אלגינט אוליגוסכריד מקל על הזדקנות לב הנגרמת על ידי D-גלקטוז באמצעות ויסות תפקוד המיטוכונדריה של שריר הלב ושלמות בעכברים

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

תַקצִיר

הזדקנות היא גורם סיכון מכריע להתפתחות מחלות לב וכלי דם הקשורות לגיל. לכן, יש לחקור לעומק את המנגנונים המולקולריים של ההזדקנות והתערבויות אנטי-אייג'ינג חדשות. אוליגוסכריד אלגינט (AOS) הוא בעל פעילות פרמקולוגית גבוהה והשפעות מועילות. המחקר שלנו נערך כדי לחקור האם ניתן להשתמש ב-AOS כתרופה נגד הזדקנות כדי להקל על הזדקנות המכונית. עכברים מזדקנים C57BL/6J המושרים על ידי D-galactose (D-gal) הוקמו על ידי הזרקה תת עורית של D-gal (200 מ"ג-ק"ג-ד') למשך 8 שבועות. AOS (50,100 ו-150 מ"ג;kg'l.d') ניתנו תוך קיבה במשך 4 השבועות האחרונים. כתוצאה מכך, AOS מנע תפקוד לקוי של הלב בעכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal, כולל חלקי פליטה שנשמר חלקית (EF אחוז) וקיצור חלקי (FS אחוז).cistanche benefíciosAOS עיכב ויסות-על המושרה על-ידי D-gal של פפטידים נטרי-אורטיים A(ANP), פפטיד נטרי-אורטי במוח (BNP) וסמני הזדקנות p53 ו-p21 באופן תלוי מינון. כדי להמשיך ולחקור את המנגנונים הפוטנציאליים התורמים להשפעת ההגנה האנטי-אייג'ינג של AOS, נותחה הפשרה המיטוכונדריאלית הקשורה לגיל. הנתונים שלנו הצביעו על כך ש-AOS הקל על הזדקנות לב הנגרמת על ידי D-gal על ידי שיפור הביוגן-זה של המיטוכונדריה, שמירה על שלמות המיטוכונדריה ושיפור ההסרה היעילה של מיטוכונדריה לקויה. AOS גם הפחית את ייצור ה-ROS ואת מצב עקה חמצונית, אשר, בתורו, מעכב עוד יותר את ההרס של המיטוכונדריה הלבבית. יחד, תוצאות אלו מוכיחות כי AOS עשוי להיות סוכן טיפולי יעיל להקלה על הזדקנות הלב.

מילות מפתח

אוליגוסכריד אלגינט, הזדקנות לב, D-galactose, מיטוכונדריה, עקה חמצונית

1|מבוא

ניתן להגדיר את ההזדקנות בצורה רחבה כהצטברות תלויה בזמן של נזק תאי, הגורמת לירידה תפקודית מתקדמת של רקמות ואיברים.¹ באופן כללי, שינויים הקשורים לגיל בלב כוללים בעיקר היפרטרופיה של החדר השמאלי, פיברוזיס מוגברת של שריר הלב ואי ספיקת לב.Cistanche Extract Anti Radiationההזדקנות היא גורם סיכון מכריע להתפתחות מחלות לב וכלי דם הקשורות לגיל, מה שמוביל לשכיחות מוגברת באופן ניכר של מחלות לב וכלי דם באוכלוסייה המזדקנת. 23 לפיכך, יש צורך דחוף באסטרטגיות טיפול יעילות יותר לטיפול באי ספיקה לבבית הנגרמת על ידי הזדקנות .

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

אלגינט הוא פוליסכריד טבעי שמקורו באצות ים המופק מאצות חומות. אלגינט אוליגוסכריד (AOS) מיוצר על ידי דה-פולימריזציה של אלגינט, שיש לו מספר יתרונות ייחודיים כגון מסיס במים, לא רעיל, לא אימונוגני ומתכלה. AOS מפעילה פעילויות ביולוגיות מבטיחות. לאוליגוסכריד זה יש תכונות נוירו-פרוקטטיביות, היפוליפידמיות, נוגדות חמצון, 'אנטי דלקתיות', אנטי-אגרגטוריות, אנטי גידוליות, 10 תכונות אנטי-בקטריאליות ואימונו-רגולטוריות, "כמו כן מדכא השמנת יתר¹ ופעילויות תוצר סופי של גליקציה מתקדמת (AGE) .4 יש לציין, לא נחקרו מחקרים ביכולת של AOS להגן מפני הזדקנות לב.

