מסך חדש עבור מווסתי ביטוי של החלבון הטלומרי TRF2 זיהה מולקולות קטנות הפוגעות בדיכוי החיסון תלוי TRF2 ובצמיחת הגידול

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

סיכום פשוט:החלבון הטלומרי TRF2 (Telomeric repeat-binding factor 2) מווסת בסוגי סרטן אנושיים וקשור לפרוגנוזה גרועה. תכונות אונקוגניות של TRF2 מסתמכות על תפקידו המגן על הטלומרים, אך גם על השפעות חיצוניות של התא באמצעות פעילויות מדכאות חיסוניות ואנגיוגניות. לכן, מיקוד TRF2 נראה כאסטרטגיה טיפולית אנטי-סרטנית מבטיחה. במחקר זה, פיתחנו שיטה מבוססת תאים לבדיקת מעכבי TRF2 המאפשרת לנו לזהות שתי תרכובות שמקהות את התכונות הפרו-אונקוגניות של TRF2 in vivo.

תקציר: Telomer Repetition-binding factor 2 (TRIF2) הוא תת-יחידה של קומפלקס החלבון shelterin, אשר נקשר ומגן על טלומרים מפני הפעלת תגובת נזק DNA (DDR) לא רצויה. ביטוי TRF2 ממלא תפקיד מרכזי בהזדקנות ובסרטן, כשהוא מווסת מטה במהלך ההזדקנות הסלולרית ומתבטא יתר על המידה במהלך אונקוגנזה. סרטנים המבטאים יתר על המידה TRF2 מראים לעתים קרובות פרוגנוזה גרועה. בתאי סרטן, TRF2 ממלא פונקציות מרובות, כולל הגנה על טלומרים ותפקידים אוטונומיים שאינם תאים, קידום ניאו-אנגיוגנזה ודיכוי חיסוני.פוריטנים ויטמין cאנו מציגים כאן אסטרטגיית סקר מקורית, המאפשרת זיהוי של מולקולות קטנות המקטינות או מגדילות את ביטוי TRF2. על ידי בדיקה של ספרייה קטנה של תרופות מאושרות של סוכנות המזון והתרופות (FDA), זיהינו שתי מולקולות (AR-A014418and alexidine-2HCl) שפגעו בצמיחת הגידול, ניאו-אנגיוגנזה ודיכוי חיסוני על ידי הורדת ביטוי TRF2 בעכבר דגם xenograft. תוצאות אלו תומכות באסטרטגיה הכימותרפית של הורדת ביטוי TRF2 לטיפול בגידולים אנושיים אגרסיביים ולאמת ניסוי מבוסס תא זה המסוגל לסנן מולקולות אנטי-סרטניות ואנטי-אייג'ינג פוטנציאליות על ידי אפנון רמות הביטוי TRF2.

מילות מפתח:TRF2; סרטן; הְזדַקְנוּת; בדיקת סקר מבוססת תאים; ניאו-אנגיוגנזה; דיכוי חיסוני

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

1. הקדמה

טלומרים הם מבני נוקלאופרוטאין מיוחדים שנמצאים בקצוות של כרומו-סומים ליניאריים המווסתים על ידי גורמים הקשורים לטלומרים כגון טלומראז, קומפלקסים של חלבון שלטרין ו-RNA המכיל חוזר טלומרי שאינו מקודד [1]. כאשר מווסתים כראוי, הטלומרים מגנים על הכרומוזומים מפני חוסר יציבות והזדקנות. קיצור DNA טלומרי מתרחש כחלק מהתפתחות פיזיולוגית מתוכנתת והזדקנות [2]. עם זאת, קיצור DNA מוגזם של טלומרים גורם לתסמונות פרוגרואידיות נדירות, כמו דיסקראטוזיס congenita [3]. יתרה מכך, מצבי טלומרים לא מווסתים מעורבים במספר מחלות השכיחות באוכלוסייה הכללית, כולל כמעט כל סוגי הסרטן ומספר מחלות ניווניות [4]. לפיכך, פיתוח טיפולים תרופתיים למיקוד רכיבי טלומרים ספציפיים מבטיח למנוע ולטפל במחלות כאלה.

בכל הנוגע לטלומרים ולסרטן, נקודות ביקורת של תגובת נזק לדנ"א חיוניות (DDR) נכשלות לפעמים; זה יכול להוביל לקיצור DNA טלומרי מוגזם ולסידורים חריגים של כרומוזומים, אשר בתורם יכולים לתרום לאונקוגנזה. יתר על כן, הרגולציה העליונה של טלומראז היא אירוע מפתח בהתפתחות של כ-90% מכלל סוגי הסרטן, שכן הדבר יכול להקנות צמיחה בלתי מוגבלת לתאי הסרטן [5]. מסיבה זו, עיכוב טלומראז היה היעד של מספר מחקרים המבקשים לפתח טיפולי סרטן [6]. למרות ההתקדמות האחרונה, ישנן מגבלות מסוימות לשימוש הקליני בתרופות נגד טלומראז. לדוגמה, כדי לעצור את התפשטות תאי הסרטן, יש להגיע לאורך DNA טלומרי קצר במיוחד, וההשפעות האנטי-אונקוגניות של טלומרים מקוצרים אובדות בהיעדר הגן מדכא הגידול p53 [7,8]. תקופת פיגור זו מפחיתה את היעילות הטיפולית ומגבירה תופעות לוואי פרו-הזדקנות על ידי הגבלת חידוש תאים והעדפת הפעלה של מנגנוני התארכות חלופיים מבוססי רקומבינציה [9,10].sistancheלכן, אסטרטגיות אנטי-טלומראז עשויות להיות מתאימות יותר למיקוד בתאי סרטן שכבר מכילים טלומרים קצרים קריטיים [11].

