השפעה אנטי-מלנוגנית של תמצית אתנולית של סורגום ביקולור על מלנוגנזה המושרה על ידי IBMX בתאי מלנומה B16/F10
Mar 22, 2022
איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com
היי ג'ו האן, סון קיונג פארק, ג'ין יונג קאנג, ג'ונג-מין קים, סאול קי יו והו ג'ין היו
תַקצִיר:כדי להעריך אפשרות כחומר הלבנת עור שלסורגום ביקולור(S. bicolor), שלהנוגד חמצוןפעילות, והשפעה אנטי-מלנוגנית על 3-isobutyl-1-מתילקסנטין (IBMX) המושרהמלנוגנזהב-B16/F10 תאי מלנומה נחקרו. התוצאה של התוכן הפנולי הכולל (TPC) הצביע על כי 60 אחוז תמצית אתנול שלS. bicolor(ESB) יש את התוכן הגבוה ביותר מאשר תמציות אתנול אחרות.נוגד חמצוןהפעילות הוערכה באמצעות 2,2'-אזינו-ביס-(3-אתיל-בנזותיאזולין-6-חומצה סולפונית) דיאממוניום-מלח (ABTS)/1,1-דיפניל-2-פיקריל-הידראזיל (DPPH) פעילויות ניקוי רדיקליות והשפעה מעכבת של מלונדאלדהיד (MDA). תוצאות אלו הראו ל-ESB יש משמעותנוגד חמצוןפעילויות. ההשפעה המעכבת נגד טירוזינאז הוערכה גם באמצעות L-tyrosine (ערך IC50=89.25 µg/mL) ו-3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) כמצעים. בנוסף, טיפול ב-ESB עיכב ביעילות את ייצור המלנין בתאי מלנומה מסוג B16/F10 המושרה על ידי IBMX. כדי לאשר את המנגנון של ההשפעה האנטי-מלנוגנית של ESB, בדקנו חלבונים הקשורים למלנוגנזה. ESB הורד ויסותמלנוגנזהעל ידי הפחתת הביטוי של גורם שעתוק הקשור למיקרופתלמיה (MITF),tyrosinase וחלבון הקשור ל-tyrosinase (TRP)-1. לבסוף, חומצה 9-hydroxyoctadecadienoic (9-HODE),1,3-O-dicaffeoylglycerol ו-tricin כתרכובות העיקריות של ESB נותחו באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים אולטרה-ביצועים-ניידות הפרדת יונים-קוואדרופול זמן טיסה/ספקטרומטריית טנדמה (UPLC-IMS-QTOF/MS2). ממצאים אלו מצביעים על כך של-ESB יש את הפוטנציאל הפיזיולוגי לשמש כחומר להלבנת עור.
מילות מפתח:אַנְטִימלנוגנזה; תא מלנומה B16/F10; חומצה הידרוקסיאוקטקדקדיאנואית;Sorghumbicolor; 3-isobutyl-1-מתילקסנטין
1. הקדמה
מלנין נוצר באמצעות תהליך, הנקראמלנוגנזהבתוך המלנוזומים התוך-תאיים של מלנוציטים, והייצור וההפצה של המלנין קובעים את העור, העיניים וצבע השיער. בנוסף, מלנין ממלא תפקיד חיוני בהגנה על העור מפני מולקולות וגירויים שונים כגון קרינה אולטרה סגולה (UV), מיני חמצן תגובתיים (ROS), הורמון מגרה מלנוציטים (-MSH), וחומרי העלאת אדנוזין מונופוספט מחזוריים (cAMP) כולל פורסקולינד. IBMX [1]. בפרט, קרינת UV, באופן ישיר ועקיף, פוגעת בתאי עור באמצעות דורות ROS כגון רדיקלים הידרוקסילים, אניונים סופראוקסיד ומי חמצן [2]. ה-ROS שנוצר גורם ל-DNA חד-גדילי ודו-גדילי שובר ותוקף מולקולות מבניות תאיות חשובות כגון חלבונים ושומנים [2]. לפיכך, מלנין ונוגד חמצוןאנזימים כגון גלוטתיון פרוקסידאז, סופרוקסיד דיסמוטאז וקטלאז שומרים על רמה קבועה על ידי הסרת ה-ROS המיוצר. עם זאת, ייצור ROS מוגזם כתוצאה מגורמים שונים מפעיל את המלנוגנזה בעור, והצטברות המלנין החריגה גורמת להשפעות היפרפיגמנטציה שליליות, הגורמות לגיל או לכתמי כבד, כתמים ונמשים [3,4]. נכון לעכשיו, תרכובות טבעיות כגון חומצה קוג'ית, הידרוקינון, ארבוטין וחומצה אסקורבית, הידועים כמעכבי סינתזת מלנין, משמשות כתוספים להלבנת עור. עם זאת, למרכיבים אלה יש חדירה לקויה לעור, אלא גם גורמים לרעילות ציטוטית ודלקת במתן ארוך טווח [5]. בהקשר זה, יש צורך לפתח חומר הלבנה לא מעצבן ויעיל לטיפול בהיפרפיגמנטציה של העור האנושי, כמו גם ללמוד חומרי משאבים טבעיים לכך.
תאי עור אנושיים מייצרים בדרך כלל מלנין כתגובת הגנת הפוטו. מלנוגנזה הוא תהליך מורכב המווסת באמצעות מגוון מסלולי איתות, וכל האותות בסופו של דבר מגבירים את ה-MITF. כאשר MITF מופעל מקדם את ביטוי משפחת הגנים של טירוזינאז (טירוזינאז ו-TRP),מלנוגנזהמתחיל ברצינות [6]. באופן כללי, השלב הראשון במלנוגנזה הוא שטירוזינאז מזרז את החמצון של L-tyrosine ל-3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA), ובהמשך מחמצן את L-DOPA לכינון DOPA. ואז TRP-2 הופך את DOPA chrome ל-5,6-dihydroxyindole-2-חומצה קרבוקסילית (DHICA) או 5,6-dihydroxyindole (DHI). לבסוף, DHICA ו-DHI מתחמצנים על ידי TRP-1, מה שמוביל בסופו של דבר לייצור מלנין [6].
