עקרונות אנטי דלקתיים ממחטי Pinus Taiwanensis Hayata ובסיליקו מחקרים על השפעות האנטי-אייג'ינג הפוטנציאליות שלהם

תַקצִיר:פינוסתה מחט פופולרי מאוד במדינות המזרח כמו יפן, רוסיה, קוריאה וסין. לתה מחט אורן נטען כי יש משמעותהשפעות אנטי אייג'ינג,אבל שום ראיה ברורה לא תמכה בכך עד עכשיו. במחקר הנוכחי, חמש עשרה תרכובות לא מתוארות (1–5), כמו גם שבעים ושתיים תרכובות ידועות, טוהרו ואופיינו מהחלק הביולוגי של תמציות מתנול שלP. taiwanensisמחטים.

מיטב מוצרי האנטי אייג'ינג עשבי תיבול Cistanche

רוב המבודדים נבדקו לגביהםפעילות ביולוגית אנטי דלקתיתלפי מודל נויטרופילים תאי ושש תרכובות (45, 47, 48, 49, 50, ו51) הציג אעיכוב משמעותי ביצירת אניון סופראוקסידושחרור אלסטאז עם ערכי IC50 הנעים בין 3.3± 0.9 עד 8.3± 0.8 µמ' אלהמרכיבים אנטי דלקתייםהועברו למחשוב עגינה כדי להעריך את זיקת הקישור שלהם לקולטן גרלין, שמילא תפקיד חשוב בוויסות חילוף החומרים, עםהשפעות אנטי אייג'ינג. תרכובות49, 50, ו51 יצר קומפלקס יציב עם קולטן הגרלין באמצעות קשרי מימן וסוגים שונים של אינטראקציות.

1. הקדמה

פינוסהסוג (Pinaceae), הכולל יותר מ-100 מינים ומופץ בעיקר בחצי הכדור הצפוני, הם בדרך כלל עצים ירוקי עד בעוד שחלקם שיחים [1]. עץ אורן קל ומשמש לרוב לרהיטים. עם זאת, השפעות פרמקולוגיות שונות של מחטים על ניצני אורן נרשמו בספרים העתיקים של הרפואה הסינית המסורתית. ב"קנון הצמחים של הבעל האלוהי", מחטי האורן קידמו צמיחת שיער, האריכו חיים והרוו את הצמא. ב"Taiping Shenghui Fang", תועד שניתן לבשל מחטי אורן עם אלכוהול ולהציג אפקט אנטי אייג'ינג. כיום, מחטי אורן מעובדות כתה והן פופולריות באסיה. בקוריאה, המרכיבים של הP. densifloraתה מחט כמו גם שלוביולוגיות נוגדות חמצון ואנטי בקטריאליות נחקרו בהרחבה [2,3]. מאז תחילת המאה שעברה, יותר משבע מאות תרכובות זוהו מהןמחטי פינוס. רוב הספרות המדווחת קשורה לשמן האתרי שלP. densiflflora[4,5], P. halepensis[6,7], פ' ניגרה[4,8], וP. sylvestris[4,9]. המרכיבים המאופיינים שלפינוסמחטים הן בעיקר בנזנואידים, דיטרפנואידים, פלבנואידים, ליגנאנים, מונוטרפנואידים וססקיטרפנואידים [10]. המחטים שלP. densifloraופ. מוריסוניקולהדווחו על פעילותם הביולוגית נוגדת החמצון [11–14]. בנוסף, תמצית אתיל אצטט של מחטים שלפ. מוריסוניקולהעיכב את ביטוי החלבון וה-mRNA של NO וiNOS במקרופאג RAW 264.7 המושרה על ידי LPS, המציג פעילות ביולוגית אנטי דלקתית משמעותית [13]. תמצית הנוזל העל-קריטי שלP. densifloraמחטים הציגו את ההשפעה המעכבת על ייצור NO המושרה על ידי LPS על ידי הורדת הביטוי שלiNOS, והפחתת הביטוי של IL-6 ו-IL-1 והפעלה של חלבוני STAT1 ו-STAT3 במקרופאגים המושרים על ידי LPS [15]. תמצית האתנול שלP. thunbergiiמחטים הראו השפעה אנטי דלקתית משמעותית במקרופאגים ודיכאו בצקת אוזניים הנגרמת על ידי חומצה ארכידונית ועיכבו פעילות אנזימטית של מיאלופרוקסידאז.16]. יתר על כן, התססהפ. מוריסוניקולהמחטים הראו את הפעילות הביולוגית המצוינת שלהם נוגדת חמצון ואנטי דלקתית על ידי אפנון NF-κמסלול איתות B [17]. 

