מוטציית KLHL3 הומוזיגוטית חדשה כגורם לפסאודו-היפואלדוסטרוניזם אוטוזומלי רצסיבי מסוג II מאובחן מאוחר בחיים

מבוא תקציר:

Pseudohypoaldosteronism type II (PHA II) היא הפרעה מנדלית, הכוללת חמצת היפרקלמית ורמות נמוכות של רנין בפלזמה, הקשורות בדרך כלל ליתר לחץ דם. מוטציות ב-WNK1, WNK4, CUL3 ו-KLHL3 גורמות ל-PHA II, עם מוטציות דומיננטיות ב-WNK1, WNK4 ו-CUL3 ומוטציות דומיננטיות או רצסיביות ב-KLHL3. דווח על 14 משפחות עם מוטציות KLHL3 רצסיביות, עם אבחנה בגיל 3 חודשים עד 56 שנים, בדרך כלל אצל אנשים עם תפקוד כליות תקין.

שיטות: ביצענו מחקרים קליניים וגנטיים בחולה עם יתר לחץ דם היפר-קלמי והשתמשנו בהדמיות דינמיקה מולקולרית, ביטוי הטרולוגי בתאי COS7 ו-Western blotting כדי לחקור את ההשפעה של מוטציה של מחלה מועמדת KLHL3 על ביטוי חלבון WNK4.

לחץ כאן כדי לקבל ניסוח צמחי של CISTANCHE לכליות

תוצאות: המטופלת, אישה 58-בת בת ממשפחת קרובי משפחה, הראתה יתר לחץ דם, חמצת היפרקלמית מתמשכת הקשורה לכאבי שרירים חזקים, נפרוליתיאסיס, מחלת כליות כרונית (CKD) ומחלת לב כלילית. טיפול עם hydrochlorothiazide תיקן היפרקלמיה, יתר לחץ דם וכאבי שרירים. ניתוח גנטי גילה מוטציה הומוזיגוטית של p.Arg431Trp במיקום KLHL3 שמר מאוד. סימולציות הציעו יציבות מופחתת של החלבון המוטנטי, אשר אושרה על ידי Western blot. בהשוואה ל-KLHL3 מסוג פרא, העברה משותפת של p.Arg- 431Trp KLHL3 הובילה לעלייה ברמות החלבון WNK4, והוסיקה לגרום לספיגה חוזרת מוגברת של NaCl דרך הנשא הרגיש לתיאזיד ו-PHA II.

מסקנות: גם בחולים המוצגים בשלב מאוחר בחיים ובנוכחות של CKD, יש לחשוד ב-PHA II אם רמות הרנין נמוכות וחמצת היפרקלמית ויתר לחץ דם אינם מתאימים לשלב CKD, במיוחד בנוכחות היסטוריה משפחתית חשודה.

מבוא

יתר לחץ דם מערכתי עורקי משפיע על למעלה מ-1.1 מיליארד מבוגרים ברחבי העולם [1] ונחשב לגורם הסיכון החשוב ביותר שניתן לשינוי לתחלואה ותמותה מכל הסיבות ברחבי העולם [2]. לכ-90% מהחולים המבוגרים יש מה שנקרא יתר לחץ דם ראשוני או חיוני עם אטיולוגיה רב-פקטוריאלית של גנים-סביבה [2], בעוד שבשאר ניתן לזהות גורם בסיסי ליתר לחץ דם. הסיבות השכיחות ליתר לחץ דם משני הן אלדוסטרוניזם ראשוני, דום נשימה חסימתי בשינה, מחלת כליות פרנכימלית והיצרות עורק הכליה [3]. במקרים נדירים, יתר לחץ דם עובר בתורשה כתכונה מונו-גנטית. חולים מושפעים מופיעים בדרך כלל עם רמות רנין נמוכות בפלזמה, בעוד שרמות האלדוסטרון והאלקטרוליטים משתנות בהתאם לאטיולוגיה הבסיסית [4]. צורות מנדליות של יתר לחץ דם מתבטאות לעתים קרובות בילדות או בנוער. מבוגרים נחקרים רק לעתים נדירות עבור יתר לחץ דם מונו-גני; לפיכך, שכיחותו באוכלוסייה הכללית נותרה בלתי ידועה. בקבוצה שנבחרה (קריטריוני הכללה לפחות אחד מ: גיל בתחילתו פחות או שווה ל-35 שנים, יתר לחץ דם עמיד, יתר לחץ דם עם הפרעות אלקטרוליטים, חריגות הורמונליות, תוצאות הדמיה חריגות או סימנים קליניים מרמזים), נבדקו 37 גנים מועמדים, ווריאנטים פתוגניים או פתוגניים סבירים זוהו ב-33 מתוך 1,179 מקרים (2.8%) [5].