IBMX ומתילקסנטינים אחרים מעוררים מלנוגנזה על ידי עיכוב פוספודיאסטראז ובכך מגדילים את רמות cAMP [7]. cAMP המופעל על ידי IBMX phosphorylates אקסטרא-cellular signal-regulated kinase (ERK) ו-phosphoinositide 3-kinases/protein kinase B (PI3K/Akt) pathways ובסופו של דבר מוביל להפעלה של MITF בתהליכי מלנוגנזה [7]. לכן, ניתן להתייחס להורדת הוויסות של חלבונים אלה כגורם חשוב להשפעה האנטי-הלבנה.
סורגום ביקולור(S. bicolor), השייך למשפחת Poaceae, נחשב לגידול חשוב לאזורים אינטרופיים, כולל אפריקה, מרכז אמריקה ואזורים צחיחים, והוא גידול הדגנים הרביעי בחשיבותו בעולם אחרי חיטה, אורז ותירס [8 ]. מחקרים אחרונים הראו כי S. bicolor מועיל לבני אדם מכיוון שהוא מכיל פיטוכימיקלים כגון תרכובות פנוליות, טאנינים ואנתוציאנינים [9]. פיטוכימיקלים אלה זכו לתשומת לב מוגברת בשל שלהםנוגד חמצון, אנטי השמנת יתר, אנטי סוכרת והשפעות אנטי דלקתיות [10-14]. אמנם ישנן תוצאות מחקר שונות, אך עדיין לא נערכו מחקרים על השפעת הלבנת העור של S. bicolor. לכן, המחקר הנוכחי נועד לחקור את הפעילות נוגדת החמצון וההשפעות האנטי-מלנוגניות שלS. bicolorולבחון את ההשפעות שלהם על IBMX-inducedמלנוגנזהבתאי מלנומה B16/F10.
2. חומרים ושיטות
2.1. כימיקלים
ריאגנט Folin-Ciocalteu, L-DOPA, L-tyrosine, L-ascorbic acid, arbutin, acarbose, dimethylsulfoxide (DMSO), אלבומין בסרום בקר, -גלוקוזידאז, טירוזינאז פטריות, אלבומין בסרום בקר,3-(4,{ {6}}dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) ו-IBMX נרכשו מ-Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, ארה"ב). MITF (bsm-51339M) ו-tyrosinase (bs-0819R) נרכשו מ-Bioss (בייג'ינג, סין). TRP-1 (sc-166857) ו-actin (sc-69879) נרכשו מסנטה קרוז ביוטכנולוגיה (דאלאס, טקסס, ארה"ב). נוגדנים משניים (אנטי ארנב ואנטי עכבר) התקבלו מטכנולוגיית Cell Signaling (Danvers, MA, ארה"ב).
2.2. הכנת דוגמא
S. bicolor(20 גרם) חולצה עם ריכוזי אתנול שונים (0, 20, 40, 60, 80 ו-95 אחוזים; 1 ליטר) ב-40 מעלות למשך שעתיים באמצעות מעבה ריפלוקס. התמציות סוננו באמצעות נייר סינון (WhatmanInternational Limited, קנט, בריטניה), ורוכזו באמצעות מאייד ואקום (N-1000; EYELA Co.,Tokyo, יפן). לאחר שהתמציות עברו ליופילציה באמצעות מייבש הקפאה ואקום (Il Shin Lab Co., Ltd.,Yangju, קוריאה), התמציות המיובשות אוחסנו בדרגה של -20 עד לשימוש.
2.3. פעילות נוגדת חמצון במבחנה
2.3.1. תוכן פנולי כולל (TPC)
התוכן הפנולי הכולל נבדק על בסיס העיקרון שהריאגנטיס של Folin-Ciocalteu מופחת לתוצר תגובה כחול בתנאים אלקליים. דגימה (1 מ"ל) מעורבבת עם ריאגנט Folin-Ciocalteu ו-7 אחוז נתרן קרבונט. התערובת הופעלה למשך 2 שעות, ולאחר מכן נמדדה הספיגה ב-760 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר (UV-1201; Shimadzu, קיוטו, יפן). TPC חושב מהעקומה הסטנדרטית של חומצה גאלית והתוצאות הובעו כ- GAE g-1.
2.3.2. פעילות סילוק רדיקלית
תמיסת קטיון רדיקלי ABTS הופקה על ידי ערבוב של 2.45 mM אשלגן פרסולפט ו-7 mMABTS עם חיץ של 10{{10}} mM אשלגן פוספט (pH 7.4) המכיל 150 mM ומאפשר הם יגיבו במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. תמיסת ה-ABTS דוללה לאחר מכן במים מזוקקים לקבלת ספיגה של 0.700 ± 0.020 ב-734 ננומטר. הדגימה הורשה להגיב עם 980 µL של תמיסת ABTS למשך 10 דקות ב-37 מעלות ולאחר מכן נמדדה ספיגה ב-734 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר (UV-1201; Shimadzu, קיוטו, יפן). תמיסה רדיקלית של DPPH הוכנה על ידי המסת 0.1 mM DPPH ב-80 אחוז מתנול. תמיסת DPPH דוללה לספיגה של 1.000 ± 0.020 ב-517 ננומטר. 50 μL מהדגימה עורבבו עם 1.45 מ"ל של תמיסת DPPH והגיבו במשך 30 דקות בחושך. לאחר התגובה, התערובת נקבעה ב-517 ננומטר.
