תכונות אנטי טירוזינאז של מינים שונים של כורכום ובידוד של תרכובות פעילות מכורכומה אמאדה

Jesmin Akter1 ● Md. Zahorul Islam1,2 ● Md. Amzad Hossain1 ● Kensaku Takara1

1 הפקולטה לחקלאות, אוניברסיטת ריוקיוס, אוקינאווה, יפן

2 המחלקה לפרמקולוגיה, הפקולטה למדעי הוטרינריה, האוניברסיטה החקלאית של בנגלדש, מימנסינג, בנגלדש

למידע נוסף:Scotty.Wang@wecistanche.com

תַקצִיר

כורכום משמש באופן מסורתי כקוסמטיקה לעור באירועים דתיים ותרבותיים מסוימים בתת היבשת ההודית. במחקר זה, השווינו את התכונות המעכבות טירוזינאז של ארבעת Curcuma spp., כלומר, C. xanthorrhiza, C. aromatic, C. amada ו-C. zedoaria. בידוד מונחה ביולוגי וטיהור של מעכבי טירוזינאז באמצעות עמודת סיליקה ג'ל וכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים. זיהוי מבני של התרכובות נערך באמצעות 1 H NMR, 13C

NMR, וכרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדמית. C. amada הראה את הפעילות המעכבת טירוזינאז הגבוהה ביותר, עם IC50 של 53.4 ug/mL. לכן, הוא נבחר לבידוד וטיהור של מעכבי טירוזינאז. התרכובות המטוהרות היו זדרון (1), furanodienone (2), 1,5-אפוקסי-3-הידרוקסי-1-(3,4-dihydroxy-5-methoxyphenyl){ {13}}(4-הידרוקסיפניל) הפטאנים (3), 3,5-דיהידרוקסי-1-(3,4-דיהידרוקסי פניל)-7-({{22 }}הידרוקסי-3-מתוקסיפניל) הפפטנים (4) ו-1,5- אפוקסי 3-הידרוקסי-1-(3,4-דיהידרוקסי-5-מתוקסיפניל) -7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) heptane (5). ערכי IC50 עבור הפטרייהאנטי טירוזינאזהפעילות של תרכובות 1, 2, 3, 4 ו-5 הייתה 108.2, 89.2, 92.3, 21.7 ו-41.3 µM, בהתאמה. תרכובות אלו גם עיכבו פעילות טירוזינאז תוך תאית, ובכך הפחיתו את סינתזת המלנין בתאי מלנומה B16F10. תרכובת 4 הראתה חזקה משמעותיתאנטי טירוזינאזפעילות מזו של ארבוטין (תרופת ביקורת חיובית). לא נצפה הבדל משמעותי בהשפעה מעכבת טירוזינאז בין תרכובת 5 לארבוטין. הממצאים שלנו מצביעים על כך ש-C. Amanda הוא מקור מבטיח של מעכבי טירוזינאז טבעיים למניעת מלנוגנזה ויכול לשמש כקוסמטיקה מלבינה.

מילת מפתח: Curcuma amada ● תרכובות פעילות ● NMR ● אנטי טירוזינאז ● אנטי-מלנוגני

Cללקק ל-Cistanche לאנטי טירוזינאז

מבוא

המלנין הוא הפיגמנט השחור בשיער ובעור והוא חיוני להגנה על העור מפני קרינת UV. הפיגמנט מיוצר על ידי תאי מלנוציטים, הנמצאים בשכבה הבסיסית של הדרמיס בתהליך פיזיולוגי הנקרא מלנוגנזה. עם זאת, ייצור לא תקין של מלנין גורם להפרעות דרמטולוגיות כגון נמשים, מלזמה, lentigines, כתמי גיל, אפלידים והיפרפיגמנטציה פוסט-דלקתית [1]. בתעשיית המזון, היפרפיגמנטציה של פירות וירקות מובילה לאובדן משמעותי של איכות תזונתית וערך שוק [2]. ניתן לשלוט במלנוגנזה על ידי עיכוב הפעילות של טירוזינאז, אנזים מגביל קצב לסינתזת מלנין ביונקים, צמחים, מיקרואורגניזמים ופטריות [3]. לכן, עיכוב פעילות טירוזינאז מונע היפרפיגמנטציה ומוביל להלבנת העור. זה גם שולט באיכות הירקות והפירות על ידי ויסות השחמה לא רצויה של ירקות ומזון. רוב החומרים להבהרת העור, כגון הידרוקינון, חומצה אזלאית, חומצה קוג'ית וארבוטין הם מעכבי טירוזינאז חזקים. עם זאת, יש להם השפעות לא רצויות שונות כגון ציטוטוקסיות, אוכרונוזה, ויטיליגו, גירוי, קילוף עור ואדמומיות [4]. יתר על כן, חומצה קוג'ית ו--arbutin מדגימים יציבות פורמולציה גרועה ויכולת חדירה לעור, ויעילות נמוכה in vivo [5]. לחלק ממלחי כספית אורגניים ואי-אורגניים יש השפעות אנטי-מלנוגניות והם משמשים בחומרים להלבנת עור. עם זאת, באמצעות ספיגה עורית, תרכובות כספית עלולות לגרום להשפעות רעילות כגון שינוי צבע העור, נזק לכליות, תגובה אלרגית וצלקות [6]. לפיכך, יש צורך בחקירה של מעכבי טירוזינאז פחות רעילים ויעילים יותר. לכורכום (משפחה: Zingiberaceae; סוג: Curcuma), צמח מרפא מסורתי הגדל בעיקר באזורים הטרופיים והסובטרופיים של אסיה ואפריקה, בעל קשת רחבה של פונקציות פרמקולוגיות. הוא שימש באופן מסורתי בטקסים טרום נישואים במשך אלפי שנים בתת היבשת ההודית כחומר להבהרת העור. מאמינים שכורכום משפר את גוון העור על ידי הפחתת צמיחת שיער הפנים, אקנה והזדקנות העור [7, 8]. לכן, מוצרי טיפוח בתוספת כורכום זמינים בשוק [9]. זוהו יותר מ-70 מינים/זנים של כורכום בעלי תכונות כימיות ותרופתיות שונות. עם זאת, קיים חוסר במידע מדעי על התכונות האנטי-מלנוגניות של מינים שונים של כורכום והרכיבים הפעילים הפוטנציאליים הקיימים בכורכום. כורכומינואידים הם התרכובות הפעילות העיקריות האחראיות לרוב הפעילויות הביולוגיות של הכורכום. לכורכומינואידים יש פוטנציאל במוצרי קוסמטיקהנוגד חמצון, אנטי דלקתי,וחומר להבהרת העור [7, 8]. עם זאת, במחקר קודם, מצאנו שינויים משמעותיים בתכולת הכורכומינואידים בכורכום, ומינים מסוימים (C. amada, C. zedoaria) אפילו לא הכילו כורכומין [10]. דיווחנו גם על התרופה נגד פטריות,נוגד חמצון, ופעילויות מרחיבות כלי דם של מינים וזנים שונים של כורכום [10-13]. לכן, מחקר זה נועד להעריך את ההשפעות של מינים שונים של כורכום, דהיינו C. xanthorrhiza, C. aromatica, C. amada ו-C. zedoaria, על האנזים טירוזינאז ולזהות את התרכובות הכימיות הספציפיות האחראיות ל-C.אנטי טירוזינאזפעילות. כמו כן, הערכנו את הפעילות המעכבת טירוזינאז וההשפעות האנטי-מלנוגניות של תרכובות פעילות מטוהרות על סינתזת המלנין בתאי מלנומה B16F10.