מחקר זה מתמקד בפסאודו-היפואלדוסטרוניזם מסוג II (PHA II), צורה של יתר לחץ דם מנדלאני הכולל חמצת היפרקלמית ורמות רנין נמוכות בפלזמה [6]. PHA II ידוע גם כיתר לחץ דם היפרקלמי משפחתי. זה תואר לראשונה בשנת 1964 על ידי פאבר ופאולין בזכר צעיר עם יתר לחץ דם חמור והיפרקלמיה למרות תפקוד כליות תקין [7] שאופיין עוד יותר על ידי סטוקס ועמיתיו [8] וארנולד והילי [9] והוכח כבעל נמוך פלזמה רנין. בעקבות הדיווח על ילדה בת 10- עם קומה נמוכה, יתר לחץ דם, היפרקלמיה חמורה, חומצה קלה, שיתוק תקופתי ורנין מדוכא בשנת 1970 על ידי Gordon et al. [10], התסמונת כונתה מדי פעם גם כתסמונת גורדון.

בשנת 2001 זוהו מוטציות בגנים ללא-ליזין (WNK) סרין-תראונין קינאז WNK1 ו-WNK4 כגורמים ל-PHA II [11], ומוטציות נוספות ב-KLHL3 (המקודד ל-Kelch-like 3) ו-CUL3 (מקודד). גנים של cullin 3) תוארו בשנת 2012 [12, 13]. תת-צורות PHA II הנגרמות על ידי מוטציות ב-WNK1, WNK4 ו-CUL3 הן הפרעות אוטוזומליות דומיננטיות, ואילו מוטציות KLHL3 יכולות לעבור בתורשה באופן אוטוזומלי-דומיננטי או אוטוזומלי-רצסיבי [12]. KLHL3 כולל תחום N-טרמינלי BTB, ואחריו תחום BACK ומבנה מדחף עם שישה להבים C-טרמינלי המורכב ממה שנקרא חזרות דמויות קלץ' (מוצג באיור 1d,2a). מוטציות KLHL3 דומיננטיות מתקבצות בתוך או בין להבי מדחף, בעוד שמוטציות רצסיביות מפוזרות בכל החלבון [12]. מקרים רצסיביים שכיחים פחות ממקרים דומיננטיים; בסך הכל, פורסמו 21 חולים מ-14 משפחות עם מוטציות KLHL3 רצסיביות [12-15] (טבלה 1).

