אנטי אייג'ינג - פיגום מופעל על ידי גנים של Klotho מקדם תגובה מחודשת לריפוי פצעים בתאי גזע שמקורם בשומן אנושי

מילות מפתח:נוגד הזדקנות; -Klotho; פיגום מופעל על ידי גנים; תאי גזע שמקורם בשומן; אנגיוגנזה;תצהיר מטריצה;ריפוי מרענן

לחץ כאן כדי לקבל צמחי מרפא לאנטי אייג'ינג וריפוי פצעים

1. הקדמה

ריפוי פצעים הוא תהליך ביולוגי מורכב הדורש תזמור הדוק של אירועים תאיים מרובים [1]. עם זאת, באוכלוסייה המזדקנת, אירועים סלולריים מופרעים, מה שמוביל לעיכוב ריפוי [2]. ההפרעה במנגנוני הריפוי נובעת בחלקה עקב היעדר מופחת של תאי האב ממח העצם ומחלות מטבוליות אחרות כמו סוכרת [3,4]. בטיפול בפצעים, היישום של פיגומים ביולוגיים הופך נפוץ יותר כטיפול. פיגומים ביו-חומרייםלהגן על הפצע מזיהום, לספוג יציאות פצעים ולשמור על לחות הפצע כדי למנוע נמק רקמות [5]. ניתן להטעין תרופות טיפוליות גם בפיגומים ביולוגיים ולקדם ריפוי מהיר יותר בפצעים שקשה לרפא [1]. עם זאת, פיגומים ביולוגיים לבדם עשויים שלא לתזמר ביעילות את מפלי האיתות המרובים המתרחשים בתוך הפצע. מתן תאי גזע מוצע לעתים כפתרון למתן את אירועי האיתות המורכבים בפצע [6]. 

תאי גזע מפרישים גורמים פראקריניים ויכולים להתמיין לתאים בעלי שושלת רקמות מרובות [7]. תאי גזע מועברים בדרך כלל לתוך הפצע באמצעות זריקות תוך עוריות [6], ריסוס מקומי [8], או כשתלים מהונדסים רקמות [9]. בשנים האחרונות, היישום של שתלים מהונדסים רקמות לריפוי פצעים כרוני זכה בהדרגה להכרה רחבה יותר בגלל יכולתם לרפא פצעים במהירות.9–11]. אפליגרף® ו-Dermagraft® הם שניים מהמבנים הביו-הנדסיים המאושרים על ידי מינהל המזון והתרופות (FDA) בשימוש נרחב לטיפול בפצעים כרוניים [12,13]. עם זאת, יצירת השתלים הללו דורשת תרבית תאים ממושכת כדי לייצר מספר תאים גבוה [14]. בעת שימוש בתאי גזע, תרבית ממושכת יכולה להגביר את ההזדקנות התאית ולהפחית את הגזע של תאי הגזע [15,16]. לכן, שמירה על גזעיות תאי הגזע היא מרכזית להשגת התגובה הטיפולית האופטימלית. מסירת גנים טיפולית לתאי הגזע באמצעות וקטורים לא ויראליים היא אסטרטגיה פוטנציאלית לשיפור הפונקציונליות של תאי גזע [17]. באופן מסורתי, התאים עוברים transfected בתרביות 2 D ומושתלים מאוחר יותר in vivo [18]. עם זאת, פלטפורמות כמו הפיגומים המופעלים על ידי גנים, המורכבות מפיגומים ביולוגיים המתפקדים עם ננו-חלקיקים הנושאים את הטרנסגן הטיפולי [19], שהקבוצה שלנו הייתה חלוצה להציע פתרון חלופי להעברה של התאים בתוך 3-סביבת D. מחקר זה התמקד בפיתוח גרסה מופעלת גנים של פיגום 3D קולגן-כונדרואיטין סולפט (coll-CS) בעל פוטנציאל תרגום קליני אדיר, שכן הרכבו דומה לזה של תבנית התחדשות העור (DRT) של אינטגרה, תבנית מאושרת קלינית פיגום לריפוי פצעים כרוניים [20]. אנו משתמשים בעיקר בפולימר קטיוני בשם פוליאתילןאימין (PEI) כדי לעבות פלסמידים של DNA המקודדים לגנים של גורמי גדילה כגון הגורם הסטרומאלי-1 אלפא וגורם גדילת העצבים ומרכיבים אותם לננו-חלקיקים טעונים [21–23]. ננו-חלקיקים טעונים אלה מושרים לאחר מכן לתוך הפיגום coll-CS שלנו כדי ליצור את הפיגומים המופעלים על ידי גנים. מחקרים קודמים שלנו הראו גם שהפיגום המופעל על בסיס PEI יכול לגרום לביטוי יתר חולף של הטרנסגן הטיפולי במגוון של תאים מרפאים פצעים ולקדם את יכולות ההתחדשות שלהם [21,24,25]. באופן מסורתי, הפיגום המופעל על ידי גנים פותח כדי להתמקד בתאי מארח ולקדם תיקון מקומי [26]. עם זאת, עדויות מתעוררות מצביעות על כך שפיגומים מופעלי גנים עמוסי תאים נושאים עוצמה מעולה לחידוש מבני רקמה מורכבים מאשר פיגומים מופעלי גנים בלבד [27]. 