המיטוכונדריה הם אברונים דו-ממברניים ומשרתים פונקציות מרובות בביו-אנרגטיקה ובמטבוליזם של התא.14 הלב הוא איבר בעל דרישה אנרגיה גבוהה ואיבר בעל תכולת מיטוכונדריה גבוהה. המיטוכונדריה הלבבית מייצרות 90 אחוז מה-ATP וממלאות תפקיד חיוני בשמירה על לב בריא.cistanche herbaתפקוד לקוי של המיטוכונדריה, שעלול להאיץ את תהליך ההזדקנות ביונקים, הוא אחד המנגנונים החשובים ביותר של ההזדקנות.15;16 תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הקשור לגיל מציג מאפיינים שונים כולל אובדן שלמות המיטוכונדריה, יעילות מופחתת של ביוגנזה מיטוכונדריאלית, איכות לקויה שליטה באמצעות אוטופגיה, ירידה בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (MMP), שינויים בדינמיקה של המיטוכונדריה, היווצרות מוגברת של מיני חמצן תגובתיים (ROS) והצטברות מוטציות ב-DNA המיטוכונדריאלי (mtDNA). שילוב של נזק מוגבר והתחדשות מופחתת במיטוכונדריה עשוי בסופו של דבר לתרום לתהליך ההזדקנות.18,17 בנוסף, חוסר התפקוד המתקדם של המיטוכונדריה מביא לייצור מוגבר של ROS ולחץ חמצוני, אשר בתורם גורמים להידרדרות נוספת של המיטוכונדריה ולנזק תאי ובסופו של דבר תורמים לבעיות בתפקוד הלב הקשור לגיל.20

Cistanche יכול אנטי אייג'ינג

מודלים של הזדקנות הנגרמת על ידי D-galactose (D-gal) היו בשימוש נרחב לחקר מנגנוני הזדקנות והשפעות אנטי-אייג'ינג של תרופות. 21 מתן כרוני של כמות גדולה של D-gal גורם להפרעות בחילוף החומרים בתאים ולפגיעה בתאים אשר מאיצים את תהליך ההזדקנות ובסופו של דבר לגרום לשינויים מבניים ותפקודיים במערכת הלב וכלי הדם.22 לכן, במחקר הנוכחי, הקמנו את מודל ההזדקנות של עכברים המושרה על ידי D-gal כדי להעריך באופן מערכתי את פעילות ההזדקנות האנטי-לבבית של AOS ולחקור עוד יותר המנגנון הבסיסי האפשרי.

2|חומרים ושיטות

2.1|תרופות וריאגנטים

D-galactose התקבל מסיגמה-אלדריץ'. AOS נרכשה מ-Qingdao BZ Oligo Biotech Co., Ltd. ערכת בדיקת Malondialdehyde (MDA) התקבלה ממכון Jiancheng Bioengineering. נוגדנים רב שבטיים לארנבים נגד BNP, PGC-1a, p67-phox ו-gp91-phox התקבלו מ-Abcam Inc. נוגדנים חד שבטיים של ארנב נגד פפטידים נטריאורטיים A (ANP) ו-SIRT3 ו נוגדנים חד שבטיים של עכברים נגד p53 התקבלו מ-Abcam Inc. נוגדנים רב שבטיים של ארנב נגד beclin-1 ו-p-mTOR נרכשו מ- Cell Signaling Technology. נוגדנים רב שבטיים לארנבים נגד p21 ונוגדנים חד שבטיים של עכבר נגד p47-phox התקבלו מסנטה קרוז ביוטכנולוגיה, Inc. נוגדנים רב שבטיים לארנבים נגד mTOR נרכשו מ-Proteintech Group, Inc. Kit לחילוץ מיטוכונדריאלי ו-JC{{14} } ערכת בדיקת פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית נרכשה מ- Beijing Solarbio Science &Technology Co., Ltd. ערכת ה-DNA TIANamp Genomic התקבלה מ-Tiangen Biotech (Beijing) CO., LTD.צמיחת הפין cistancheערכת PCR בדיקת mtDNA של עכבר נרכשה מ-Beijing Tiandz Gene Technology CO., Ltd. נרכשו IgG של עז נגד ארנב (H＋L) (מצומד פרוקסידאז/HRP) ו-IgG נגד עכבר של עיזים (H ועוד L) (מצומד פרוקסידאז/HRP) מ Elabscience Biotechnology Co., Ltd. כל הכימיקלים והריאגנטים האחרים נרכשו מספקים מסחריים סטנדרטיים אלא אם צוין אחרת.

2.2|חיות

עכברים זכרים 8-בני שבוע C57BL/6J (20±2gbodyweight,n=40) התקבלו מ-Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co, LTD. כל העכברים הוזנו בתזונה רגילה ושוכנו במחזור של 12-שעה אור/12-שעה חשיכה בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים (SPF) במרכז למעבדה לחיות במחלקה הרפואית של אוניברסיטת צ'ינגדאו . כל ההליכים הניסויים בבעלי חיים תואמים את 'המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה' שפורסם על ידי המכון הלאומי לבריאות ובריאות הציבור בארה"ב בנושא טיפול אנושי ושימוש בחיות מעבדה. פרוטוקולי המחקר אושרו על ידי הוועדה לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת צ'ינגדאו (מספר אישור: QYFYWZLL25840).

2.3|מודל ההזדקנות המושרה על ידי D-gal ומתן תרופות

העכברים חולקו אקראית לחמש קבוצות (n =8 כל קבוצה): ביקורת, D-gal, D-gal פלוס AOS במינון נמוך (D-gal plus AOS-50), D-gal plus קבוצות AOS במינון בינוני (D-gal plus AOS-100) ו-D-gal פלוס AOS במינון גבוה (D-gal plus AOS-150). ההזדקנות נגרמה בעכברי C57BL/6J באמצעות הזרקה תת עורית של D-gal (200 מ"ג/ק"ג, Sigma-Aldrich) למשך 8 שבועות. 23,24 לעכברי הביקורת ניתנה הזרקה תת עורית של מים סטריליים מקבילים. ארבעה שבועות לאחר הזרקת D-gal, קבוצות D-gal plus AOS-50, D-gal plus AOS-100 ו-D-gal plus AOS-150 ניתנו תוך קיבה עם AOS ( 50, 100 ו-150 מ"ג-ק"ג2-ד'ל) למשך 4 שבועות נוספים, בהתאמה. קבוצת הביקורת ועכברי קבוצת D-gal קיבלו מתן תוך קיבה של מי מלח שווה ערך.