הפתופיזיולוגיה הבסיסית של יתר לחץ דם ב-PHA II היא ספיגה חוזרת של NaCl מוגברת דרך הנשא הרגיש לתיאזיד (Na-Cl cotransporter, NCCT) בצינורית המפותלת המרוחק של הכליה, וטיפול בתיאזידים מתקן גם יתר לחץ דם וגם הפרעות אלקטרוליטים בחולים עם PHA II [16]. בקיצור, WNK1 ו-WNK4 מזרחנים OSR1 (גן מגיב ללחץ חמצוני 1) ו-SPAK (קינאז עשיר בפרולין-אלנין הקשור ל-Ste20-), אשר לאחר מכן מזרחנים ומפעילים NCCT [17, 18]. KLHL3 הוא מתאם מצע של ה-Ubiquitin ligase CUL3; קומפלקס KLHL3-CUL3 יוביקוויטינילט קינאזות WNK ובכך מקדם את הפירוק שלהם [19]. אובדן תפקוד Ubiquitin ligase או פגיעה בקישור ל-WNK kinases גורם לשפע WNK מוגבר, להגברת זרחון NCCT [18], ולספיגה מוגברת של NaCl באבובית המפותלת הדיסטלית. במקטעים מאוחרים יותר של הנפרון, ספיגה חוזרת של NaCl דרך ENaC (תעלת נתרן אפיתל) והפרשת K+ דרך ROMK (תעלת אשלגן כלייתי חיצונית מדולרית) מופחתת [20, 21]. עכברי נוקאאוט KLHL3 מראים היפופלזיה של הצינורית המפותלת הדיסטלית, רמות מוגברות מאוד של WNK1 ו-WNK4, והגברת זרחון OSR1, SPAK ו-NCC בכליה. יתר על כן, הם מציגים היפרקלמיה, היפרכלורמיה וחמצת מטבולית [22]. כאן אנו מדווחים על חולה עם PHA II אוטוזומלית-רצסיבית ומאפיינים את המוטציה הגנטית והפתופיזיולוגיה הבסיסית

חומרים ושיטות

הכנת DNA ורצף Sanger DNA הוכן מדגימת דם ורידי היקפית באמצעות ערכת QIAamp DNA Blood Maxi (Qiagen) לפי הוראות היצרן. PCR סטנדרטי וריצוף Sanger דו-כיווני ישיר של DNA גנומי בוצעו באמצעות פריימרים שפורסמו עבור KLHL3 [13], WNK1 ו-WNK4 [11], וה-CUL3_9F (5'-AGGAGACACTTTCTCAAACCG-3') ו-CUL3_9R (5′-TGTTTCTTCTCCAAAACAATCTACC-3′) פריימרים עבור CUL3. רצף סנגר בוצע ב-Eurofins Genomics.

יישור רצף

רצפי חלבון הומולוגיים זוהו באמצעות NCBI Protein BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) ומסד הנתונים eggNOG (http://eggnogdb.embl.de). הרצפים המוצגים כוללים KLHL3 אנושי והאורתולוגים שלו: Homo sapiens (NP_059111.2), Mus musculus (NP_001349344.2), Gallus gallus (XP_015149442.1), Danio rerio (XP_021328460.1), Ciona intestinalis (XP_009862126.1), Drosophila melanogaster (NP_724095.1), ו-Caenorhabditis elegans (NP_001254310.1) . פרלוגים אנושיים זוהו על ידי מחקר ספרותי וכוללים KLHL1 עד KLHL42 כפי שמוצג בטבלה משלימה מקוונת 1 (לכל החומר המקוון, ראה www.karger.com/doi/10.1159/000521626) [23]. רצפים יושרו באמצעות Jalview גרסה 2.10.5 [24]. מבנה הדומיין היה מ-UniProt (Q9UH77, ניגש אליו ב-13 באפריל 2021) והוצג באמצעות DOG [25].

פלסמידים ומוטגנזה מכוונת אתרים

הפלסמידים pTRE2hyg WNK4 ו-pFN21A KLHL3 היו מתנות טובות של ד"ר Shinichi Uchida (Tokyo Medical and Dental University). כדי להציג את המוטציה p.R431W, פרימרים תוכננו באמצעות Primer X (https://www.bioinformatics.org/primerx): 5′- GATGAACACGCGGTGGAGCAGTGTGG -3′ (KLHL3_ R431W{{10} }F) ו-5′- CCACACTGCTCCACCGCGTGTTCATC -3′ (KLHL3_R431W_1R). שאריות מוטציות מוצגות בהדגשה. מוטגנזה מכוונת-אתר בוצעה באמצעות ערכת ה-QuikChange Site-Directed Mutagenese עם PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ארה"ב) לפי הוראות היצרן. ה-cDNA היה ברצף Sanger ב-Eurofins Genomics. פלסמידים הוכנו באמצעות ערכת QIAGEN Plasmid Plus Maxi.