תוצאות ודיון

בין ארבעת מיני הכורכום השונים, תמצית MeOH של C. amada הראתה את ההשפעה המקסימלית המעכבת טירוזינאז פטריות עם ערך IC50 של 53.4 ± 2.7, ואחריה C. xanthorrhiza, C. aromatic ו- C. zedoaria (איור 1a). כורכומין הוא המרכיב הפעיל העיקרי של הכורכום (Curcuma longa) והוא בעל מגוון רחב של פעילויות ביולוגיות, כולל פעילות אנטי סרטנית, אנטי דלקתית, אנטי בקטריאלית, אנטי פטרייתית ונוגדת חמצון. הוא הראה פעילות אנטי-טירוזינאז חזקה פי 75- מאשר ארבוטין וחומצה קוג'ית [14]. עם זאת, במחקר קודם, דיווחנו כי היו שינויים משמעותיים בתכולת הכורכומין במינים שונים של כורכום [10].

כורכומין היה קיים ב-C. xanthorrhiza ו-C. ארומטי אך נעדר ב-C. zedoaria ו-C. amada [10]. הממצאים המעניינים של מחקר זה הם שללא כורכומין, C. amada הראה פעילות מעכבת טירוזינאז חזקה. תוצאה זו מצביעה על כך שחייבות להיות כמה תרכובות פעילות של C. amada המיוחסות להשפעה החזקה שלו נגד טירוזינאז. הפעילות האנטי-טירוזינאזית של C. xanthorrhiza ו-C. aromatica עשויה להיות בגלל תכולת הכורכומין שלהם. עם זאת, לא יכולנו לשלול את האפשרות של נוכחות של תרכובות אחרות. תמצית MeOH של C. amada חולקה עם מים, n-hexane ו-EtOAc. בין שלושת השברים הללו, EtOAc הראה השפעה מעכבת חזקה משמעותית ממים ו-n-hexane (איור 1b). לכן, החלק EtOAc נלקח לפירוק נוסף. הפעילות האנטי-טירוזינאזית של שישה חלקים [n-hexane:EtOAc; 100:0 (F1), 80:20 (F2), 60:40 (F3), 40:60 (F4), 20:80 (F5) ו-0:100 (F6)] מהחלק EtOAc של C. amada הושוו. בין ששת השברים הללו, F6 ו-F3 הראו פעילות אנטי-טירוזינאז גבוהה משמעותית מהאחרים (איור 1c). לאחר מכן זוהו המבנים הכימיים של חמש התרכובות מהשברים F3 ו-F6 על פי ספקטרום 1H NMR ו-13C NMR שלהם. נתוני השיא היו כדלקמן:

מתחם 1:

גביש בצורת מחט חסרת צבע; UV λmax: ננומטר 234, 285. ESI-MS ( פלוס ) m/z: 247.3 [M פלוס H] פלוס , 229.4 [ M פלוס H-H2O] פלוס . 1 H-NMR (CD3OD): δ 7.22 (1H, s, H-12), 5.59 (1H, br d, J=12 Hz, H{{20}}) , 3.99 (1H, s, H-5), 3.85 (1H, d, J=16 Hz, H-9a), 3.69 (1H, d, J=16 Hz, H-9b), 2.57 (1H, dddd, J=13, 13, 12, 4 Hz, H-2a), 2.26 (1H, m, H{{46 }}א), 2.20 (1H, m, H{{50}}b), 2.09 (3H, s, H-13), 1.57 (3H, s, H-15), 1.32 (1H, ddd, J=13, 13, 4 Hz, H-3b), 1.28 (3H, s, H-14). 13C-NMR (CD3OD): δ 194.2(C-6) 160.2(C-8), 139.7(C12), 132.8 (C-1), 132.0(C-10 ), 124.3(C-11), 123.0(C-7), 67.8(C-5), 65.2(C-4), 42.5(C-9 ), 39.0(C-3), 25.4(C-2), 15.7 (C-15), 15.4(C-14), 10.7(C-13 ) (נתונים משלימים). מהשוואת נתונים אלו לאלו המדווחים בספרות [15, 16], החומר זוהה כזדרון (איור 2). זהו ססקוויטרפן, בודד בעבר מ-C. amada ו-C. zedoaria ודווח על השפעותיו המשככות כאבים, אנטי-דלקתיות, אנטי-פטרייתיות וציטוטוקסיות [12, 17-20].

