים. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, ארה"ב). הנתונים מוצגים כסטיית התקן הממוצעת, והבדלים משמעותיים נותחו על ידי ניתוח חד-כיווני של שונות יחד עם מבחן הפוסט-הוק של דנט. פ<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.
תוצאות
ארבוטין מעודד שגשוג תאי MC3T3-E1. ההשפעות של ארבוטין על שגשוג תאי MC3T3-E1 נבדקו באמצעות מבחן CCK-8. ארבוטין ניתן בריכוזים שונים (0, 10, 50 ו-100 µM) במשך 24, 48 ו-72 שעות, ובוצעה בדיקת CCK-8 (איור 2A). לאחר 24 שעות, לא זוהו הבדלים סטטיסטיים בשגשוג האוסטאובלסטים בהשוואה לתאי הביקורת שלא טופלו. עם זאת, שגשוג תאי MC3T3-E1 גדל באופן משמעותי בעקבות טיפול בארבוטין ב-100 µM לאחר 48 ו-72 שעות. בדיקת תיוג EdU בוצעה לאחר 72 שעות, והתוצאות הראו שאחוז תאי MC3T3-E1 חיוביים ל-EdU שטופלו בארבוטין בריכוז של 50 ו-100 מיקרומטר גדל באופן משמעותי בהשוואה לביקורת הלא מטופלת (איור 2B ו-C) .
ארבוטין מאיץ את התקדמות מחזור התא. ההשפעות של ארבוטין על התקדמות מחזור התא הוערכו באמצעות ניתוח מחזור התא (איור 3). טיפול בארבוטין ב-50 ו-100 µM הוביל לעלייה באחוז התאים ב-S-phase (איור 3A ו-C) ו-100 µM arbutin הוביל לירידה באחוז התאים בשלב G1-( איור 3D). לא זוהו הבדלים מובהקים סטטיסטית בקבוצת ה-10 µM בהשוואה לקבוצת הביקורת. ההשפעות של ארבוטין על אפופטוזיס MC3T3-E1 הוערכו גם באמצעות ציטומטריית זרימה (איור 3B ו-E). שיעור האפופטוזיס לא השתנה משמעותית בעקבות טיפול בארבוטין ב-10, 50 ו-100 מיקרומטר בהשוואה לביקורת.
השפעות של ארבוטין על פעילות ALP. ההשפעות של ארבוטין על התמיינות אוסטאובלסט נותחו על ידי צביעת ALP. לאחר 9 ימים, טיפול בריכוזים שונים של ארבוטין (0, 10, 50 או 100 מיקרומטר) הגביר באופן ניכר את פעילות ALP בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 4A). הממצאים הנוכחיים העלו כי ארבוטין עשוי להגביר את הפעילות של ALP בתאי MC3T3-E1.
השפעות של ארבוטין על רמות ביטוי ה-mRNA של COL1A1, קטנין, RUNX2, BGLAP ו-SP7. רמות ביטוי ה-mRNA של COL1A1, -catenin, RUNX2, BGLAP ו-SP7 הוערכו בתאי MC3T3-E1 באמצעות RT-qPCR בעקבות טיפול בארבוטין בריכוזים שונים (0, 10, 50 או 100 µM) עבור 3 ימים. רמות הביטוי COL1A1 ו-catenin עלו באוסטאובלסטים שטופלו ב-10, 50 ו-100 µM ארבוטין בהשוואה לתאים לא מטופלים (איור 4B ו-C). רמות הביטוי של RUNX2, BGLAP ו-SP7 עלו באופן משמעותי בעקבות טיפול בארבוטין ב-50 ו-100 µM (איור 4D-F).
השפעות של ארבוטין על רמות ביטוי חלבון של קטנין ו-RUNX2. כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים של התמיינות אוסטאובלסטים המושרה על ידי ארבוטין, רמות ביטוי החלבון של RUNX2 ו-catenin נבדקו בתאי MC3T3-E1 באמצעות Western blotting (איור 5A ו-B). טיפול בארבוטין ב-100 µM העלה משמעותית את רמות ביטוי החלבון של -catenin ו-RUNX2 באוסטאובלסטים בהשוואה לביקורות (איור 5C ו-D, בהתאמה). התוצאות הנוכחיות הציעו כי ארבוטין עשוי להשפיע על התמיינות אוסטאובלסט על ידי ויסות רמות ביטוי החלבון של -catenin ו- RUNX2. כדי לחקור אם ארבוטין ממריץ התמיינות אוסטאובלסטית דרך מסלול האיתות Wnt/-catenin, תאי MC3T3-E1 טופלו ב-0.5 מיקרוגרם/מ"ל DKK1 במשך 6 שעות לפני הטיפול ב-100 מיקרומטר ארבוטין.