גרלין הוא הורמון פפטיד המורכב מעשרים ושמונה חומצות אמינו והתגלה במקור בקיבה [18,19]. זהו ליגנד אנדוגני להפרשת הורמון הגדילה (GHSR), שהוא חבר ב- -ענף ב-GPCRs בכיתה A (רצפטורים מצמדים לחלבון G) [18,19]. גרלין הוא ההורמון הפפטידי היחיד שגורם לרעב לקדם תיאבון [20]. מחקרים רבים העלו שגרלין ממלא תפקיד חשוב בוויסות חילוף החומרים, מאזן האנרגיה, הזיכרון, תפקודי הלב וכלי הדם ותפקודי מערכת העיכול בגוף האדם.21–23]. גרלין מעורב גם במנגנונים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים שונים בגוף האדם כמו הזדקנות [24,25], וזה עשוי להיות קשור לפעילות אנטי דלקתית [26,27]. בשנת 2014 זוהו לראשונה בתה אולונג של צ'ין-שין על-ידי הקבוצה שלנו, הטטרה-גליקוזידים הייחודיים של הפלבונואידים האצילים, בשם Teaghrelins, והדגימו את פעילותם המעודדת בשחרור הורמון גדילה (GH) [28]. שתי תרכובות דומות אחרות טוהרו בתה אולונג של Shy-jih-chuen והפעילות הביולוגית שלהן על הקולטן לגרלין אומתה גם היא [29]. ארבעת הטגרלין גרמו לרעב דרך אותו מסלול רגולטורי כמו גרלין. לא רק תה, תרכובות בעלות מבנים דומים או ביולוגיות דומות ל-teaghrelins נחקרו גם בPolygonum multiflflorum(הס הוו) [30], גינקו בילובה[31], מורוס אלבה[32], וCistanche tubulosa [33]. תוצאות אלו תומכות בנו בחיפוש אחר עקרונות אנטי-אייג'ינג טבעיים על ידי בדיקת תרכובות דמויות גרלין תה בעלות השפעות אנטי דלקתיות. בנוסף לביצוע ישיר של הפעילות המקדמת בשחרור הורמון גדילה במודלים תאיים, מודל מולקולרי של כמה תרכובות פוטנציאליות יהיה יעיל יותר בבחינת מועמדים אפשריים [34]. שיטות חישוביות יושמו לפיתוח והערכה של השערות פרמקולוגיות. עגינה מולקולרית היא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר וצופה את הקונפורמציה והזיקה של קשירת ליגנד לכיס הפעיל בדיוק גבוה [35,36]. שיטות עגינה מחפשות ביעילות חללים בעלי ממדים גבוהים לאיתור אינטראקציה אפשרית ומשתמשות בפונקציית ניקוד המדרגת כראוי את המועמדים [37]. 

בשנת 2018 טוהרו שלוש תרכובות מהמחטים שלפ. מוריסוניקולהוהציג פעילות מרגיעה כלי דם משמעותית, ובין המרכיבים הללו, דווח על אחד עם מבנה דמוי גרלין תה [38]. בטיוואן,P. taiwanensisמחטים לרוב מיובשות ואפויות ולאחר מכן מעובדות כתה בשל הפעילות הביולוגית המפורסמת שלהן.P. taiwanensisHayata הוא אחד המינים המקומיים והאנדמיים בטייוואן. זה נקרא גם אורן אדום טייוואן, או אורן הואנגשאן. ישנן שתי מחטים בפסקל באורך 8-11 ס"מ ומעט נוקשה וישר, והוא צומח על פני כל האי מגובה נמוך לגבהים ולעתים קרובות יוצר יער טהור [39]. בבדיקה ראשונית, שכבת האתיל אצטט של תמציות מתנול שלP. taiwanensisמחטים הראו עיכוב משמעותי ביצירת אניונים של סופראוקסיד ושחרור אלסטאז עם IC50 ערכים של 0.8± {{0}}.2 ו-1.0± 0.1 µg/mL, בהתאמה (טבלה S1). לכן, במחקר הנוכחי, המרכיבים הביו-אקטיביים שלP. taiwanensisמחטים נחקרו והתרכובות המטוהרות הוערכו לגבי נוגדי הדלקת שלהן פעילות ביולוגית על מודל נויטרופילים תאי. בנוסף, המבודדים מP. taiwanensisמחטים עם פעילויות ביולוגיות אנטי דלקתיות היו נתונים למחשוב עגינה ונחקרו על האינטראקציה שלהם עם הקולטן לגרלין.