מתחם 2:

שמן חסר צבע; UV λmax: ננומטר 243, 280. ESIMS ( פלוס ) m/z: 231. 0 [M ועוד H] פלוס , 223.3 [M ועוד H-H2O] פלוס . 1 H-NMR (CD3OD): δ 7.16 (1H, s, H-12), 5.83 (1H, s, H-5), 5.21 (1H, dd, J=12 Hz , 5 Hz, H-1), 3.73 (1H, d, J=16 Hz, H-9a), 3.63 (1H, d, J=16 Hz, H -9ב), 2.45 (1H, ddd, J=15 Hz, 11 Hz, 4 Hz, H-3a), 2.31 (1H, m, H-2a ), 2.20 (1H, dddd, J=12 Hz, 12 Hz, 12 Hz, 4 Hz, H-2b), 2.06 (3H, s, H{{57} }), 1.92 (3H, s, H-14), 1.89 (1H, m, H-3b), 1.25 (3H, s, H-15). 13C-NMR (CD3OD): δ 191.8 (C-6), 158.6 (C-8), 147.6 (C-4), 140.0 (C-12), 136.1 ( C-10), 133.3 (C-5), 132.0 (C-1), 124.6 (C-11), 123.1 (C-7), 42.4 ( C-9), 41.4 (C-3), 27.3 (C-2), 19.3 (C-14), 15.9 (C-2), 9.9 ( C-13) (נתונים משלימים). מהשוואת נתונים אלו לאלו המדווחים בספרות [21], החומר זוהה כפוראנודינון (איור 2). הוא היה מבודד מ- Lindera pulcherrima (Nees.) Benth. וו לשעבר. f [22], Curcuma zedoaria [19], Curcuma amada [12] ו-Curcuma wenyujin [23]. זהו furanosesquiterpenoid המציג פעילות אנטי-פטרייתית [12], אנטי-דלקתית [19], אנטי-סרטנית [24], אנטי-בקטריאלית ואנטי-אוקסידנטית [22].

מתחם 3:

שמן צהבהב; UV λ max: nm 275. ESIMS ( פלוס ) m/z: 383.3 [M פלוס Na] פלוס , 361.3 [M ועוד H] פלוס , 343.2 [M פלוס H-H2O] פלוס . 1 H-NMR (CD3OD): δ 6.99 (2H, dd, J=9, 2 Hz, H-2´´, -6´´), 6.67 (2H, d, J=9 Hz, H-3´´, -5´´), 6.52 (2H, s, H-2´, -6´), 4.63 (1H , br b, J=12 Hz, H-1), 4.21 (1H, m, H-3), 3.89 (1H, m, H-5), 3.85 ( 3H, s, 5´-OCH3), 2.63 (2H, m, H-7), 1.82 (1H, m, H-2a), 1.78 (1H, m, H{{6{ {107}}}}a), 1.73 (1H, m, H-2b), 1.69 (1H, m, H-4a), 1.68 (1H, m, H{{72} }ב), 1.53 (1H, m, H-4b). 13C-NMR (CD3OD): δ 156.3 (C-4´´), 149.5 (C-5´), 146.4 (C-3´), 134.5 (C-4 ´), 134.44 (C-1´), 134.41 (C-1´´), 130.4 (C-2´´, -6´´), 116.1 (C{ {104}}´´, -5´´), 108.0 (C-2´), 102.8 (C-6´), 75.2 (C-1), 72.6 ( C-5), 65.6 (C3), 56.6 (5´-OCH3), 41.1 (C-2), 39.5 (C-4), 39.2 (C-6) 31.8 (C-7) (נתונים משלימים). מההשוואה של נתונים אלה לאלה שדווחו בספרות [25], החומר זוהה כ-1,5-אפוקסי-3-hydroxy-1-(3,4-dihydroxy{ {145}} methoxyphenyl)-7-(4-hydroxyphenyl) הפטנים (איור 2). הוא בודד מקנה השורש של Zingiber officinale, ותכונות נוגדות החמצון שלהם נחקרו [25].

מתחם 4:

סירופ צמיג; UV λ max: nm 281. ESIMS ( פלוס ) m/z: 385.3 [M פלוס Na] פלוס , 363.3 [M ועוד H] פלוס , 345.2 [M פלוס H-H2O] פלוס . 1 H-NMR (CD3OD): δ 6.75 (1H, d, J=2 Hz, H-2´), 6.68 (1H, d, J=8 Hz, H{{21 }}´), 6.64 (1H, J=8 Hz, H-5´´), 6.61 (1H, J=2 Hz, H-2´´), 6.60 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6´), 6.49 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6´´), 3.80 (3H, s, 3´-OCH3), 3.73 (2H, m, H-3, -5), 2.64-2.47 (4H, m, H{{59 }}a, -1b, -7a, -7b), 1.71-1.65 (4H, m, H-2a, {{ 68}}ב, -6a, -6ב), 1.61 (2H, m, H-4a, -4b). 13C-NMR (CD3OD): δ 148.8 (C-3´), 146.1 (C-3´´), 145.4 (C-4´), 144.2 (C-4 ´´), 135.24 (C-1´ או C-1´´), 135.22 (C-1´ או C-1´´), 121.8 (C{{101 }}´), 120.6 (C-6´´), 116.5 (C-2´´), 116.3 (C-5´´), 116.1 (C-5´ ), 113.2 (C-2´), 70.94 (C-3 או C-5), 70.92 (C-3 או C-5), 56.4 (3 ´-OCH3), 44.9 (C-4), 40.8 (C-2, -6), 32.3 (C-1), 32.1 (C-7) (נתונים משלימים). מההשוואה של נתונים אלה לאלה שדווחו בספרות [26, 27], החומר זוהה כשמן 3,5-dihydroxy-1-(3,4-dihydroxyphenyl){{150 }} (4-hydroxy-3-methoxyphenyl) הפפטנים (איור 2). הוא היה מבודד מקנה השורש של Tacca chantrieri [26] ו-Curcumalonga L. [27]. הם דיאריל-הפטנואידים שמפגינים פעילויות ציטוטוקסיות [26] ואנטי-גידוליות [27].

