השפעות נוגדות חמצון ונוגדי קרישה של גליקוזידים של פניל ​​פרופנואידים

למידע נוסף:ali.ma@wecistanche.com

Bartosz Skalski, et al

תַקצִיר

צמחים הולופרזיטים של ה- Orobanchaceae, כולל Cistanche, Orobanche ו-Phelipanche spp, ידועים בעושר שלפניל פרופנואידגליקוזידים(PPGs). תרכובות PPG רבות נמצאו בעלות קשת רחבה של פעילויות, כגון אנטי מיקרוביאלית, אנטי דלקתית, נוגדת חמצון ומשפרת זיכרון. כדי לבחון טוב יותר את פוטנציאל הפעילות הביולוגית של מטאטא אירופאי (O. Caryophyllaceae – OC, P. Arenaria – PA, P. ramosa – PR) ועשרה מרכיבי פניל-פרופנואיד בודדים בודדים, חקרנו את פעולתם האנטי-רדיקלית, ההשפעה המגנה מפני חמצון בפלסמה במבחנה. , והשפעה על פרמטרי קרישה. התמציות שנבדקו הראו פעילות ניקוי של 50-70 אחוזים מהכוח של Trolox. לתמצית ה-OC, העשירה באקטאוזיד, הייתה פוטנציאל אנטי-רדיקלי טוב יותר ב-20 אחוזים מאשר תמצית PR שהייתה היחידה שהכילה PPGs חסרות קבוצת קטקול טבעת B ביחידת האציל. יתרה מכך, נמצא כי רק שמונה PPGs נבדקו(pהניל פרופנואידגליקוזידים)הוכיח פוטנציאל נוגד חמצון בפלזמה אנושית שטופלה ב-H2O2/Fe; עם זאת, שלושת ה-PPG שנבדקו(pהניל פרופנואידגליקוזידים)בעל פוטנציאל נוגד קרישה בנוסף לתכונות נוגדות חמצון. נראה כי המבנה של PPGs, במיוחד נוכחותם של חלקי אציל וקטכול, קשור בעיקר לתכונות נוגדות החמצון שלהם. פוטנציאל נוגד הקרישה של תרכובות אלו קשור גם למבנה הכימי שלהן. PPGs נבחרים מציגים את הפוטנציאל לטיפול במחלות לב וכלי דם הקשורותחמצונילחץ.

מילות מפתח:מטאטא, גליקוזידים של פניל ​​פרופנואידים, עקה חמצונית, דימום פלזמה

Cistancheיש לפניל פרופנואידגליקוזידים

לחץ למוצרי Cistanche

1. הקדמה

מחמצןלחץידוע בהשפעתו השלילית על בריאותם של אורגניזמים חיים, כולל הזדקנות מואצת וכמה סוגי סרטן. התרחשות שלחמצונילחץקשורה לאיזון מופרע בין מנגנוני החמצון והאנטיאוקסידטיביים (כולל הגנה אנזימטית (קטלאז, גלוטתיון פרוקסידאז) והגנה לא אנזימטית (גלוטתיון) בתאי הגוף [1]. ייצור יתר של מינים של חמצן תגובתי (ROS), כולל רדיקלים מחמצנים ומינים בעלי קליפה סגורה, הוא אחד המנגנונים העיקריים מאחורי היווצרות עקה חמצונית. עם זאת, ההשפעה הביולוגית הנגרמת על ידי ROS תלויה במידה רבה בריכוז, זמן החשיפה והמיקום. בתנאים רגילים (ריכוז נמוך), רדיקלי חמצן/חנקן יכולים לשחק את התפקיד של שליחים משניים, אך ברמה הגבוהה יותר, הם עשויים להתחיל להגיב עם מבנים ביולוגיים, כמו קרומי תאים [2]. בין כל מיני ROS, רדיקל הידרוקסיל (HO.) גורם למחמצןמדגישידוע כממלא תפקיד חשוב במגוון מחלות, כולל קרדיווסקולריות. הפרעות במערכת הדם נמצאו בקורלציה ו/או קדמו לשינויים בפרמטרים שונים של דימום וסמנים ביולוגיים בפלזמה [1,3].

מצד שני, חומרים טבעיים רבים, כגון פוליפנולים וחומצות שומן רב בלתי רוויות, זוהו כנוגדי חמצון חזקים המסוגלים למנוע היווצרות ו/או להפחית מיני חמצן תגובתיים. תרכובות בעלות תכונות כאלה נמצאות במוצרי מזון רבים ובתכשירים פרמצבטיים ממקור צמחי. תזונה מועשרת בירקות ופירות טריים, וטיפולים נוגדי חמצון המבוססים על נוגדי חמצון טבעיים, מומלצים לפיכך מכיוון שהם יכולים להפחית את רמתחמצונילחץולמנוע תהליכים פתופיזיולוגיים שונים [4,5]. פוליפנולים צמחיים הם קבוצה מגוונת של מטבוליטים משניים, שביניהם חומצות פנוליות תופסות מקום חשוב, שכן הם מופצים באופן נרחב ומציגים מגוון השפעות ביולוגיות, כגון אנטי-מיקרוביאליות, נוגדות חמצון ואנטי-דלקתיות.פניל פרופנואידגליקוזידים(PPGs) הן נגזרות אסטר של חומצה הידרוקסינמית והן המעמד העיקרי/היחיד של מטבוליטים משניים הקיימים בצמחי Orobanchaceae holoparasitic, כולל Cistanche, Orobanche ו-Phelipanche spp. כמה מינים ממשפחה זו הם מזיקים רציניים של גידולים שחקלאים רוצים להיפטר מהם בשדות (דוגמה של Phelipanche ramosa), מעטים משמשים בפרמקולוגיה, בעוד שלרובם אין חשיבות לבני אדם. הרבה סיסטאנצ'ה נמצא בשימוש נרחב ברפואה המסורתית באסיה בטיפול במחסור בכליות וכחומר משפר חסינות וזיכרון, אנטי אייג'ינג ונוגד עייפות [6]. ניתוחים פיטוכימיים של קבוצות מחקר שונות הוכיחו זאתפניל פרופנואידגליקוזידים, כגון אקטאוזיד, אכינאקוסיד וצד פודיום, הם אחד המרכיבים הפעילים העיקריים של הרבה סיסטאנצ'ה [7]. מחקר שנערך לאחרונה על כמה מיני מטאטא נמצא בפולין על ידי Jedrejek וחב'. [8] הראה שלחומר צמחי זה יש הרכב איכותי דומה (שליטה של ​​PPGs)(pהניל פרופנואידגליקוזידים)יתר על כן, הוא שווה או אפילו עולה על ה- Cistanche spp. מבחינת תכולת החומרים הפעילים [8]