2.3.3. השפעה מעכבת על חמצון ליפידים
כדי למדוד את ההשפעה המעכבת על חמצון שומנים ברקמת המוח, נעשה שימוש בשיטת החומרים התגובתיים של חומצה thiobarbituric (TBA). רקמת המוח הומוגגה במאגר 20 mM Tris-HCl (pH7.4) וצנטריפוגה ב-6000×g למשך 20 דקות. הסופרנטנט נוסף ל-0.1 מ"מ חומצה L-אסקורבית ו-10 מיקרומטר סולפט ברזל 37 מעלות למשך 1 שעה דגירה. לאחר מכן, נוספו 30 אחוז חומצה טריכלורואצטית ו-1 אחוז TBA לתערובת, אשר הודגרה באמבט מים ב-80 מעלות למשך 20 דקות. לאחר מכן, TBA-MDAcomplex נמדד באמצעות ספקטרופוטומטר (UV-1201; Shimadzu, קיוטו, יפן) ב-532 ננומטר.
2.4. אפקט מעכב טירוזינאז
ההשפעה המעכבת של טירוזינאז נקבעה באמצעות L-tyrosine כמצע. דוגמה נוספה לצלחת 96-באר וערבבה עם 0.1 M חיץ נתרן פוספט, טירוזינאז ומצע 0.1 mML-טירוזין כדי להגיב ב-37 מעלות. לאחר הדגירה, פעילות האנזים נמדדה באמצעות microplatereader (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, ארה"ב) ב-490 ננומטר. כמו כן, L-DOPA שימש כמצע למדידת פעילות מעכבת טירוזינאז. 67 מ"מ חיץ נתרן פוספט, טירוזינאז ומצע 10 מ"מ-DOPA נוספו לדגימה כדי להגיב ב-37 מעלות למשך 10 דקות. פעילות טירוזינאז נמדדה ב-415 ננומטר.
Cistanche מעכב יצירת מלנין
2.5. -אפקט מעכב גלוקוזידאז
ההשפעה המעכבת של-glucosidase נמדדה על ידי ערבוב של 0.1 M נתרן פוספט באפר ו-glucosidase ב-37 מעלות למשך 10 דקות. לאחר ההפעלה, התערובת נוספה ל-5 mM4-nitrophenyl- -D-glucopyranoside במאגר ב-37 מעלות למשך 5 דקות, ולאחר מכן נמדדה הספיגה ב-405 ננומטר באמצעות קורא צלחות (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, ארה"ב).
2.6. בדיקת כדאיות תאים
הציטוטוקסיות של הדגימה הוערכה באמצעות בדיקת MTT. תאי מלנומה B16/F10 טופחו ב-1×104 תאים/באר בצלחת 96-באר למשך 24 שעות. לאחר מכן, הדגימות טופלו לריכוזים של 1, 2, 5 ו-10 מיקרוגרם/מ"ל. דגימות טופלו במשך 48 שעות, ולאחר מכן התאים טופלו ב-10 מיקרוגרם/מ"ל של תמיסת מניות MTT למשך 3 שעות. לבסוף, המדיה הוסר, ו-DMSO נוסף כדי להמיס את הפורמזן. כמות הפורמאזן הוכמתה באמצעות קורא מיקרו-לוחיות (EPOCH2;BioTek, Winooski, VT, ארה"ב) ב-570 ננומטר (אורך גל עירור) ו-655 ננומטר (אורך גל פליטה).
2.7. מדידת תכולת המלנין הסלולרית
כדי למדוד את כמות המלנין, תאי מלנומה B16/F10 תורבו בצלחת 24-באר בצפיפות של 4×104 תאים/מאוד מעל למשך 24 שעות. לאחר מכן, התאים טופלו ב-100 mM IBMX ו- ESB או בקרה חיובית (arbutin) למשך 48 שעות נוספות. לאחר הטיפול, התאים נשטפו ונקצרו באמצעות מלח פוספט חוצץ (PBS). התאים שנקטפו עברו צנטריפוגה ב-16,000×g למשך 10 דקות, והגלולה שהתקבלה הומסה עם 1 N נתרן הידרוקסיד המכיל 10 אחוז DMSO ב-90 מעלות למשך 20 דקות. תכולת המלנין נמדדה ב-490 ננומטר באמצעות קורא microplate (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, ארה"ב).
2.8. Western Blot Analysis
תאי מלנומה B16/F1{10}} שטופלו מראש נשטפו ב-PBS והוסרו באמצעות חיץ RIPA המכיל 1% מעכבי פרוטאז על קרח. ריכוזי החלבון נקבעו על ידי בדיקת חלבון ברדפורד, והחלבונים השווים עברו דנטורציה עם חיץ Laemmli למשך 10 דקות ב-95 מעלות. החלבונים המפונפים הופרדו על ידי אלקטרופורזה של ג'ל (SDS-PAGE) של 10 אחוז נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד ולאחר מכן הועברו על גבי ממברנות פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, ארה"ב). לאחר מכן, הממברנות נחסמו עם 5 אחוז חלב דל שומן בתמיסת מלח מבוקרת Tris עם 0.1 אחוז Tween20 (TBST) למשך שעה אחת, ולאחר מכן הגיבו עם נוגדנים ראשוניים למשך הלילה ב-4 מעלות. הממברנות הגיבו עם הנוגדנים המשניים במשך שעה אחת והקומפלקסים החיסוניים הוצגו באמצעות ריאגנט כימילומינסנציה משופר (Bionote, Hwaseong, קוריאה). תמונות הלהקה זוהו ונותחו על ידי Chemi-doc (iBright Imager, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב).
