השפעה מועילה/שלילית של קוורצטין על הממברנות של תאי נוירובלסטומה SK-N-SH חלק 2

בבקשה תלחץoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

2.2.2. פעילות נוגדת חמצון של קוורצטין

כדי לבדוק את היעילות של quercetin בהגנה על ממברנות מפני עקה חמצונית, בוצעו ניסויים שבהם דגמי השומנים של הממברנה נחשפו לאוזון בהיעדר (איור 4a) ונוכחות של quercetin בריכוז של 6.25 מיקרומטר (איור 4b).

בהשפעת האוזון, מהלך שתי התלות, כלומר π{{0}}f(A) ו-Cs-1=f(rn) משתנה. האיזותרמיות שהתקבלו עבור התפשטות חד-שכבתית על תת-השלב המכיל אוזון אופיינו בשיפוע קטן יותר ובמעבר לערכי A נמוכים יותר. יתרה מכך, ערכי Cs-1 ירדו בהשפעת האוזון. שינויים אלו היו הגדולים ביותר בריכוז אוזון של כ-0.4 ppm.cintancheעלייה נוספת בריכוז האוזון לא הגדילה את השינויים במאפיינים החד-שכבתיים (איור 4 א').

איור 4. איזותרמיות לחץ פני השטח ומודול הדחיסה המקביל של מודל השומנים של שכבות נוירובלסטומה הפרוסות על תת-השלב הכילו את הריכוזים המצוינים של אוזון המומס במאגר. איזותרמיות: (א) בהיעדר נוגדי חמצון; (ב) בנוכחות קוורצטין (6.25 מיקרומטר) שנוספו למאגר המכיל אוזון.

כאשר קוורצטין בריכוז של 6.25 מיקרומטר הוכנס לתת-פאזה, האוזון לא השפיע באופן משמעותי על מהלך האיזותרם r(A); עם זאת, הערכים של מודול הדחיסה השתנו בנוכחות האוזון בדומה למקרה של היעדר קוורצטין (איור 4b הוספה).

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

הערכים המספריים של הפרמטרים המאפיינים את המונו-שכבות שנקבעו על סמך האיזותרמיות שהתקבלו מוצגים בטבלה 3.

טבלה 3. פרמטרי פני השטח של השכבות המונו-שכבות Alim ו-Cs-I שחושבו עבור מונו-שכבות של המודל של קרום נוירובלסטומה שהתפשט על תת-השלב הכילו את הריכוזים המצוינים של אוזון המומס במאגר בהיעדר ובנוכחות קוורצטין (6.25 uM). הנתונים מייצגים את הממוצע משלושה ניסויים ± SD. אותיות שונות מצביעות על הבדלים משמעותיים (p פחות או שווה ל-0.05).

בנוכחות אוזון, נצפית הפחתה קלה בשטח הפנים לכל מולקולה (אלים) בשכבה חד-שכבתית צפופה. ההפחתה המקסימלית של פרמטר זה היא 3.2 אחוז בהשוואה לבקרה (חד-שכבה על המאגר הטהור). גם הפרמטר Cs-I מופחת, ומגיע לערכי מישור בריכוזי אוזון מעל 0.6 ppm O. ההפחתה המקסימלית של פרמטר זה מגיעה ל-24 אחוזים ביחס לבקרה.

כאשר קוורצטין בריכוז של 6.25 uM קיים בתת-השלב, ערכי אלים (1-2 אחוזים) יורדים מעט, בעוד שההפחתה בערך-1Cs היא כ-27 אחוזים.

לאופי השינויים של אלים בנוכחות אוזון ושל אוזון בשילוב עם קוורצטין יש קורסים שונים. בריכוז אוזון של כ-0.3 ppm, בהיעדר הקוורצטין, ה-Aim יורדת בפתאומיות לכ-88.3 A2. לאחר מכן הוא מגיע לערך הרמה המינימלי המעניק תלות אופיינית בצורת S (איור 5a, נקודות אדומות). בנוכחות קוורצטין, יש ירידה מונוטונית חלקה קלה של Alim, להגיע לריכוז אוזון גבוה יותר ברמה של כ-93.5 A2 (איור 5a, נקודות ירוקות).