2.4|אקו לב

אקו לב בוצעה על עכברים מורדמים באמצעות Vevo2100(VisualSonics) עם מתמר 30-MHz בסוף הניסוי. הפרמטרים הבאים נמדדו כפי שתואר קודם: חלק פליטת חדר שמאל (EF) וקיצור חלקי חדר שמאל (FS).25

2.5|ניתוח היסטולוגי

דגימות הלב תוקנו עם 4 אחוז פרפורמלדהיד למשך 24 שעות ולאחר מכן הוטמעו בפרפין וחתכו לקטעים 4-עוביים. צביעת הטריכרום של H&E ו-Masson שימשו כדי להמחיש את ארכיטקטורת הלב ופיברוזיס לבבי, בהתאמה. הפרוסות נבדקו תחת מיקרוסקופ אור הפוך (TE 200, Nikon). נתונים מקבילים נותחו וחושבו על ידי חוקרים שהיו עיוורים להקצאת קבוצת טיפול.

2.6|מיקרוסקופ אלקטרונים העברה

מבנה האולטרה של המיטוכונדריה נקבע באמצעות ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים של שידור. בעקבות המחקר הקודם, 26 רקמות טריות של חדר שמאל נחתכו לגושים בגודל 1 מ"מ וקובעו ב-2.5 אחוז גלוטאראלדהיד למשך שעתיים ב-4 מעלות. לאחר קיבוע שלאחר ב-1% אוסמיום טטרוקסיד במשך שעתיים בטמפרטורת החדר, רקמות החדר השמאלי התייבשו ואז הוטבעו בשרף. חתכים אולטרה-דקים סדרתיים (30-40 ננומטר) נאספו על גבי רשתות נחושת ולבסוף נצבעו ב-0.5 אחוז אורניל אצטט ואחריו 1 אחוז עופרת ציטראט. הניתוח האולטרה-סטרוקטורלי של קטעים מוכתמים נקבע תחת מיקרוסקופיה אלקטרונית של Tecnai G2 12 (FEI Co.).

2.7|קביעת פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (MMP).

פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלי נמדד באמצעות הצביעה האימונופלואורסנטית JC-1 וציטומטריית זרימה. רקמות לב טריות שימשו להכנת קטעים קפואים או מיצוי מיטוכונדריה. קטעים קפואים שימשו לצביעה אימונופלואורסנטית JC-1 בהתאם לפרוטוקול היצרן.יתרונות cistanche סלסההקרינה נקבעה בעת עירור/פליטה 485/580 ננומטר (אדום) ועירור/פליטה 485/530 ננומטר (ירוק) באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

בנוסף, מיטוכונדריה בודדו מרקמת לב טריה באמצעות ערכת המיצוי המיטוכונדריאלי לפי השיטה שפורסמה על ידי Peng et al? לאחר מכן נעשה שימוש במיטוכונדריה שחולצו כדי לגלות את שלמות ה-MMP באמצעות מדידת עוצמת הפלורסנט של JC{ {2}}. בקצרה, המיטוכונדריה הודגרה עם JC-1 במאגר Assay JC-1 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. קרבוניל ציאניד m-chlorophenylhydrazone הוחל כדי לשבש MMP ושימש כביקורת חיובית בהתאם להוראות היצרן. הדגימות נותחו ב-488 ו-575 ננומטר על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות תוכנת CellQuest (Becton Dickinson).

2.8|מדידה של מספר עותק mtDNA

מספר העתקת ה-DNA המיטוכונדריאלי נמדד על ידי PCR כמותי בזמן אמת (qPCR). בקיצור, רקמות הלב הומוגגו והוסרו חלבונים ו-RNA באמצעות פרוטאינז K ו-RNaseA. כל ה-DNAs חולצו על ידי ערכת TIANamp Genomic DNA ולאחר מכן הוכמת על ידי QuickDrop Spectrophotometer מ-Molecular Devices (Holliston, MA). ערכת PCR probe mtDNA של עכברים שימשה להגברת ה-mtDNA של הדגימה על ידי מערכת זיהוי PCR פלואורסצנטי (Hangzhou Bioer Technology Co. Ltd). מספר עותק mtDNA חושב מעקומת הבקרה החיובית של qPCR לפי פרוטוקול היצרן.

2.9|זיהוי במקום של ייצור ROS

כפי שתואר בעבר, צביעת פלואורסצנטי DHE בוצעה כדי להעריך את רמת ייצור ROS באתרו.2³ בקצרה, רקמות לב טריות הוטבעו בתרכובת OCT ולאחר מכן הוקפאו מיד באמצעות קריוסטט בדרגה -20. רקמות הלב הקפואות נחתכו לשקופיות היסטולוגיות בעובי 6-. פרוסות לב נשטפו עם 1xphosphate-buffered saltine (PBS) ולאחר מכן הודגרו בתמיסת DHE (5 umol/L) בתא לחות מוגן אור ב-37 מעלות למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, קטעי לב רוחבי נשטפו עם 1×PBS. לבסוף, התקבלו תמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ועוצמת הקרינה הוכמתה על ידי תוכנת ImageJ על ידי בודק עיוור.