תרבות רקמות, טרנספקציה חולפת וכתם מערבי

תאי COS7 תורבו ב-DMEM + L-glutamine, 10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין (כולם Gibco, Thermo Fisher). עבור טרנספקציות, תאים נזרעו על 6-צלחות באר בצפיפות של 1.9 × 105 תאים/באר וגדלו לכ-90% צפיפות. תאים הועברו טרנסfected עם 1 מיקרוגרם pTRE2hyg WNK4 ו-2 מיקרוגרם pFN21A (וקטור ריק או KLHL3 wild type [WT]) או KLHL3 R431W cDNA באמצעות Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) לפי הוראות היצרן. שני שיבוטים עצמאיים כל אחד שימשו לטרנספקציה. ארבעים ושמונה שעות לאחר ההעברה, התאים נשטפו ב-PBS קר והוסרו ב-10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA ו-1% NP40 המכילים קוקטייל מלא של מעכבי פרוטאז (Roche, Merck). הליזאט עבר צנטריפוגה ב-20,000 גרם למשך 30 דקות ב-4 מעלות, והסופרנטנט אוחסן ב-20 מעלות. ריכוזי החלבון נקבעו בכפולות (סטנדרטיות) או בשלושה (דגימות) על ידי מבחן BCA (Pierce, Thermo Fisher) לפי הוראות היצרן. כ-20 מיקרוגרם חלבון כולל חולקו על ידי SDSPAGE והועברו לממברנת PVDF (1.5 שעות, 100 V). ממברנות נחסמו בחלב יבש 2% ב-TBST. כתם מערבי בוצע באמצעות אנטי-HaloTag ארנב פולישבטי (Promega #G9281, 1:500, 4 מעלות למשך הלילה), ולאחר מכן כביסה ודגירה עם חמור IgG אנטי-ארנב IgG (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # {{46 }}, dianova, 1:20,000, שעה בטמפרטורת החדר), שטיפה וזיהוי כימי-אור משופר (Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent, GE Healthcare). כתמים הופשטו באמצעות ROTIFree Stripping Buffer 2.0 (Carl Roth), נחסמו בחלב יבש של 2% ב-TBST למשך הלילה ב-4 מעלות, והודגרו עם עכבר חד שבטי אנטי-FLAG M2 (SigmaAldrich #F1804, Merck, 1:1,{{69} }, 1.5 שעות בטמפרטורת החדר), ואחריו IgG אנטי-עכבר של חמור IgG (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # 715-035-151, dianova, 1:20,000, שעה אחת בחדר טמפרטורה), זיהוי, הפשטה וחסימה של ECL כמפורט לעיל. לאחר מכן הודגרו כתמים עם אנטי- -אקטין עכבר חד שבטי (Sigma-Aldrich # A2228, Merck, 1:5,000, שעה אחת בטמפרטורת החדר) ו-IgG אנטי-עכבר של חמור, ולאחר מכן זיהוי ECL. להקות נכמתו באמצעות תוכנת Image Lab ב-ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad). העוצמות של רצועות שזוהו על ידי נוגדן האנטי-HaloTag ו-Anti-FLAG M2, בהתאמה, חולקו לפי עוצמות תואמות של רצועות שזוהו על ידי נוגדני אקטין אנטי- -. כדי להעריך את רמות הביטוי של KLHL3, תאים הועברו טרנסfected כאמור לעיל עם זאת באמצעות 0 מיקרוגרם, 0.5 מיקרוגרם, 1 מיקרוגרם, 2 מיקרוגרם, 4 מיקרוגרם ו-8 מיקרוגרם של pFN21A KLHL3 WT או R431W. אלקטרופורזה ג'ל וספיגה בוצעו כאמור לעיל. עבור מבחן המרדף של cycloheximide, תאים נזרעו כמתואר לעיל והועברו כמתואר לעיל, אולם עם 2 מיקרוגרם pFN21A KLHL3 WT או 4 מיקרוגרם KLHL3 R431W. ארבעים ושמונה שעות לאחר ההעברה, נוספו 100 מיקרומטר ציקלוהקסימיד, והתאים עברו ליטוש לאחר נקודות הזמן המצוינות. שלבי ניתוח נוספים היו כמפורט לעיל.