מתחם 5:

שמן חסר צבע; UV λ max nm: 279. ESI-MS ( פלוס ) m/z: 413.3 [M פלוס Na] פלוס , 391.3 [M פלוס H] פלוס , 373.3 [M פלוס HH2O] פלוס . 1 H-NMR (CD3OD): δ 6.76 (1H, s, H-2´´), 6.67 (1H, d, J=8 Hz, H{{20}} ´´), 6.21 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6´), 6.53 (2H, s, H-2´, -6´´ ), 4.63 (1H, br d, J=12 Hz, H-1), 4.21 (1H, m, H-3), 3.83 (3H, s, 5´-OCH3) , 3.78 (3H, s, 3-OCH3), 2.65 (2H, m, H-7), 1.84 (1H, m, H-2a), 1.79 (1H, m, H-6a), 1.74 (1H, m, H-2b), 1.69 (1H, m, H-4a), 1,68 (1H, m, H{{ 75}}ב), 1.53 (1H, m, H-4b). 13C-NMR (CD3OD): δ 149.5 (C-5´), 148.8 (C-3´´), 146.4 (C-3´), 145.4 (C-4 ´´), 135.3 (C-1´), 135.2 (C-1´´), 134.4 (C-4´), 121.9 (C-6´´), 116.1 (C-5´´), 113.4 (C-2´´), 108.0 (C-2´), 102.7 (C-6´), 75.2 (C{ {121}}), 72.5 (C-5), 65.6 (C-3), 56.6 (5´-OCH3), 56.3 (3´´-OCH3), 41.2 (C{{140} }), 39.4 (C-4), 39.3 (C-6), 32.2 (C-7) (נתונים משלימים). מההשוואה של נתונים אלה לאלה שדווחו בספרות [20], החומר זוהה כ-1,5-אפוקסי-3-hydroxy-1-(3,4-dihydroxy{ {157}}methoxyphenyl)- 7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) הפטנים (איור 2) ואין מידע על הפעילות הביולוגית שלהם. בודדנו תרכובות 3, 4 ו-5 בפעם הראשונה מ-C. amada. כל התרכובות הראו פעילות מעכבת נגד טירוזינאז פטריות

חמש תרכובות, כלומר, זדרון, furanodienone, 1,5-אפוקסי-3-הידרוקסי-1-(3,4-dihydroxy-5-methoxyphenyl)- 7-( 4-הידרוקסיפניל) הפטנים, 3,5-דיהידרוקסי-1-(3,4-דיהי הידרוקסיפניל)-7-(4-הידרוקסי-3- methoxyphenyl) הפטנים ו-1,5-אפוקסי-3-הידרוקסי-1-(3,4-dihydroxy-5-methoxyphenyl)- 7-(4- ההפטנים הידרוקסי-3-methoxyphenyl), בודדו משברים F3 ו-F6. התרכובות המבודדות הראו פעילות אנטי טירוזינאז באופן תלוי ריכוז. בין חמש התרכובות, תרכובת 4 הראתה פעילות נוגדת טירוזינאז חזקה משמעותית מאשר ארבוטין. לא היו הבדלים משמעותיים בהשפעות האנטי-טירוזינאז בין תרכובת 5 לארבוטין (איור 3). ההשפעות של התרכובת המבודדת על הכדאיות התאית נחקרו על תאי מלנומה עכברים B16F10. התאים טופלו בריכוזים של 50, 100, 200 ו-400 מיקרומטר של התרכובת במשך 48 שעות. התרכובות המבודדות לא הראו השפעות ציטוטוקסיות של עד 200 מיקרומטר, עם זאת, כחמישים אחוז ממקרי המוות התאיים נצפו בכל המקרים בריכוז של 400 מיקרומטר (איור 4). לפיכך, נעשה שימוש בריכוזים של עד 200 מיקרומטר להערכת השפעות האנטי-טירוזינאז התוך-תאיות והאנטי-מלנוגניות שלהם.