2. חומרים ושיטות

2.1. נהלי ניסוי כלליים

ספקטרום אולטרה סגול (UV) התקבלו על ידי Hitachi U-2001 UV/V הוא ספקטרומטר. הספקטרום אינפרא אדום (IR) נבדק עם ספקטרופוטומטר Jasco FT/IR-4100.1H-, 13C-, וספקטרום של תהודה מגנטית גרעינית דו-ממדית (NMR) תועדו ב-Bruker AV-400ספקטרומטר NMR. שינויים כימיים מוצגים בδ ערכים (ppm) עם tetramethylsilaneכתקן פנימי. הδH וδC הערכים היו עבור השינויים הכימיים של האותות,בהתאמה. ספקטרומטריית מסה יינון באלקטרוספריי ברזולוציה גבוהה (HR-ESI-MS) הייתהנערך עם ספקטרומטר JEOL JMS-700 (מופעל במצב יון שלילי).

2.2. חומר צמחי

המחטים שלP. taiwanensisנאספו בפולי, נאנטו, טייוואן וזוהומאת פרופ' שנג-יאנג וואנג (המחלקה ליערות, אוניברסיטת צ'ונג-הסינג הלאומית,טאיצ'ונג, טייוואן). דגימת השובר (PCKuo_2016003) הופקדה ב-herbarium של בית הספר לרוקחות, אוניברסיטת צ'נג קונג הלאומית, טיינן, טייוואן.

2.3. מיצוי ובידוד

2.4. נתונים ספקטרליים ופיזיים של 1-5

2.4.2. 1-[(70 R,80 S)-70 ,90 -דיהידרוקסי-70 -(4-הידרוקסי-3-מתוקסיפניל)פרופן-80 -ילוקסי]-2-חומצה הידרוקסיבנזואית (2)סירופ חסר צבע; [ ]25 D פלוס 5.3 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH)λמקסימום(עֵץε) 284 (3.59), 253 (3.80) ננומטר; ECD (c 3.51 × 10−4 M, MeOH)λמקסימום(∆ε) 248 ( פלוס 1.33 ), 224 ( פלוס 1.03 ),214( פלוס 1.10) ננומטר; IR (מסודר)νמקסימום3425, 2927, 1541, 1384, 1271 ס"מ−1;1יד13C NMR; HRESIMSm/z 349.0936 ([M − H]− חישוב עבור C17H17O8, 349.0923).

2.4.3. (13E,12R)-12-חומצה הידרוקסיאגתית (3)

אבקה חסרת צבע; mp: 263◦C (דצ.); [ ]25 D פלוס 30.8 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH)λמקסימום(עֵץε) 225 (ש) (3.83) ננומטר; IR (מסודר)νמקסימום3450, 2937, 1648, 1252 ס"מ−1;1H-NMR (CD3OD,400 מגה-הרץ) δ 0.63 (3H, s, CH3-20), 1.09 (1H, ddd,J = 13.6, 13.6, 3.6 הרץ, H-3a), 1.21 (3H, s, CH3-18), 1.21 (1H, m, H-1a), 1.42 (1H, m, H-5), 1.51 (1H, m, H-2a), 1.59 (2H, m, H-11),1.79 (1H, m, H-1b), 1.91 (1H, m, H-2b), 1.91 (1H, m, H-6a), 1.98 (1H, m, H-7a), 2.01 (1H, m,H-6b), 2.08 (3H, s, CH3-16), 2.12 (1H, m, H-9), 2.14 (1H, m, H-3b), 2.43 (1H, m, H-7b), 4.03 (1H, dd,J = 9.2, 2.8 הרץ, H-12), 4.53 (1H, s, H-17a), 4.91 (1H, s, H-17b), 5.88 (1H, br s, H-14);13C-NMR (CD3OD, 100 מגה-הרץ)δ 13.5 (CH3-20), 14.9 (CH3-16), 21.2 (C-2), 27.6 (C-6), 29.6 (CH3-18), 31.5 (C-11), 39.4 (C-3), 40.0 (C-7), 40.3 (C-1), 41.2 (C-10), 45.3 (C-4), 53.1 (C-9), 57.6 (C-5), 75.5 (C-12), 106.9 (C-17), 117.8 (C-14), 150.2 (C-8), 159.5 (C-13), 167.2 (C-15), 181.5 (ג-19); HRESIMSm/z 349.2024 ([M − H]− חישוב עבור C20H29O5, 349.2015).