בנוסף לטלומראז, שינויים בביטוי ובפעילות של תת-יחידות מורכבות של שלטרין (TRF1,TRF2,RAP1,TIN2,TPP1 ו-POT1) מעורבים בגידול הגידול, ובמקרים מסוימים ללא תלות באורך הטלומרים [12-16]. לפיכך, הכוונה לשלטרין לטיפול בסרטן יכולה להיות חלופה מעניינת להתערבויות נגד טלומראז. תת-יחידת השל-טרין TRF2 מייצגת מועמד מעניין; TRF2 מתבטא יתר על המידה במספר מחלות ממאירות אנושיות, הן בסרטן והן בתאי כלי דם, וזה בדרך כלל קשור לפרוגנוזה גרועה [17-20]. יש לציין, ביטוי יתר של TRF2 יכול לקדם את גידול הגידולים שאינם תאים באופן אוטונומי, מה שמוביל לדיכוי חיסוני ולניאו-אנגיוגנזה[13,18-20]בפרט, הגברה של TRF2 יוצרת מיקרו-סביבה מדכאת חיסונית חזקה. על ידי שינוי הביטוי של פרוטאוגליקנים של הפראן סולפט, TRF2 מגייס ישירות ומפעיל תאים מדכאים שמקורם במיאלואידים (MDSCs) דרך מסלול TLR2 [21]. בעוד שביטוי יתר של TRF2 בתאי סרטן מעכב מאוד גיוס תאי NK במיקרו-סביבת הגידול על ידי ויסות סינתזת HSPG [13], הפעלת TLR2 של MDSC המושרה על ידי ביטוי יתר של TRF2 מובילה לעיכוב רב עוצמה של המעקב החיסוני של תאי NK עם ירידה חזקה של דה-גרנולציה של תאי NK, ייצור והרג IFNgamma [21].מה זה cistancheלפיכך, ביטוי יתר של TRF2 מקהה מאוד את השלב המוקדם של מעקב חיסוני אנטי-גידולי על ידי עיכוב ישיר של גיוס תאי NK ובעקיפין את הפונקציונליות של תאי NK באמצעות עיצוב של מיקרו-סביבה מדכאת חיסונית תלוית MDSC. כתוצאה מכך, התמקדות ב-TRF2 בסרטן עשויה להיות אסטרטגיה רבת-מכות רבת ערך באמצעות תהליכים אוטונומיים של תאים ולא אוטונומיים על ידי קידום הזדקנות כמו גם פגיעה ב-neo-angiogensis ובבריחה חיסונית.

cistanche יכול אנטי אייג'ינג

עד כה, כל התרכובות הקטנות שזוהו המכוונות ל-TRF2 פוגעות ביכולתו להגן על קצוות הכרומוזומים מפני DDR ובכך עם תופעות לוואי פוטנציאליות לקידום ההזדקנות [22]. העבודה הקודמת שלנו הוכיחה שהפחתה חלקית של ביטוי TRF2 יכולה להפוך את הגידוליות במודלים של עכברים באמצעות השפעות לא אוטונומיות של תאים, מבלי לגרום ל-DDR [13]. לפיכך סברנו כי התמקדות בהפחתת עודף TRF2 בסוגי סרטן הנובעים מביטוי יתר שלו יכולה להיות אסטרטגיה מעניינת לטיפול בסרטן ללא תופעות לוואי פרו-הזדקנות. במחקר זה, אנו מציגים פלטפורמת סינון מקורית לזיהוי תרכובות קטנות המכוונות ליציבות TRF2. אנו מראים ששני כניסות מובילות עיכבו את הפעילות הגידולית של ביטוי יתר של TRF2. מחקר זה הוכיח שניתן לשנות את ביטוי TRF2 מבחינה תרופתית וכי בדיקת ההקרנה שלנו היא שיטה אמינה לבחירת תרופות המסוגלות לווסת את רמות הביטוי של TRF2, עם תכונות אנטי-סרטניות ואנטי-אייג'ינג פוטנציאליות.

2. חומרים ושיטות 2.1.תאים

כליה עוברית אנושית (HEK)293-תאי T (ATCC CRL-1573) ותאי BJ-HELTRAs[13] גודלו ב-Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Lonza, Levallois Perret, צרפת) בתוספת עם 10 אחוז סרום עגל עוברי (FCS), 100 IU/mL פניצילין ו-100ug/mL סטרפטומיצין (Invitrogen, Cergy Pontoise, צרפת).