המחקר הנוכחי נועד להעריך את הפוטנציאל האנטי-רדיקלי ונוגדי חמצון, כמו גם את ההשפעה על הפרמטרים המוסטזיס של שלושת תמציות המטאטא (Orobanche caryophyllacea - OC, Phelipanche Arenaria - PA ו-P. ramosa - PR) העשירים בפניל-פרופנואידים שונים, כמו כמו גם מרכיבי ה-PPG הבודדים שלהם. הקיבולת האנטי-רדיקלית נמדדה באמצעות 2,2'-azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid/Trolox Equivalent (ABTS/TE) ו-2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH ) בדיקות. החמצונילחץבמערכת בדיקת הפלזמה הושרה באמצעות רדיקל הידרוקסיל (H2O2/Fe), לאחר מכן נמדדה פרוקסידציה של שומנים (TBARS) ורמת חלבון קרבוניל וקבוצות תיול. בין הפרמטרים שנקבעו של המוסטזיס היו: זמן טרומבופלסטין חלקי מופעל (APTT), זמן פרוטרומבין (PT) וזמן טרומבין (TT).

Cistancheיש לפניל פרופנואידגליקוזידים

2. חומרים ושיטות

2.1. כימיקלים

רדיקל 2,2-דיפניל-1-פיקרילהידראזיל (DPPH), 2,2'-אזינוביס-3-אתיל-בנציאזולין-6-חומצה סולפונית (ABTS), אשלגן פרסולפט, 6- הידרוקסי-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-חומצה קרבוקסילית (טרולוקס), דימתילסולפוקסיד (DMSO), חומצה תיוברביטורית (TBA), חומצה פורמית (דרגת LC-MS) ו-H2O2 נרכשו מ-Sigma-Aldrich (סנט לואיס, מונגריה, ארה"ב). מתנול (דרגת שיפוע HPLC) ואצטוניטריל (דרגת LC-MS) נרכשו מ- Merck (Darmstadt, גרמניה). עשר תרכובות פנילפרופנואידים שנבדקו בעבודה זו, כולל 2'-O-acetylacteoside (97 אחוז), 2'-O-acetylpoliumoside (98 אחוז), 3-O-methylpoliumoside (96 אחוז), אקטאוזיד (99 אחוז), זירה בפנים (97 אחוז), קרנאטוסיד (98 אחוז), טניפוזיד (99 אחוז), פוליומוזיד (99 אחוז), טובולוזיד A (96 אחוז), ו-wiede mannioside D (96 אחוז) בודדו על ידינו בעבר מהצמח הניתן מתחת לנתונים חומר [8]. טוהר התרכובות הוערך באמצעות ניתוח UHPLC-PDA-MS. מים טהורים הוכנו בבית באמצעות מערכת לטיהור מים Milli-Q (Millipore Co.). ריאגנטים אחרים היו בדרגה אנליטית וסופקו על ידי ספקים מסחריים מקומיים.

2.2. חומר צמחי

צמחים פורחים משלושה מינים של מטאטא, כולל Orobanche Caryophyllaceae Sm., Phelipanche Arenaria Pomel ו-P. ramosa (L.) Pomel זוהו על ידי פרופ'. רנטה פיווורצ'יק (אוניברסיטת יאן קוצ'נובסקי, קילצה, פולין) ונאספה ממקור טבעי בפולין. דגימות שובר (O. Caryophyllaceae – Chomentowek ´ (50.3349◦N, 20.4000◦E), שטח עשב קסרוטרמי, טפילי Galium boreale, מאי 2014; P. Arenaria – Zwierzyniec (50.3652◦N, 50.3652◗N, fallsimmophilous, 8022◦N, p. Artemisia campestris, יוני 2014; P. ramosa – Szewce (50.3553◦N, 22.3038◦E), שדה, טפיל Solanum Lycopersicum, ספטמבר 2014) מופקדים בצמחייה של אוניברסיטת Jan Kochanowski בKielce (KTC). החומר הצמחי עבר ליאופיל ונטחן דק לפני המיצוי.

2.3. הכנת תמציות מטאטא

אבקת חומר צמחי (O. Caryophyllaceae (OC) – 2 גרם, P. Arenaria (PA) – 3 גרם ו-P. ramosa (PR) – 3 גרם) הופץ עם 80 אחוז MeOH ב-40 ◦C ו-1500 psi (לחץ ממס ) באמצעות מחלץ ממס מואץ ASE 200 (Dionex, Sunnyvale, CA, ארה"ב). התמציות אודו ויובשו בהקפאה (מייבש הקפאה Gamma 2-16 LSC, ישו, גרמניה). יעילות המיצוי עבור OC, PA ו-PR הייתה 55%, 37% ו-43% ממשקל החומר הצמחי, בהתאמה. בשל התכולה הגבוהה של פחמימות (נתונים לא מוצגים), התמציות הגולמיות טוהרו עוד יותר על ידי מיצוי פאזה מוצק (SPE) על Oasis HLB מיקרו-עמודה (500 מ"ג; Waters, Milford, MA, ארה"ב). הסוכרים הוסרו עם 1 אחוז MeOH, ואז התרכובות המעניינות נפלטו עם 80 אחוז MeOH. לאחר הסרת הממס, תמציות OC, PA ו-PR עברו ליאופיל (מייבש הקפאה Gamma 2-16 LSC), והתשואות של טיהור SPE היו 53 אחוז (OC), 67 אחוז (PA) ו-51 אחוז (PR) .