2.9. ניתוח UPLC-IMS-QTOF/MS2
התרכובות העיקריות בתמציות אתנוליות של 60 אחוז שלS. bicolorנותחו על ידי UPLC-IMS QTOF/MS2 (Vion, Waters Corp., Milford, MA, ארה"ב). הפרדה כרומטוגרפית בוצעה באמצעות עמודת Acquity UPLC BEH C18 (2.1 × 10{{10}} מ"מ, גודל חלקיקים של 1.7 מיקרומטר; Waters Corp.) בקצב זרימה של 0.35 מ"ל לדקה. השלבים הניידים כללו ממס A (0.1 אחוז חומצה פורמית במים מזוקקים) ו-B (אצטוניטריל), ותנאי הניתוח כללו את שיפוע הזמן הבא: 1 אחוז B ב-0-1 דקות, 1-100 אחוז B ב-1-7 דקות, 100 אחוז B ב-7-8 דקות, 100-1 אחוז B ב-8-8.2 דקות, 1 אחוז B ב-8.2-10 דקות. ספקטרומטריית מסה בוצעה במצב שלילי של יינון אלקטרוספריי (ESI) בתנאים הבאים: טמפרטורת מקור, 100 ◦C; טמפרטורת קו ההשמדה, 400 ◦C; אנרגיית התנגשות רמפה, 10–30 וולט; מתח קפילרי, 2.5 קילו וולט. תרכובות פנוליות זוהו בסריקה מלאה שנעה מ-m/z 50 עד 1500.
2.10. ניתוח סטטיסטי
כל התוצאות הוצגו כממוצע ± סטיית תקן (SD). ההבדל הסטטיסטי בין קבוצות נקבע על ידי ניתוח שונות של שונות (ANOVA) באמצעות מבחן הטווחים המרובים החדש של Duncan (p < 0.05)="" עם="" תוכנת="" sas="" גרסה="" 9.4="" (sas="" institute,="" cary,="" nc,="" ארה"ב)="" .ויחסי="" הגומלין="" בין="">נוגד חמצוןהשפעות (פעילות ניקוי רדיקליים של ABTS/DPPH והשפעה מעכבת MDA) והאפקט המעכב שלמלנוגנזהאנזימים בתיווך (tyrosinase ו-glucosidase) הוערכו ניתוח מתאם Pearson.
3. תוצאות
3.1. תוכן פנולי כולל
כדי להשוות אתנוגד חמצוןפעילות של כל תמצית אתנולית מS. bicolor, TPC נחקר. כפי שמוצג באיור 1, TPC היו שונים בין התמציות האתנוליות; התמצית האתנולית של 60 אחוז (150.08 ± 1.13 מ"ג GAE/g) הייתה גבוהה משמעותית מהמיצויים האחרים (0 אחוז; 70.83 ± 1.18, 20 אחוז; 100.42 ± 0.72, 40 אחוזים ; 114.67 ± 1.46, 80 אחוז ; 118.33 ± 3.17 ו- 95 אחוז ; 73.67 ± 1.46 מ"ג GAE/g). לכן, התמצית האתנולית של 60 אחוז שימשה לניתוחים ניסיוניים נוספים.
3.2. פעילות סילוק רדיקלית
הנוגד חמצוןפעילות התמצית האתנולית של 60 אחוז מS. bicolor(ESB) נמדדה באמצעות מבחן ABTS/DPPH ומבחן MDA, והתוצאות הוצגו באיור 2. פעילות הניקוי הרדיקליים של ABTS של ESB הוצגה ב-97.98 אחוז בריכוז של 1000 ug/mL, וויטמין C (99.82 אחוז) , המשמשת כביקורת חיובית וגם הייתה בעלת פעילות ניקוי רדיקלית דומה באותו ריכוז (איור 2A). וכן, ESB הראה אפקט עיכוב של 50 אחוז (ערך IC50) של רדיקל ABTS בריכוז של 409.71 ug/mL. כפי שמוצג באיור 2B, פעילות ניקוי הרדיקליים של DPPH של ESB הוצגה ב-79.44 אחוזים בריכוז של 1000 ug/mL, וערך IC50 צוין על 612.53 ug/mL. ההשפעה המעכבת של ייצור MDA של ESB הראתה השפעה מעכבת של 89.54 אחוז בריכוז של 50 ug/mL והראתה השפעה מעכבת גבוהה יותר מהקטצ'ין (71.03 אחוז), שהוא הביקורת החיובית, באותו ריכוז (איור 2C). בנוסף, ערך IC50 של MDA נצפה בריכוזים של 16.56 ug/mL של ESB.