2.2.SDS-PAGE ו-Western Blotting

סה"כ ליזטים של תאים הוכנו, מופרדים על ידי אלקטרופורזה ונמחקו כמתואר קודם [14]. בקצרה, תאים נקצרו והוסרו במאגר תמוגה (8.76 גרם/ליטר NaCl 10 mM Tris-HCL pH7.2,0.1% SDS,0.1% Triton X -100,10 גרם/ליטר נתרן דאוקסיכולאט, 5 מ"מ חומצה אתילן-דיאמין-טטרה-אצטית (EDTA), 1{{50}} ug/mL לאופפטין, 1 מ"מ AEBSF ו-19 ug/mL אפרוטינין). לאחר מכן בוצע טיטרציה של דגימות באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA (Interchim, Monlucon, צרפת). דגימות (60 ug/מסלול) חוממו ב-95 מעלות למשך 5 דקות במאגר טעינה (500 מ"מ Tris-HCl, 100 מ"מ DTI, 2 אחוז SDS, 0.1 אחוז ברומופנול כחול, 10 אחוז גליצרול pH 6.8). לאחר מכן הועמסו דגימות על ג'לים של 10 אחוז פוליאקרילאמיד והפעילו במשך 45 דקות ב-160 V. לאחר מכן הועברו חלבונים על גבי ממברנות Immobilon-FL (Millipore, Upstate New York, ארה"ב) באמצעות Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell (Bio- ראד, הרקולס, קליפורניה, ארה"ב). ממברנות נחסמו למשך שעה אחת במאגר חסימת יירוט (LI COR, לינקולן, ניו יורק, ארה"ב) לפני דגירה של לילה ב-4 מעלות עם תערובת של נוגדנים ראשוניים (mouselgGl anti-TRF2 מדולל ב-1: 250;ו-IgGanti-Beta-actin של ארנב מדולל ב-1:10,000) במאגר של Intercept Blocking המכיל 0.5 אחוז Tween20. לאחר שטיפה ב-PBS 0.1 אחוז Tween20, ממברנות הודגרו למשך שעה בטמפרטורת החדר במאגר חסימת יירוט המכיל 0.25 אחוז Tween20 עם תערובת של נוגדנים משניים: IRDye 680 נגד עז נגד עכבר עבור נוגדן אנטי-TRF2 ו-IRDye נגד ארנבת עיזים 800CW עבור נוגדן אנטי בטא-אקטין (דילול 1:15,000).אנטי אייג'ינג cistancheנוגדנים משניים ראשוניים ו-IRDye שהיו בשימוש מפורטים להלן בטבלת הנוגדנים (טבלה 1). לבסוף, להקות חלבון הוצגו באמצעות מערכת הדמיה LiCor Odyssey 9120 (LI-COR). ביטוי TRF2 נמדד על ידי נרמול עוצמת הלהקה של TRF2 לעוצמות של פס האקטין והרקע.

2.3.אסטרטגיית שיבוט

רצף cDNA TRF2 האנושי שובט בין אתרי ההגבלה של BamHI/BclI של פלסמיד Lentiviral SFFV-GPR שהוא נגזרת HIV-SFFV-GFP-WPRE [23]. הפלסמיד SFFV-GPR מכיל מקדם וירוס ליצירת מיקוד טחול (SFV) השולט בגן פוליציסטרוני GPR הכולל רצפי cDNA לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), חלבון עמידות לפורומיצין וחלבון ניאון אדום תג (RFP)-T (S158T מוטציה תג -RFP), כל אחד מופרד על ידי רצפי E2 ו-T2 Picornaviridae. hTRF2 cDNA הוכנס באזור C-terminal של RFP-T, כדי לאפשר ביטוי של חלבון היתוך RFP-TRF2.

2.4. הפקת לנטיוירוס

לייצור lentivirus, 5 × 10* HEK 293-תאי T הועברו transfected עם 8.6 ug של SFFV-GPR או RFP-TRF2- ריק המבטאים וקטור SFFV-GPR, 8.6 ug של Lenti -Delta 8.91 ו-2.8 ug של VSV-g באמצעות טרנספקציה בתיווך סידן פוספט. תאים שעברו תרבית תורבו ב-DMEM בתוספת של 10% FCS ב-37 מעלות עם 5% CO2 בכלי 10-ס"מ. סופרנטנטים המכילים את הווירוסים החדשים שנבנו נאספו לאחר 48 שעות, ואז עברו דרך מסנן 0.45-מיקרומטר Millipore. לאחר טיטרציה של וירוסים, נעשה שימוש ביחס של 1∶1 （וירוס∶cell） כדי להדביק את שורת התאים BJ-HELTRAs, שנבחרה בשל עמידותו בפני פגמי TRF2[13].cistanche benefíciosשיבוט שהביע GFP וחלבון RFP-TRF2 המאוחד לרמות מתונות בודד אז על ידי מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS).

2.5. בדיקת ציטומטריית זרימה

תאי קו משובטים BJ-HELTRas המכילים את וקטור SFFV-GPR ומבטאים את חלבון ההיתוך RFP-TRF2 תורבו ב96-צלחות באר במדיום DMEM בתוספת של 10 אחוז FCS ו-1 אחוז פניצילין/סטרפטומיצין. לאחר 24 שעות של טיפול תרופתי, התאים עברו טריפסין ונשטפו במי מלח מבוצר פוספט (PBS) המכילים 0.5 mM EDTA ו-2 אחוז FCS לפני קיבוע עם 0.5 אחוז פורמלדהיד (FA). לאחר מכן בוצעו תאים קבועים לזרימת ציטומטריה באמצעות דגימת FacsCalibur בתפוקה גבוהה (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, ארה"ב).