איור 2. הדמיות MD של תחומי WT ו-p.Arg431Trp (R431W) KLHL3 Kelch. תצוגה מלמעלה למטה של ​​תחום Kelch (PDBID: 4CH9), בצבע על ידי להבי מדחף (K1–K6). אתר המוטציה מסומן על ידי כוכב צהוב, והאזור המעניין בצבע אפור (שאריות 425-465), והפפטיד WNK4 (לא כלול בהדמיות) שקוף וצבוע באפור. ב הבדל ב-MSFs של תחום Kelch ממופה על עמוד השדרה של החלבון. אתר המוטציה מסומן בכוכב צהוב. הצבע האדום מצביע על חלקים דינמיים יותר (פחות יציבים) של החלבון. c RMSD של החלבון השלם (עליון), שאריות 425-465 (באמצע), וכיס הקישור WNK4- (התחתון) ממבנה הגביש לשלושה העתקים עצמאיים של הדמיה (קווים מודגשים, ממוצעים רצים). d עלילות כינור של hbonds (משמאל) ומרחק COM (אמצע) בין K3 (שאריות 425-441) ו-K4 (442-465) -להבי מדחף ואלקטרוסטטיקה של כיס קשירה (מימין). e שכבת-על מבנית של ממשק K3–K4 מהמסגרת הסופית (1.1 מיקרון) של כל העתק (WT, כחול; R431W, אפור) עם המודלים הניסיוניים/ראשוניים (שחור). עמוד השדרה של החלבון מוצג כקריקטורה, כאשר שאריות 431 מוצגות כמקלות. MSF, תנודת ריבוע ממוצעת.

הדמיית דינמיקה מולקולרית

מודל ה-WT התבסס על מבנה גבישי רנטגן (PDBID: 4CH9) של תחום Kelch האנושי במתחם עם שבר הפפטיד WNK4 [26]. אטומים חסרים ומכסים סופניים נוספו באמצעות כלי השירות psfgen בדינמיקה מולקולרית חזותית בגרסה 1.9.3 [27]. המודל המוטנטי (R431W) KLHL3 נוצר באמצעות גרסה 9.18 של Modeller [28]. טווח השאריות הסופי עבור כל מערכת היה 300-585. ה-N-ו-C-termini של דגמי WT ו-R431W נוטרלו על ידי אצטילציה ו-N-methylamidation, בהתאמה. מצבי פרוטונציה המוגדרים כברירת מחדל הוקצו לכל שארית ניתנת לטיטרציה בהתאם לניתוח עם PROPKA גרסה 3.0 [29]. הפפטיד WNK4 הוסר מהדמיות ייצור עקב ניתוק מ-KLHL3 לאחר סימולציות שיווי משקל ראשוניות.

כל הסימולציות נערכו באמצעות חבילת התוכנה GROMACS גרסה 2021 [30]. פרמטרים של שדה כוח CHARMM36m שימשו עבור אטומי חלבון [31]. יונים תוארו באמצעות פרמטרי CHARMM ברירת מחדל, ומודל TIP3P שימש עבור מים [32]. שלב זמן אינטגרציה של 1 fs שימש לשלב האיזון הראשוני, כאשר 2 fs שימשו עבור כל הסימולציות הבאות. כל הקשרים הכוללים מימן הוגבלו באמצעות LINCS [33]. אינטראקציות של ואן דר ואלס לא קשורות חושבו באמצעות פוטנציאל לנארד-ג'ונס עם רדיוס חיתוך של 1.2 ננומטר; הכוחות בוטלו בצורה חלקה בטווח של 1.2-1.0 ננומטר. כל האלקטרוסטטיקה חושבה באמצעות שיטת Ewald המוחלקת חלקיקי רשת [34] עם מרחק חיתוך אמיתי של 1.2 ננומטר. לאחר סימולציה ראשונית בהרכב האיזוקרי-איזותרמי (NVT), כל הסימולציות הבאות בוצעו בהרכב האיזוברי-איזותרמי (NPT) בטמפרטורה של 310.15 K באמצעות התרמוסטט להרחבת מהירות [35] עם קבוע זמן של 0.5 ps. התרמוסטט הוחל בנפרד על החלבון והממס (כלומר, מים ויונים); אותן קבוצות שימשו להסרת תנועת מרכז המסה (COM). לחץ של 1 בר הופעל באמצעות ברוסטט של Berendsen [36] או Parrinello-Rhman [37] באופן איזוטרופי עם קבוע זמן של 5 ps.