3.3. השפעה מעכבת של אנזימים בתיווך מלנוגנזה
ההשפעה המעכבת שלמלנוגנזהאנזימים בתיווך הוערכו באמצעות טירוזינאז ו-glucosidase (איור 3). כדי למדוד את הפעילות המעכבת של טירוזינאז כנגד סינתזת מלנין, בוצעו ניסויים באמצעות L-tyrosine ו-L-DOPA כמצע בתנאים נטולי תאים. כתוצאה מכך, ערך ה-IC50 היה 89.25 מיקרוגרם/מ"ל כאשר L -טירוזין שימש כמצע (איור 3A), אך L-DOPA לא הצליח שיותר מ-50 אחוזים מהאפקט המעכב נצפו (איור 3B). בשלב זה, ערך ה-IC50 של הביקורת החיובית (ארבוטין) עבור L-tyrosine היה 74.35 מיקרוגרם/מ"ל, שהיה גבוה יותר מ-ESB. ל-ESB נמצאה השפעה מעכבת טובה יותר על טירוזינאז באמצעות L-tyrosine מאשר שימוש ב-L-DOPA כמצע. לכן, בהתבסס על תוצאות הבדיקה תוך שימוש בשני מצעים, ההשפעה המעכבת טירוזינאזין של ESB נחשבת כקשורה לחמצון של L-tyrosine ל-L-DOPA ולא לחמצון של L-DOPA ל-DOPA quinone במלנוגנזה. אפקט מעכב טירוזינאז באמצעות L-DOPA כמצע ופעילות סילוק רדיקלית (ABTS; 0.943, p <0.05, dpph;="" 0.952,="" p=""><0.05) הצביע="" על="" המתאמים="" החזקים="" החיוביים="" בטבלה="">
כדי למדוד את ההשפעה המעכבת שלמלנוגנזהאנזים מתווך, נמדדה הפעילות המעכבת נגד -גלוקוזידאז של ESB. כפי שמוצג באיור 3C, ESB עיכב את-glucosidase ב-33.72 אחוזים בריכוז של 200 מיקרוגרם/מ"ל. וה-IC50 של ESB היה 46.29 מיקרוגרם/מ"ל, שזה בערך פי חמישה יותר מ-Acarbose (216.05 מיקרוגרם/מ"ל). תוצאות אלו מצביעות על כך של-ESB יש פעילות מעכבת גלוקוזידאז טובה יותר מאשר לאקרבוז כביקורת חיובית. והשפעה מעכבת גלוקוזידאז גילתה מתאם חיובי חזק עם השפעה מעכבת MDA (0.966, p <0.05) בטבלה="">
3.4. כדאיות תאים וסינתזת מלנין סלולרית
כדי לאשר את הציטוטוקסיות של ESB, תאי מלנומה B16/F10 טופלו עם ESB במשך 24 שעות בריכוזים 1, 2, 5, 10 ו-20 מיקרוגרם/מ"ל. התוצאות הראו כי ESB לא השפיע על כדאיות התא בריכוזים המצוינים בהשוואה לבקרה (איור 4A). לכן, ניסויים בוצעו על ידי בחירת ריכוזים של 2, 5 ו-10 מיקרוגרם/מ"ל. לאחר מכן, תאי מלנומה B16/F10 טופלו ב-IBMX כדי לנתח את ההשפעה של ESB על ייצור המלנין. כפי שמוצג באיור 4B, רמת תכולת המלנין עלתה ל-316.85 אחוזים בטיפול ב-IBMX. מצד שני, הקבוצה שטופלה ב-ESB (108.60 אחוז) בריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל הראתה ירידה משמעותית בתכולת המלנין בהשוואה לקבוצה שטופלה ב-IBMX, ותכולת מלנין דומה בהשוואה לקבוצת הארבוטין (101.79 אחוזים) כביקורת חיובית.
3.5. מסלול מלנוגנזה בתאי מלנומה B16/F10
מלנוגנזההוא תהליך חיוני להגנה על עור האדם מפני גירויים חיצוניים, ותהליך זה מווסת על ידי מנגנונים שונים. במחקר זה, מדדנו את רמת הביטוי של מולקולות מווסתות מלנוגנזה כדי לאשר את המנגנון המעכב הפוטנציאלי של ייצור מלנין המושרה על ידי ESB onIBMX בתאי מלנומה B16/F10 (איור 5). התוצאות הראו כי ESB הפחית ביעילות את ביטוי MITF המושרה על ידי IBMX (איור 5A, B). לפיכך, הביטוי של טירוזינאז (איור 5A, C) ו-TRP-1 (איור 5A, D) היה מופחת על ידי MITF מופחת עם טיפול ESB. כתוצאה מכך, הטיפול ב-ESB הוריד את הביטוי של חלבונים קשורים בתאי מלנומה המושרה על ידי IBMX.
3.6. ניתוח UPLC-IMS-QTOF/MS2
פרופיל של התרכובות העיקריות של ESB נסרק על ידי LC/MS בטווח של m/z 50-1500, וכרומטוגרמות שיא הבסיס מוצגות באיור 6. זיהוי ואפיון נוסף של התרכובות בוצעו בהשוואה לנתוני ספרות באמצעות MS2fragmentationdata (טבלה 2). בהתבסס על השברים בספרות הקודמת, שיא 2 היה 1-O-caffeoylglycerol(m/z 253.07, 179.03, 161.02 ו-135.04) [15]; שיא 3, dicaffeoylglycerides (מ/ז 415.10, 253.07, 179.03 ו-135.04) [16]; שיא 4, 1,3-O-dicaffeoylglycerol (m/z 415.10, 253.07, 179.03, 161.02 ו-135.04) [16]; שיא 5, p-coumaroyl-caffeoylglycerol (m/z.03.02 .503.02 .503,02 ו-135.04) [17]; שיא 6,feruloyl-caffeoylglycerol (מ/ז 429.12, 253.07, 193.05, 161.02 ו-134.03) [18]; שיא 7, טריצין (מ/ז 329.23,314.04, 299.01 ו-271.02) [19]; ו-peak 9, 9-hydroxyoctadecadienoic acid (9-HODE) (m/z 295.22, 277.21ו 171.10) [20], בהתאמה. ביניהם, 1,3-O-dicaffeoylglycerol (איור 6B), טריצין (איור 6C) ו9-HODE (איור 6D) זוהו כתרכובות עיקריות.
השפעות של cistanche:אנטי חמצון
4. דיון
מלנוגנזהמדווח כי הוא נגרם על ידי לחץ חמצוני מוגבר מגירויים חיצוניים. מתח חמצוני גורם לחמצון של DNA וחלבונים, חמצון שומנים, ועלייה בחומצות שומן בלתי רוויות. מתח זה מוביל גם להגברת סינתזת המלנין שלא לצורך במלנוציטים על העור. לפיכך, עודף מלנין שנוצר יכול לגרום לפיגמנטציה, וזה יכול להוביל לסרטן העור. IBMX ממריץ מלנוגנזה על ידי עיכוב פוספודיאסטראז ובכך הגדלת רמות cAMP [7]. ככל שרמת ה-cAMP בתאים עולה, היא גורמת להפעלה של מסלולי האיתות ERK ו-PI3K/Akt המקדמים יצירת חלבונים הקשורים למלנוגנזה. לכן, חקרנו את השפעת ההלבנה של ESB על מלנוגנזה המושרה על ידי IBMX בתאי מלנומה B16/F10.