2.6. תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (RT-qPCR)

RNA הכולל בודד באמצעות RNeasy Mini Kit (Qiagen, Venlo, הולנד). שעתוק הפוך בוצע באמצעות Superscript II הפוך Transcriptase (Invitrogen) עם 1 ug של RNA כולל. הביטוי של כל גן היה מנורמל לזה של GAPDH. נעשה שימוש בפריימרים הבאים: hTRF2 Fw 5'-GCTGCCTGACTIGAACAGT-3';hTRF2 Rv 5'-CCGTTCTCAACCAACCCCTC-3';hGAPDHFw5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'hGAPDH Rv 5'CGACCAGACCCA{ATA-AAGACCA{11' 14}}. 2.7.AlamarBlue

בצלחת 96-בתחתית שטוחה היטב, 5 × 103 תאים לבאר נזרעו ב-200 uL DMEMsup בתוספת של 10 אחוז FCS. ב-24 שעות לאחר הטיפול התרופתי, נוספו 10 uL של AlamarBlue (Bio-Rad) והספיגה נמדדה ב-570 ננומטר ו-600 ננומטר למשך 36 שעות בקורא צלחות Spectrostar Nano (BMGLabtech, Ortenberg, גרמניה). אחוז הפחתת החמצון של AlamarBlue נקבע כמתואר על ידי היצרן.

2.8.בעלי חיים

ניסויים בוצעו על 8- בעכברי נקבות עירום NMRI בני 12-שבוע מ-Janvier Labs (צרפת). כל הניסויים בעכברים נערכו על פי הנחיות מוסדיות מקומיות ובינלאומיות ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של IRCAN והאזורית (CIEPAL Cote d'Azur #187 ו-#188) והלאומית (משרד המחקר הצרפתי #03482.01/02482.2 ו-#02973.01/02973.2) רשויות.

2.9.ניסויים בגידול גידולים

כל עכבר עירום NMRI הוזרק תת עורית בגב עם 1 x 106 תאי BJ-HELTRas שהושעו ב-100 μL של עכברים PBS (n=8 לקבוצה). העכברים טופלו בימים 16, 18, 20 ו-22 בזריקות תוך צפקית של 100 ul של DMSO (45 אחוז), אלקסידין-2HCl (1 מ"ג/ק"ג) או AR-A014418 (5 מ"ג/ק"ג), לאחר מכן עוקב עד יום 26. הופעת הגידול הוערכה על ידי מישוש מדי יום. גודל הגידול נמדד כל 2-3 ימים באמצעות קליפר. לאחר מכן נקבע נפח הגידול באמצעות הנוסחה ההמי-אליפסואידית:π×(L×1×h)/6, כאשר L מתאים לאורך,I לרוחב ו-h לגובה הגידול, בהתאמה.

2.10. מבחני תקע מטריגל

תאי BJ-HELTRAs טופלו ב-DMSO (1 אחוז), אלקסידין-2HCl (1 uM) או AR-A014418 （10 מיקרומטר למשך יומיים. לאחר מכן, 100 μL של תאים שטופלו ב-1 × 10 מעלות שהושעו ב-PBS יחד עם 400 ul של Matrigel מופחתת גורם גדילה (קורנינג, ניו יורק, ארה"ב) חוסן תת עורית לחלק האחורי של עכברי NMRI עירומים בהרדמה איזופלורנית. ביום ה-5 שלאחר החיסון, פקקי המטריגל נקצרו, ותאים חודרים נאספו על ידי ניתוק אנזימטי באמצעות דיספאזה (Corning), קולגנאז A (Roche, Bale, שוויץ) ועיכול DNAseI (Roche) למשך 30 דקות ב-37 מעלות [13] ]. התאים היו רוויים במשך 15 דקות על קרח עם נוגדני Fe-Block anti-CD16/CD32 (שיבוט 2.4G2) לפני צביעה בנוגדנים מצמודים למשך 30 דקות ב-4 מעלות. הנוגדנים המצומדים בשימוש מופיעים בטבלת הנוגדנים. תאים נשטפו ב-PBS עם 0.5 מ"מ EDTA, 2 אחוז FCS וקובעו עם 0.5 אחוז FA. תאים מוכתמים נותחו באמצעות ציטומטר ARIA III עם תוכנת DIVA6 (BD Biosciences) ו-FlowJo 10(LLC).