שפע סלולרי הוא אחת הדרישות המכריעות ליצירת שתלים מהונדסים רקמות [28]. רקמת השומן היא מקור עשיר שיכול לספק מספר רב של תאי גזע. רקמת השומן מכילה עד פי 500 מתאי גזע לאותה מסה של מח עצם, מקור רקמה מסורתי למיצוי תאי גזע [29]. יתרה מכך, ניתן להפיק את תאי הגזע מרקמת השומן באמצעות תהליך שאיבת שומן זעיר פולשני [29]. המחקר האחרון שלנו מצא שתאי גזע שמקורם בשומן אנושיים (ADSCs) מפגינים תאימות ביולוגית מצוינת עם פיגום coll-CS. שימוש בפיגום המופעל על ידי גנים פרו-אנגיוגני שיפר עוד יותר את התגובות התחדשותיות של ADSCs [30]. עם זאת, ה-ADSCs נוטים לאבד את הגזע שלהם עם התרחבות [31]. בעבר, מצאנו כי חלבון אנטי אייג'ינג -Klotho יכול לשפר באופן משמעותי את התפשטות ADSCs אנושיים בריאים וחולי סוכרת [32]. רוב המחקרים משתמשים בדרך כלל בגרסה העיקרית -קלוטו [33–35] והראו שהחלבון יכול להגדיל את תוחלת החיים של ADSCs על ידי הפעלת פעילות התעתוק של טלומראז [33]. - MSCs המביעים יתר על המידה של Klotho נמצאו גם כבעלי השפעות אנטי-פיברוטיות חזקות בפגיעה בכליות באמצעות עיכוב של Wnt/ איתות קטנין [36]. עם זאת, תפקידו של -Klotho בתאי גזע נותר בלתי נחקר יחסית.

מלבד ההבדל במיקוד המחקרי בין ה - ו -קלוטו, האנטי אייג'ינגחלבוני Klotho עדיין לא שולבו במלואם באסטרטגיות הנדסת רקמותלריפוי פצעים. לכן, במחקר זה, ביקשנו לחקור את ההשפעה התפקודית של א -פיגום מופעל על ידי גן Klotho על ADSCs אנושיים ליישומי ריפוי פצעים. אָנוּחקר לראשונה את פעילויות התעתיק של גורמי הפלוריפוטנציה הקלאסיים (אוק-4,Nanog, and Sox-2), סמן התפשטות (Ki-67), ומווסת ריפוי פצעים (TGF- 3 ו-TGF- 1) ב-ADSCs. לאחר מכן הערכנו את הפעילות הביולוגית של המדיה המותניתנוצר על ידי הפיגום המופעל בגנים עמוסי ADSCs כדי להעריך את הפוטנציאל הפרקריני שלו.בסופו של דבר, בדקנו את ההתחדשות של קרום הבסיס (פיברונקטין, למינין,וקולגן IV) וחלבונים הקשורים לצלקת ( -SMA ואלסטין) בעמוסי ADSCsפיגום מופעל על ידי גנים להערכת הבשלת רקמות מבוקרת.

