שינויים בתרגום חלבונים ובתהליכים קטבוליים של חומצה קרבוקסילית במחלת כליות סוכרתית

מילות מפתח:חתימת ביטוי גנים; רצף RNA גרעיני יחיד;מטבולומיקה; פרופיל ריבוזומלי

עשבי תיבול חדשים עבורכליה סוכרתית

1. הקדמה

סוכרת (DM) משפיעה על למעלה מ-400 מיליון אנשים ברחבי העולם [1] ולמעלה מ-30 מיליון בארה"ב [2]. מחלת כליות סוכרתית (DKD) היא אחד הסיבוכים החמורים ביותר של DM, המשפיעה על 19 מיליון אנשים בארצות הברית [3], והיא הגורם העיקרי למחלת כליות סופנית(ESKD) [4]. DKD נתפסת באופן קלאסי כמחלה גלומרולרית; עם זאת, התמקדות אך ורק בפתולוגיה גלומרולרית כאתר הפציעה העיקרי מתעלמת משינויים ביולוגיים מרכזיים בתא הבין-בין-צינורי התורמים לפתופיזיולוגיה של DKD [5]. ואכן, הפרוגנוזה וההתקדמות של DKD לעיתים קרובות במקביל לאטרופיה צינורית והיקף המחלה הבין-סטילית [6,7]. רלוונטית נוספת לנקודה זו היא עדות לכך שהכוונה לאבובית הפרוקסימלית עם מעכבי SGLT2 מאט את התקדמות DKD [8].

המנגנונים הסלולריים המובילים להתפתחות ולהתקדמות של DKD הם אמנם מורכבים. הסביבה הסוכרתית מתאפיינת בהפרעות מטבוליות, דלקת, מתח חמצוני ושינויים בהומאוסטזיס חלבוני. כל ההפרעות הללו תורמים ללחץ בתאים ולהתפתחות DKD. ישנן עדויות הולכות וגדלות לכך שתרגום שונה, השלב הבסיסי בביטוי גנים שיוצר חלבונים פונקציונליים, חשוב הן בתגובה והן בתרומה ללחץ בתאים [9,10]. שינויים בתרגום תורמים לחוסר איזון בהומאוסטזיס של חלבון ומשפיעים על בריאות האדם ומחלות [11-14].

חקירה של דגימות ביופסיה של כליות אנושיות משתמשת באופן שגרתי במיקרוסקופ אור, מיקרוסקופ אלקטרוני שידור ופעולות חיסוניות כדי לאפשר לפתולוג לתת אבחנה ופרוגנוזה. עם זאת, לכלי אבחון אלו יש מגבלות בחשיפת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס מחלת כליות כולל DKD. כתוצאה מכך, מודלים של בעלי חיים של DM שימשו באופן היסטורי לחקר המנגנונים הפתופיזיולוגיים של DKD; עם זאת, אף אחד מהמודלים הללו לא מדמה כראוי DKD אנושי [15]. למרות שהמאמצים האחרונים ליישם טכניקות חקירה מולקולריות מתקדמות יותר על דגימות ביופסיה של כליה אנושית מעודדים [16], אנו מאמינים ששימוש במודלים של בעלי חיים במקביל לרקמת כליה אנושית נותרה גישה ניסיונית חשובה לספק תובנות ייחודיות לגבי היסודות המולקולריים של DKD.

ביקשנו לבחון את חתימת הביטוי הדיפרנציאלי של DKD אנושי ב- glomerulus ו-proximal tubule. שיערנו שהחתימה התעתיק הצינורי הפרוקסימלי, בנוסף לזו של הגלומרולוס, קובעת גם את תוצאות ה-DKD. התייחסנו להשערה זו על ידי חקירת דגימות ביופסיה של כליה אנושית עם מיקרודיסקציה בלייזר של אזורים צינוריים גלומרולריים ופרוקסימליים כדי לזהות מסלולים הקשורים ל-DKD ולהתקדמותו. לאחר מכן, מסלולי מפתח אושרו במודל עכבר סוכרתי באמצעות גישה רב-מודאלית של רצף RNA גרעיני בודד (RNA-Seq), פרופיל פוליריבוזום ומטבולומיקה. בנוסף להפרעות בתרגום חלבונים, הממצאים שלנו תומכים בתפקיד הפוטנציאלי של חילוף החומרים של חומצה קרבוקסילית כגורם מפתח בהתקדמות מחלת כליות סוכרתית.