2.11.סטטיסטיקה

כל הגרפים והניתוחים הסטטיסטיים הופקו באמצעות תוכנת GraphPad Prism (סאן דייגו, קליפורניה, ארה"ב). כל התוצאות מיוצגות כממוצע ± סטיית תקן (sd) או ממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). הבדלים משמעותיים בין האמצעים נקבעו באמצעות מבחן דו-זנב של מאן-וויטני. בדיקת ה-log-rank (Mantel-Cox) שימשה לקביעת נטילת הגידול. עבור כל מבחן, עמ'<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. תוצאות

3.1.זיהוי מולקולות מעכבות TRF2

כדי לסנן תרופות המסוגלות לווסת את רמות החלבון TRF2, השתמשנו במערכת lentiviral כדי לתמלל את הגן GFP ו-RFP שהתמזגו לקצה ה-N של TRF2. בעקבות אסטרטגיה כללית שתוארה במקום אחר [23], בנינו נגיף GRT lentivirus, שבו מקדם ה-SFFV שלט בביטוי של גן פולי-ציסטרוני המקודד ל-GFP, חלבון עמידות לפורומיצין ו-RFP-TRF2 או RFP רק בתור בקרה (איור 1א). כתוצאה מכך, כל התאים שהועברו הביעו גם GFP וגם RFP-TRF2. מערכת זו תוכננה לזהות תרופות המווסתות את ביטוי TRF2, על ידי מדידת עוצמת RFP באמצעות ציטומטריית זרימה, בעוד שעוצמת ה-GFP משמשת בקרה פנימית לתעתוק של מבנה הכתב.

העברנו את ה-GRT lentiviruses לתוך fibroblasts BJ-HELTRAs אנושיים שהונצחו על ידי SV40 ו-hTERT והפכו לאונקוגניים על ידי Ras v12[13]. כדי להקל על מדידות של ויסות מעלה ומטה של ​​TRF2, שיבוט עמיד לפורומיצין שביטא בצורה מתונה גם חלבוני GFP וגם RFP-TRF2 בודד באמצעות מיון FACS ונקרא GRI-BJ-HELTRAs (איור 1A). כביקורת חיובית, טיפלנו בתאי GRT-BJ-HELTRAs עם 10 uM gemcitabine, מאפנן שתואר בעבר של יציבות TRF2 [24], במשך 24 שעות. בעוד שלא זוהה אפנון RFP בתאים שהועברו עם וקטור ריק, נצפתה הפחתה משמעותית ביחס עוצמת הקרינה הממוצעת (MFI) של RFP/GFP בתאי GRT-BJ-HELTRAs שטופלו בגמציטאבין בהשוואה לביקורת שטופלה ב-DMSO (82 אחוזים). של הבקרה; ע<0.0001)(figure 1b).moreover,="" gemcitabine="" specifically="" diminished="" rfp-trf2="" protein="" levels="" without="" affecting="" gfp="" levels="" (figure="" s1a).="" of="" note,="" we="" observed="" here="" that="" gemcitabine="" is="" reducing="" trf2="" level="" in="" contrast="" to="" the="" published="" work[24],="" a="" difference="" that="" may="" be="" explained="" by="" cell="" type="" differences="" in="" the="" dna="" damage="" response="" induced="" by="" gemcitabine="" since="" trf2="" stability="" can="" be="" altered="" in="" a="" p53-dependent="" manner="" [25].="" this="" effect="" was="" further="" confirmed="" by="" western="" blotting="" analyses="" where="" we="" observed="" that="" endogenous="" trf2="" levels="" were="" affected="" by="" gemcitabine="" treatment="" on="" untrans-duced="" bj-heltras="" cells="" (figure="" s1b).therefore,="" grt-bj-heltras="" cells="" enabled="" detection="" of="" specific="" variations="" in="" trf2="" protein="" levels="" induced="" by="" drug="" treatment.="" or="" gemcitabine="" (right="" panel)(n=""><0.001;two-tailed student'st="" test).="" (c)representative="" rfp/gfp="" flow="" cytometry="" plots="" of="" trf2="" vector-transduced="" bj-heltras="" cells="" treated="" with="" 10="" um="" of="" alexidine-2hcl,="" ar-a014418="" or="" dmso="" (left="" panel).="" box-plot="" quantification="" of="" rfp-trf2="" fusion="" (trf2="" vector)="" proftein="" levels="" following="" treatment="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418(right="" panel)(n=""><0.05;mann-whitney test).(d)representative="" western="" blotting="" showing="" reduced="" trf2="" protein="" levels="" following="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" in="" untransduced="" bj-heltras="" cells="" (left="" panel;="" full="" western="" lolotting="" image="" is="" presented="" in="" figure="" s2a).="" quantification="" of="" trf2="" protein="" levels="" after="" treatment="" with="" 10="" μm="" alexidine-2hccl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" （right="" panel)(n="2;mean" +="" standard="" error="" of="" the="" mean).(e)quarntification="" of="" trf2="" mrna="" levels="" analyzed="" by="" rt-qpcr="" after="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="">

