השפעות אנטי אייג'ינג של אנתוציאנינים של ריבס מייירי על תאי גזע עצביים ועכברים מזדקנים חלק 2

אנא צרו קשרoscar.xiao@wecistanche.comלקבלת מידע נוסף

Nar מציל פנוטיפים סנסנטיים של 23M-NSCs

אנתוציאנינים של R. Meyer עשירים בסוגים רבים של פלבנואידים ורכיבים ביו-אקטיביים [1,3-5]. כדי לקבוע איזה מרכיב של אנתוציאנינים של R. Meyer ממלא תפקיד חשוב באנטי-אייג'ינג, ביצענו ניתוח מטבולי של אנתוציאנינים של R. Meyer. גילינו כי ייתכן שנאר הוא מטבוליט פלבונואידי חשוב מכיוון שהמסלול הביוסינטטי של הפלבונואידים הועשר מאוד באנתוציאנינים של ר' מאייר (טבלה משלימה 1). כדי לקבוע את ההשפעות האנטי-סנסנטיות של Nar, ריכוזים שונים (0, 1.7,3.4,6.8,13.6 ו-27.2 מיקרוגרם/מ"ל) יושמו על מבחני 23M-NSCs ו-CCK-8 כדי לחקור את כדאיות התא. כפי שמראה איור משלים 3,6.8 מיקרוגרם/מ"ל טיפול בנאר הגדיל את הכדאיות של התאים ב-150%. כדי להמשיך ולחקור את ההשפעות האנטי-סנסנטיות של נאר, טופלו 23M-NSCs ב-Nar, ולאחר מכן זוהו אינדיקטורים הקשורים להזדקנות.שימושים בהספרידיןב-23M-NSCs שטופלו ב-6.8 מיקרוגרם/מ"ל נאר, ביטוי ה-mRNA p16nk4a הופחת (איור 3A). נאר גם האריך את הטלומרים של mNSCs מתורבתים ואת סינתזת הדנ"א המוגברת (איור 3B,3C). כדי להמשיך ולחקור את ההשפעות של Nar על התפשטות התאים, ביצענו צביעה אימונופלואורסצנטית של Ki67, שהוא אנטיגן גרעיני של תאים מיטוטיים המתבטא לאורך כל מחזור התא, למעט ב-G0 [19,27]. הטיפול ב-Nar שיפר את התפשטות התאים, כפי שנמדד על-ידי מספר גדל והולך של תאים חיוביים ל-Ki67 (איור 3D, 3E). לאחר מכן, זיהינו גם את פוטנציאל ההבחנה של NSCs לנוירונים. ואכן, טיפול ב-6.8ug/mL Nar גם הגדיל את מספר התאים החיוביים ל-MAP2 (איור 3F,3G). תוצאות אלה מראות באופן עקבי כי Nar יכול להפוך את הסנסנציה של 23M-NSC.

איור 2. אנתוציאנינים של ריבס מאייר משפרים את זיכרון העכברים ואת יכולות הלמידה שלהם על ידי הגדלת תאי גזע עצביים (NSCs). (א) לוקח זמן למצוא את הפלטפורמה. (ב) לוקח זמן להגיע תחילה לפלטפורמה. (C) מהירות ממוצעת למציאת הפלטפורמה. (ד) המרחק שחה לפני שמצא את הרציף. (ה. פ) טיפול עם R.האימפריה האבודה ציסטנצ'הכל אנתוציאנין הגדיל את מספר וגודל הנוירוספרה בהשוואה לבקרות. (G) נוירוספרות בגודל 50-100 אום הוגדלו במספרן על ידי טיפול באנתוציאנין של R. Meyer בעכברים. הנתונים מוצגים כממוצע ±SD של שלושה ניסויים בלתי תלויים. *פ<><0.01, and=""><0.0001 compared="" with="" untreated="" cells."n"="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" in="" each="" experimental="">