איור 5. התלות של השטח לכל מולקולה בריכוז האוזון (א) והתלות של מודול הדחיסה בריכוז האוזון (ב) עבור קרום נוירובלסטומה בתת-פאזה: ללא נקודות קוורצטין-אדומות; עם נקודות ירוקות קוורצטין. קווים אינם מציגים שום מודל פיזי, הותאמו מתמטית ושורטטו לנוחות המעקב אחר שינויים בפרמטרים. ערכי מודול הדחיסה המרבי של השכבה משתנים באופן דומה עם ריכוז האוזון עבור שניהם: בהיעדר ובנוכחות של קוורצטין (איור 5ב).

3. דיון

מנגנון הפעולה של quercetin נחקר באינטנסיביות במשך שנים רבות, אך תוצאות הניסויים סותרות לעתים קרובות ומצביעות על כך שבנסיבות מסוימות, תרכובת זו מועילה, ובאחרות, אינה חיובית לתאים. ניתוח המחקרים הזמינים מראה כי השפעתה של תרכובת זו על תאים קשורה לשני היבטים, קרי האינטראקציה שלה עם ממברנות ופעילות נוגדת חמצון. עם זאת, בתאים, לא ניתן להבחין בין שני האופנים הללו של פעולת קוורצטין והערכת התאמתה של תרכובת זו כחומר פוטנציאלי, למשל בעל פעילות אנטי-גידולית. מסיבה זו, הניסויים תוכננו בצורה כזו כדי להעריך בצורה איכותית וכמותית את השפעתה של תרכובת זו על התכונות המכניות של הממברנות, כמו גם פעילות נוגדת החמצון שלה במערכת המודל, אשר מבטלת את ההשפעות של פעילותם של מסלולים מטבוליים אחרים.

בהתבסס על הניסויים שבוצעו, אושר כי אפילו בריכוזים הנמוכים ביותר (6.25 uM), הקוורצטין משנה (כפי שצוין על ידי העלייה ב-Alimvalue) את השכבות המונו-שכבות של המודל, מחקה את החלק השומני של הממברנה של תאי נוירובלסטומה. זה מצביע על אפשרות של אינטראקציה של quercetin עם ממברנות של תאים אלה כאשר מגיעים למוח, אפילו בריכוזים נמוכים. יש לכך חשיבות מיוחדת עבור תאי עצב שהממברנות שלהם מכילות כמויות גדולות יחסית של שומנים.

Cistanche יכול לשפר חסינות

יחס השומנים והחלבון המשוער עבור תאי עצב הוא 80:20 אחוז, ולדוגמה, עבור קרום האריתרוציטים, יחס זה הוא 50:50 אחוז [29]. רמה כזו של שומנים בממברנה של תאי עצב קשורה לתפקידם של תאים אלו בהעברת אותות חשמליים. יחד עם זאת, אפילו שינויים עדינים בתכונות הפיזיקליות-כימיות, כגון גמישות ונוקשות, של קרום התא, עלולים להפריע לתפקוד זה באופן משמעותי.

פוטנציאל הפעולה מועבר לאורך הממברנה של תא העצב הודות לעבודת תעלות יונים, ולאחר מכן, הודות לפעולת משאבות היונים, פוטנציאל המנוחה מוחזר. התפקוד התקין של חלבונים אלה (בפרט, נקבע על פי צורתם) תלוי מאוד בסביבת השומנים. יתרה מכך, שינויים בתכונות המכאניות של הממברנה עלולים להפריע לפעולת תעלות שמנגנון השער שלהן תלוי בדיוק בתכונות המכניות של הממברנה.