באמצעות ציטומטריית זרימה, בדקנו 396 תרכובות פרמקולוגיות מאושרות של מינהל המזון והתרופות (FDA) המסוגלות למקד שש קטגוריות עיקריות של תהליכים ביולוגיים: תעלות יונים, פוספטאזות, קינאזות, גורמים אפיגנטיים, ליגנים קולטן גרעיני ומסלול Wnt (איור S1C) תאי GRT-BJ-HELTRAs טופלו לראשונה ב-10 uM מכל אחת מ-396 התרכובות או DMSO במשך 24 שעות לפני ניתוח ציטומטרי זרימה (איור S1D). במקרה זה, 84 תרכובות נמצאו מווסתות את רמות החלבון TRF2 (איור S1D, לוח ימין; טבלה S1), ושימשו למסך משני (איור S1E; ​​טבלה S1). במסך משני זה, בנוסף לטיפול בתאי GRT-BJ-HELTRAs עם 10 uM מהתרכובות שנבחרו, תאי BJ-HELTRAs שאינם עוברים התמרה או תאי BJ-HELTRAs שהועברו באמצעות וקטור ריק טופלו באופן דומה כדי להשליך תוצאות חיוביות שגויות פולטות אדום או אוטופלואורסצנטי ירוק או משפיע על חלבוני RFP או GFP. לאחר מכן נבחרו 18 התרכובות הטובות ביותר כדי לקבוע את יכולתן לווסת את הביטוי של TRF2 אנדוגני בתאי BJ-HELTRAs שאינם מועברו, בהתבסס על סופג מערבי (איור S2A,B טבלה S1). הגדרנו כניסות כתרכובות המווסתות ב-20 אחוז לפחות ממינון TRF2 (מעלה או מטה). באמצעות קריטריונים אלה, מתוך 18 התרופות שהוערכו על ידי Western blotting, 9 מהן הפחיתו ואחת העלתה את רמות החלבון האנדוגני TRF2 (איור S2A, טבלה S1) לאחר מכן החלטנו לבחור שתי תרכובות מבין התרופות הללו לניסויים in vivo כדי לקבוע אם הן יכולות לנטרל את ההשפעות הפרו-אונקוגניות של ביטוי יתר של TRF2. כדי להימנע מהפעלת DDR ותופעות לוואי בתאים שאינם גידוליים, בחרנו תרכובות שלא הפחיתו לרמה הגבוהה ביותר ולא לרמה הנמוכה ביותר של מינון TRF2. ביניהם, AR ו-AD תאמו את הקריטריונים הללו. שתי התרכובות הורידו את RFP-TRF2 בתאי GRT-BJ-HELTRAs כפי שניתחו על ידי ציטומטריית זרימה (איור 1C), רמות חלבון TRF2 אנדוגני כפי שמוצג על ידי ניתוח סופג מערבי (איור 1D; איור S2A,B) ורמות mRNA של TERF2 כפי שנקבע באמצעות RT -qPCR (איור 1E). יתרה מכך, טיפול בריכוזי LD50 הספציפיים של AR ו-AD הפחית את ביטוי ה-TERF2 mRNA הן בתאי BJ-HELTRAs והן בתאי BJ-HELTRas המבטאים יתר על המידה (איור S3A-C).

3.2.AR-A014418 ו-Alexidine-2HCl הפכו את הגידוליות הניתנת מרמות ביטוי גבוהות של TRF2

בשלב הבא הערכנו את ההשפעה של AR ו-AD על צמיחת הגידול. כדי לשלוט על יכולתם למקד לסרטן 2-מבטא-יתר, ניתחנו את ההשפעות האנטי-גידוליות הפוטנציאליות של AR ו-AD על תאי BJ-HELTRas סטנדרטיים וגם על תאי BJ-HELTRAs הסטנדרטיים של TRF2-. תאי BJ-HELTRAs הועברו באמצעות וקטור TRF2lentiviral או וקטור ריק, ולאחר מכן הוזרק תת עורי לעכברים עירומים. לאחר מכן העכברים טופלו ב-DMSO,1 מ"ג/ק"ג AD או 5 מ"ג/ק"ג AR בימים 16,18,20 ו-22 לאחר ההזרקה [26,27] (איור 2A). כפי שדווח בעבר [13,21], ביטוי יתר של TRF2 קידם גידול איני. קשר וצמיחה in vivo (איור 2B-D; עמ'<0.05). treatment="" with="" neither="" ar="" nor="" ad="" impacted="" tumor="" volume="" in="" bj-heltras="" cells="" transduced="" with="" the="" empty="" vector="" (figure="" 2e,="" upper="" panels)="" neither="" tumor="" growth="" rate(figure="" 2f-h).="" by="" contrast,="" both="" drugs="" induced="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" tumor="" volume="" of="" trf2-overexpressing="" xenografted="" tumors,="" leading="" to="" significantly="" smaller="" tumor="" sizes="" at="" day="" 26="" (figure="" 2e,middle=""><001)but also="" of="" the="" tumor="" growth="" rate="" (figure="" 2f-h)="" at="" each="" time-point.="" furthermore,="" the="" vol-ume="" and="" growth="" rates="" of="" trf2-overexpressing="" tumors="" treated="" by="" the="" two="" drugs="" returned="" to="" levels="" similar="" to="" those="" of="" the="" control="" tumors,="" thus="" demonstrating="" the="" trf2-specific="" selectivity="" of="" ar="" and="" ad="" (figure="" 2e,lower="" panels).these="" results="" show="" that="" ar="" and="" ad="" treatment="" reversed="" specifically="" the="" tumorigenicity="" conferred="" by="" trf2="" overexpression.="" or）="" were="" injected="" subcutaneously（1×10°cells/100μl）into="" nmri="" nude="" mice.="" the="" mice="" were="" then="" treated="" with="" dmso,alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)="" or="" ar-a014418(5="" mg/kg)="" at="" days16,18,20="" and="" 22="" post-injection,="" then="" followed="" up="" until="" day="" 26="" (n="8" mice="" per="" group).(b-d)="" the="" percentage="" of="" tumor-free="" mice="" (b)="" and="" tumor="" volumes(c)="" were="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" in="" mice="" injected="" with="" bj-heltras="" cells="" overexpressing="" trf2(trf2="" vector)="" or="" empty="" vector.="" tumor="" take="" based="" on="" palpability="" was="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" and="" is="" represented="" as="" a="" percentage="" of="" tumor-free="" mice.p="" values="" were="" determined="" using="" the="" log-rank="" mantel-cox="" test(*=""><0.05). tumor="" volumes="" were="" assessed="" at="" different="" time-points="" (mean="" ±="" standard="" deviation);="" tumor="" volume="" at="" d.ay="" 15="" is="" represented="" in="" (d).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><0.001). (e)="" tumor="" volumes="" were="" followed="" as="" in="" (c)="" after="" repetitive="" treatments="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg),="" or="" ar-a014418(5mg/kg).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><0.0001;ns: not="" significant).(f-h)="" tumor="" growth="" rate="" of="" ar-a014418(5mg/kg)treated="" mice(f,h)="" or="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)(g,h)="" treated="" mice="" were="" determined="" by="" considering="" the="" last="" day="" before="" treatment="" for="" empty="" vector="" or="" trf2="" vector="" as="" 100%.="" variations="" of="" the="" growth="" rate="" in="" both="" treatments="" over="" the="" time="" are="" represented="" in="" (f,g)="" and="" for="" each="" time-point="" (h).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><>