2.10|מדידת חמצון ליפידים

בתור תוצרי החמצון המשני העיקריים של חמצון שומנים, נמדד ריכוז המלונדיאלדהיד (MDA) בהומוגניות בסרום ובלב על פי ההוראות של ערכת ה-MDA Assay (Jiancheng Bioengineering Institute).

2.11|ניתוח כתם מערבי

רקמות הלב עברו הומוגניות במאגר RIPA המכיל מעכבי phos-phatase ופרוטאזות ועברו צנטריפוגה ב-12 00 סל"ד ב-4 מעלות למשך 20 דקות. לאחר מכן, הסופרנטנט נאסף לניסויים הבאים. ריכוז החלבון נקבע באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA. כמויות שוות של חלבונים הונחו בג'ל SDS-PAGE של 10 אחוז והועברו לממברנות PVDF (Roche). הממברנות נחסמו בתמיסת האיטום למשך שעה והודגרו עם נוגדנים ראשוניים מתאימים ב-4 מעלות למשך הלילה. לאחר מכן, ממברנות נשטפו ב-TBS-T והודגרו עם הנוגדנים המשניים המתאימים. לאחר מכן, ממברנות נשטפו ב-TBS-T והוצגו באמצעות ריאגנטים לגילוי זיהוי סופג של ECL Western (Bio-Rad). ביטוי החלבון הוכמת על ידי ניתוח דנסיטומטריה של להקות באמצעות תוכנת ImageJ. החלבון לשמירה על הבית GAPDH שימש כבקרת טעינה. יחסי הדילול של הנוגדנים הראשוניים והמשניים הוצגו כדלקמן:ANP(1:1000),BNP(1:2000),p53(1:1000),p21 (1:1000),PGC-1 a (1:1000),SIRT3(1:1000),beclin-1(1:1000),p-mTOR(1:1000),mTOR (1:1000),p47-phox( 1:500),p67-phox(1:1000),gp91-phox(1:2000), GAPDH (1:2000), עז נגד ארנבת IgG (H ＋ L)(פרוקסידאז /HRP מצומד) (1:5000) ו-Goat Anti-Mouse lgG (H＋L) (מצומד פרוקסידאז/HRP) (1:5000).

2.12|ניתוח סטטיסטי

הנתונים הובעו כממוצע ±SEM. מובהקות סטטיסטית נקבעה עם ה-ANOVA החד-כיווני ואחריו המבחן הפוסט-הוק של Student-Newman Keuls (SNK).<.05 was="" considered="" to="" be="" statistically="">

3|תוצאות

3.1|השפעות של AOS על תפקוד הלב והביטוי של סמני הזדקנות בעכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal

אקו לב שימש לניתוח תפקוד הלב של עכברים. עכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal הראו ירידה משמעותית באחוז EF ובאחוז FS. עם זאת, AOS מנע באופן משמעותי תפקוד לקוי של הלב בעכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal, כולל אחוז EF משומר חלקית ואחוז FS (איור 1A-C). כפי שמוצג באיור 1D-G, לא היה הבדל סטטיסטי בקצב הלב בין כל קבוצה. לעכברי D-galactose הייתה נטייה להגדיל את LVEDD (קוטר קצה חדר שמאל-דיאסטולי) ו-LVPWd (עובי דופן אחורי של החדר השמאלי בקצה הדיאסטולה), אך לא היה הבדל מובהק סטטיסטית בהשוואה לעכברי הביקורת. עם זאת, LVESD (קוטר קצה סיסטולי של חדר שמאל) גדל באופן משמעותי בעכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal, ו-AOS הפחית את LVESD באדם תלוי מינון. הביטוי של ANP ו-BNP ברקמת הלב נקבע על ידי Western blot כדי לאמת עוד יותר את תפקוד הלב של עכברים בכל קבוצה. כפי שמוצג באיור 1H-I, רמות ה-ANP וה-BNP עלו באופן משמעותי בעכברים מזדקנים המושרים על-ידי D-gal, ו-AOS הפחית משמעותית את רמות ה-ANP וה-BNP באדם תלוי מינון. נתונים אלה הצביעו על כך ש-AOS מנע הפרעה בתפקוד הלב בעכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal. יתר על כן, זיהינו את ביטוי החלבון של סמני ההזדקנות p53 ו-p21. כצפוי, ביטוי חלבון p53 ו-p21 גדל באופן משמעותי ברקמות הלב של עכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal, ו-AOS הפחית באופן משמעותי את ביטוי p53 ו-p21 באופן תלוי מינון (איור 1J-K).