2.4. מאפיינים פיטוכימיים של תמציות מטאטא

ניתוחים איכותיים וכמותיים של תמציות מטאטא בוצעו באמצעות מערכת ACQUITY UPLC (Waters) המחוברת לגלאי מערך פוטו-דיודות (PDA) ולספקטרומטר מסה טנדם קוואדרופול (TQD-MS/MS). תמציות OC, PA ו-PR מיובשות בהקפאה הומסו ב-50 אחוז מתנול בריכוז של 0.50 מ"ג/מ"ל ולאחר מכן עברו כרומטוגרפיה בעמודה BEH C18 (1{ {21}}0 × 2.1 מ"מ, 1.7 מיקרומטר, ווטרס). התנאים הכרומטוגרפיים היו כדלקמן: טמפרטורת התנור – 25 ◦C, גרדיאנט ליניארי 10→25 אחוז משלב B נייד (0.1 אחוז חומצה פורמית באצטוניטריל) בשלב נייד A (0.1 אחוז חומצה פורמית ב-H2O) במשך 12 דקות, קצב זרימה – 0.4 מ"ל/דקה, נפח הזרקה – 2 μL, טווח UV – 190-490 ננומטר (רזולוציית 3.6 ננומטר). ניתוח MS בוצע במצב של יונים שליליים עם יינון אלקטרוספריי (ESI), תוך שימוש בהגדרות הבאות: טווח סריקה 100-1200 מ/צ; מתח נימי 2.8 קילו וולט; מתח חרוט 35 V; טמפרטורת מקור 150 ◦C; טמפרטורת ההשמדה 450 ◦C; זרימת גז דהסולבציה 900 ליטר לשעה, וזרימת גז קונוס 100 ליטר לשעה. רכישת נתונים ועיבודם בוצעו באמצעות תוכנת Waters MassLynx 4.1.

פסגות של פניל ​​פרופנואיד גליקוזיד (PPG) זוהו על ידי השוואה של נתוני LC-MS שהתקבלו עם אלו של תרכובות מבודדות בעבר [8]. כמות של PPGs(pהניל פרופנואידגליקוזידים)בתמציות מטאטא התבסס על שיטת UPLC-UV עם זיהוי ב-330 ננומטר, וכיול סטנדרטי חיצוני באמצעות אקטאוזיד (Sigma-Aldrich, גדול או שווה ל-99 אחוז, HPLC) כסטנדרט קבוצתי. עקומת כיול ליניארית הוכנה בשישה ריכוזים בטווח של 1-200 ug/mL והראתה ליניאריות טובה (R2 גדול או שווה ל-0.999). תוצאות כמותיות מייצגות את הערך הממוצע ± SD של שלוש זריקות והובאו כמיליגרם מקבילות אקטאוזיד (eq) לגרם של תמצית (mg acteoside eq/g).

Cistancheיש לפניל פרופנואידגליקוזידים

2.5. פעילות אנטי רדיקלית במבחנה

2.5.1. מבחן ניקוי רדיקלי של ABTS

בדיקת ה-ABTS האנטי-רדיקלית בוצעה בשיטה שתוארה על ידי Kontek et al. [9], עם שינויים קלים כדלקמן: 20 אחוז MeOH שימש להכנת ריאגנטים (7 מ"מ ABTS ו-4.9 מ"מ אשלגן פרסולפט); התמיסות של תמציות OC, PA ו-PR, ברמות ריכוז של ארבעה בטווח של 100-400 ug/mL, ותמיסות Trolox, ברמת שישה ריכוזים בטווח של 10-250 ug/mL, הוכנו עם 50 אחוזים MeOH. היחס בין המדגם ל-ABTS בתוספת תמיסת עבודה היה 1:25 (v/v). הספיגה ב-734 ננומטר נמדדה לאחר דגירה של 30 דקות בחושך באמצעות ספקטרופוטומטר UV-vis (Evolution 260 Bio, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ארה"ב).

עיכוב הספיגה (אחוז) חושב באופן הבא: [(Abscontrol–Abssample)/Abscontrol] ×100.

ה-Trolox Equivalents (TE) של תמציות מטאטא חושבו באמצעות נוסחה TE {0}} מדגם/תקן, כאשר m הוא השיפוע של עקומות הקו הישר (עיכוב ספיגה לעומת ריכוז). ערך ה-TE של המדגם מתאר את הפעילות המנורמלת שלו כנגד Trolox (תקן TE =1.0). ערכי IC50 עבור תמציות OC, PA ו-PR ו-Trolox הושגו בניסוי, ולאחר מכן חושבו מהעקומות הקו הישר שלהם (עיכוב ספיגה לעומת ריכוז) והם מבוטאים ב-ug/mL.

הבדיקה בוצעה בשלושה עותקים, והתוצאות מוצגות כאמצעים ± סטיות תקן (SD).

2.5.2. בדיקת סילוק רדיקלי DPPH

בדיקת DPPH האנטי-רדיקלית בוצעה בשיטה שתוארה על ידי Jedrejek וחב'. [8] ו-Brand-Williams et al. [10], עם שינויים קלים כדלקמן: התמיסות של תמציות OC, PA ו-PR, בארבע רמות ריכוז בטווח של 50-250 ug/mL, ותמיסות Trolox, ברמת שישה ריכוזים בטווח של 10- 250 ug/mL, הוכנו עם 50 אחוז MeOH. היחס בין המדגם ל-DPPH היה 1:19 (v/v). הספיגה ב-517 ננומטר נמדדה לאחר דגירה של 30 דקות בחושך באמצעות ספקטרופוטומטר UV-vis (Evolution 260 Bio).