3.3.AR-A014418 ו-Alexidine-2HCI נגד TRF2-דיכוי חיסוני תלוי וניאו-אנגיוגנזה

כדי לקבוע אם ההשפעות האנטי-גידוליות של AR ו-AD יכולות למקד את התכונות האונקוגניות הלא-תאיות של TRF2, בחנו חדירת תאי חיסון והפעלתם כמו גם אנגיוגנזה בגידולים מטופלים. טיפלנו בתאי BJ-HELTRAs סטנדרטיים וב-TRF2-מבטאים יתר (איור S3A) עם 1 uM של AD, 10 uM של AR או DMSO במשך 48 שעות לפני ההזרקה התת עורית שלהם עם Matrigel לעכברים עירומים. תקעי מטריגל נאספו לאחר מכן 5 ימים לאחר ההזרקה כדי לנתח את המיקרו-סביבה של הגידול על ידי ציטומטריית זרימה (איור 3A). כצפוי [13,21], ביטוי יתר של TRF2 לא שינה את חדירת תאי החיסון העולמיים (CD45 פלוס תא) (איור 3B; איור S4A), אך עיכב גיוס תאי הרוצח הטבעי (NK) (איור 3C; איור S4B) ותפקוד NK -אליות (איור 3C-E; איור S4C), והגדלת חדירת MDSC (איור 3F). בתאי TRF2- המבטאים יתר על המידה תאי BJ-HELTRAs באופן ספציפי, טיפול בכל אחת מהתרופות הגביר את החדירה החיסונית הגלובלית (איור 3B; איור S4A), כמו גם את הכמות והפונקציונליות של תאי NK תוך-גידוליים (איור 3C-E; איור S4B,C). יש לציין ששתי התרופות הצילו לחלוטין את העיכוב של מעקב חיסוני בתיווך תאי NK (CD107a פלוס ו-CD69 פלוס תא NK) המושרה על ידי ביטוי יתר של TRF2 (איור 3C). זה היה קשור לירידה דרמטית בגיוס MDSC (איור 3F; איור S4D) ועם גיוס מוגבר של מונוציטים ומקרופאגים (איור 3G).

כפי שדווח בעבר [14,20], אנגיוגנזה של הגידול הייתה גבוהה יותר בגידולים המבטאים יתר על המידה TRF2- בהשוואה לגידולי ביקורת. בעוד שביטוי יתר של TRF2 הגדיל את כמות תאי האנדותל CD31 פלוס CD45- בתוך מיטת הגידול (איור 3H; איור S4E), לא זוהה הבדל בין וקטור ריק או TRF2- המבטאים יתר על המידה לאחר טיפול בשתי התרופות. ing TRF2 (TRF2 vector) או וקטור ריק טופלו ב-1uM של alexidine-2HCl או 10 מיקרומטר של AR-A014418 או DMSO יומיים לפני הזרקה תת עורית עם Matrigel (1 × 10 מעלות תאים) לעכברי NMRI עירומים( n=8). חדירת תאי חיסון ואנדותל הוערכה לאחר 5 ימים לאחר ההזרקה על ידי ציטומטריית זרימה. (ב"ה). ניתוח ציטומטריית זרימה של החדירה החיסונית של תקע המטריגל. מוצגים מספרי התאים החיסוניים החודרים לתקעי המטריגל בין תאים חיים. חדירת תאי חיסון כוללת (CD45 פלוס תאים) מוצגת ב-(B); חדירת תאי רוצח טבעי (NK) (NKp46 פלוס תאים) מוצגת ב-(C); הסתננות NK מופעלת (CD107a פלוס ו-CD69 פלוס תאי NK) מוצגת ב-(D,E); תא מדכא שמקורו במיאלואיד (MDSC;CD11b בתוספת GR1 פלוס ))הסתננות מוצגת ב-(F); חדירת מונוציטים-מקרופאגים מוצגת ב-(G) וחדירת תאי אנדותל מוצגת ב-(H).p ערכי נקבעו באמצעות Mann- מבחן ויטני(*עמ'<><><0.001;n =="" 8="" mice="" per="">