איור 3. השפעת נרינגנין(Nar) על סנסנציה של תאי גזע עצביים של עכברים (MNCs). (A) ביטוי mRNA p16k4a נמדד על ידי qRT-PCR ב-23M-NSCs עם וללא טיפול ב-6.8 ug/mL Nar במשך 48 שעות( B) התפלגויות פאזה של מחזור תאים של 23M-NSCs שטופלו ב-Nar במשך 48 שעות ותאי בקרה. (C) אורך הטלומרים היחסי של 23M-NSCs גדל באופן משמעותי עם טיפול בנר, (D)צביעת אימונופלואורסצנציה Ki67 של שרירים שטופלו ב-Nar במשך 48 שעות, עם תיוג גרעיני DAPI, (E) כימות של (D),(F)שדות מייצגים של MAP2 ו-GFAPimmunofluorescence מכתימים של mNSCs מתורבתים לאחר בקרה וטיפול ב-Nar. (ז) כימות של (ו). הנתונים מוצגים כממוצע± SD של שלושה ניסויים בלתי תלויים. *פ<>< 0.01,="" and="">< 0.0001="" compared="" with="" untreated="">

אנא לחץ כאן כדי לדעת עוד

Nar משפר את הזיכרון והקוגניציה בעכברים מזדקנים

הרמות הקוגניטיביות יורדות עם ההזדקנות, וטיפולי אנטי-אייג'ינג יכולים לשפר את הרמות הקוגניטיביות [11, 28]. כדי לאמת את ההשפעות האנטי-אייג'ינגיות של Nar in Vivo, הזרקנו 20 מ"ג/ק"ג Nar לעכברים מזדקנים C57BL/6 (בני 12 חודשים) דרך וריד הזנב. מבחן MWM שימש לבחינת הזיכרון המרחבי והיכולות הקוגניטיביות של העכברים.פלבונואיד מטוהר מיקרוניזציה חלק 1000 מ"ג שימושיםבמשך 5 ימים של אימונים חוזרים ונשנים, הזמן שנדרש לעכברים מזדקנים שטופלו בנר כדי למצוא את הפלטפורמה פחת בהדרגה בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 4A). תוצאות הבדיקה גילו שהזמן שלקח להגיע לראשונה לפלטפורמה צומצם (איור 4B), בעוד שהזמן שהוקדש לאזור הרציף הוגדל (איור 4C). יתר על כן, עכברים מזדקנים שטופלו בנר נצפו באזור הפלטפורמה בתדירות גבוהה יותר מזו של קבוצת הביקורת (איור 4D). יחד, התוצאות האלה מצביעות על כך שנאר יכול לשפר את הזיכרון המרחבי ואת היכולות הקוגניטיביות בעכברים מזדקנים.

ניתוח ריצוף RNA של דם שטופל בנר מעכברים מזדקנים

כדי לחקור את מנגנוני האנטי-אייג'ינג הספציפיים לנאר, ניתחנו את פרופיל ביטוי הגנים של דם שטופל בנר מעכברים מזדקנים באמצעות ריצוף RNA (RNA-seq). התוצאות חשפו 1,961 גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי (DEGs). באופן כללי, Nar הפחית את ביטוי הגנים, ורק מספר קטן של גנים היו מווסתים כלפי מעלה בהשוואה לקבוצת הביקורת שלא טופלה (איור 5A, 5B). בנוסף, גנים חשובים של מסלולי איתות הקשורים להזדקנות היו מווסתים כלפי מטה, במיוחד אלה שנמצאים במסלול האיתות TNF (איור 5C).oteflavonoidתוצאות אלה מרמזות על כך שנאר משפיע על מסלול האיתות של TNF, ובכך משפיע באופן עמוק על תפקודו של TNF-a, המעורב בפגיעה קוגניטיבית הקשורה להזדקנות [29,30]. לכן בחנו את רמות ה-TNF-α בפלזמה של עכברים. תוצאות מבדיקות d immunosorbent (ELISA) הקשורות לאנזים