כדי לקבוע את הפעילויות האנטי-מלנוגניות והאנטי-טירוזינאזות של התרכובות המבודדות, השפעתם על תכולת המלנין ופעילות טירוזינאז הוערכה בתאי מלנומה B16F10. כפי שמוצג בטבלה 1, התרכובות המבודדות שלנו עיכבו בהתאם למינון את תכולת המלנין התוך תאית ואת פעילות טירוזינאז. תרכובת 4 הייתה חזקה משמעותית מתרופת הביקורת החיובית ארבוטין הן בהשפעות מעכבות המלנין והטירוזינאז. לא נצפה הבדל משמעותי בין תרכובת 5 לבין ארבוטין. מכיוון שטירוזינאז תאי משפר את ייצור המלנין, הפחתת פעילות טירוזינאז היא אסטרטגיה יעילה לפיתוח חומרים אנטי-מלנוגניים. לשם כך, הערכנו את התכונות המעכבות של פעילות טירוזינאז תוך תאית ומלנוגנזה בתאי מלנומה B16F10. בדומה לממצאים של פעילות מעכבת טירוזינאז פטריות, התרכובות המבודדות מעכבות פעילות טירוזינאז תוך תאית ומלנוגנזה באופן תלוי מינון. ההשפעות האנטי-טירוזינאזות של התרכובות המבודדות הביאו לתכונות האנטי-מלנוגניות שלהן. סדר הפעילות האנטי-טירוזינאז והאנטי-מלנוגני של תרכובות אלו היה תרכובת 4 > ארבוטין > 5 > 2 > 3 > 1. ערך ה-IC50 המחושב של תרכובת 4 היה נמוך משמעותית מזה של ארבוטין. היעילות של תרכובת 4 הייתה פי 1.9- עד פי 5- מאשר אלו של ארבע התרכובות האחרות. תרכובת 5 הראתה גם פעילות אנטי-טירוזינאז חזקה שהיתה דומה לזו של ארבוטין. התוצאות שלנו הצביעו על כך שניתן להשתמש בתרכובות 4 ו-5 כמעכבי טירוזינאז טבעיים וקוסמטיקה להלבנת עור. סטרס חמצוני הוצע להיות מעורב במנגנון הבסיסי של ייצור יתר של מלנין [28]. לכן, תפקיד נוגד החמצון נחקר במגוון רחב של הפרעות עור, כולל פוטו-קרצינוגנזה או מלנומה [9]. אנו ואחרים דיווחנו בעבר על תכונות נוגדות החמצון של C. amada [13, 29] שעשויות להיות אחראיות להשפעות האנטי-לנוגניות של התרכובות המבודדות. במחקר זה, זיהינו השפעות מעכבות של התרכובות המבודדות על סינתזת מלנין תוך תאית ופעילות טירוזינאז המושרה על ידי -MSH. לפיכך, ניתן להשתמש בתרכובות המבודדות שלנו כסוכנים בקוסמטיקה פונקציונלית לפיתוח טיפולים יעילים להלבנת עור.

סיכום

אנו מציעים בחום כי C. amada יכול למלא תפקיד חשוב כמעכב טירוזינאז יעיל. C. amada והתרכובות הביו-אקטיביות שלה יכולות לשמש בתעשיית הקוסמטיקה כחומרי הלבנה טבעיים, בתעשיית המזון כחומרים נגד השחמה, ובתחום הרפואי לטיפול בהיפרפיגמנטציה. עם זאת, יש צורך במחקרים נוספים כדי לחקור את ההשפעות האנטי-מלנוגניות של התרכובות המבודדות במודלים של בעלי חיים.

חומרים ושיטות

כימיקלים

טירוזינאז מפטריות וארבוטין נרכשו מ-Sigma–Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, ארה"ב). L-Tyrosine היה מ-Wako Pure Chemical Industries Ltd. (אוסקה, יפן). מתנול (MeOH), אתיל אצטט (EtOAc) ו-n-הקסאן נרכשו מ-Nacalai Tesque (קיוטו, יפן). סיליקה ג'ל (63-200 מיקרומטר, Kanto Chemical Co. Tokyo, יפן) ו-MeOH-d4 (CD3OD, Merck KGaA, גרמניה) נרכשו.

הכנת חומר צמחי ארבעה מינים שונים של כורכום, כלומר C. xanthorrhiza, C. aromatica, C. amada ו-C. zedoaria, טופחו בשדה של אדמה אפורה (חול גס 3.6 אחוז, חול דק 30.9 אחוזים , סחף 24.3 אחוז , חימר 32.8 אחוז , pH 7.4, NO{{10}}N 0.07 אחוז , NH4-N 0.08 אחוז , P 4.6 ng/g, K 42.9 ng/g) בשעה מרכז מדעי השדה הסובטרופי, אוניברסיטת ריוקיוס, אוקינאווה, יפן. הטמפרטורה החודשית הממוצעת, הלחות והמשקעים בתקופת הגידול היו 17-29 מעלות, 61-83 אחוזים ו-22-369 מ"מ, בהתאמה. ניתנו שיטות אגרונומיות נפוצות כולל דשן והשקיה. קני שורש נקצרו כאשר כל נבטי המין קמלו לחלוטין. קני השורש נשטפו, פרוסים וייבשו בתנור אוויר חם ב-50 מעלות למשך 72 שעות.

שאיבת דגימות

המיצויים בוצעו על ידי המסת אבקת הכורכום השונה (300 גרם) לתוך MeOH (3 ליטר) בטמפרטורת החדר (25 מעלות) ובלחץ אטמוספרי ונשמרו במשך יומיים עם ערבוב מגנט מתמשך למניעת חמצון באוויר והגנה מפני אור השמש. התרכובות המסיסות בממס סוננו באמצעות נייר סינון (מס' 2, Advantec, Tokyo Roshi Kaisha Ltd., טוקיו, יפן). לחומר הצמחי המשמש נוספו ממיסים טריים (MeOH) והתהליך חזר על עצמו שלוש פעמים. התמיסות המסוננות המכילות תרכובות צמחיות יובשו על ידי מאייד סיבובי בלחץ מופחת ב-40 מעלות. התשואה של כל התמציות נשמרה במקרר ב-4 מעלות לצורך ניתוחים ניסיוניים.