2.4.4. 5-איזופרופיל-3-אוקסוציקלוהקס-1-אן-1-חומצה קרבוקסילית (4)

גביש טבלאי חסר צבע; mp: 235◦C (דצ.); [ ]25 D פלוס 28.6 (c 0.3, MeOH); UV (MeOH)λמקסימום(עֵץε) 237 (ש) (3.40) ננומטר; IR (מסודר)νמקסימום3456, 2925, 1635, 1395 ס"מ-1;1H-NMR (CD3OD,400 מגה-הרץ) 0.88 (3H, d,J = 6.8 הרץ, CH3-9), 0.98 (3H, d, J = 6.8 הרץ, CH3-10), 1.84 (1H, m, H-4a), 2.02 (1H, m, H-4b), 2.09 (1H, m, H-5), 2.31 (1H, hept,J = 6.8 הרץ, H-8), 2.50 (1H, dddd,J = 19.2, 9.2, 4.8, 2.4 הרץ, H-6a), 2.70 (1H, dddd,J = 19.2, 5.2, 5.2, 1.2 הרץ, H-6b), 6.32 (1H, dd,J = 2.4, 1.2 הרץ, H-2);13C-NMR (CD3OD, 100 מגה-הרץ)δ 19.0 (C-9), 20.9 (C-10), 24.3 (C-4), 27.0 (C-6), 27.1 (C-8), 53.7 (C-5), 128.7 (C-2), 160.6 (C-1), 174.8 (C-7), 205.7 (C-3); HRESIMSm/z 181.0855 ([M − H]− חישוב עבור C10H13O3, 181.0865).

2.4.5. חומצה סטירקסינולית (5)

סירופ חסר צבע; UV (MeOH)λמקסימום(עֵץε) 308 (2.89), 237 (ש) (3.37), 222 (ש) (3.70) ננומטר;IR (מסודר)νמקסימום3421, 2926, 1572, 1395, 1268 ס"מ-1;1H-NMR (CD3OD, 400 מגה-הרץ) 1.82 (2H, tt,J {{0}}.0, 6.8 הרץ, H-8), 2.61 (2H, t,J {{0}}.0 הרץ, H-7), 3.56 (2H, t,J = 6.8 הרץ, H-9), 3.83 (3H, s, OCH3-3), 6.86 (1H, d, J = 2.4 הרץ, H-4), 7.31 (1H, d,J = 2.4 הרץ, H-6);13C-NMR (CD3OD,100 מגה-הרץ)δ 32.7 (C-7), 35.6 (C-8), 56.6 (OCH3-3), 62.3 (C-9), 116.3 (C-4), 120.1 (C-1), 122.8 (C-6), 131.9 (C-5), 149.2 (C-3), 150.7 (C-2), 176.2 (C-10); HRESIMSm/z 225.0767 ([M − H]−חישוב עבור C11H13O5, 225.0763).

2.5. בדיקת ביואקטיביות אנטי דלקתית

2.5.1. הכנת נויטרופילים אנושיים

המחקר נערך באישור מועצת הביקורת המוסדית של בית החולים הזיכרון צ'אנג גונג (IRB מס' 201800369A3). דגימות דם נלקחו מתורמים אנושיים בריאים (בני 20 עד 30), ונויטרופילים בודדו וטיהרו על פי הפרוטוקולים שתוארו קודם לכן [40]. 

2.5.2. דור אניון סופראוקסיד

מדידה המבחן למדידת ייצור אניון סופראוקסיד התבסס על הפחתה הניתנת לעיכוב SOD של ferricytochromec כפי שתואר קודם [40].

2.5.3. מבחן שחרור אלסטאז

דה-גרנולציה של גרגירים אזרופיליים נקבעה על ידי מדידת שחרור האלסטאז כפי שתואר קודם לכן [40]. 

2.5.4. ניתוח סטטיסטי התוצאות מבוטאות כממוצע± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). חישוב של ריכוזים מעכבים של 50 אחוזים (IC50) בוצע באמצעות תוכנת PHARM/PCS v.4.2. נערכו השוואות סטטיסטיות בין קבוצות באמצעות הסטודנטיםt-מִבְחָן. ערכים שלp < 0.05 were considered to be statistically significant. 

2.6. מחקר עגינה מולקולרית

הבסיליקוההערכה נערכה על תוכנת AutoDock Vina [41]. המבנה הגבישי של קולטן הגרלין אופיין [42], ו- . קובץ PDB הורד מ-Protein Databank (PDB ID: 6KO5). המבנים התלת מימדיים של ליגנדים נבנו בתוכנית Chem3D. נערכו תוסף המימן, מדידת מטען של Gasteiger עבור אטומי חלבון, ובחירת פיתולים גמישים לליגנדים. על ידי AutodockTools (ADT גרסה 1.5.6). גודל הרשת תוכנן ב-18.5 Å× 18.5 Å × 18.5 Å ומרכז רשת בממדים (x, y ו-z, בהתאמה): 9.7, –19.2, 14.6 נקבע. אנרגיית הזיקה הקישורית סופקה כציוני עגינה והוצגה ב-kcal/mol. האינטראקציה הטובה ביותר נחשבה רק לתנוחה בעלת הניקוד הגבוה ביותר. ההדמיה של אינטראקציות העגינה הטובות ביותר נותחה בלקוח Biovia Discovery Studio 2020 [43].