תרשים 4. נרינגנין (Nar) משפר את יכולות הזיכרון והלמידה בעכברים מזדקנים. (א) חביון הבריחה של עכברים מזדקנים שטופלו בנר היה קצר יותר בהשוואה לקבוצת הביקורת. (B) הזמן שלקח להגיע לראשונה לרציף היה קצר יותר בעכברים מזדקנים שטופלו בנאר מאשר בקבוצת הביקורת. (C) משך הזמן המושקע באזור הרציף. (D) תדירות הצפייה באזור הפלטפורמה של עכברים מזדקנים שטופלו בנר בהשוואה לקבוצת הביקורת. הנתונים מוצגים כממוצע ±SD של שלושה ניסויים בלתי תלויים.*P<>< 0.01,=""><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group.“n”="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" used="" for="" each="" experimental="" group.="" revealed="" that="" nar="" treatment="" led="" to="" the="" downregulation="" of="" plasma="" tnf-a="" levels="" (figure="" 5d).="" we="" also="" examined="" pl6ink4agene="" expression="" in="" the="" hippocampus="" of="" mice="" and="" demonstrated="" that="" nar="" treatment="" downregulates="" pl6ink4amrna="" expression(figure="">

ציסטנצ'ה יכול אנטי אייג'ינג

דיון

הזדקנות קשורה לסיכון מוגבר לירידה קוגניטיבית, כמו גם לאובדן יכולת למידה וזיכרון [22,23]. אובדן עצבי ופגיעה בנוירוגנזה קשורים קשר הדוק לתפקוד לקוי של המוח הקשור לגיל [11-13]. לפיכך, הגדלת מספר הנוירונים ושיפור הנוירוגנזה הם חיוניים לטיפול אנטי-אייג'ינג. לר' מאייר, צמח עשיר בפלבנואידים ובחומרים ביו-אקטיביים אחרים [1, 3-6], יש תפקידים רבים שטרם תוארו. במחקר הנוכחי, ר 'מאייר אנתוציאנינים קידמו את התפשטות NSC והגבירו את היווצרותן של נוירוספרות עם מורפולוגיה אחידה. הטיפול באנתוציאנין של R. Meyer שיפר גם את הפנוטיפ של ההזדקנות התאית, עם רמות מופחתות של ROS וביטוי גנים P16nk4 הקשורים להזדקנות, שלב סינתזה מוגבר של DNA וטלומרים מוארכים.פוריטנים ויטמין Cיתר על כן, תוצאות צביעת אימונופלואורסצנציה גילו כי אנתוציאנינים של R Meyer עוררו את היווצרותם של נוירונים. תוצאות אלה מצביעות על כך שלאנתוציאנינים של R. Meyer יש השפעות אנטי-אייג'ינג על mNSCs, והן עשויות גם לקדם באופן ישיר את היווצרותם של נוירונים במבחנה. יתר על כן, ירידה קוגניטיבית קשורה קשר הדוק להזדקנות [22, 23]. תוצאות ה-MWM שלנו הראו כי מתן תוך-קיבה של אנתוציאנינים מסוג R. Meyer שיפר את הזיכרון המרחבי ואת יכולות הלמידה בעכברים מזדקנים, וגם הגביר את יכולת הזיכרון המרחבי ואת יכולות הלמידה בעכברים מזדקנים, וגם הגביר את הזיכרון המרחבי ואת יכולות הלמידה בעכברים מזדקנים, וגם הגדיל את העלייה