DKK1 עיכב באופן משמעותי את ביטוי חלבון RUNX2 המושרה על ידי ארבוטין (איור 5E). התוצאות הנוכחיות הציעו כי ארבוטין עשוי להשפיע על התמיינות אוסטאובלסט באמצעות מסלול האיתות Wnt/-catenin.
דִיוּן
אוסטאופורוזיס עלולה לגרום לשברים ולנכויות חמורים ומייצגת בעיה הקשורה לגיל ברחבי העולם (19). עדויות מצטברות הראו שחוסר איזון בין אוסטאוקלסטים לאוסטאובלסטים ביצירת עצם ובספיגה עלול להוביל לאוסטאופורוזיס (20). יש לציין כי יצירת עצם תלויה בשגשוג ובידול אוסטאובלסטים (21,22).
מספר תרופות זמינות המשמשות לטיפול באוסטיאופורוזיס הן תרופות אנטי-ספוגיות (23); עם זאת, טיפולים אלה אינם מסוגלים להפוך את אובדן העצם (24). חומרים אנבוליים הממריצים את היווצרות העצם עשויים לשחזר מיקרו-מבנה שלד פגום חמור ואובדן מסת עצם (24). Teriparatide הוא חומר אנבולי אחד שהוכח כממריץ יצירת עצם, וניסויים קליניים הוכיחו שטיפול ב-teriparatide הפחית את הסיכון לשברים חדשים בחוליות ולעלייה בצפיפות המינרלים של העצם בירך, בעמוד השדרה המותני ובצוואר הירך (25). יש לציין ש-teriparatide הוא טיפול יקר. לכן, חשוב לפתח תרופות חדשות שיכולות לקדם ביעילות יצירת עצם.
ארבוטין הוא חומר ציטו-פרוטקטיבי ואינו מפגין השפעות ציטוטוקסיות משמעותיות בריכוזים גבוהים (26). למרות שריכוז הדם של ארבוטין אינו ברור (13), ארבוטין משמש כתרופה אנטי-מיקרוביאלית בדרכי השתן ונחשב לסוכן אוראלי בטוח (27,28). מחקרים קודמים הראו כי ארבוטין עשוי להפגין פעילויות מרובות, כולל הלבנת עור (10,11), אנטי דלקתי (29), אנטי סרטני (30) ודיכוי התמיינות אוסטאוקלסט (13). עם זאת, נדרשים מחקרים נוספים כדי לחקור את ההשפעות של ארבוטין על אוסטאובלסטים והפוטנציאל שלו לשמש כתרכובת חדשה לטיפול באוסטיאופורוזיס. לכן, המחקר הנוכחי חקר את ההשפעות של ארבוטין על התפשטות והתמיינות של תאי MCET3-E1 ואת המנגנונים העומדים בבסיס תפקוד ארבוטין במבחנה.
היווצרות עצם קשורה למספר האוסטאובלסטים ולפעילותם של אוסטאובלסטים בודדים (31). ניתן להגדיל את מספר האוסטאובלסטים על ידי קידום שכפול או התמיינות פרה-אוסטאובלסטים, או על ידי הפחתת מוות תאי של אוסטאובלסטים בוגרים (32). במחקר הנוכחי, ארבוטין הגביר את השגשוג של תאי MC3T3-E1 מבלי להשפיע על קצב האפופטוטי. בנוסף, ארבוטין הגביר את התקדמות מחזור התא על ידי מעבר תאים משלב G1-לשלב S. תוצאות אלו הציעו כי ארבוטין עשוי לגרום לשגשוג אוסטאובלסטי.
ALP הוא סמן מוקדם של התמיינות אוסטאוגנית (33). ALP קשורה להסתיידות של השלד במהלך היווצרות עצם (34). במחקר הנוכחי, תוצאות צביעת ALP הצביעו על כך שאוסטאובלסטים שטופלו בארבוטין ב-10, 50 ו-100 מיקרומטר, ועם תוסף אוסטאוגני למשך 9 ימים, הראו פעילות מוגברת של ALP, מה שמצביע על כך ש-arbutin עשוי לקדם את ההתמיינות המוקדמת של אוסטאובלסטים.