תזות אלו מאוששות על ידי מחקרים שהראו כי השפעת הקוורצטין על קרום התא קשורה, בין היתר, להובלה של יוני Ca2 פלוס ו/או מטבוליזם Ca2 פלוס [30,31]. לפיכך, להחדרת מולקולות קוורצטין לסביבת הממברנה (במיוחד של תאי עצב) עשויה להיות השלכות משמעותיות על תפקודן.

כדי לבדוק אם פעולת קוורצטין שנקבעה במערכות מודל ממלאת תפקיד מועיל או לא חיובי בתאים, הושוו התוצאות שהתקבלו עבור ממברנות מודל להשפעה של תרכובת זו על תאי נוירובלסטומה שלמים. עבור תאי SK-N-SH, בדיקת MTT נעשתה,תמצית Cistanche נגד אלצהיימרמתן מידע על כדאיות התא של תאים, אשר בתורו עומד ביחס ישר לאנזימי דהידרוגנאז מיטוכונדריאלי.

התוצאות שהתקבלו הראו שהנוכחות של quercetin בריכוזים של 100 ו-200uM הגדילה את מספר התאים הבריאים. תוצאות דומות התקבלו על ידי Bao et al. [32], חוקר את ההשפעה של quercetin על תאי PC-12. גם דליפת ה-LDH לסביבה החוץ-תאית, שנותנת מידע על הפרעה בקרום התא, נבדקה באותן רמות קוורצטין. התוצאות שהתקבלו הוכיחו שהממברנות של התאים שנבדקו לא נפגעו בתנאים כאלה. Boots et al. [2], חקר ההשפעות של quercetin על תאי אפיתל ריאות, ראה תוצאות דומות. לכן, ניתן להסיק שבריכוזים אלה, לקוורצטין יש השפעה חיובית על התאים, ומגביר את הכדאיות שלהם.

ההיבט החשוב השני של מנגנון פעולת הקוורצטין קשור לתכונות נוגדות החמצון שלו. כדי להעריך את ההשפעה הקשורה לפוליפנול שנחקר, בוצעו ניסויים שבהם נבדק האם לקוורצטין תפקיד מגן בתאים החשופים ללחץ חמצוני. מתח חמצוני נוצר על ידי החדרת H, O2 לסביבת התא.Cistanche לשיפור הזיכרוןכפי שהוכח במחקר זה, מי חמצן גורם לתמותה משמעותית של תאים, המתבטאת כפגיעה במיטוכונדריה.

כאשר תאי SK-N-SH תורבו במשך 3 שעות במדיום המכיל 3 ו-5 מ"מ H2O2, כדאיות התא ירדה לכ-44 אחוזים מזו של תאים לא מטופלים (מבחן MTT). המחקרים הראו שטיפול מקדים של 24 שעות בתאים בקוורצטין גורם לעלייה במספר התאים החיים ביחס לתאים שטופלו ב-H2O2. Suematsu et al. [13] דיווחו על תופעות דומות.

מדדנו גם את רמת ה-MDA, שהוא סמן ביולוגי של עקה חמצונית כתוצר סופי של חמצון שומנים [33]. טיפול מקדים בתאים עם ריכוזי קוורצטין גבוהים, ואחריו הוספת מי חמצן, הביא לעלייה קלה בתכולת MDA בהשוואה לתאים שנחשפו ל-HO, לבד. ייתכן שהסיבה לכך היא שקוורצטין (בריכוזים גבוהים יותר) יכול גם לעבור הפעלה מפחיתה תחמוצת ולהיות נושא למחזור חיזור, ויוצר מיני חמצן תגובתיים תוך תאי [34].

לא היו שינויים משמעותיים בהרס הממברנה (כפי שמצוין על ידי רמת LDH ללא שינוי) של תאים שטופלו בקוורצטין ו-H2O2 בהשוואה למקרה שבו תאים היו חשופים ללחץ חמצוני בלבד. לכן, ניתן להסיק שלמרות עלייה בפרוקסידציה של שומנים (בריכוזי קוורצטין גבוהים), הדבר לא היה משמעותי מספיק כדי להרוס את הממברנות ולשבש את המשכיותם.