2. תוצאות

2.1. -פיגום המופעל על ידי גנים של Klotho משפר באופן חולף את גבעול ה-ADSC האנושי ואת הגנים התומכים בתיקון

ניתוח ביטוי גנים הראה לראשונה שה-ADSCs על הפיגום המופעל על ידי גנים הביעו ביטוי יתר של -גן Klotho מעל פי 172-(p < 0.01) than the gene-free scaffold group on day 3 (Figure 1א). ממצא זה אישר את האינטראקציה היעילה של ADSCs עם הפיגום המופעל על ידי גנים. ניתוח של סמן התפשטות Ki-67 אישר עוד שה-ADSCs על הפיגום המופעל על ידי גנים שמרו על יכולת התפשטות חזקה לאורך 14 ימים (איור1א). לאחר שאישר את ביטוי היתר של האנטי אייג'ינג -גן Klotho, לאחר מכן הערכנו את ההתחדשות של תאי גזע באמצעות הפעלה של גורמי "פלוריפוטנטיות" ב-ADSCs. בסך הכל, ציינו ויסות חולף של כל שלושת גורמי התעתוק במהלך 14 הימים (איור1ב). עם זאת, ה-ADSCs הראו רק עלייה משמעותית בביטוי של הגן Oct-4 שנמשך עד יום 14. באופן ספציפי, ADSCs הראו פי 2.5-(p < 0.05) increase in the expression of the Oct-4 gene on day 3 before subsiding to 1.6-fold (p < 0.05) on day 14 relative to the gene-free scaffold group. The next set of genes we investigated were the transforming growth factors beta 1 and 3, which are crucial for regulating scarless wound healing (Figure 1ג). רמות ה-TGF הפרו-פיברוטי גן אחד ב- - ADSCs המביעים יתר על המידה של Klotho נמצאו בקנה אחד עם זה של קבוצת הפיגומים ללא גנים במהלך 14 הימים. עם זאת, הרמות של TGF אנטי פיברוטי- 3 היו באופן משמעותי (3.6-קפל,p < 0.05) elevated during the early days (day 3) and, as anticipated, subsided by about 0.4-fold by day 14, showing a controlled expression of the regulatory gene. 

2.2. -פיגום מופעל על ידי גן Klotho

משפר את העוצמה הפראקרינית של ADSCs אנושיים2.2.1. ביו-אקטיביות פרו-אנגיוגנית מבחן הפעילות הביולוגית של ה-CM שנוצר על ידי פיגום מופעל גנים עמוס ב-ADSC הראה לראשונה שהוא יכול לשלוט באופן זמני על הפעילות המטבולית ב-HUVECs. יום 3 CM הגביר באופן משמעותי את הפעילות המטבולית ב-HUVECs, בעוד שהשימוש ב-CM מיושן מהיום 14 הפחית באופן משמעותי את הפעילות המטבולית של HUVEC (איור2א). לאחר שצפינו בכך, בדקנו את ההשפעה הפרו-אנגיוגנית של ה-CM מיום 3 ו-14 על HUVECs שנזרעו על Matrigel. כצפוי, יום 3 CM מקבוצת הפיגום המופעל על ידי גנים באופן משמעותי (p < 0.05) enhanced HUVEC tubule formation capacity and their branching (Figure 2ב). עם זאת, לא התרחשה עלייה נוספת בפעילות האנגיוגנית ביום 14 CM בהשוואה לזו של יום 3 CM. כמו כן, היום 14 CM משתי הקבוצות הפגין יעילות פרו-אנגיוגנית דומה (איור2ג). ביחד, הממצא שלנו מצביע על כך שהפיגום המופעל על ידי גנים מזרז באופן חולף את התגובה הפרו-אנגיוגנית של ADSCs.