עיכוב הספיגה (אחוז) חושב באופן הבא: [(Abscontrol–Abssample)/Abscontrol] ×100.

ערכי Trolox Equivalent (TE) ו-IC50 של דגימות הבדיקה חושבו באותו אופן כמו במבחן ABTS (סעיף 2.5.1). הבדיקה בוצעה בשלושה עותקים, והתוצאות מוצגות כאמצעים ± SD.

2.6. פתרונות מלאי של תרכובות צמחיות ותמציות שנבדקו לניסויים בפלזמה אנושית

פתרונות מלאי של התרכובות שנבדקו ותמציות צמחים הוכנו ב-50 אחוז DMSO. הריכוז הסופי של DMSO בדגימות שנבדקו היה נמוך מ-0.05 אחוז והשפעותיו נקבעו בכל הניסויים.

2.7. בידוד פלזמה אנושית

דם אנושי, או פלזמה, הושג משישה תורמים קבועים (גברים ונשים לא מעשנים) לבנק דם (לודז', פולין) ולמרכז רפואי (לודז', פולין). הדם נאסף כתמיסת CPD (ציטראט/פוספט/דקסטרוז; 9:1; v/v דם/CPD) או תמיסת CPDA (ציטראט/פוספט/דקסטרוז/אדנין; 8.5:1; v/v; דם/CPDA). התורמים לא נטלו תרופות או חומרים ממכרים (כולל טבק, אלכוהול ותוספי נוגדי חמצון) במשך שבועיים לפחות לפני התרומה. הניתוח שלנו של דגימות הדם בוצע תחת ההנחיות של הצהרת הלסינקי לחקר האדם ואושר על ידי הוועדה לאתיקה של מחקר בניסויים בבני אדם באוניברסיטת לודז'. הפלזמה הוכנה על ידי צנטריפוגה של דם אנושי טרי ב-4500xg למשך 25 דקות בטמפרטורת החדר. ריכוז החלבון חושב על ידי מדידת הספיגה של הדגימות שנבדקו ב-280 ננומטר, לפי הנוהל של Whitaker ו-Granum [11].

Cistancheיש לפניל פרופנואידגליקוזידים

2.8. סמנים של עקה חמצונית בפלזמה אנושית

2.8.1. מדידת חמצון ליפידים

חמצון שומני פלזמה הוכמת על ידי מדידת הריכוז של חומרים תגובתיים חומצה thiobarbituric (TBARS). ריכוז TBARS חושב באמצעות מקדם ההכחדה המולארי (ε =156,000 M− 1cm− 1). השיטה מתוארת בצורה יסודית יותר במקום אחר [12,13].

2.8.2. מדידת קבוצת קרבוניל

רמת קבוצות הקרבוניל חושבה באמצעות מקדם ההכחדה המולארי (ε=22,000 M− 1 cm− 1) והיא באה לידי ביטוי כקבוצות קרבוניל nmol/mg של חלבון פלזמה, על פי Bartosz [13] ] ולווין ואח'. [14].

2.8.3. קביעת קבוצת תיול

תכולת קבוצת התיול בחלבוני פלזמה נמדדה בצורה ספקטרופוטומטרית באמצעות SPECTROstar Nano Microplate Reader (BMG LABTECH, גרמניה) על ידי ספיגה ב-412 ננומטר עם 5,5'-dithiol-bis-(2- nitrobenzoic acid). השיטה מתוארת ביתר פירוט במקום אחר [15–17].

2.9. פרמטרים של דימום דם

2.9.1. מדידת זמן פרוטרומבין (PT)

PT נקבע בקרישיות באמצעות מנתח קרישה אופטי (דגם K-3002, Kselmed, Grudziadz, פולין) לפי Malinowska וחב'. [18].

2.9.2. מדידת זמן תרומבין (TT)

ה-TT נקבע בקרישיות באמצעות מנתח קרישה אופטי (דגם K-3002, Kselmed, Grudziadz, פולין), לפי השיטה שתוארה על ידי Malinowska וחב'. [18].

2.9.3. מדידת זמן טרומבופלסטין חלקי מופעל (APTT)

ה-APTT נקבע בקרישיות באמצעות מנתח קרישה אופטי K-3002 (Kselmed, Grudziadz, פולין) לפי Malinowska et al. [18].

2.10. ניתוח נתונים

בדיקת Q-Dixon בוצעה כדי למנוע נתונים לא ודאיים. הנתונים נבדקו להתפלגות נורמלית במבחן שפירו-וילק ושוויון השונות למבחן של Levene. הבדלים מובהקים סטטיסטית זוהו באמצעות ANOVA, ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של Tukey או מבחן Kruskal-Wallis. השוואות נחשבו מובהקות ב-p < 0.05.="" הערכים="" מוצגים="" כאמצעים="">

3. תוצאות ודיון

עשרה בודדים בעבר על ידינופניל פרופנואידגליקוזידים[8], כולל 2'-O-acetylacteoside, 2'-O-acetylpoliumoside, 3-O-methylpoliumoside, acteoside, arena inside, crenatoside, pheliposide, podium side, tubuloside A ו-wiedemannioside D, יחד עם שלושה תמציות מטאטא (Orobanche Caryophyllaceae (OC), Phelipanche are naria (PA) ו-P. ramosa (PR)) נחקרו כעת לצורך הקלהחמצונילחץותכונות נוגדות קרישה במערכת פלזמה אנושית. מבנים כימיים של הפניל-פרופנואידים שנבדקו מוצגים באיור 1, וכפי שניתן לראות, כולם בנויים לפי תבנית דומה, עם אותן/דומות תת-יחידות: הידרוקסי-טירוסול, חד-סוכרים (גלוקוז, רמנוזה ו/או קסילוזה), וחומצה הידרוקסינמית. רוב תרכובות ה-PPG שנבדקו מוחלפות בחומצה קפאית, אך ניתן להחליף אותה בחומצה קומרית או פרולית.