3.2|השפעת AOS על שינויים היסטופתולוגיים לבביים בעכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal

כדי לחקור את השינויים בארכיטקטורת שריר הלב של עכברים, שקופיות רקמת לב נצבעו בהמטוקסילין ואאוזין (H&E). כפי שמוצג באיור 2A, בהשוואה לעכברי הביקורת, עכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal הפגינו ארכיטקטורה חריגה של שריר הלב, המאופיינת בעיקר בסידור לא מסודר של קרדיומיוציטים וברווח בין תאי מוגדל בין תאים. מתן AOS הפחית באופן משמעותי את הסדר והרווח בין קרדיומיוציטים. צביעת H&E הדגימה גם שאזור הקרדיומיוציטים של החדר השמאלי גדל באופן משמעותי בעכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal, וטיפול ב-AOS הפחית באופן משמעותי את אזור הלב-מיוציטים באופן תלוי מינון (איור 2B,D).

על מנת להבהיר את מידת הפיברוזיס הלבבי, בוצעה צביעה תלת-כרומית של מאסון של חתכי לב. כפי שמוצג באיור 2C,E, הצטברות הקולגן באזורים בין-סטיציאליים בשריר הלב ובאזורי כלי הדם גדלה באופן דרמטי בעכברים מזדקנים המושרים על-ידי D-gal. עם זאת, בהשוואה לקבוצת D-gal, טיפול ב-AOS הפחית משמעותית את אחוז אזור הקולגן באופן תלוי מינון (איור 2C,E). נתונים אלה הצביעו על כך ש-AOS מנע שינויים מורפולוגיים המושרים על ידי D-gal ופיברוזיס לבבי בעכברי C57BL/6J.

3.3|השפעת AOS על מבנה האולטרה המיטוכונדריאלי הלבבי של עכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal

לאחר מכן השתמשנו במיקרוסקופ אלקטרוני של העברה כדי לזהות את השינוי במבנה האולטרה-מבנה המיטוכונדריאלי של הלב. כפי שמוצג באיור 3, המיטוכונדריה הקרדיומיוציטים של עכברי הביקורת היו תקינים מבחינה מבנית והראו קריסטלים ניתנים להבחין בבירור ומטריצה ​​שקופה אלקטרונית. עם זאת, חלק מהמיטוכונדריות של קרדיומיוציטים של עכברי D-gal היו מוגדלים, נפיחות ואובדן חלקי של cristae, וטיפול ב-AOS מנע את הרס האולטרה-סטרוקטורה המיטוכונדריאלית הלבבית בעכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal.

3.4|השפעת AOS על ה-MMP הלבבי של עכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal

כגורם חשוב למצב התפקודי של המיטוכונדריה, MMP נמדד באמצעות צביעת פלואורסצנטי JC-1 וצי-טומטריית זרימה. באופן כללי, כאשר פוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה גבוה, JC-1 מתקבץ במיטוכונדריה ופולט פלואורסצנטי אדום, בעוד JC-1 קיים כמונומר בציטוזול ופולט פלואורסצנטי ירוק כאשר מיטוכונדריה עם פוטנציאל ממברנה נמוך.29 אז היחס בין הקרינה האדומה לקרינה ירוקה יכול לשקף את עוצמת ה-MMP. כפי שמוצג באיור 4A-B, תוצאת צביעת הקרינה JC-1 הצביעה על כך שרמת ה-MMP הלבבי בעכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal הייתה נמוכה באופן דרמטי מזו שבעכברי הביקורת, וניהול AOS מוגן מפני D- ירידה בתיווך גלקטוז של MMP. ב

3.5|השפעת AOS על ביוגנזה מיטוכונדריאלית וביטוי חלבון אוטופגיה בלבבות של עכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal

השתמשנו ב-Western blot כדי לקבוע את ביטוי החלבון של סמן ביוגנזה מי-טוכונדריאלי PGC-1a. כצפוי, נצפתה ירידה משמעותית בביטוי חלבון PGC-1o ברקמות לב של עכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal, ו-AOS העלה משמעותית את הביטוי של PGC-1 במינון תלוי מינון אופן (איור 5A-B). מחקרים הראו ש-SIRT3 ממלא תפקיד חשוב בשמירה על ביו-אנרגטיקה המיטוכונדריה. לכן, זיהינו עוד את ביטוי SIRT3 ברקמות הלב. התוצאה שלנו הראתה שירידה משמעותית בביטוי חלבון SIRT3 בעכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal, ו-AOS הגדילו באופן משמעותי את ביטוי חלבון SIRT3 באופן תלוי מינון (איור 5C-D). יתרה מכך, תוצאת PCR של בדיקת mtDNA הראתה שמספר עותק mtDNA ירד באופן משמעותי בעכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal, ו-AOS הגדיל באופן משמעותי את מספר עותק mtDNA באופן תלוי מינון (איור 5E). נתונים אלה הצביעו על כך ש-AOS הסדיר את הביוגנזה המיטו-כונדריה בעכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal.

לאחר מכן השתמשנו ב-Western blot כדי לקבוע את הביטוי והזרחון של מווסת אוטופגיה קריטית ברקמות הלב. כפי שמוצג באיור 5F-I, נצפתה ירידה משמעותית בביטוי חלבון beclin-1 ועלייה משמעותית בזרחן mTOR ברקמות הלב של עכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal. כצפוי, AOS הגדיל משמעותית את ביטוי beclin-1 והפחית את זרחון mTOR באופן תלוי מינון.