בדיקת עיכוב טירוזינאז

פעילות עיכוב טירוזינאז נקבעה על פי השיטה הקודמת [30], מדידת ריכוז כרום DOPA המיוצר על ידי פעולת אנזים טירוזינאז על מצע טירוזין. בקצרה, דגימת הבדיקה הומסה ב-80 אחוז MeOH כדי להשיג ריכוזים שונים (25, 50 ו-100 מיקרוגרם/מ"ל). צלחת הבאר 96- הוקמה בסדר הבא: 120 μL של חיץ פוספט (20 מ"מ, pH 6.8), 20 μL מהדגימה ו-20 μL של טירוזינאז פטריות (500 U/mL ב-20 מ"ל פוספט בַּלָם). לאחר דגירה של 15 דקות ב-25 מעלות, התגובה התחילה על ידי הוספת 20 μL של תמיסת L-tyrosine בנפח 0.85 מ"ל ולאחר מכן הודגרה למשך 10 דקות ב-25 מעלות. פעילות טירוזינאז נקבעה על ידי מדידת הספיגה ב-470 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלטים (ספקטרופוטומטר Biotek Powerwave XS2). ארבוטין שימש כביקורת חיובית, ואילו 80 אחוז MeOH שימש כביקורת שלילית. אחוז עיכוב טירוזינאז חושב באופן הבא:

כאשר C היא הספיגה של הבקרה השלילית, B היא הספיגה של הריק, ו-S היא הספיגה של דגימת הבדיקה.

בידוד של תרכובות ביו-אקטיביות מהתמצית הגולמית של Curcuma Amada

בהתחשב בתוצאות של ארבע תמציות הכורכום, C. amada הראה פעילות נוגדת טירוזינאז גבוהה משמעותית מהאחרות. לכן, בוצע טיהור מונחה ביו-אסאי של תרכובות פעילות מהתמצית הגולמית של C. amada. כדי לזהות את תרכובות האנטי טירוזינאז, בוצע חלוקה מהתמצית הגולמית של C. amada כמתואר באיור 5. התמצית הגולמית דוללה במים מזוקקים ולאחר מכן חולצה עם n-hexane, ואחריה EtOAc. לאחר מכן ערבבו נפחים שווים של כל ממס ותמיסת תמצית גולמית על ידי ניעור במשך 3 דקות במשפך הפרדה. כל השברים רוכזו עד ליובש על ידי מאייד סיבובי ב-40 מעלות. הפעילות האנטי-טירוזינאזית של שלושת החלקים הללו נקבעה על פי הנוהל לעיל. מכיוון שחלק ה-EtOAc הראה את הפעילות האנטי-טירוזינאז הגבוהה ביותר, הוא נבחר לבידוד וטיהור של התרכובת הביו-אקטיבית. חלק ה-EtOAc הפעיל התאדה ליובש והועבר לכרומטוגרפיה על עמודת סיליקה ג'ל (75 גרם) (30 × 3 ס"מ). החלוקה בוצעה באמצעות n-hexane ו-EtOAc עם כמויות הולכות וגדלות של EtOAc [100:0 (F1), 80:20 (F2), 60:40 (F3), 40:60 (F4), 20:80 (F5) , ו-0:100 (F6)]. הפעילות האנטי-טירוזינאזית של ששת החלקים הללו בוצעה על פי הנוהל לעיל, ורוב הפעילויות נמצאו ב-F3 ו-F6. שברים F3 ו-F6 טוהרו על ידי C18 הפוך שלב HPLC (COSMOSIL 5C18-AR-II; Nacalai Tesque, Inc., קיוטו, יפן) מצויד במים ואצטוניטריל כשלב הנייד עם קצב זרימה של 2.5 מ"ל min-1, זוהה ב-280 ננומטר.

שלושה פסגות מ-F3 נפלטו ב-9.55, 13.66 ו-16.47 דקות, וארבעה פסגות מ-F6 נפלטו ב-11.56, 12.20, 12.75 ו-15.03 דקות כחומרים לבנים חסרי צבע, מתוכם מעכבים פעילות זוהתה בחמישה חלקי שיא שנפלטו ב-9.55 ו-16.47 דקות מ-F3 ו-11.56, 12.75 ו-15. 03 דקות (נתונים משלימים) מ-F6 (איור 5). התרכובות המבודדות (~10 מ"ג) הומסו ב-MeOH-d4 ולאחר מכן הועברו לניתוח ספקטרלי. ספקטרום של תהודה מגנטית גרעינית (NMR) תועדו בספקטרומטרים של BRUKER NMR (500 מגה-הרץ עבור 1 שעה ו-125 מגה-הרץ עבור 13 מעלות צלזיוס) בטמפרטורת החדר. שינויים כימיים (δ) נרשמו כחלקים למיליון (ppm) ביחס ל-tetramethylsilane (TMS) כתקן הפנימי. ניסויי ספקטרומטריית מסה בוצעו על ספקטרומטר מסה ווטרס באמצעות בדיקה של יינון אלקטרוספריי (ESI − MS) בתנאים האינסטרומנטליים הבאים: עמודה: COSMOSIL 5C18-AR-II, (2 × 150) מ"מ. ממס A: מים (0.1 אחוז חומצה פורמית), ממס B: אצטוניטריל, קצב זרימה: 4 מ"ל/דקה, נפח הזרקה: 100 µL, זמן ריצה: 35 דקות, תוכנית זמן עבור F3: 75 אחוז B (0 דקות) → 75 אחוז B (20 דקות) → 100 אחוז B (20.1 דקות) → 100 אחוז B (27 דקות) → 75 אחוז B (27.1 דקות) → 75 אחוז B (35 דקות). תוכנית זמן עבור F6: 45 אחוז B (0 דקות) → 45 אחוז B (14 דקות) → 100 אחוז B (14.1 דקות) → 100 אחוז B (20 דקות) → 45 אחוז B (20.1 דקות) → 45 אחוז B (25) דקות). מצב משאבה: שיפוע בינארי. פרטי התנור: CTO-20AC, טמפרטורה 40 מעלות. מצב יינון MS: ES ( פלוס ), מתח נימי: 4.0 קילו וולט, מתח קונוס: 20 וולט, טמפרטורת מקור: 120 מעלות, טמפרטורת דיסולבציה: 350 מעלות, זרימת גז חרוט: 100 ליטר לשעה, זרימת גז התפרקות: 800 ליטר /h (נתונים משלימים).