מלבד תרכובות PPG בודדות, שלוש תמציות מטאטא - OC, PA ו-PR, שהן תערובות של מספר PPGs(pהניל פרופנואידגליקוזידים)ושימשו בעבר כחומר מוצא לבידוד תרכובות, נכללו גם במחקר הביולוגי. סיבה נוספת לבחירת שלושה מינים שונים הייתה ההבדל הגדול בפרופיל הפיטוכימי ביניהם, כפי שניתן לראות באיור 2. השוואה מפורטת יותר של תמציות OC, PA ו-PR, כולל הנתונים הכמותיים, מוצגת בטבלה. 1. אקטאוזיד היה המרכיב העיקרי של תמצית O. Caryophyllaceae (690 מ"ג/ג), טניפוזיד והזירה הפנימית שלטו ב-P. Arenaria (יחד 550 מ"ג/ג'), בעוד שפוליומיוזיד ונגזרת האצטיל שלו היו המטבוליטים החשובים ביותר ב-P. Arenaria. תמצית P. ramosa (ביחד 640 מ"ג/גרם). התמציות שנבדקו היו שונות גם בתכולה הכוללת של פנילפרופנואידים, הכמות הגבוהה ביותר נמצאה ב-OC (810 מ"ג/ג), מעט נמוכה יותר ב-PR (795 מ"ג/ג), ונמוכה יותר ב-PA (685 מ"ג/ג). יתרה מכך, ראוי לציין כי נוכחות של PPGs עם חלקים אחרים מלבד קפאוי, כגון קומארויל או feruloyl, זוהתה רק בתמצית P. ramosa, כאשר תרכובות אלו היוו כשישית מסך ה-PPGs (כ-120 מ"ג/ ז) (טבלה 1).

מחקרים קודמים על הפעילות האנטי-רדיקלית שלפניל פרופנואידגליקוזידיםמאת Heilmann et al. [19] ו-Jdrejek et al. [8], כולל כ-30 PPGs שונים(pהניל פרופנואידגליקוזידים)כגון אקטאוזיד, איזואקטאוזיד וקרנאטוסיד, חשפו את הקשר החזק שלו למבנה של חלקי האציל (חומצה פנולית וטירוסול). באופן כללי, השינוי או ההחלפה של יחידת הקטכול של יחידת האציל הביאו לירידה משמעותית בפעילות הניקוי נגד מיני חמצן תגובתיים (ROS) ו-DPPH רדיקלי. במחקר הנוכחי, הפוטנציאל האנטי-רדיקלי במבחנה של שלוש תמציות מטאטא (OC, PA ו-PR) נבדק עם מבחני ABTS ו-DPPH, והתוצאות הושוו הן ביניהן והן עם הפעילות של רכיבי פניל ​​פרופנואיד בודדים שנמדדו ב המחקר הקודם שלנו [8]. התוצאות הובעו כערכי Trolox Equivalents (TE) ו-IC50 (טבלה 2). באופן כללי, כל שלושת התמציות היו מנקות טובות של רדיקלים ABTS ו-DPPH, אך גם הבדלים נצפו בין הדגימות שנבדקו (ההערכה של TE היה בטווח של 0.5–0.7; 1.0 היה המקבילה לטרולוקס). פעילות הסרה אנטי-רדיקלית של דגימות הייתה בסדר הבא: Trolox > OC > PA > PR. לתמצית של Orobanche Caryophyllaceae (IC50=155-275 מיקרוגרם/מ"ל) הייתה פעילות גבוהה יותר ב-20 אחוזים מאשר תמצית Phelipanche ramosa (IC50=200-320 מיקרוגרם/מ"ל).

ניתן להסביר את הפעילות הספיגה הרדיקלית הגבוהה ביותר של תמצית ה-OC על ידי ה-PPG הגבוה ביותר(pהניל פרופנואידגליקוזידים)התוכן במדגם זה, כמו גם לקלט של אקטאוזיד, המרכיב הדומיננטי שלו, שלפי המחקר הקודם [8,19] הוא אחד ממוציאי הרדיקלים החופשיים החזקים ביותר מבין המטבוליטים מקבוצה זו (TEDPPH=0 .87; [4]). עם זאת, בהתחשב בקשר ההדדי של פעילות אנטי-רדיקלית ותכולת הפניל-פרופנואידים בתמציות OC, PA ו-PR, לא נמצא מתאם פשוט בין שני הגורמים הללו (r < 0.5),="" המצביע="" על="" קלט="" משמעותי="" של="" פרופיל="" איכותי.="" זה="" קשור="" בעיקר="" לתמצית="" p.="" ramosa,="" שלמרות="" הרמה="" הגבוהה="" של="">(pהניל פרופנואידגליקוזידים)({{0}}.8 גרם/גרם) אופיינה בפעילות הביולוגית הנמוכה ביותר מבין הדגימות שנבדקו (TE ~ 0.5). תמצית ה-PR, כאמור לעיל, הייתה הדגימה היחידה שהכילה את הפניל-פרופנואידים עם חומצות קומאריות או פרוליות, חומרים חסרי קבוצת קטכול טבעת B, אשר דווח כי יש להם ירידה בפוטנציאל האנטי-אוקסידטיבי. לארבע תרכובות PPG בעלות חומצה קפאית שונה, כולל 3-O-methylpoliumoside, ramose A ו-wiedemannioside D, שנבדקו על ידינו בעבר, היו ב-TEDPPH של סביב 0.3 [8]. לפיכך, התוצאות הנוכחיות תואמות ומאשרות את הממצאים של הניסויים האנטי-רדיקליים הקודמים במבחנה על פניל-פרופנואידים.