2. חומרים ושיטות

2.1. סובייקטים אנושיים

מחקר זה אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אינדיאנה (IRB מס' 190657223). עשרים ושבע דגימות כליה התקבלו מקונסורציום פרויקט רפואת הדיוק של הכליות ומקוהורט הביופסיה של אינדיאנה [17]. ביופסיות כליה היו ביופסיות אינדיקציה לפרוטאוריה או לירידה בתפקוד הכליות בנבדקים עם סוכרת. 18 דגימות נרכשו ממבוגרים עם מחלת כליות סוכרתית וללא נגע גלומרולרי שני. תשע דגימות ייחוס ללא עדות היסטולוגית ל-DKD נרכשו מפרנכימה לא נאופלסטית של דגימות כריתת כליה או תורמים שנפטרו. משתנים קליניים והיסטופתולוגיים חולצו מתיק הבריאות האלקטרוני. קצב הסינון הגלומרולרי המוערך (eGFR) הוגדר כערך הקרוב ביותר למועד הביופסיה, אלא אם כן ירידה של 20% או יותר בהפניה לביופסיה של eGFR. בתרחיש זה, eGFR בתוך שנה אחת לפני הביופסיה ולפני הירידה של 20% נקבע כקו הבסיס לחישובי התקדמות.

2.2. מיקרודיסקציה בלייזר של רקמת כליה אנושית וריצוף RNA

חתכים קריוסקים בעובי 12 מיקרומטר נחתכו מגושי רקמה קפואים שנשמרו במדיום אופטימלי של טמפרטורת חיתוך, מוצמדים לשקופיות ממברנת פוליפנילן גופרתי (PPS), ועובדו באמצעות פרוטוקול Rapid Stain כפי שתואר קודם [18,19]. שטח מינימלי של 500,000 µm2 נותח עבור תאים צינוריים גלומרולריים ופרוקסימליים באמצעות לייזר UV דופק על Leica LMD6500 ואובייקטיבי 20×. רקמה מנותחת נאספה בשפופרת סטרילית נטולת RNAse המכילה RNA Extraction Buffer ו-RNA בודד לפי הוראות היצרן (Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit, ThermoFisher, Waltham, MA, ארה"ב). איכות ה-RNA נקבעה באמצעות Agilent 2100 Bioanalyzer.

ריצוף בוצע במרכז האוניברסיטאי של אינדיאנה לליבה לגנומיקה רפואית. RNA Ribosomal היה מדולדל באמצעות פרוטוקול RiboGone-Mammalian Kit (Cat #634847, Takara Bio USA, Mountain View, CA, ארה"ב). פרוטוקול SMARTer Universal Low Input RNA Kit v2 (Cat #634938, Takara Bio USA, Mountain View, CA, ארה"ב) שימש עבור סינתזת cDNA ובניית ספרייה. ריצוף בוצע עם תצורת קצה זוגי של 2 × 75 bp ב-Illumina HiSeq 4000 באמצעות ערכת HiSeq 3000/4000 PE SBS, והנתונים הרצפים מופו לגנום hg38 באמצעות STAR. קריאות רצף ממופות באופן ייחודי הוקצו לגנים של גנום הייחוס hg38 באמצעות Rsubread featureCounts [20,21].

2.3. אישורי מחקר בבעלי חיים

2.4. בידוד של רקמת כליות עכבר ורצף RNA בתפזורת

הכליות הוקפאו במהירות ו-RNA חולץ באמצעות ערכת QIAGEN RNeasy Plus Midi עם עמודה להסרת DNA גנומי. איכות ה-RNA נקבעה באמצעות Agilent 2100 Bioanalyzer. ערכת הכנה לספריית mRNA של Illumina TruSeq Stranded שימשה לבניית ספרייה. ריצוף בוצע עם תצורת קצה מזווג של 2 × 75 bp על Illumina HiSeq 4000 באמצעות ערכת HiSeq 3000/4000 PE SBS, והנתונים הרצפים מופו לגנום mm10 באמצעות STAR. קריאות רצף ממופות באופן ייחודי הוקצו לגנים של הגנום הייחוס mm10 באמצעות ספירת תכונות Rsubread.

2.5. בידוד של רקמת כליה של עכבר ורצף RNA חד-גרעיני