התצפיות שהתקבלו עבור המערכת המקומית עומתו עם אלו שהתקבלו עבור מערכת מודל שבה ניתן לשלוט בדיוק גם בריכוז הקוורצטין וגם ברמת המתח. נבדק כיצד החלק השומני של קרום הנוירובלסטומה עמיד בפני עקה חמצונית. תנאי לחץ נוצרו על ידי החדרת אוזון למאגר, שבו האוזון בסביבת המים עובר תגובות פירוק היוצרות רדיקלים חמצוניים, בין היתר רדיקלי הידרוקסיל ורדיקלי אניון סופראוקסיד [35]. התערובת המתקבלת של מיני חמצן תגובתיים תואמת לאלה המופיעים באופן טבעי בתאים, עקב חוסר האיזון בהפרעה במצב החיזור [36-38].

בהשפעת הלחץ, צורת האיזותרמיות השתנתה, מה שמעיד על ירידה משמעותית בשטח לכל מולקולה בודדת במונו-שכבה הדחוסה בצפיפות. שינויים כאלה התרחשו עקב חמצון של קשרים בלתי רוויים בשרשרות חומצות השומן. השפעה זו גדלה עם העלייה בריכוז האוזון לכ-{{0}}.3 ppm, ואז פרמטר איזותרמי זה נשאר באותה רמה למרות העלייה ב-ROS. משמעות הדבר היא שבריכוז אוזון של כ-0.3 ppm, כל חומצות השומן הבלתי רוויות הקיימות בשכבה החד-שכבתית התחמצנו (במודל הנוירובלסטומה, הכמות הכוללת של חומצות שומן בלתי רוויות הייתה 52 אחוזים).

לשכבות חד-שכבות מחומצנות יש קשיחות משמעותית,cistanche בסיניתכפי שמיוצג על ידי הערך Cs-1 (ככל שהערך של פרמטר זה גבוה יותר, הקשיחות של השכבה גדולה יותר). בנוכחות קוורצטין, אפילו בריכוז נמוך （6.25 μM）, השינויים של הממברנה החשופה לאוזון, כפי שהוצגו על ידי שינויים בערך Alim, הופחתו באופן משמעותי (איור 5a), מה שמוכיח את הפעילות נוגדת החמצון של תרכובת זו. . עם זאת, ראוי לציין שלמרות שהקוורצטין סילק את הרדיקלים, והגן על חומצות השומן הבלתי רוויות מפני חמצון, הוא לא הפך את השינויים בנוקשות הממברנה (איור 5ב).

לפיכך, הוכח כי קוורצטין מפגין פעולה נוגדת חמצון, אך עצם נוכחותו בין מולקולות שומנים משפיעה (קובעת) את הפרמטרים של הכיור, כלומר, למרות ההגנה של שרשראות חומצות שומן מפני חמצון, קשיחות הממברנה ירדה באופן משמעותי (Cs- אני מעריך בערך 25 אחוז נמוך יותר בהשוואה לבקרה).

תוצאות אלו מצביעות על כך ששינוי הממברנה הוא הגורם העיקרי להשפעות התאיות הנובעות מנוכחות קוורצטין. עם זאת, ההשלכות של שינוי זה (שינוי איתות, הובלה) משתנות בהתאם למספר מולקולות הפוליפנול, ההרכב הראשוני של הממברנה ותפקוד התא. זה מסביר מדוע, בנסיבות שונות ובמחקרים שונים, קוורצטין מראה אפקט מגן, בעוד שבאחרים בדיוק ההפך.

במצב של עקה חמצונית גבוהה, האפקט נוגד החמצון מסייע לתא על ידי הגנה על מרכיביו מפני נזקים. עם זאת, אם הממברנות משתנות באופן משמעותי על ידי מיקום תרכובת זו בסביבתם וכתוצאה מכך להפצה של מסלולי האיתות או התחבורה על ידי שינוי קשיחות הממברנה, הדבר עלול להוביל להשפעות שליליות. יש לזכור גם שתהליכים רבים בתא מתרחשים בו זמנית, הן אלו הקשורות לממברנות והן אלו שיוצרות עקה חמצונית. ההשפעה שניתן לצפות ולמדוד על ידי קביעת רמת האינדיקטורים הספציפיים היא תמיד טוטאלית. לפיכך, ישנם מצבים בהם השפעת הקוורצטין נתפסת כטובה ולא חיובית.