כפי שחן ואח'. [20] המתואר, זה קשור ליכולת גבוהה יותר של תרומת H או לייצוב של הרדיקל על ידי קבוצות תפקודיות שונות של תערובת של תרכובות. מספר אלמנטים מבניים זוהו כמגבירים את הפעילות נוגדת החמצון הישירה של פוליפנולים, במיוחד אלה הקשורים למספר ולמיקום של קבוצות הידרוקסיל. מאמינים שפעילות ניקוי רדיקלים חופשיים עולה עם הגידול במספר קבוצות -OH. עם זאת, למיקומן של קבוצות אלו, במולקולה, יש השפעה גדולה עוד יותר על הפעילות המופעלת. תרכובות חזקות יחסית יציבות הן אלו שיש להן 3,4-דיהידרוקסי במבנה שלהן, כמו גם אלו שיש להן יותר משתי קבוצות הידרוקסיל [21]. המבנה הכימי של החומר נוגד החמצון מאפשר הבנה של מנגנון התגובה נוגדת החמצון. Lopez-Munguía et al. [22] בהתבסס על תיאוריית פונקציונליות הצפיפות (DFT) חישובים קבעו שה-PPGs(pהניל פרופנואידגליקוזידים)מנגנון נוגד חמצון ממשיך באמצעות העברת אלקטרונים בודדת לאובדן פרוטונים רציף (SPLET). עם זאת, Li et al. [23] ניסיון לחקור את המנגנונים של נוגדי חמצון פניל-פרופנואידים פנוליים, הגיע למסקנה כי PPGs (אקטאוזיד, פורסיטוסיד B ופולימוזיד) עשויים להיות מעורבים במספר מסלולים להפעלת הפעולה נוגדת החמצון, הגבירו את תפקידם של שאריות סוכר.

מחקרים הראו כי נוגדי חמצון שמקורם בצמח הם מאפננים יעילים של דימום דם במחלות לב וכלי דם [24-26]. צמחים שונים המשמשים ברפואה מסורתית מכילים רמות משמעותיות של PPGs [27,28]. בנוסף, PPGs(pהניל פרופנואידגליקוזידים)ידועים כבעלי מגוון פעילויות ביולוגיות, כולל תכונות אנטי דלקתיות, אנטי נפריטיות ואנטי כבדיות [29-33].

במחקרם האחרון, Jedrejek et al. [8] תיאר את הבידוד של PPGs(pהניל פרופנואידגליקוזידים)משלושה מטאטאים פולניים והעריכו את פעילותם נוגדת החמצון על ידי מבחן DPPH. בהתבסס על כך, המחקר הנוכחי מעריך האם עשרת ה-PPG שנבחרו מבודדים מצמחים אלה יכולים להפחיתחמצונילחץבפלזמה אנושית שטופלה בחומצן ביולוגי חזק, כלומר תורם רדיקלי ההידרוקסיל H2O2/Fe, ומווסת את תכונות הקרישה של פלזמה במבחנה. תכונות נוגדי החמצון של עשרה PPGs מבודדים נקבעו על פי פרמטרים נבחרים שלחמצונילחץ: רמת TBARS כסמן של חמצון שומנים, יחד עם רמות קבוצת קרבוניל וקבוצת תיול, כסמנים של נזק לחלבון חמצוני.

גם רמות חמצון שומנים בפלזמה וגם רמות קרבונילציה של חלבון בפלזמה המושרה על ידי H2O2/Fe הופחתו באופן משמעותי בנוכחות שמונה תרכובות שנבדקו, כלומר. acteoside, crenatoside, 2'-O-acetylacteoside, pheliposide, arena inside, tubuloside A, poliumoside ו-3- O-methylpolimuoside, בכל הריכוזים שנבדקו (1, 5 ו-50 µg/mL); עם זאת, אף אחת מהן לא נצפתה עבור שתיים מהתרכובות שנבדקו, כלומר. 2'-O-acetylpoliumoside ו-wiedemannioside D, או כל אחת מהתמציות שנבדקו בכל ריכוז (1, 5 ו-50 מיקרוגרם/מ"ל). בנוסף, אף אחת מהתרכובות שנבדקו או התמציות שנבדקו לא נמצאה כמגינה על הפלזמה מפני H2O2/Fe - חימצון קבוצת תיול המושרה בחלבונים (איורים 3-5). עם זאת, התמציות שנבדקו עשויות להיות מקור לתרכובות בעלות תכונות ביולוגיות שונות.

לראשונה, תוצאות המחקר הנוכחי מצביעות על כך ששמונה מה-PPGs שנבדקו(pהניל פרופנואידגליקוזידים)להדגים פוטנציאל נוגד חמצון בפלזמה אנושית בנוכחות מיני חמצן תגובתיים אקסוגניים על ידי עיכוב חמצון שומנים וקרבונילציה של חלבונים בפלזמה שטופלה ב-H2O2/Fe. בנוסף, 2′-O-acetylpoliumoside ו- wiedemannioside D לא הציגו כל השפעה כזו. באופן כללי, הממצאים שלנו תואמים לניסויים קודמים במבחנה על PPGs. Heilmann et al. [19] ו-Jdrejek et al. [8] מדווחים על מתאם בין המבנה הכימי של PPGs ופעילותם. תכונות נוגדות חמצון של PPGs(pהניל פרופנואידגליקוזידים)נראה שקשור בעיקר למבנה של חלקי האציל שלהם, כלומר יחידת החומצה הפנולית והפנילפרופנואיד, כולל נוכחות ו/או שינוי של חלק קטכול. לדוגמה, נמצא כי wiedemannioside D מאבד את הפוטנציאל האנטי-אוקסידטיבי שלו כלפי פלזמה שטופלה ב-H2O2/Fe בעקבות החלפת חלק הקפאואיל שלו בחלק פרולואיל.

שינויים בתהליך הקרישה נובעים לעתים קרובות מחמצונילחץ; שינויים אלו יכולים לווסת את תפקודי מערכת הלב וכלי הדם ויכולים להוביל להתפתחות של מחלות לב וכלי דם [1]. מתוך עשר תרכובות הצמח ושלוש תמציות צמחים שנבדקו במחקר הנוכחי, טובולוזיד, צד פודיום ו-3-O-methylpoliumoside וכל התמציות שנבדקו הוכיחו כי הם מאריכים משמעותית את זמן הטרומבין בכל הריכוזים שנבדקו, כלומר. 1, 5 ו-50 מיקרוגרם/מ"ל (איור 6B). עם זאת, אף אחת מהתמציות הללו, ואף אחת מהתרכובות שנבדקו, לא שינו PT או APTT (איור 6A ו-C).