לתרכובות פנוליות כמטבוליטים משניים של צמחים יש את התכונה להיות מיוצבת על ידי מבנה תהודה כאשר הם מגיבים עם רדיקלים [21]. כמו כן, תרכובות פנוליות פועלות כגורמים חשובים לפעילות נוגדת החמצון כגון פעילות ניקוי רדיקליים של ABTS/DPPH, ומעכבות היווצרות פיגמנטים מכיוון שיש להן מבנה כימי כמו זה של L-tyrosine [22,23]. בדיקת ABTS/DPPH היא השיטה הנפוצה והפשוטה ביותר לאומדן במבחנהנוגד חמצוןפעילות. במחקר זה, ESB הראה TPC גבוה (איור 1) ופעילות סילוק רדיקלית ABTS/DPPH (איור 2A, B). במיוחד, ESB היה גבוה יותר בפעילות ההסרה הרדיקלית של ABTS מאשר בפעילות ההסרה הרדיקלית של DPPH. בדיקת ה-DPPH משמשת למדידת פעילות הניקוי הרדיקליים של תרכובות הידרופוביות, בעוד שבדיקת ה-ABTS מאפשרת למדוד את פעילות הניקוי הרדיקליים כנגד תרכובות הידרופוביות כמו גם הידרופיליות [24]. לפיכך, אושר שפעילות הניקוי הרדיקלית של ESB הושפעה יותר מהתרכובת ההידרופלית.
חשיפה לקרינת UV גורמת לייצור ROS ויש לה השפעות ישירות ועקיפות על העור. בפרט, ROS משרה חמצון שומנים על ידי תקיפת חומצות שומן בלתי רוויות, שהן מרכיבים של ממברנות התא [2]. הצטברות של פרוקסיד שומנים מובילה להרס של מערכת נוגדי החמצון של העור, הגורמת לפיגמנטציה, דלקת והזדקנות [25]. במחקר זה, ESB הראה מעכב מעולה של חמצון שומנים (איור 2C). התרכובות הפנוליות הכלולות בצמחים טבעיים דווחו כקשורות לפעילות סילוק רדיקלית [26]. כמו כן, Maresca et al. [27] דיווח כי הסרת ROS עם נוגדי חמצון יעילה בעיכוב ביוסינתזה של מלנין. מחקר שנערך לאחרונה דיווח כי חלקי האתיל אצטט והאגליקון של עלה Dendropanax morbifera יכולים לשמש כמגנים על תאי העור ונוגדי חמצון טבעיים על ידי הגנה על תאי HaCaT מפני עקה חמצונית [28]. יתר על כן, טיפול באותם חלקים הראה אפקט אנטי-מלנוגני טוב יותר מאשר ארבוטין, המשמש כשליטה חיובית, כנגד יצירת מלנין מוגזמת הנגרמת על ידי MSH בתאי מלנומה B16/F10 [28].
מספר מנגנונים קשוריםמלנוגנזה, והמטרה המשותפת לחומרי הלבנת עור היא ויסות של טירוזינאז, שהוא אנזים חשוב במלנוגנזה. טירוזינאז, אנזים המכיל נחושת, מזרז שתי תגובות במסלול זה: הידרוקסילציה של L-tyrosine ל-L-DOPA וחמצון של L-DOPA ל-DOPA quinone [6]. כאשר נחשפים לכמויות גדולות של UV orROS, הפעילות של טירוזינאז מוגברת וגם סינתזת המלנין מוגברת. לכן, התוצאות של מדידת ההשפעה המעכבת של טירוזינאז ביחס לסינתזת המלנין הראו של-ESB נמצאה השפעה מעכבת טובה יותר על טירוזינאז באמצעות L-tyrosine מאשר שימוש ב-L-DOPA כמצע (איור 3A,B). מחקר שנערך לאחרונה דיווח על המתאם בין TPC לבין עיכוב טירוזינאז מכיוון שלתרכובות פנוליות יש מבנה כימי דומה לזה של L-tyrosine, מצע של טירוזינאז. לפי Choi וחב'. [29], נצפה כי היעילות של פעילות ניקוי רדיקלים חופשיים והשפעה מעכבת טירוזינאז עלתה בפרופורציה לזמן התסיסה של Cheonggukjang, שנבעה מכך שכמות ה-TPC עולה עם זמן התסיסה. Im & Lee [30] הבחינו שלחלק האתיל אצטט של תמצית אתנולית של 75 אחוז מ-Taraxacum core num יש פעילות שפע של TPC ופעילות נוגדת חמצון, והאפקט מעכב טירוזינאז היה עדיף על פני חלקים אחרים (הקסאן, כלורופורם, בותנול ומימי).