4. דיון

כאן אנו מדווחים על פיתוח של בדיקה מבוססת תאים לבדיקת תרכובות המווסתות את הביטוי של החלבון הטלומרי TRF2. על ידי סינון ספרייה קטנה של מולקולות מאושרות ה-FDA, זיהינו תרכובות שיכולות להגדיל או להקטין את רמות הביטוי TRF2. גילינו ש-AD ו-AR הורידו את ה-TRF2 והפגינו פעילות אנטי-גידולית ספציפית לתאי גידול המבטאים יתר על המידה TRF2. בהמשך להדגמת הפעילות הספציפית של ה-TRF2-, טיפול ב-AR ו-AD הציל דיכוי חיסוני וניאו-אנגיוגנזה שנגרמה על ידי ביטוי יתר של TRF2. באופן מדהים, העובדה שהחדירה החיסונית הגלובלית מוגברת עבור גידולים המבטאים יתר על המידה TRF2 לאחר טיפול ב-AR או AD, מעידה על כך שתרופות אלו חזקות יותר לשיפור התגובה החיסונית כאשר TRF2 מתבטא יתר על המידה. תרופות אלו מעכבות את ההשפעה המדכאת את מערכת החיסון של ביטוי יתר של TRF2 על ידי שחזור תפקוד תאי NK (CD107a ו-CD69 בתוספת תאי NK) ומפחיתות מאוד את חדירת ה-MDSC. זה מצביע על כך שהתרופות האלה מקהות את התוכנית הספציפית התלויה ב-TRF2- שמפעילה בריחה חיסונית ודיכוי חיסוני ועשויות לשפר את שחרור ה-Danger Associated Molecules (DAMP) שמגבירות את התגובה החיסונית במיוחד כאשר TRF2 בא לידי ביטוי יתר. יש לציין, אנו רואים ש-AR ו-AD הצילו את הפונקציות החיסוניות והפרו-אנגיוגניות של ביטוי יתר של TRF2, שני מאפיינים של ביטוי יתר TRF2 שהצגנו בעבר כבלתי תלויים ב-DDR. לפיכך, שיערנו שהשפעות ה-AR וה-AD על צמיחת הגידול אינן תלויות ב-DDR, מנגנון שנותר לתאר במלואו במחקרים נוספים. מחקר ההוכחה של הרעיון הנוכחי מספק הוכחה לכך שהפחתה תרופתית של ביטוי TRF2 יכולה להיות אסטרטגיה אנטי-סרטנית בעלת ערך

למרות ששיטת הסקר שקלה את רמות החלבון TRF2 ללא תלות ברמות התעתיק, שתי התרופות הפחיתו את רמות ה-TERF2 mRNA אנדוגני, מה שמרמז ש-AR ו-AD מכוונות לרמות מרובות של ויסות TRF2. תומך בכך, AR הוא מעכב של איתות Wnt [28], שהוא מפעיל של תעתיק TERF2 [29]. באופן כללי יותר, התרופות המכוונות למסלול איתות Wnt הועשרו במהלך שלבי ההקרנה (איור S1B-D). עדיין יש לקבוע כיצד AD, סוכן המכוון למיטוכונדריה, משפיע על ביטוי TRF2. מאחר שלסרטנים שמציגים רמות גבוהות של TRF2 יש פרוגנוזה גרועה ומפגינים עמידות מוגברת לכימותרפיה [21], AR ו-AD הם סוכנים טיפוליים בעלי עניין עבור גידולים כאלה. הפוטנציאל לנתק את הפעילויות הטלומריות והפרו-אונקוגניות של TRF2[13] מעלה את האפשרות של הורדה תרופתית של TRF2 ובכך להעניק יתרונות אנטי-סרטניים רבים ללא תופעות לוואי מזיקות פרו-הזדקנות. לכן, מחקרים עתידיים מתבקשים לקבוע את ההשפעות הסינרגטיות של תרופות אלו על רמות ביטוי TRF2 במחקרים קליניים.

למרות ש-TRF2 מווסת בסוגי סרטן אנושיים שונים [13,21], הביטוי שלו מווסת מטה במהלך הזדקנות נורמלית ופתולוגית של רקמות רבות [30,31] יתרה מכך, מספר דיווחים הכוללים מודלים של עכברים של חוסר ויסות TRF2 מדגישים את החשיבות של TRF2 ב- צומת דרכים בין הזדקנות לסרטן [31-35]. לכן, המולקולות שזוהו על ידי הליך ההקרנה המתואר כאן הן מועמדות לתרופות מעניינות, הן כסוכנים אנטי סרטניים להורדת ויסות TRF2 כפי שאושר במחקר זה, והן כסוכני אנטי אייג'ינג על ידי העלאת ויסות TRF2.

מאמר זה מופק מסרטנים 2021, 13, 2998. https://doi.org/10.3390/cancers13122998 https://www.mdpi.com/journal/cancers