4. חומרים ושיטות

4.1.חומרים

הרכב המודל של החלק השומני של קרום תאי הנוירובלסטומה נקבע על סמך עבודתם של מחברי [39-41]. פוספוליפידים: 1-oleoyl-2-palmitoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine;1-hexacosanoyl-d4-2-hydroxy-sn-glycerol-3-phosphocholine; 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-פוספוכולין; L- -phosphatidylethanolamine (מוח); sphingomyelin (מוח)-(Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL, ארה"ב). כולסטרול נרכש (Sigma-Aldrich, Darmstadt, גרמניה). היחס בין פוספוליפיד לכולסטרול היה 79 אחוז עד 21 אחוז. היחס בין חומצות שומן רוויות לבלתי רוויות היה 48 אחוז עד 52 אחוז.

הממיסים (כלורופורם, אתנול) של טוהר כימי-Poch (Gliwice, פולין); מים מפוזרים טריים המיוצרים על ידי HLP 5 Hydrolab (Straszyn, פולין). מצע התרבות, הסרום והאנטיביוטיקה נרכשו מ- CytoGen GmbH. הריאגנטים הכימיים ששימשו בניסויים התקבלו מסיגמא אלדריץ'.

4.2.תרבות התא

שורת תאי נוירובלסטומה אנושית SK-N-SH (האוסף האירופי של תרבויות תאים מאומתות (ECACC) תופח ב-10 אחוז נסיוב בקר עוברי (FBS) ב-Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), בתוספת 0.01 אחוז פניצילין -סטרפטומיצין ב-37 מעלות באווירה לחה, המכילה 5 אחוז CO2.

4.3. מדידת כדאיות התא (MTT Assay)

תאים נזרעו בצלחת באר {{0}} בצפיפות של 1×104 תאים לבאר בנפח של 0.1 מ"ל. התאים טופלו במשך 24 שעות בריכוזים שונים של קוורצטין (3.75-200 μM). לאחר זמן זה, נוספו 3 מ"מ ו-5 מ"מ מי חמצן למשך 3 שעות. עקב היעדר הבדלים בין ההשפעות של HO2 at3 וריכוזי 5 מיקרומטר, עבור מחקרים סטטיסטיים, הם טופלו כאל אותם טיפולים ותוארו כטיפול 3-5 uM H2O2.

לאחר מכן 50μL MTT（3-【4,5-dimethylthiazol-2-yl】-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) (תמיסת מניות סטרילית של 5 מ"ג/מ"ל) נוספה לתאים והודגרה למשך שעתיים ב-37 מעלות באווירה לחה של 5 אחוז CO. לאחר מכן, 0.4 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) נוספו לכל באר ונשמר במשך 10 דקות. לאחר צנטריפוגה, הצפיפות האופטית של הסופרנטנט נמדדה ב-570 ננומטר באמצעות קורא לוחות מיקרוליטר (BioTek Instruments, VT, ארה"ב).

4.4.מבחן נזק לממברנה (מבחן LDH)

מבחן הלקטט דהידרוגנאז (LDH) שימש כסמן למכלול קרום התא.

תאים בכמות של 1× 1{{10}}* תאים לבאר נזרעו בצלחת של 96-באר והודגרו בנוכחות קוורצטין （3.75-200 μM） למשך 24 שעות; לאחר מכן, נוספו 3 מ"מ ו-5 מ"מ H2O למשך 3 שעות. לצינורות המכילים 0.5 מ"ל של 0.75 מ"מ נתרן פירובט ו-10 ul NADH (140 מיקרומטר) (חוממו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות), נוספו 150 מיקרוליטר של סופרנטנט ודגגרו למשך 30 דקות. לאחר מכן נוספו 0.5 מ"ל של 2,4-dinitrophenylhydrazine לדגימה, ולאחר שעה אחת נמדדה הספיגה ב-450 ננומטר.