הוכח כי אוסטאוגנזה מווסתת על ידי גורמי שעתוק שונים, כולל RUNX2 ו-SP7, וחלבוני מטריקס מרובים ספציפיים לעצם, כולל ALP,BGLAP, ו-COL1A1 (35). RUNX2 ו-SP7 חשוביםגורמי שעתוק המעורבים בהתמיינות אוסטאובלסטיםבמהלך היווצרות עצם (36). COL1A1 הוא חוץ תאיחלבון מטריקס המקדם התחדשות עצם ואוסטאובידול פיצוץ (37). BGLAP הוא חומר שאינו קולגןחלבון מטריצת עצם המווסת את מחזור העצם והעצםמינרליזציה (38). המחקר הנוכחי זיהה כי ארבוטיןעשוי לגרום לרמות ביטוי mRNA של חשובמווסתים אוסטאוגניים, כולל RUNX2, BGLAP, SP7, וCOL1A1. בנוסף, רמת הביטוי של -קטנין היהמוּגדָל. תוצאות אלו הציעו כי ארבוטין עשוי לקדםהתמיינות אוסטאובלסטית באמצעות מנגנון הכרוךWnt/ איתות קטנין.
מסלול האיתות Wnt משפיע על יצירת העצם במהלך ההתפתחות, ועיצוב העצם במהלך חידוש הרקמות (39). מסלול האיתות הקנוני של Wnt היהזוהה להיות יזום על ידי איתות ליגנד Wnt בתאפני השטח דרך קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכהחלבון 5 או 6 (Lrp5/6) וטרנסממברנה שבעה מעבריםקולטן מקורזל (40). האינטראקציה בין ליגני Wntוהקולטן שלהם עשוי לעכב GSK3- בציטופלזמה,מוביל לשחרור של -קטנין, אמצעי התעתיקator של איתות Wnt קנוני. בעקבות השחרור, -קטניןיכול להיכנס לגרעין, ובכך לשלוט בביטוירמות של גני המטרה שלו (41). RUNX2 שייך ל-Runtמשפחת גנים של תחום ומהווה גורם שעתוק המעורב בהתמיינות אוסטאובלסטית (42). RUNX2 משרת חשובתפקיד בתיאום מסלולי איתות מרובים במהלךהתמיינות אוסטאובלסטית (43). שד מחקר קודםקבע כי איתות Wnt קנוני עשוי לווסת ישירותRUNX2. ספציפית, ה -catenin/HNF1 homeobox Aקומפלקס עשוי להפעיל את רמת הביטוי של RUNX2,ובכך לקדם יצירת עצם (44). DKK1 הוא חזקמעכב של Wnt/ -מסלול קנוני של קטנין, על ידי כריכהל-Lrp5/6 (45,46). תוצאות המחקר הנוכחי הציעושטיפול בארבוטין העלה משמעותית את החלבוןרמות ביטוי של RUNX2 ו -קטנין ב-MC3T3-E1תאים, ו-DKK1 הפחיתו משמעותית את ביטויי החלבוןרמת sion של RUNX2. התוצאות הנוכחיות הצביעו על כךארבוטין עשוי לקדם התמיינות תאי MC3T3-E1 באמצעות Wnt/ הקנוני-מסלול קטנין.
באופן קולקטיבי, למיטב ידיעת המחברים, המחקר הנוכחי הוא הראשון שמצביע על כך ש-arbutin עשוי לעורר שגשוג והתמיינות של תאי MC3T3-E1 באמצעות מסלול האיתות Wnt/-catenin. לכן, ארבוטין עשוי לייצג מועמד פוטנציאלי חדש לטיפול באוסטיאופורוזיס. עם זאת, נדרשים מחקרים נוספים כדי לזהות את התפקיד הספציפי של מסלול האיתות Wnt/-catenin באוסטאוגנזה המושרה על ידי ארבוטין, כולל הזרחון של -catenin ב-Ser675 (47); מידע נוסף לגבי התפקיד של איתות Wnt/-catenin עשוי להיות מושג באמצעות אגוניסטים של Wnt. בעתיד, מחקרים נוספים עשויים לחקור את יכולתו של ארבוטין לקדם יצירת עצם in vivo.
תודות
לא ישים.
מימון
העבודה הנוכחית נתמכה על ידי התוכנית המרכזית של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מספר מענק 81370981) והקרן המדעית המצטיינת של בית החולים שנג'ינג.