3.6|השפעת AOS על ייצור ROS ולחץ חמצוני בלבם של עכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal

קבענו ייצור ROS בלבבות באמצעות צביעת DHE פלואורסנס. כפי שמוצג באיור 6A-B, מצאנו שעוצמת הקרינה DHE של קרדיומיוציטים שמאליים-טריקולריים גדלה באופן משמעותי בעכברים מזדקנים המושרים על-ידי D-gal, ו-AOS הפחיתה משמעותית את עוצמת הקרינה DHE של קרדיומיוציטים של חדר שמאל.

כדי לחקור את ההשפעה של AOS על מצב עקה חמצונית בלבם של עכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal, השתמשנו ב-Western blot כדי לקבוע את ביטוי החלבון של NADPH אוקסידאז ברקמות הלב. תת-יחידת המשנה של NADPH אוקסידאז p47-phox,p67-phox ו-gp91-phox גדלה באופן משמעותי בעכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal. עם זאת, AOS הפחית את הביטוי של אותן יחידות משנה NADPH אוקסידאז באופן תלוי מינון (איור 6C-D).

מכיוון ש-MDA נחשב לסמן ביולוגי משוער עבור חמצון שומנים באורגניזמים חיים, יתר על כן, זיהינו ריכוז MDA כדי להעריך מצב עקה חמצונית in vivo. כפי שמוצג באיור 6E-F, מצב עקה חמצוני מוגבר בעכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal אושר על ידי ריכוז גבוה יותר של MDA בהומוגניות בסרום ובלב. מתן AOS הוריד את רמות MDA באופן תלוי מינון בהשוואה לקבוצת D-gal. יחד, נתונים אלה הצביעו על כך ש-AOS הפחית באופן משמעותי את ייצור ה-ROS ואת מצב הלחץ החמצוני בעכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal.

4|דִיוּן

הזדקנות היא שינוי מערכתי כרוני ורב איברים הקשורים באורגניזם. הגידול במחלות לב וכלי דם הקשורות לגיל והעומס הכספי הנובע מכך הפכו לאתגר עולמי עיקרי.30,31 לכן, יש לחקור לעומק את המנגנונים המולקולריים של הזדקנות הלב, ולהתערבויות אנטי-אייג'ינג חדשות יהיו משמעות רבה ב שיפור תוחלת הבריאות וכן עיכוב אי ספיקת לב הנגרמת על ידי הזדקנות.

אלגינאט הוא קופולימר ליניארי של פוליסכרידים המופק מאצות ים חומות. בשל משקלו המולקולרי הגבוה והצמיגות שלו, קשה לאלגינט לחצות קרומי תאים ומחסומים ביו-לוגיים, מה שמגביל את ניצולו. AOS, המופק מהידרוליזה של אלגינט, משך תשומת לב גוברת בגלל המשקל המולקולרי והצמיגות הנמוכים שלו. AOS היא תרכובת מסיסה במים, לא רעילה, לא אימונית ומתכלה ובעלת פעילות ביולוגית טובה בהרבה מאלגינט.' עדויות מצביעות על כך של-AOS, כאוליגוסכריד נוגד חמצון, יש את היכולות להגן על מחלות ניווניות עצביות ועל רעילות לבבית חריפה של דוקסורוביצין באמצעות עיכוב מתח רשתית אנדופלזמית ולחץ חמצוני.5 מחקרים אחרונים הוכיחו ש-AOS שמקורו ימי מראה פעילות ביולוגית מבטיחה בהפחתת hyperlipidae-mia, היפרגליקמיה ויתר לחץ דם ודיכוי השמנת יתר.27 עם זאת, לא הוכחה היכולת של AOS להגן מפני הזדקנות.

מחקרים קודמים מצביעים על כך שללב מזדקן יש מאפיינים היסטולוגיים ותפקודיים ייחודיים, לרבות מודלים מתקדמים של הלב והתדרדרות העתודה הלבבית. . מודלים של הזדקנות מוקדמת הנגרמת על ידי D-gal מציגים פנוטיפים דומים של שינויים לבביים בהשוואה להזדקנות טבעית במכרסמים.*4 במחקר זה, הדגמנו כי עכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal הפגינו ארכיטקטורה לא תקינה של שריר הלב והצטברות קולגן מוגברת בשריר הלב. ואזורים perivascular, וניהול AOS עיכב את שיפוץ הלב המושרה על ידי D-gal בעכברי C57BL/6J. בינתיים, מצאנו ש-AOS מנע תפקוד לקוי של הלב בעכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal, כולל אחוזי EF ו-FS משומרים חלקית, והפחית את הביטוי של ANP ו-BNP. אקו לב שימש גם כדי לנתח את השינויים במבנה הלב של עכברים. לעכברי D-galactose הייתה נטייה להעלות את LVEDD ו-LVPWd, אך לא היה הבדל מובהק סטטיסטית בהשוואה לעכברי הביקורת. עם זאת, LVESD גדל באופן משמעותי בעכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal, ו-AOS הפחית את LVESD באופן תלוי מינון. ייתכן שהסיבה לתופעה זו היא שלמודל ה-D-galactose המחקה הזדקנות מואצת יש זמן מידול קצר יחסית, המשפיע בעיקר על תפקוד המיטוכונדריה כפי שמוצג להלן ומוביל לתפקוד לקוי של הלב. שינויים גדולים במבנה הלב התרחשו אך לא הביאו להבדלים מובהקים סטטיסטית. בנוסף, הנתונים שלנו הראו גם כי מתן AOS הפחית משמעותית את ביטוי סמני ההזדקנות p53 ו-p21 באופן תלוי מינון. כדי להמשיך ולחקור את המנגנונים האפשריים התורמים ליכולת ההגנה נגד ההזדקנות של AOS, נותחה הפשרה המיטוכונדריאלית הקשורה לגיל.