איור 5. גורם נמק הגידול (TNF)-a ממלא תפקיד חיוני בהשפעות אנטי-אייג'ינג בתיווך נרינגנין (Nar). (A) סיכום ביטויי גנים בדם עכברים, כפי שנקבע על ידי RNA-seq. (ב) מפת חום המציגה גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי (DEGs) בדם בין שליטה לעכברים שטופלו בנר. DEGs זוהו על ידי שינוי קיפול של >2.0 או<0.5. (c)bar="" graph="" showing="" the="" major="" correlated="" signaling="" pathways.="" (d)="" heatmap="" showing="" degs="" in="" the="" tnf="" signaling="" pathway="" (e)="" plasma="" tnf-a="" levels="" determined="" by="" enzyme-linked="" immunosorbent="" assay.="" (e)="" p16hka="" gene="" expression="" levels,="" as="" determined="" by="" qrt-pcr.="" data="" are="" presented="" as="" the="" mean="" ±="" sd="" of="" three="" independent=""><><><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group.="" nsc="" and="" neuronal="" numbers="" in="" the="" hippocampus="" of="" aging="" mice.="" these="" results="" suggest="" that="" r.="" meyer="" anthocyanins="" may="" enhance="" cognitive="" function="" by="" increasing="" nsc="" proliferation="" and="">

השימוש באנליזה מטבולית כדי לחקור את ההרכב הספציפי של אנתוציאנינים של R. Meyer גילה כי Nar עשוי להיות מטבוליט פלבונואידי חשוב. בעבר דווח כי נאר מצמצם את הסנסנציה של תאי שריר הלב [31], משפר את היכולת המטבולית של מערכת העיכול [32], ומפעיל השפעות אנטי-דלקתיות [33] ואנטי-סרטניות [34]. עם זאת, ההשפעות של Nar על NSCs במהלך ההזדקנות עדיין אינן ידועות. כדי לחקור את ההשפעות האנטי-אייג'ינגיות של אנתוציאנינים של ר' מאייר, ערכנו מחקרים נוספים באמצעות Nar. טיפול ב-6.8 ug/mL Nar הגביר את הכדאיות של התאים, הפחית את ביטוי הגנים P16ink4a, האריך את הטלומרים וקידם התמיינות NSC לנוירונים במבחנה. כדי להעריך עוד יותר את ההשפעות של Nar על התפשטות תאים, ביצענו מחקרי אימונופלואורסצנציה. התוצאות הצביעו על כך שטיפול בנר הגדיל הן את מספר התאים החיוביים ל-Ki67 והן את שיעור התאים החיוביים ל-MAP2, מה שמרמז על כך ש-Nar עשוי לקדם נוירוגנזה. יתר על כן, ההשפעות של Nar על למידה וזיכרון הוערכו גם בעכברים מזדקנים. תוצאות הבדיקה של MWM הראו באופן עקבי שטיפול בנאר משפר את ההשתוללות המרחבית בעכברים מזדקנים. באופן מעניין, ניתוח RNA-seq גילה כי Nar עשוי להשפיע על הסנסנציה דרך מסלול האיתות TNF, במיוחד על ידי הפחתת ויסות ביטוי TNF-a בדמם של עכברים מזדקנים. מבחני ELISA הצביעו גם על כך שטיפול בנר הפחית את רמות ה-TNF-a בפלזמה בהשוואה לעכברים מזדקנים בבקרה. TNF-a הוא גורם מפתח במסלול האיתות TNF והוא קשור קשר הדוק להזדקנות קוגניטיבית. תפקידיו כוללים קידום של שינויים פתולוגיים בסינפסות בהיפוקמפוס [29] ועיכוב התפשטות התאים המבשרים [35]. רמות TNF משתנות קשורות לפגיעה קוגניטיבית בדיכאון, סכיזופרניה, הפרעה דו קוטבית ומחלת אלצהיימר [30,36,37]. ליתר דיוק, TNF-a מווסתת בחולים עם מחלת אלצהיימר [38].

לסיכום, המחקר שלנו מדגים כי אנתוציאנינים של R. Meyer משפרים את השפעות ההזדקנות ב- NSCs באמצעות Nar, מה שמנמיך את רמות TNF-a in vivo ומשפר את הקוגניציה בעכברים מזדקנים. באופן קולקטיבי, הממצאים שלנו מספקים אסטרטגיה חדשנית לפיתוח טיפולים קליניים, שמטרתה מימוש גדול יותר של הערך הרפואי של אנתוציאנינים של R.Meyer.