פרו-פיברוטי TGF- 1. ** ו-* מצייניםp < 0.01 and p < 0.05 respectively. Data represent mean ± סטיית תקן (n = 3).

איור 2. ביו-אקטיביות פרו-אנגיוגנית פאראקרינית של הפיגום המופעל על ידי ADSCs עמוס בגנים. (א) CM שהופק על ידי הפיגום המופעל בגנים עמוסי ADSC במהלך 14 הימים הוכיח יכולת לשלוט זמנית בפעילות המטבולית של HUVECs. (ב) יום 3 CM מקבוצת הפיגום המופעל על ידי גנים שיפר משמעותית את היווצרות צינוריות האנדותל והסתעפות שלה בהשוואה לזו של קבוצת הפיגום נטולת הגנים. (ג) היווצרות צינוריות והסתעפות של תאי אנדותל 6 שעות לאחר חשיפה ל- CM מה-ADSCs. פיגום מופעל על ידי זרע ונטול גנים, * מציין p < 0.05. נתונים מייצגים ממוצע! סטיית תקן (n=3)

2.2.2. ריפוי והבשלה של פיברובלסט דרמלי

אחד הממצאים ממחקר האנגיוגנזה הוא שככל שהפיגום המופעל על ידי ADSCs עמוס בגנים מתבגר, הוא כבר לא מקדם אנגיוגנזה. יתר על כן, ביום 14 העוצמה האנגיוגנית שלהם הייתה דומה לזו של קבוצת הפיגומים נטולת הגנים (איור 2B, C) לכן, חקרנו את ההשפעה של יום 14 CM בגילאי על סגירת פצעי פיברובלסט עורי. בדומה לתוצאות מחקר האנגיוגנזה, שתי הקבוצות הראו רמות דומות של סגירת פצע פיברובלסט עם יום 14 CM. באופן ספציפי, שתי הקבוצות ריפאו את הפצע בכ-40 אחוז תוך 12 שעות (איור 3A). ממצא זה חשף כי במהלך ההבשלה, קבוצת הפיגום המופעל על ידי גנים תומכת אך אינה מקדמת סגירת פצע פיברובלסט עורי.

עם זאת, כאשר הפיברובלסטים עוררו עם CM מיושן, בדקנו אם ההשפעות של הביטוי של חלבוני מטריקס המעורבים בהבשלת פצעים. כצפוי, פיברובלסטים עוריים מגורים עם CM מקבוצת הפיגומים נטולת הגנים ביטאו בשפע את חלבון הקולגן הפרו-פיברוטי I (איור 3B). להיפך, פיברובלסטים מגורים עם CM מקבוצת הפיגום המופעל על ידי גנים הדגימו ביטוי נמוך ב-50 אחוזים (p < 0.05) של חלבון הקולגן I. בינתיים, לשתי הקבוצות היה חסר ביטוי של קולגן אנטי פיברוטי, ולא נצפו הבדלים בין שתי הקבוצות. ביחד, זה מרמז שהפיגום המופעל על ידי גנים משפר את התגובה המווסתת של ADSCswound במהלך ההתבגרות.