הלב מכיל מיטוכונדריות רבות המבוססות על הדרישה יוצאת הדופן שלו ל-ATP. מיטוכונדריה מייצרות ATP באמצעות זרחון חמצוני של חומצות שומן ופחמימות. בנוסף, רדיקלים חופשיים נוצרים כל הזמן בתהליך זה. ראוי לציין כי הומאוסטזיס מיטוכונדריאלי חיוני לשמירה על תפקודם וכדאיותם של קרדיומיוציטים.3 מעלות. שריר הלב מראה נוכחות של מיטוכונדריה מוגדלות ומתנפחות, עם שיבוש ה-ma-trix ואובדן של cristae." במחקר זה, בהשוואה לעכברי הביקורת, כמה מיטוכונדריות קרדיומיוציטים של עכברי D-gal היו מוגדלים, נפיחות ואובדן חלקי של cristae. טיפול ב-AOS הקל על הרס מבנה המיטוכונדריאלי הלבבי בעכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal. במקביל, D-gal גרמה לירידה משמעותית ברמת ה-MMP הלבבי, ומתן AOS מוגן מפני D-gal. ירידה ב-MMP תוצאות אלו הצביעו על כך ש-AOS מנע את השמדת המיטוכונדריה הלבבית בעכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal.

צוין כי תהליכים מרובים של המיטוכונדריה שנפגעו מעורבים בפתוגנזה של לב מבוגר, כולל השינוי בביוגנזה והסרה של המיטוכונדריה. בינתיים, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה והסרה לקויה של המיטוכונדריה ההרוסה, בתורם, מגבירים את הפגיעות לפציעת מאמץ של הלב המבוגר." ביוגנזה מיטוכונדריאלית מווסתת בעיקר על ידי קבוצה של קואקטיבים מקודדים גרעיניים וגורמי שעתוק. קולטן המופעל על ידי פרוקסיזום פרוליפרטור. coactivator 1a (PGC-1a), שהוא קריטי לשמירה על הומאוסטזיס אנרגטי, הוכח כממלא תפקיד מפתח בוויסות הביוגנזה והתפקוד של המיטוכונדריה.4 ירידה ב-PGC-1נקשרו ביטוי ופעילות להזדקנות המכונית ולפיתוח של אי ספיקת לב."2 מחקר קודם הראה שהפעלת p53 הקשורה לגיל גורמת ישירות לפגיעה במיטוכונדריה באמצעות דיכוי מספר מווסתים ראשיים של ביוגנזה מיטוכונדריאלית, כולל PGC-1a. 43 שורות ראיות מצטברות מצביעות גם על כך שהפעלת PGC-1o על ידי התערבות תרופתית או גנטית מונעת את השינויים הקשורים להזדקנות בלב." Sirtuins (SIRTs) הם מוכר כמווסתים בלתי ניתנים לביטול של תהליך ההזדקנות. SIRT3, הממוקם במטריקס המיטוכונדריאלי, ממלא תפקיד חשוב בשמירה על ביו-אנרגטיקה של המיטוכונדריה, מווסת חילוף החומרים של המיטוכונדריה וויסות אורך החיים. הוכח שחסר Sirt3 מוביל להפרעות בלב ופוגע בביו-אנרגטיות המיטוכונדריאליות בעכברים. 45 במחקר זה, הראינו שירידה משמעותית בביטוי חלבון PGC-1a ו-SIRT3 נצפתה ברקמות לב של עכברים מזדקנים הנגרמת על ידי D-gal, ו-AOS העלה משמעותית את ה-PGC-1a וביטוי חלבון SIRT3 באופן תלוי מינון. יתרה מכך, תוצאת PCR של בדיקת mtDNA הראתה שמספר עותק mtDNA היה ירידה משמעותית בעכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal, ו-AOS הגדיל באופן משמעותי את מספר עותק mtDNA באופן תלוי מינון. יחד, נתונים אלה הצביעו על כך ש-AOS הסדיר את ה-bio-genesis של המיטוכונדריה בעכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal.