זמינות נתונים וחומרים
מערכי הנתונים ששימשו ו/או נותחו במהלך המחקר הנוכחי זמינים מהמחבר המתאים לפי בקשה סבירה.
תרומות מחברים
QF, XM ו-LiY הגו ועיצבו את הניסויים. XM ביצע את הניסויים וכתב את כתב היד. SL, LiY, LeY ו-ML ניתחו את הנתונים ושינו באופן ביקורתי את כתב היד. QF פיקח על כל המחקר ותיקן את כתב היד. כל המחברים קראו ואישרו את כתב היד הסופי.
אישור אתיקה והסכמה להשתתפות
לא ישים.
הסכמת המטופל לפרסום
לא ישים.
אינטרסים מתחרים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.
הפניות
1. Das S ו-Crockett JC: אוסטאופורוזיס - השקפה עדכנית של מניעה וטיפול תרופתי. Drug Des Devel Ther 7435-448.2013.
2.Rachner TD, Khosla S and Hofbauer LC: אוסטאופורוזיס: עכשיו והעתיד. Lancet 377: 1276-1287. 2011.
3. Hernlund E, Svedbom A, Ivergard M, Compston J, Cooper CStenmark JMcCloskey EVJOnsson B andKanis JA: אוסטאופורוזיס באיחוד האירופי: ניהול רפואי, אפידמיולוגיה ונטל כלכלי. דו"ח שהוכן בשיתוף עם הקרן הבינלאומית לאוסטאופורוזיס (IOF) והפדרציה האירופית של איגודי תעשיית התרופות (EFPIA). Arch Osteoporos 8: 136.2013.
4. Cauley JA: השפעת בריאות הציבור של אוסטיאופורוזיס. J Gerontol ABiol Sci Med Sci 68: 1243-1251.2013.
5. Manolagas SC ו-Jilka RL: מח עצם, ציטוקינים ושיפוץ עצם. תובנות חדשות על הפתופיזיולוגיה של אוסטאופורוזיס. N Engl J Med 332: 305-311. 1995.
6. Baron R and Hesse E: Update on anabolics עצם בטיפול באוסטיאופורוזיס: נימוק, מצב נוכחי ונקודות מבט. J ClinEndocrinol Metab 97: 311-325.2012.
7.TangDZ, Hou WZhou Q, ZhangM, HolzJ, SheuTJ, LiTF ChengSDShi O. Harris SE.et al: Osthole מגרה התמיינות אוסטאובלסט ויצירת עצם על ידי הפעלה של Beta-catenin-BMP איתות Bone Miner Res 25: 1234-1245 . 2010.
8. Canalis E: עדכון בטיפולים אנבוליים חדשים לאוסטאופורוזיס. J Clin Endocrinol Metab 95: 1496-1504.2010.
9. Lamien-Meda A, Lukas B, Schmiderer C, Franz C, and Novak J: Validation of assay quantitative of arbutin באמצעות כרומטוגרפיית גז ב-Origanum majorana and Arctostaphylos uva-ursiextracts.Phytochem Anal 20: 416-420.2009 .
10.Lim YJ, Lee EH, Kang TH, Ha SK, Oh MS, Kim SM, Yoon TJ.Kang C, Park JH, and Kim SY: השפעות מעכבות של ארבוטין על ביוסינתזה של מלנין של היפרפיגמנטציה הנגרמת על ידי אלפא-מלנוציטים. ברקמות עור חזיר ניסיונות חום תרבותיות. Arch Pharm Res 32: 367-373.2009.
11. Maeda K ו-Fukuda M: Arbutin: מנגנון של פעולת הפיגמנטציה שלו בתרבות המלנוציטים האנושיים. J Pharmacol ExpTher 276: 765-769.1996.
12. Wu LH Li P Zhao OL. Piao JL Jiao YF Kadowaki M andKondo T: Arbutin. סולל רדיקלי הידרוקסיל תוך תאי מגן על אפופטוזיס הנגרמת על ידי קרינה בתאי לימפומה U937 אנושית. אפופטוזיס 19: 1654-1663.2014
13. Omori A Yoshimura Y. Deyama Y וסוזוקי K: Rosmarinicacid ו-arbutin מדכאים התמיינות אוסטאוקלסטים על ידי עיכוב הורדת סופרוקסיד ו-NFATel בתאי RAW 264.7 Biomed Rep 3: 483-490.2015
14. Baron R and Kneissel M: איתות WNT בהומאוסטזיס עצם ומחלות: ממוטציות אנושיות לטיפולים. Nat Med l9.179-197.2013
15. Baron R and Rawadi G: Targeting the Wnt/beta-catenin pathway כדי לווסת יצירת עצם בשלד הבוגר.Endocrinology 148: 2635-2643.2007.