פעילות אנטי טירוזינאז של התרכובות המבודדות

תרכובות מבודדות הומסו ב-MeOH בריכוזים של 5, 10, 30, 50, 100 ו-200 מיקרומטר לכל תרכובת. פעילות אנטי טירוזינאז נקבעה באמצעות ההליך שתואר קודם.

עיכוב תוך תאי של טירוזינאז ומלנוגנזה על ידי התרכובות המבודדות

תרבית תאים

תאי מלנומה B16F10 תורבו במדיום מסוג Eagle's שונה (DMEM) של Dulbecco בתוספת של 10 אחוזים של סרום בקר עוברי מושבת בחום (FBS) ו-1 אחוז פניצילין (10,000 U/mL)/סטרפטומיצין (100 ug/mL) ב-37 מעלות באווירה לחה המכילה 5 אחוז CO2.

כדאיות תאים

תאי B16F10 צופו בצפיפות של 5 × 104 תאים/באר בצלחת 96-באר. לאחר 24 שעות, התאים נחשפו לריכוזים שונים של התרכובת המבודדת והודגרו למשך 48 שעות נוספות ב-37 מעלות. לאחר הדגירה, כדאיות התא נקבעה על ידי בדיקת MTS. נוספו עשרים מיקרוליטר של תמיסת MTS והודגרו במשך 60 דקות. לאחר הדגירה, הספיגה של התאים נקבעה ב-490 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוחיות (Benchmark Plus).

פעילות אנטי-טירוזינאז ואנטי-מלנוגנית של התרכובות המבודדות

קביעת תכולת המלנין הסלולרית ומבחני פעילות טירוזינאז נערכו כמתואר קודם [31], עם שינויים קלים. תאי מלנומה B16F10 צופו בצפיפות של 5 × 104 תאים/באר בצלחת 96-באר. לאחר 24 שעות, תאים נחשפו לריכוזים שונים של התרכובת המבודדת או ארבוטין. לאחר שעה אחת, נוספו הורמון מגרה של 100 ננומטר-מלנוציטים (-MSH), והתאים הודגרו למשך 48 שעות נוספות ב-37 מעלות. עבור מחקר פעילות אנטי-טירוזינאז, התאים נשטפו לאחר מכן עם חיץ פוספט קר כקרח והוסרו עם חיץ פוספט (pH 6.8) המכיל 1 אחוז Triton-X (90 μL/באר). הצלחות הוקפאו ב-80 מעלות למשך 30 דקות. לאחר הפשרה וערבוב, נוספו 10 μL של 1 אחוז L-DOPA לכל באר. לאחר דגירה ב-37 מעלות למשך שעתיים, הספיגה נמדדה ב-490 ננומטר. עבור בדיקת תכולת המלנין, התאים נשטפו פעמיים עם חיץ פוספט ולאחר מכן מומס ב-100 μL של NaOH (1 N) המכילה 10 אחוז DMSO. דגימות הודגרו ב-80 מעלות למשך שעה וערבבו כדי להמיס מלנין. הצפיפות האופטית של ההומוגנט המעורב נמדדה ב-490 ננומטר.

ניתוח סטטיסטי

התוצאות מבוטאות כממוצע ± SEM. הבדלים סטטיסטיים בין שני הממוצעים הוערכו על ידי מבחן t של הסטודנט. השוואות מרובות בוצעו באמצעות ניתוח חד כיווני של שונות ולאחר מכן מבחן Bonferroni. הבדלים נחשבו מובהקים ב-P <>

זה המוצר שלנו נגד עייפות! לחץ על התמונה למידע נוסף!

הפניות

1. Solano F, Briganti S, Picardo M, Ghanem GH. סוכנים היפופיגמנטים: סקירה מעודכנת על היבטים ביולוגיים, כימיים וקליניים. פיגמנט Cell Res. 2006;19:550–71.

2. Loizzo MR, Tundis R, Menichini F. מעכבי טירוזינאז טבעיים וסינתטיים כסוכנים נגד השחמה: עדכון. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2012;11:378–98.

3. Lin YS, Chen HJ, Huang JP, Lee PC, Tsai CR, Hsu TF, et al. קינטיקה של פעילות מעכבת טירוזינאז באמצעות תמציות עלי vinifera של Viti. Biomed Res Int. 2017:5232680.

4. Manini P, Napolitano A, Westerhof W, Riley PA, d' Ischia M. אורתו-קינון תגובתי שנוצר על ידי חמצון מזורז טירוזינאז של מונובנזון חומר הפיגמנטציה של העור: תגובות צימוד עצמי ותיול-צימוד והשלכות אפשריות על מלנוציטים רַעֲלָנוּת. Chem Res Toxicol. 2009;13:1398–405.

5. Couteau C, Coiffard L. סקירה כללית של סוכני הלבנת עור: תרופות ומוצרים קוסמטיים. קוסמטיקה. 2016;3:27.

6. Al-Saleh I, Shinwari N, El-Doush I, Billedo G, Al-Amodi M, Khogali F. השוואה של רמות כספית ברקמות שונות של לבקנים ועכברים פיגמנטיים שטופלו בשני מותגים שונים של קרמים להבהרת עור כספית. ביו-מתכות: Int J תפקיד Met ions Biol, Biochem, Med. 2004;17:167–75.

7. Gopinath H, Karthikeyan K. כורכום: תבלין, קוסמטי ומרפא. Indian J Dermatol Venereol Leprol. 2018;84:16–21.

8. Vaughn AR, Branum A, Sivamani RK. השפעות של כורכום (Curcuma longa) על בריאות העור: סקירה שיטתית של העדויות הקליניות. Phytother Res. 2016;30:1243–64.

9. Baliga MS, Katiyar SK. מניעת כימיקלים של פוטו קרצינוגנזה על ידי חומרים בוטניים תזונתיים נבחרים. Photochem Photobio Sci. 2006;5:243–53.