איור 6. השפעות של תרכובות שנבדקו (אקטאוזיד, קרנאטוסיד, 2'-O-אצטילקטאוזיד, פליפוזיד, ארנריוסיד, טובולוזיד A, פוליומוזיד, 3-O-methylpoliumoside, 2'-O-cetylpolimuoside, וידמניוזיד D) ו תמציות (P. arenaria extract - PA, P. ramosa extract - PR, ותמצית O. caryophyllacea - OC) (1-50 מיקרוגרם/מ"ל) על פרמטרים המוסטטיים נבחרים של פלזמה: PT (A), TTn (ב) ו-APTT (ג). הנתונים מייצגים ממוצעים ± SEM של שישה ניסויים עצמאיים.n* p < 0.05="" (לעומת="" בקרה),="" ns="" –="" p=""> 0.05 (לעומת בקרה).

טבלה 3 משווה את ההשפעות של ה-PPGs (5 מיקרוגרם/מ"ל) על סמנים ביולוגיים שלחמצונילחץבפלזמה שטופלה ב-H2O2/Fe והשפעתם על הקרישה. שמונה מה-PPG שנבדקו(pהניל פרופנואידגליקוזידים)הוכיח פוטנציאל נוגד חמצון רק בפלזמה האנושית המטופלת; עם זאת, נמצאו שלושה PPGs שנבדקו כבעלי תכונות נוגדות חמצון ופוטנציאל נוגד קרישה. מעניין לציין שתוצאות בדיקת DPPH לא עלו בקנה אחד עם אלו שהתקבלו במודל הביולוגי באמצעות פלזמה אנושית שטופלה ב-H2O2/Fe: הפוטנציאל נוגד החמצון של התמציות שנבדקו עשוי להיחסם על ידי תרכובות מסוימות הקיימות בפלזמה.

לסיכום, הממצאים הנוכחיים שלנו שופכים אור חדש על פוטנציאל נוגדי החמצון ותכונות נוגדות הקרישה של PPGs(pהניל פרופנואידגליקוזידים). נראה כי המבנה של PPGs(pהניל פרופנואידגליקוזידים), במיוחד הנוכחות של חלקי אציל וקטכול, קשורה בעיקר לתכונות נוגדות החמצון והנוגד קרישה שלהם. PPG נבחרים עשויים בהחלט להיות בעלי פוטנציאל לטיפול במחלות לב וכלי דם הקשורותחמצונילחץ. עם זאת, יש צורך בניסויים נוספים כדי לקבוע את הריכוזים של תרכובות אלה הדרושים עבור מודלים in vivo.

הצהרת ניגוד אינטרסים

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים או קשרים אישיים ידועים שהיו עשויים להשפיע על העבודה המדווחת במאמר זה.