חומרים ושיטות

חיות ניסוי

מחקר זה אושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת טונג'י ונערך בהתאם להנחיות המוסדיות. אנתוציאנינים של R. Meyer נוהלו באופן תוך-קיבה במשך חודשיים עד 12 חודשים של עכברים שהוחזקו על רקע C57BL/6. נאר הוזרק לווריד הקאודלי לעכברים בני חודש עד 12 חודשים שנשמרו על רקע C57BL/6. עכברי בקרה קיבלו את אותו נפח של מלח בעל מאגר פוספט (PBS).

הכנת אנתוציאנינים של ר' מאיר ונר

פרי R. Meyer(500 גרם) עבר הומוגניזציה באמצעות הומוגנייזר רקמה ותלוי ב-1 L מתנול המכיל 0.1% hvdrochloric acid. מיצוי קולי בוצע שלוש פעמים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. התמציות שולבו, והמתנול התרכז תחת לחץ מופחת כדי להשיג תמציות של R מאייר. התמצית טוהרה עוד יותר עם שרף מאקרו-נקבובי AB-8 כדי להגדיל את תכולת האנתוציאנין.

נרינגנין(C15H1205; MW:272.25; טוהר: ≥98%; HPLC כיתה) נרכשה מ צ'נגדו Push Biotechnology ושות' בע"מ (סצ'ואן, סין) ומאוחסנת ב 2°C-8°C בסביבה יבשה ללא אור. ריכוז תמיסת המניות היה 100 mM בדימתיל סולפוקסיד (DMSO). ריכוז ה-DMSO הסופי לא עלה על 0.1% במדיום התרבות.

מבחני נוירוספרה והבחנה

NSCs נגזרו מהעכבר SVZ. עכברים הוקרבו לאחר ההרדמה וה-SVZ נותח בקפידה והתפרק לתאים בודדים עם 0.4 U/mL papain (אימוג'ן, אלכסנדריה, וירג'יניה, ארה"ב; מספר חתול: LS003126). NSCs היו מצופים ב 10 ס"מ כלים המכילים 10 מ"ל NSC בזלת מדיום עם 10 ng / mL EGF (PeproTech, Cranbury, ניו ג'רזי, ארה"ב; מספר חתול:AF-100-15) ו-10 ng/mL FGF (PeproTech, Cranbury, NJ, ארה"ב; מספר חתול:AF-100-18B). נוירוספרות עברו כל 5 ימים. NSCs מנוירוספרות מעבר 2 מנותקות טריות נזרעו על למינין (Gibco, Gaithersburg, MD, ארה"ב; חתול מספר:23017015)ופולי-L-אורניתין הידרוברומיד (פולי-L; סיגמא אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב; מספר חתול: P3655)-שקופיות זכוכית מצופות ב- NSCBasalMedium ללא תוספי הבחנה. תאים מתמיינים היו מוכתמים במערכת החיסון של Tu1 (בטא-טובולין II; תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'ם, מסצ'וסטס, ארה"ב; מספר חתול:480011), MAP2 (תרמו פישר סיינטיפיק, מס' חתול: MA5-12826), וחלבון חומצי פרפור גליאלי (GFAP; תרמו פישר סיינטיפיק, חתול מס' PA5-16291), ולאחר מכן נגדי עם 4'6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI; תרמו פישר מדעי, מס' חתול: D1306). השקופיות נבדקו באמצעות מיקרוסקופ אולימפוס BX53 (אולימפוס, מדיסון, ויסקונסין, ארה"ב). הכימות של תאים חיוביים TuJ1 ו-MAP2 בוצע על ידי ספירת תאים מסומנים משלושה ניסויים בלתי תלויים. הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t לא מזווג.

מאמר זה מופק מתוך www.aging-us.com AGING 2020, כרך 12, מס '17