10. Akter J, Hossein MA, Sano A, Takara K, Islam MZ, Hou DX. פעילות אנטי פטרייתית של מינים וזנים שונים של כורכום (Curcuma spp.) נגד Fusarium Solani Sensu Lato. Pharm Chem J. 2018;52:292–7.

11. Akter J, Islam MZ, Hossain MA, Kawabata S, Takara K, Nguyen H, et al. הרפיה בלתי תלויה באנדותל ותעלות סידן של עורק המוח החזירי על ידי מינים וזנים שונים של כורכום. J Tradit Complement Med. 2018;9:297–303.

12. Akter J, Takara K, Islam MZ, Hossain MA, Sano A, Hou DX. בידוד והבהרה מבנית של תרכובות אנטי-פטרייתיות מ- Curcuma amada. Asian Pac J Trop Med. 2019;12:123–9.

13. Akter J, Hossain MA, Takara K, Islam MZ, Hou DX. פעילות נוגדת חמצון של מינים וזנים שונים של כורכום (Curcuma spp): בידוד של תרכובות פעילות. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharm. 2019;215:9–17.

14. Khunlad P, Tundulawessa Y, Supasiri T, Chutrtong W. Tyrosinase פעילות מעכבת של כורכומינואידים מאבקת הכורכום (Curcuma longa Linn.). J SWU Sci. 2008;24:125–39.

15. Giang PM, Son PT. בידוד של sesquiterpenoids מקנה השורש של כורכומה וייטנאמית סליסב ארומטי. J Chem. 2000;38:96–9.

16. Asem SD, Laitonjan SW. חקירת הקשר בין מבנה לא-לינאריות של זדרון מקנה השורש של Curcuma caeca Roxb. Ind J Chem. 2012;51:1738–42.

17. Faiz Hossain C, Al-Amin M, Rahman KM, Sarker A, Alam MM, Chowdhury MH, et al. עקרון משכך כאבים מכורכומה אמאדה. J Etnopharmacol. 2015;163:273–7.

18. אחמד חמדי OA, Syed Abdul Rahman SN, Awang K, Abdul Wahab N, Looi CY, Thomas NF, Abd Malek SN. מרכיבים ציטוטוקסיים מקני השורש של Curcuma zedoaria. Sci World J. 2014;2014:321943.

19. Makabe H, Maru N, Kuwabara A, Kamo T, Hirota M. Antiinflammatory sesquiterpenes from Curcuma zedoaria. Nat Prod Res. 2006;20:680–5.

20. Kikuzaki H, Nakatani N. Cyclic diarylheptanoids מקני שורש של Zingiber officinale. פיטוכימיה. 1996;43:273–7.

21. Dekebo A, Dagne E, Sterner O. Furanosesquiterpenes מ-Commiphora sphaerocarpa ומנואפים קשורים של מור אמיתי. Fitoterapia. 2002;73:48–55.

22. ג'ושי SC, Mathela CS. פעילויות נוגדות חמצון ואנטי-בקטריאליות של השמן האתרי העלים ומרכיביו הפוראנודינון והקורצרנון מבית Lindera pulcherrima (Nees.) Benth. וו לשעבר. ו. Pharmacogn Res. 2012;4:80–4.

23. Yang FQ, Li SP, Zhao J, Lao SC, Wang YT. אופטימיזציה של תנאי GC-MS על בסיס רזולוציה ויציבות של אנליטים לקביעה בו-זמנית של תשעה ססקוויטרפנואידים בשלושה מינים של קני שורש כורכום. J Pharm Biomed Anal. 2007;43:73–82.

24. Li YW, Zhu GY, Shen XL, Chu JH, Yu ZL, Fong WF. Furanodienone מעכב שגשוג תאים והישרדות על ידי דיכוי איתות ER בתאי MCF-7 של סרטן השד אנושיים. J Cell Biochem. 2011;112:217–24.

25. Tao QF, Xu Y, Lam RY, Schneider B, Dou H, Leung PS, et al. Diarylheptanoids ומונוטרפנואיד מקנה השורש של Zingiber officinale: תכונות נוגדות חמצון וציטו-פרוקטטיביות. J Nat Prod. 2008;71:12–17.

26. Yokosuka A, Mimaki Y, Sakagami H, Sashida Y. Diarylheptanoids ודיarylheptanoid glucosides חדשים מקני השורש של Tacca chantrieri ופעילותם הציטוטוקסית. J Nat Prod. 2002;65:283–9.

27. Jiang JL, Jin XL, Zhang H, Su X, Qiao B, Yuan YJ. זיהוי מרכיבים אנטי-גידוליים בכורכומינואידים מ-Curcuma longa L. בהתבסס על הקשר הרכב-פעילות. J Pharm Biomed Anal. 2012;70:664–70.

28. Marrot L, Meunier JR. פגיעה ב-DNA בעור והשלכותיו הביולוגיות. J Am Acad Dermatol. 2008;58:139–48.

29. Policegoudra RS, Abiraj K, Channe Gowda D, Aradhya SM. בידוד ואפיון של התרכובת נוגדת החמצון והאנטיבקטריאלית מקנה השורש של ג'ינג'ר מנגו (Curcuma amada Roxb.). J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci. 2007;852:40–8.

30. Tadtong S, Viriyaroj A, Vorarat S, Nimkuntat S, Suksamrarn S. Antityrosinase ופעילויות אנטיבקטריאליות של תמצית מנגוסטין. J Health Res. 2009;23:99–102.

31. Li X, Guo L, Sun Y, Zhou J, Gu Y, Li Y. Baicalein מעכב מלנוגנזה באמצעות הפעלה של מסלול האותות ERK. Int J Mol Med. 2010;25:923–7.