16. Hoeppner LH Secreto FJ ו-Westendorf JJ: איתות Wnt כיעד טיפולי למחלות עצם. Expert Opin TherTargets 13: 485-496.2009.
17. Williams BO ו-Insogna KL: לאן Wnts הלך: השדה המתפוצץ של Lrp5 ו-Lrp6 איתותים בעצם. J Bone Miner Res 24:171-178.2009
18. Livak KJ ו-Schmittgen TD: ניתוח נתוני ביטוי גנים יחסיים באמצעות PCR כמותי בזמן אמת ושיטת 2(-Delta DeltaC(T) Methods 25:402-408.2001.
19.Lin X. Xiong D. Peng YO. שנג ZF. Wu XY Wu XP Wu FYuan LO ו-Liao EY: אפידמיולוגיה וניהול אוסטאו. porosis in the People's Republic of China: Current views.Clin Interv Aging 10: 1017-1033.2015.
20. Manolagas SC: לידה ומוות של תאי עצם: מנגנוני ויסות בסיסיים והשלכות על הפתוגנזה והטיפול באוסטיאופורוזיס. Endocr Rev 21: 115-137.2000.
21.Liu S. Fang T. Yang L. Chen Z. Mu S ו-Fu O: Gastrodinprotects MC3T3-El osteoblasts מחוסר תפקוד תאי המושרה על ידי דקסמתזון ומקדם יצירת עצם באמצעות אינדוקציה של מסלול האותות NRF2. Int J Mol Med 41: 2059-2069.2018.
22. Yun HM Park KR. Quang TH Oh H. Hong JT. Kim YC ו-Kim EC: 2.4.5-Trimethox yldalbergiquinol מקדם התמיינות ומינרליזציה אוסטאובלסטית באמצעות מסלול BMP ו-Wnt/B-catenin. Cell Death Dis 6: el819. 2015.
23. Cosman F Nieves JW and Dempster DW: Treatment sequence1718.22.matters: Anabolic and antiresorptive therapy for osteoporosis Bone Miner Res 32: 198-202.2017
24.Uihlein AV ו-Leder BZ: טיפולים אנבוליים לאוסטאופורוזיס.Endocrinol Metab Clin North Am 41: 507-525.2012
25. Nakamura T Sugimoto T. Nakano T. Kishimoto H. Ito MFukunaga MHaginoH Sone T. Yoshikawa Nishizawa Y.eralRandomized Teriparatide (הורמון פרתירואיד אנושי (PTH1-341 מחקר יעילות פעם שבועי (TOWER) הפחתה בניסוי לבחינה שברים חדשים בחוליות בנבדקים עם אוסטאופורוזיס ראשוני וסיכון גבוה לשברים. J Clin Endocrinoetab 97: 3097-3106.2012
26. Jurica K BrCic Karabonji l, Mikolic A, Milcjkowic-Opsenica DBenkovic V, and Kopjar N: הערכת בטיחות במבחנה של תמצית עלי המים של עץ התות (Arbrrfus redo L) ו-arbutin לימפוציטים בדם היקפיים אנושיים. Cytotechnology 70: 1261-1278.2018
27. שינדלר G. Patzak U Brinkhaus B. זכה Niecieck A. Wittig JKrihmer N Glockl land Veit M: Urinary excretion and Metabo. רשימה של ארבוטין לאחר מתן אוראלי של תמצית Arctosfaphylos reversi כטבליות מצופות סרט ותמיסה מימית בבני אדם בריאים. J Clin Pharmacol 42: 920-927.2002.
28. Genowese C Davinelli S. Mangano K, Tempera G, Nicolosi D.Corsello S.Vergalito F Tartaglia E. Scapagnini G andDi Marco R: השפעות של שילוב חדש של תמציות צמחים בתוספת d-mannose לניהול דרכי שתן חוזרות לא מסובכות זיהומים. J Chemother 30: 107-114. 2018
29. Lee HJ and Kim KW: השפעות אנטי דלקתיות של ארבוטין בתאי מיקרוגליה BV2 מגורים ליפופוליסכרידים. InfiammRes 61: 817-825.2012.