טירוזינאז, אחד מהגליקופרוטאינים, עובר גליקוזילציה כאשר שרשראות פוליפפטידים עוברות לרשת האנדופלזמית. אנזימים שונים מעורבים בתהליך זה, וביניהם, עיכוב של גלוקוזידאז עלול לעכב את הקיפול של טירוזינאז ליצירת מבנה לא פעיל ללא נחושת. כתוצאה מכך, טירוזינאז אינו מסוגל לעבור למלנוזום ומעכב את ייצור המלנין. הפוליפנול קיים בצמחים מסוגלת לא רק להפחית מתח חמצוני, אלא גם מעכבת אנזימים הידרוליזים של פחמימות כגון -גלוקוזידאז על ידי קשירה לחלבונים [31]. מחקר קודם הצביע על כך שתאי מלנומה B16/F10 בנוכחות מעכבי גליקוזילציה מביאים להפחתה של מלנוגנזה על ידי הקטנת התוכן הכולל של טירוזינאז [32]. וצ'וי ואח'. [33] דיווח כי deoxynojirimycin, אחד ממעכבי ה-glucosidase, חסם גליקוזילציה של טירוזינאז ועיכב את נדידת טירוזינאז למלנוזומים. אנדו וחב'. [34] הראו כי ניתן לעכב את סינתזת המלנין בתאי מלנומה על ידי שליטה בגליקוזילציה של טירוזינאז על ידי מעכבי גלוקוזידאז כגון גלוטתיון, פריטין וגלדנמיצין. קים וחב'. [35] דיווחו על המתאמים הטובים עבור אבקת דבורים כטבעיתנוגד חמצוןבין TPC להשפעה מעכבת טירוזינאז ({{0}}.973,p < 0.05),="" וגם="" tpc="" נתן="" את="" המתאם="" החיובי="" עם="" פעילות="" סילוק="" רדיקלים="" של="" dpph="" (0.897,="" p="">< 0.05).="" והתוצאות="" מצביעות="" על="" כך="" שפוליפנולים="" כנוגדי="" חמצון="" טבעיים="" עשויים="" להיות="" יעילים="" להלבנת="" עור="" בהתבסס="" על="" פעילות="" נוגדת="" החמצון="" המצוינת="" שלהם.="" במחקר="" שלנו,="" ההשפעה="" נוגדת="" החמצון="" של="" esbin="" בתהליך="" של="" עיכוב="" פעולת="" טירוזינאז="" נמצאה="" בקורלציה="" גבוהה="" דרך="" עיכוב="" החמצון="" של="" l-dopa="" ל-dopa="" quinone="" וגליקוזילציה="" של="" טירוזינאז="" (טבלה="" 1).="" מסיבה="" זו,="" נוגד="" החמצון="" להשפעה="" של="" esb="" יש="" השפעה="" על="" השפעת="" הלבנת="" העור="" על="" ידי="" השפעה="" על="" העיכוב="">מלנוגנזה- אנזימים בתיווך.
נוגד חמצון טבעי: cistanche tubulosa
מסלול האיתות PKA הוא התהליך העיקרי המעורב במלנוגנזה, וזה מופעל על ידי IBMX, שהוא חומר להעלאת cAMP. מסלול האיתות PKA יכול לווסת גורמי שעתוק כגון MITF וחלבון קשירת אלמנטים המגיב ל-cAMP, המעורבים בביטוי שלמלנוגנזהמווסתים כגון טירוזינאז, TRP-1 ו-TRP-2. כתוצאה מכך, טיפול ב-IBMX מגביר את הביטוי של MITF ושל משפחת הגנים של טירוזינאז (טירוזינאז ו-TRP-1) באמצעות cAMP [7]. פארק ואח'. [36] הראה שכמות סינתזת המלנין מתמצית אתנולית PapenfusiellaCuomo (65.17 ± 13.40 אחוז) בריכוז של 40 מיקרוגרם/מ"ל דומה לחומצה קוג'ית (72.30 ± 3.92 אחוזים) כביקורת חיובית, ודיווחה כי היא הראתה פוטנציאל כחומר הלבנה טבעי. במחקר זה, ESB הראתה השפעה מעכבת יעילה על סינתזת המלנין הדומה לזו של הביקורת החיובית בריכוזים נמוכים (איור 4). לאחר מכן, כדי להעריך את ההשפעה האנטי-מלנוגנית המפורטת של ESB, בוצע ניתוח כתם מערבי על חלבון מתיווך מלנוגנזה באמצעות תאי B16/F10 מלנומה.
אקט, המעורב במנגנונים שונים, ממלא תפקיד מפתח במספר תהליכים תאיים כגון אפופטוזיס, גלוקוז ומטבוליזם של העור. בפרט, הגדלת cAMP על ידי טיפול IBMX מפחיתה את הזרחון של Akt והפעלתו. כמו כן, Akt inactivated גורם להפעלה של GSK-3, מה שאומר שלא מושגת זרחון, כלומר, רמת ה-p-GSK-3 מופחתת [7]. על פי ספרות קודמת, החלק האווירי של Pueraria thunbergia משדרג את ה-MITF על ידי הפעלת מסלול האיתות Akt/GSK-3 בתאי מלנומה B16/F10 [37]. כמו כן, Huang etal. [38] הראה כי [6]-אסכולה קידמה ביטוי p-Akt ועיכבה איתות מלנוגנזה בתאי מלנומה B16/F10. GSK מופעל-3 מגביר את משפחת הגנים של טירוזינאז על ידי זרחון של Ser289 של MITF, וכתוצאה מכך מקדם מלנוגנזה. MITF הוא גורם שעתוק עיקרי הנקשר למקדם גן טירוזינאז, ולאחר מכן הוא מגביר את הביטוי של אנזימים הקשורים לשגשוג המלנוציטיםמלנוגנזה[7]. כאשר הביטוי של טירוזינאז מקודם על ידי MITF, הוא מוביל לאחר מכן לעלייה ברמות TRP-1 ו-TRP-2, וכתוצאה מכך, האנזימים המלנוגניים הללו מייצרים מלנין [6]. מתח חמצוני הנגרם על ידי אור UV מגרה פיגמנטציה של מלנין בעור. לכן, פעילות הניקוי של רדיקלים או ROS יעילה לדיכוי ייצור המלנין, ולפוליפנולים בעלי פעילות נוגדת חמצון עשויים להיות השפעות הלבנה מצוינות [38]. צ'וי וחב'. [39] הראה שגבעול במבוק קוריאני (Phyllostachys nigra variation henosis) הורידו את הפיקוח על PKA/CREB בתיווך MITF באמצעות ניקוי רדיקלי ABTS/DPPH. ותמצית אתנולית של 70 אחוזים של Nelumbo nucifera G. Leaf עיכבה את הביטוי של MITF, טירוזינאז ו-TRPs עם פעילויות נוגדות חמצון כגון יכולת תרומת אלקטרונים ועיכוב של xanthine oxidase [40]. בניסוי זה, הוכח שטיפול ב-ESB הפחית את הביטוי של משפחת MITF ו-tyrosinase (tyrosinase ו-TRP-1), אשר מקדמים את החמצון של DHICA ל-DHI בנתיב המלנוגנזה (איור 5). בהתבסס על תוצאות אלו, הוכח כי ESB מווסת ירידה ב-IBMX-mediatedmelanogenesis על סמך המעולה שלהנוגד חמצוןאפקטים.