הפניות

[1] A. Daiber, S. Chlopicki, Revisiting pharmacology ofחמצונילחץואי תפקוד אנדותל במחלות לב וכלי דם: עדויות לטיפולים מבוססי חיזור, Free Radic. ביול. Med. 157 (2020) 15–37.
[2] J.-J. Sauvain, A. Setyan, P. Wild, P. Tacchini, G. Lagger, F. Storti, S. Deslarzes, MJ Guillemin, M. Rossi, M. Riediker, Biomarkers ofחמצונילחץוהקשר שלו ליכולת הפחתת השתן אצל עובדי אחזקת אוטובוסים, J. Occupat. Med. טוקסיקול. 6 (2011) 18–23.
[3] פ' נובק, ב' אולאס, ב' וואכוביץ',מחמצןלחץוהמוסטזיס, פוסט. Biochem. 56 (2010) 239–247.
[4] M. Martinez-Huelamo, J. Rodriguez-Morato, A. Boronat, R. de la Torre, Modulation of Nrf2 על ידי פוליפנולים של שמן זית ויין והגנת העצבים, Antioxidants 6 (2017) 73.
[5] S. Amor, P. Chalons, V. Aires, D. Delmas, תמציות פוליפנול מיין אדום וגפן: השפעות פוטנציאליות על סרטן, מחלות 6 (2018) 1-12.
[6] Z. Li, H. Lin, L. Gu, J. Gao, CM Tzeng, Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): אחת המתנות הפרמצבטיות הטובות ביותר של הרפואה הסינית המסורתית, פרונט. פרמקול. 7 (2016) 41–49.
[7] Y. Jiang, P.-F. טו, סקירה: ניתוח של מרכיבים כימיים במינים Cistanche, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970–1979.
[8] D. Jedrejek, S. Pawelec, R. Piwowarczyk, L. Precio, A. Stochmal, זיהוי והתרחשות של phenylethanoid ו-iridoid glycosides בשישה broomrapes פולני (Orobanche spp. and Phelipanche spp., Orobanchaceae), Phytochemist (170) 2020), 112189.
[9] B. Kontek, D. Jedrejek, W. Oleszek, B. Olas, פעילות אנטי-רדיקלית ונוגדת חמצון במבחנה של תמציות מופקות כשות עשירות בחומצות מרירות ו-xanthohumol, Ind. Crops Prod. 161 (2021) 1–9.
[10] W. Brand-Williams, ME Cuvelier, C. Berset, שימוש בשיטת רדיקלים חופשיים להערכת פעילות נוגדת חמצון, Lebensm. וויס. טכנול. 28 (1995) 25–30.
[11] JR Whitaker, PE Granum, שיטה אבסולוטית לקביעת חלבון המבוססת על ההבדל בספיגה ב-235 ו-280 ננומטר, אנאל. Biochem. 109 (1980) 156–159.
[12] B. Wachowicz, Adenine nucleotides in thrombocytes of birds, Cell Biochem. פונקציה. 2 (1984) 167-170.
[13] G. Bartosz, Druga twarz tlenu, Warsz. PWN 1 (2008) 7.
[14] RL Levine, D. Garland, CN Oliver, A. Amici, I. Climent, AG Lenz, BW Ahu, S. Shaltier, ER Stadtman, Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins, Methods Enzym. 186 (1990) 464–478.
[15] DM Joel, J. Gressel, LJ (עורכים), Musselman, Parasitic Orobanchaceae: Parasitic Mechanisms and Control Strategies, Springer, Heidelberg, Germany, 2013, pp. 1-10.
[16] Y. Ando, ​​M. Steiner, Sulphhydryl and disulfide group of platelets: determination of disulfide group, Biochim. ביופיס. Acta 311 (1973) 26–37.
[17] Y. Ando, ​​M. Steiner, Sulphhydryl and disulfide group of platelet membranes: determination of sulphydryl group, Biochim. ביופיס. Acta 311 (1973) 38–44.
[18] J. Malinowska, J. Kołodziejczyk-Czepas, M. Moniuszko-Szajwaj, I. Kowalska, W. Oleszek, A. Stochmal, B. Olas, שברים פנוליים מחלקים אוויריים של Trifolium pallidum ו- Trifolium scabrum בפלזמה אנושית מגנים מפני שינויים הנגרמים על ידי היפרהומוציסטינמיה, Food Chem. טוקסיקול. 50 (2012) 4023–4027.
[19] J. Heilmann, I. Calis, H. Kirmizibekmez, W. Schuhly, S. Harput, O. Stiher, Radical scavenger activity ofפניל פרופנואידגליקוזידיםב-FMLP מגורה לויקוציטים פולימורפו-גרעיניים: יחסי מבנה-פעילות, Planta Med. 66 (2000) 746–748.
[20] H. Chen, Y. Zhou, Y. Shao, F. Chen, Free phenolic acids in Shanxi aged vinegar: שינויים במהלך ההזדקנות ופעילויות נוגדות חמצון סינרגטיות, Int. J. Food Prop. 19 (2015) 1183–1193.
[21] CA Rice-Evans, NJ Miller, G. Paganga, יחסי מבנה-נוגד חמצון של פעילות פלבנואידים וחומצות פנוליות, Free Radic. ביול. Med. 20 (1996) 933–956.
[22] A. Lopez-Munguía, ´Y. Hernandez-Romero, ´J. Pedraza-Chaverri, A. MirandaMolina, I. Regla, A. Martínez, E. Castillo, Phenylpropanoid glycoside analogs: סינתזה אנזימטית, פעילות נוגדת חמצון ותיאורטית. מחקר על מנגנון השולל רדיקלים חופשיים שלהם, PloS One 6 (2011) 20115.
[23] X. Li, Y. Xie, K. Li, A. Wu, H. Xie, Q. Guo, P. Xue, Y. Maleshibek, W. Zhao, J. Guo, D. Chen, Antioxidation and cytoprotection של אקטאוזיד ונגזרותיו: השוואה וכימיה מכניסטית, מולקולות 23 (2018) 498.
[24] SE Kulling, HM Rawel, Chokeberry (Aronia melanocarpa) - סקירה על המרכיבים האופייניים והשפעות בריאותיות אפשריות, Planta Med. 74 (2008) 1625–1634.
[25] BJ Mc Even, השפעת התזונה והרכיבים התזונתיים על תפקוד הטסיות, Semin. טרומב. Hemost. 40 (2008) 214–226.
[26] B. Olas, הרב-פונקציונליות של פירות יער כלפי טסיות דם ותפקידם של פנולי פירות יער בהפרעות קרדיווסקולריות, טסיות 5 (2016) 1-10.
[27] UB Ismailoglu, I. Saracoglu, US Harput, I. Sahin-Eredemli, Effects of phenylpropanoid and iridoid glycosides on induced רדיקלים חופשיים של הרפיה תלויה אנדותל בטבעות אבי העורקים של חולדה, J. Ethnopharmacol. 79 (2002) 193–197.
[28] ZF Bai, Y. Liu, XQ Wang, Investigation of Ethnic Medicine Plants Orobanche, Cistanche and Boschniakia, Zhongguo Zhong Yao Zhi 93 (2014) 4548–4552.
[29] K. Hayashi, T. Nagamatsu, M. Ito, H. Yagita, Y. Suzuki, Acteoside, מרכיב של Stachys sieboldii MIQ, עשוי להיות סוכן אנטי-נפריטי מבטיח (3): השפעתו של אצטון על הביטוי על הבין-תאי. מולקולת הידבקות-1 בגלומרולי נפריטי ניסיוני בחולדות ובתאי אנדותל מתורבתים, Jpn. J. Pharmacol. 70 (1996) 157–168.
[30] Q. Xiong, K. Hase, Y. Tezuka, T. Tani, T. Namba, S. Kadota, Hepatoprotective activity of phenylpropanoids from Cistanche deserticola, Planta Med. 64 (1998) 120–125.
[31] WF Chiou, LC Lin, CF Chen, Acteoside מגן על תאי אנדותל מפני רדיקלים חופשייםחמצונילחץ, ג'יי פארם. פארם. 56 (2004) 743–748.
[32] S. Sahpaz, N. Garbacki, M. Tits, F. Bailleul, Isolation and pharmacological activity of phenylpropanoid esters from Marrubium vulgare, J. Ethnopharmacol. 79 (2002) 389–392.
[33] L. Lie-Chwen, W. Yea-Hwey, H. Yu-Chang, Ch Shiou, L. Kuo-Tong, Ch Yueh-Ching, W. Wen-Yen, S. Yoh-Chiang, The inhibitory effect. שֶׁלפניל פרופנואידגליקוזידיםוגלוקוזידים אירידואידים על ייצור רדיקלים חופשיים וביטוי 2 אינטגרין בלוקוציטים אנושיים, J. Pharm. פרמקול. 58 (2006) 129–135.