כפי שצוין לעיל, הסרה יעילה של מיטוכונדריה לקויה חיונית לשמירה על הומאוסטזיס של קרדיומיוציטים. המנגנון הידוע לפיו הופכים את המיטוכונדריה הוא באמצעות אוטופגיה. מוצע כי אוטופגיה ממלאת תפקיד קריטי בוויסות הומאוסטזיס לבבי במצב בסיסי וכן בתגובה ללחץ.46,47 עם זאת, אוטופגיה בדרך כלל מווסתת למטה בלב המזדקן. רמה נמוכה יותר של אוטופגיה במהלך תהליך ההזדקנות מפחיתה את הפירוק של האברונים ההרוסים והפרו-טינים הרעילים ומעוררת הצטברות של מיטוכונדריה לא מתפקדת ולא תקינה, שבסופו של דבר גורמות לתפקוד לקוי של הלב העולמי. הוכח כי גירוי של אוטופגיה משפר את תפקוד הלב במודלים של מכרסמים על ידי הסרת מיטוכונדריה לא מתפקדת, ובכך מייעל את הסביבה התאית הכוללת ובסופו של דבר מקל על פתולוגיה הקשורה להזדקנות בלב.48 במחקר זה, הוכחנו שרמת האוטופגיה ירדה באופן משמעותי בלב. רקמות של עכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal ו-AOS שיפרו משמעותית את רמת האוטופגיה באופן תלוי מינון. שינויים אלה חשפו כי AOS שיפר את ההסרה היעילה של מיטוכונדריה לקויה הקשורה לגיל באמצעות אוטופגיה מווסתת מעלה. כפי שצוין קודם לכן, עיקר ייצור ה-ROS, הנוצר ממתחמי שרשרת הולכת אלקטרונים של המיטוכונדריה (ETC), מתרחש כתוצר לוואי של זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי.4 עדויות ניסויות מצביעות על כך שהמיטוכונדריה הפגועה במהלך ההזדקנות מייצרות כמויות מוגברות. של ROS, לשפר את הנזק שנגרם על ידי רדיקלים חופשיים ובסופו של דבר להוביל לספירלה פרוגרסיבית קדימה-משוב של ריקבון מיטוכונדריאלי.4 זה בתורו גורם ליותר ROS דרך נזק ל-ETC, מה שגורם לייצור ROS נוסף ובסופו של דבר מוביל לכשל ביו-אנרגטי. . בנוסף ל-ETC, אוקסידאז של nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) הוא מקור חוץ-מיטוכונדרי עיקרי של ROS, שעשוי להיות אחראי ללחץ חמצוני במהלך תהליך ההזדקנות ולהחמיר את הנזק החמצוני למיטוכונדריה. בנוסף למנגנונים אלו, מחקר אחרון הראה גם שיצירת ROS מיטוכונדריאלי נמוך יותר תורם לייצור רמה נמוכה של נזק במצב יציב של mtDNA.47 תיקון כריתת בסיס מיטוכונדריאלי גבוה יותר (BER) ונזק מיטוכונדריאלי נמוך של יונקים ארוכים ב- כללי תורם לאריכות החיים המעולה שלהם. דוח שנערך לאחרונה מראה כי מעכב NADPH אוקסידאז מדכא חוסר תפקוד מיטוכון-דריאלי בגרעין השבלול הגחוני של חולדות מזדקנות הנגרמות על ידי D-gal. MDA נחשב לסמן ביולוגי משוער עבור חמצון שומנים באורגניזמים חיים, וניתן להשתמש בריכוז MDA להערכת מצב עקה חמצונית in vivo. במחקר זה, מצאנו כי מתן AOS החליש את ייצור ה-ROS, הסדיר את הביטוי של NADPH אוקסידאז והפחית את רמת ה-MDA בעכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal. התוצאות הנוכחיות שלנו הצביעו על כך ש-AOS הפחית ביעילות את מצב הלחץ החמצוני בעכברים מזדקנים המושרים על ידי D-gal, מה שעשוי להיות גורם הגנה חשוב נוסף עבור AOS כדי להקל על הנזק המיטוכונדריאלי.

במחקר הנוכחי, הבהרנו תחילה ש-AOS מקל על הזדקנות לב הנגרמת על ידי D-gal באמצעות שיפור ביוגנזה של המיטוכונדריה, שמירה על שלמות המיטוכונדריה ושיפור ההסרה היעילה של מיטוכונדריה לקויה בעכברי C57BL/6J. בנוסף, AOS גם מקטין את ייצור ה-ROS ואת מצב עקה חמצונית, אשר, בתורו, מעכבים עוד יותר את הרס המיטוכונדריה של הלב. AOS עשוי להיות סוכן טיפולי יעיל להקלה על הזדקנות לב. במחקר זה, השתמשנו רק בעכברים זכרים ולא בדקנו הבדלי מין על ההשפעות של AOS. זה מאוד מעניין שמולקולת הידבקות בין-תאית ספציפית לתא דנדריטי-3-תופסת ליגנד שאינו אינטגרין (DC-SIGN) טיפול 1 (DSCL1, חומר אנטי דלקתי) מפחית קיטוב מקרופאגים וחוסר תפקוד דיאסטולי בלב נקבה מזדקן אך לא זכר של עכבר.52 מאמר זה מצביע על כך שיהיה זה בעל משמעות רבה להשוות הבדלי מין במחקרים עתידיים.

לסיכום, הממצאים שלנו העלו כי AOS הקלה על הזדקנות לב הנגרמת על ידי D-gal באמצעות ויסות תפקוד המיטוכונדריה של שריר הלב ושלמותם בעכברים. AOS מציגה מגוון רחב של פעילויות ביולוגיות מבטיחות ועשויה להיות סוכן טיפולי יעיל להקלה על הזדקנות הלב.

מאמר זה מופק מ-J Cell Mol Med. 2021;25:7157–7168. wileyonlinelibrary.com/journal/jcmm|7157