בהתבסס על הספרות הקודמת, התרכובות הפנוליות העיקריות ב-ESB זוהו ש1,3-O-di-caffeoyl גליצרול (איור 6B), טריצין (איור 6C) ו-9-HODE (איור 6D) [16 ,19,20]. ביניהם, 9-HODE, שהיא התרכובת הנפוצה ביותר ב-ESB, היא אחד המטבוליטים של חומצת לינולאיקה ומראה אפקט הלבנה על עור מגורה על ידי עיכוב טירוזינאז [41]. כמו כן, בניגוד לתרכובות אליפטיות אחרות, דווח כי 9-HODE יציב בכל ניסויי החמצון וכבעל אפקט הלבנה על נזקי ROS [41]. בינתיים, טריצין (5,7-דיהידרוקסי- 2-(4-הידרוקסי-3,5-די-מתוקסיפניל)-4H-כרומן{{24 }}one) הוכר מזה זמן רב בהשפעותיו הבריאותיות המועילות, כגון פעילויות נוגדות חמצון, אנטי-ויראליות ואנטי-גידולים/אנטי סרטן [42-44]. מו וחב'. [45] דיווח כי טריצין הפגין השפעה מעכבת טובה יותר על פעילות טירוזינאז בהשוואה לארבוטין כביקורת חיובית. יתרה מכך, מנג וחב'. [46] דיווח כי טריצין שבודד מתמצית מתנול של שעורה ירוקה צעירה (Hordeum vulgare L.) עיכב את הביוסינתזה של מלנין ופעילות טירוזינאז בתאי B16/F10 מלנומה דרך קבוצת ההידרוקסיל במיקום C-4' וקבוצות מתוקסי במיקום C-3',5'מיקומים של שלד הטריצין. פניל פרופנואידים כגון 1-O-caffeoylglycerol, dicaffeoylglycerides, ו-1,3-O-dicaffeoylglycerol הם תרכובות אורגניות המסונתזות על ידי צמחים מפנילאלנין וטירוזין. דווח כי פניל-פרופנואידים וצורותיהם המוסוכרות הם נוגדי חמצון חזקים, בין אם על ידי ניקוי ROS באופן ישיר או על ידי פעולתם כגורמי פרוקסיל רדיקלי פורצי שרשרת [47].
חומצה p-Coumaric, בעלת מבנה כימי דומה ל-L-tyrosine, מתחרה עם L-tyrosine עבור אתרים פעילים על טירוזינאז [48]. הוא ידוע כמעכב טירוזינאז חזק, ודווח כי ההשפעה האנטי-מלנוגנזה שלו חזקה יותר מאשר תרכובות דומות מבחינה מבנית כגון חומצה קינמית [48]. בנוסף, An et al. [48] דיווח כי חומצה p-coumaric, מרכיב של Sasa quelpaertensis Nakai, עיכבה את פעילות טירוזינאז באמצעות L-DOPA כמצע, והפחיתה את ייצור המלנין בתאי מלנומה B16/F10. לכן, ESB עשוי להיחשב כבעל אפקט הלבנה מצוין באמצעות חומצה p-קומרית. יתר על כן, ספקטרום הטרשת הנפוצה של 1-O-caffeoylglycerol ו-1-3-O-dicaffeoylglycerol הראו דפוסי פרגמנטציה דומים ב-m/z 179, 161 ו-135, ושברים אלו דווחו כשירי חומצה קפאית. יש להם ספקטרום UV דומה לזה של נגזרת חומצה קפאית עם λmax בערך 326 ננומטר, ולכן נחשבים לנגזרת חומצה קפאית [48]. דווח שחומצת קפאית, נגזרת של תרכובות שונות, היא נוגד חמצון חזק במבחנה/in vivo, ומפחיתה את פעילות הסטירוזינאזמלנוגנזהבתאי מלנומה B16/F10. כתוצאה מכך, ההשפעה האנטי-מלנוגנית של ESB עשויה להיחשב כמקורהנוגדי חמצוןוחומרים להלבנת עור כגון תרכובות אליפטיות ופנוליות.
השפעות של cistanche: נוגד חמצון
5. מסקנות
כדי להעריך את האפשרות כסוכן הלבנת עור שלסורגום ביקולור, השפעות נוגדות חמצון ואנטי-מלנוגניות של ESB על מלנוגנזה המושרה על ידי IBMX הוערכו בתאי B16/F10 מלנומה. ESB הפגין משמעותינוגד חמצוןפעילות בפעילות ניקוי רדיקליים של ABTS/DPPH והשפעה מעכבת MDA. ESB מנע את הצעד הראשון שלמלנוגנזהעל ידי עיכוב -glucosidase and tyrosinase באמצעות L-tyrosine ו-L-DOPA כמצעים. ההשפעות האנטי-מלנוגניות של ESB המושרה על IBMXמלנוגנזההוערכו בתאי מלנומה B16/F10, והתוצאות הראו ש-ESB עיכב מלנוגנזה הנגרמת על ידי IBMX בתאי מלנומה B16/F10. הצטברות מלנין נבלמת על ידי ויסות מטה של הביטוי של MITF ושל משפחת הגנים של טירוזינאז (טירוסינאז ו-TRP-1) במלנוגנזה המושרה על ידי IBMX. התרכובות העיקריות של ESB נותחו כ-1,3-O-di-caffeoyl glycerol, tricin ו-9-HODE. כתוצאה מכך, ESB הראה במבחנהנוגד חמצוןפעילות והשפעה אנטי-מלנוגנית בתאי מלנומה B16/F10, ולפיכך, יכולה לשמש כחומר הלבנת עור בשוק הקוסמטיקה.
אנטי חמצוןטבליות cistanche