איור 3. השפעה פאראקרינית על ריפוי עורי והתבגרות. (א) בגיל 14 CM משתי הקבוצות הפעילו רמות דומות של פעילות סגירת פצעים בפיברובלסטים עוריים בוגרים אנושיים בכ-40 אחוזים ב-12 שעות.(B) CM מהפיגום המופעל על ידי גנים הפחית משמעותית את הביטוי של קולגן פרו-פיברוטי בפיברובלסטים. " מציין p < 0.05 נתונים מייצגים סטיית תקן ממוצעת=(n=3). באיור 3B, GAS ו-GFS מייצגים פיגום מופעל על ידי גנים ופיגום ללא גנים בהתאמה

2.3. B-Klotho פיגום מופעל על ידי גנים משפר את התחדשות ממברנות המרתף עם תגובה אנטי פיברוטית משופרת ב-ADSCs אנושיים

לאחר שצפינו בגירוי מבוקר של הפיגום המופעל על ידי גנים של הפונקציונליות של ADSCs, בסופו של דבר חקרנו את תגובת ה-ADSCs לכיוון התחדשות של מטריצות עוריות וחלבונים. הפיגום המופעל על ידי גנים שיפר בצורה חזקה את התחדשות הממברנה הבסיסית של ADSCs. באופן ספציפי, הפיגום המופעל על ידי גנים קידם באופן משמעותי את התצהיר של רכיבי קרום בסיס למינין וקולגן IVFigure 4A). לאחר הניתוח הכמותי למחצה, ציינו גם שתצהיר המטריצה ​​עקב אחר מגמה ביחס לקבוצת הפיגומים חסרי הגנים. המגמה כפי שנצפתה wasfibronectin (1.0-fold) < laminin (2.1-fold, p < {{10}}.05) < collagen IV (קיפול 8.8-, p < 0.01). לאחר שנקבעה היכולת לשקם את קרום הבסיס, הערכנו את הביטוי של חלבונים החיוניים לריפוי איכותי מעולה, כגון הפחתת צלקות. ה-ADSCs על הפיגום המופעל על ידי גנים הדגימו ביטוי מופחת באופן משמעותי (p<0.05) של החלבון המתכווץ a-SMA הקשור לצלקת. הביטוי a-SMA ב-ADSCs היה נמוך ב-50 אחוזים ביחס לקבוצת הפיגומים נטולת הגנים (איור 4B). לבסוף, לאחר שצפינו בביטוי המופחת של a-SMA, הערכנו את הביטוי של חלבון המטריצה ​​האלסטית אלסטין. ה-ADSCs על הפיגום המופעל על ידי גנים הדגימו ביטוי אלסטין איכותי מעולה יחסית באמצעות שקיעת רשת סיבית בוגרת של אלסטין בהשוואה ל-ADSCs על הפיגום נטול הגנים (איור 4B).

איור 4. שקיעה של חלבוני מטריקס לריפוי פצעים על ידי ה-ADSCs בפיגום המופעל על ידי גנים ביום 14. (א) ה-ADSCs בפיגום המופעל על ידי גנים הדגימו ריגן משמעותי. פעולה של קרום הבסיס בהשוואה ל-ADSCs בפיגום נטול הגנים. ה-ADSCs הפקידו בעיקר רשת בוגרת יחסית של חלבוני קולגן IV, ואחריהם למינין ופיברונקטין.(ב) ה-ADSCs בפיגום המופעל על ידי גנים ביטאו גם פי 2- נמוך יותר של חלבון SMA בהשוואה ל-ADSCs בגן -פיגום חינם. בשיתוף עם מ.מ. התחדשות הלמית, ה-ADSCs בפיגום המופעל על ידי גנים הפקידו מטריצה ​​אלסטית טובה יותר מבחינה איכותית. כל התמונות נלכדו דרך אובייקטיבי 0x באמצעות מיקרוסקופ IX73 Olympus* ו-* מציין p < 0.01 ו-p < 0.05 בהתאמה. סרגל קנה מידה 50um. הנתונים מייצגים סטיית תקן ממוצעת (n=3).-SMA ופיברונקטין הוצבעו כפול אימוני.

דוא"ל:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp פלוס 86 15292862950