4.5. קביעת חמצון ליפידים (ריכוז MDA)

חמצון שומני הממברנה נאמד על ידי תגובת חומצה thiobarbituric (TBA) עם malondialdehyde (MDA). תאים נזרעו בצלחות של {{0}}בארות המכילות קוורצטין ו-H,O2 (בריכוזים ובזמנים שתוארו לעיל) בכמות של 1×104 תאים לבאר בנפח של { {10}}.25 מ"ל. לאחר הטיפול, הדגימות נאספו וצנטריפוגה (1000×&,5 דקות). לכדורים, נוספו 0.5 מ"ל של 0.5 אחוז TCA, עברו מערבולת במשך דקה אחת, והוספו באמצעות מכשירי קול למשך 5 דקות. לאחר צנטריפוגה ב-10,000×g למשך 10 דקות, נוספו 0.4 מ"ל של סופרנטנט ל-1.25 מ"ל 20 אחוז TCA עם 0.5 אחוז TBA וחומם בתרמובלוק יבש (100 מעלות) למשך 30 דקות. לאחר הקירור, הספיגה נמדדה ב-532 ננומטר באמצעות מקדם ההכחדה המולארי של MDA השווה ל-155 M-1 ס"מ-1.

4.6.ממברנות דגם

חיץ אוזון. חיץ פוספט (0.01 M, pH 7.4) היה רווי באוזון שהופק על ידי מחולל האוזון FM 500 (Grekos, פולין). ריכוז האוזון במאגר נקבע על פי באדר והויין [42].

איזותרמיות לחץ פני השטח.צמיחת הפין cistancheשוקת Langmuir (KSV, פינלנד) שימשה לרישום איזותרמי לחץ פני השטח בקצב דחיסה קבוע המתאים למהירות מחסום של 5 מ"מ לדקה. שכבת ליפידים נוצרה על ידי פיזור כמות מוגדרת של תמיסת כלורופורם ליפידים בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל על תת-הפאזה המורכבת ממאגר פוספט מימי 0.01 M, pH 7.4 עם או בלי קוורצטין, ועם או בלי אוזון. מתח פני השטח נמדד עם לוחית Pt-Wilhelmy. הניסויים בוצעו ב-25 מעלות ±1 מעלות.

4.7. ניתוח סטטיסטי

שלוש עד שש ניתוחים עצמאיים בוצעו עבור כל וריאנט שנבדק וממוצע (±SD). ההבדלים המשמעותיים בהשוואה לבקרות נאמדו על ידי ניצול נוהל SAS ANOVA. הניתוח הסטטיסטי בוצע על ידי מבחן ריבוי הטווחים של דאנקן, תוך שימוש ב-p<0.05. statistical="" tests="" were="" carried="" out="" using="" statistica="" 13.3(cracow,="">

תרומות מחבר: מושגיות, BK, BD,ו-ER-S.methodology, BKBD; תוכנה, BK, BDvalidation, BK, BD, ER-S., ABwriting - הכנת טיוטה מקורית BK, BD, ER-S., כתיבה - סקירה ועריכה, BK, BD, ER-S., ABvisualization, BK, BDsupervision, BK, BD, ER-S., AB כל המחברים קראו והסכימו לגרסה שפורסמה של כתב היד.

מימון:מחקר זה לא קיבל מימון חיצוני.

הצהרת ועדת הביקורת המוסדית: לא ישים.

הצהרת הסכמה מדעת: לא ישים.

הצהרת זמינות נתונים: הנתונים כלולים בתוך המאמר. ניגודי עניינים: המחברים אינם מצהירים על ניגוד עניינים.

מאמר זה מופק מ-Molecules 2021, 26, 4945. https://doi.org/10.3390/molecules26164945 https://www.mdpi.com/journal/molecules