30. Jiang L. Wang D Zhang Y. Li J. Wu Z. Wang Z and Wang D חקירה של ההשפעות הפרו-אפופטוטיות של ארבוטין ונגזרת האצטיל שלו על תאי מלנומה עכברים. Int J Mol Med 41:1048-1054.2018
31. Marie PJ ו-Kassem M: Osteoblasts in osteoporosis: Pastemerging, ומטרות אנבוליות עתידיות. Eur J Endocrinol 165:1-10.2017
32. Canalis E: ניהול מחלות אנדוקריניות: טיפולים אנבוליים חדשים לאוסטאופורוזיס. Eur J Endocrinol 178: R33-R44. 2018
33. Weinreb M Shinar D and Rodan GA: ביטוי שונה של פוספטאז אלקליין, אוסטאופונטין ואוסטאוקלצין בפיתוח עצם חולדה המוצגת על ידי הכלאה במקום. J BoneMiner Res 5: 831-842.1990.
34. קים YJ. Lee MH Wozney JM Cho JY ו-Ryoo HM: ביטוי פוספטאז אלקליין המושרה על ידי חלבון מורפוגנטי-2-מוגרות על ידי Dlxs ומודחק על ידי Msx2. J BioChemm 279: 50773-50780.2004
35. An JYang H Zhang O. Liu C. Zhao J. Zhang L and Chen B מוצרים טבעיים לטיפול באוסטיאופורוזיס: ההשפעות והמנגנונים על קידום חיים של יצירת עצם בתיווך אוסטאובלסט Sci 147: 46-58.2016
36.Kobavashi T and K ronenbere H: Minireview: Transcriptional Regulation in development of bone.Endocrinoloey 146: 1012-1017.2005.
37. Cathev and Reddy ABaltordal.oiczThrombospondin-2 מקלים על הרכבה של מטריצה עשירה בקולגן מסוג I בתאי סטרומה של מח העוברים תחנה שונה אוסטאובלסטית. Connect Tissue Res 54: 275-782.2013
38. Neve A. Corrado A and Cantatore FP: Osteocalcin: Skeletal and extra-skeletal effects J Cell Physiol 228: 1149-1153.2013
39. Wang Y.Li YP Paulson C, Shao Jz, Zhang X Wu M, וצ'ן הלכו ומסלול האיתות Wnt בהתפתחות עצם ומחלות. Front Biosci (Landmark Ed) 19: 379-407.2014
40.מקדונלד BT. Tamai K and He X: רכיבי איתות Wnt/beta-catenin. מנגנונים. ומחלות. Dev Cel1 17: 9-26. 2009
41. Kramer l.Halleux C,Keller H, Pegurri M,Gooi JHWeber PB. פנג JO. Bonewald LF ו-Kneissel M: איתות OsteocytWnt/beta-catenin נדרש להומאוסטזיס תקין של העצם. Mo Cel1 Biol 30: 3071-3085.2010
42. Ducy P Schinke T וקרסנטי G: האוסטאובלסט: פיברובלסט מתוחכם במעקב מרכזי. Science 289:1501-1504.2000
43. Franceschi RI ו-Xiao G: ויסות של גורם השעתוק הספציפי לאוסטאובלסט. RUNX2: היענות למסלולי התמרה מרובים. J Cell Biochem 88: 446-454.2003
44. Gaur T, Lengner Cl, Howhannisyan H, Bhat RA, Bodine PVKomm BS. Javed A. Van Wijnen AJ. שטיין JL. Stein GS Lian JB: איתות WNT קנוני מקדם אוסטאוגנזה מגרה ישירות את ביטוי הגנים Runx2. J Biol Chem 280:33132-33140.2005
45. Kawano Y ו-Kypta R: אנטגוניסטים מופרשים של מסלול האיתות Wnt. J Cel1 Sci 116: 2627-2634.2003
46.Daoussis D ו-Andonopoulos AP: התפקיד המתהווה של Dickkopf-l בביולוגיה של העצם: האם זה הבורר הראשי לשלוט בשיפוץ העצמות והמפרקים? Semin Arthritis Rheum 41: 170-177.2011
47. Taurin S.Sandbo N. Qin Y. Browning D and Dulin NO: זרחון של בטא-קטנין על ידי חלבון קינאז מחזורי תלוי AMP. J Biol Chem 281: 9971-9976.2006
למידע נוסף: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