דגמי WT ו-R431W נפתרו בקופסה מעוקבת עם ממדים ראשוניים של 1.2 × 1.2 × 1.2 ננומטר 3. כל מערכת נוטרלה עם 150 mM NaCl. לאחר מזעור אנרגטי ראשוני בירידה התלולה ביותר, כל מערכת עברה איזון באנסמבל NVT למשך 5 ns עם מגבלות מיקום על כל אטומי החלבון. שלב שיווי משקל עוקב בוצע באנסמבל NPT במשך 5 ns עם אותם מעצורים כמו בשלב הקודם. מעצורי מיקום הוסרו מכל השרשראות הצדדיות לסימולציית האיזון הסופית של 5-ns. שלושה מבנים ראשוניים נוצרו מהשלב הסופי של שיווי משקל עבור הדמיות ייצור עצמאיות של מערכות WT ו-R431W עם כל מעצורי המיקום הוסרו. כל שכפול ייצור היה הדמיה במשך 1.1 מיקרון; 0.1 µs הראשונים הוסרו מהאנליזה.

כדי להעריך את היציבות המבנית במהלך ההדמיות, חושבו סטיות ממוצעות בריבוע (RMSDs) ממבנה הגביש עבור אטומי ה-C של החלבון כולו, כמו גם ממשק K3-K4 (שאריות 425-465) וה כיס כריכה של WNK4- (שאריות 339, 355, 360, 386, 402, 407, 432, 449, 451, 481, 498, 528 ו-577). ממוצעים רצים של עקבות ה-RMSD חושבו והוצבו עם הנתונים הגולמיים.

השפעת המוטציה על היציבות המבנית הוצגה על ידי חישוב ההבדל בתנודות הריבועיות הממוצעות של אטומי חלבון C, בממוצע על פני מסגרות והעתקים ומיפוי למבנה החלבון WT. כל הדמיות החלבון נוצרו באמצעות ChimeraX [38]. השפעת המוטציה R431W על ממשק K3 (שאריות 425-441) ל-K4 (שאריות 442-465) אופיינה בניתוח קשרי מימן (H-bond) ומרחק COM בין שתי הקבוצות. קשרי H הוערכו בכל מסגרת באמצעות הכלי GROMACS gmx hbond, עם חתכי מרחק וזווית של 3.5 Å ו-30 מעלות, בהתאמה. מרחקי COM הוערכו באופן דומה בכל פריים - התפלגות של מרחקי ה-Hbonds וגם של COM הוצגו כחלקות כינור. ממוצעים חושבו על פני מסלולים והעתקים.

האלקטרוסטטיקה של כיס הכריכה WNK4-חושבה באמצעות g_elpot [39]. מהלך הזמן של הפוטנציאל האלקטרוסטטי בכיס הקישור הוערך על ידי הגדרת נפח כדורי ברדיוס של 8 Å, במרכז הגיאומטרי של השרידים המרכיבים את כיס הקישור. כדי להעריך את השונות באלקטרוסטטיקה, חושבו ממוצעי בלוקים של 50-ns. ההתפלגות של הפוטנציאל האלקטרוסטטי בתוך כיס הקישור עבור המוטאנט WT ו-R431W הוצגה כחלקות כינור, עם ממוצעים מחושבים על פני 50- ns בלוקים ומסלולים.

השירות התומך של Wecistanche - יצואנית ה-cistanche הגדולה בסין:

דוא"ל:wallence.suen@wecistanche.com

ווטסאפ/טלפון:+86 15292862950

קנה לפרטי מפרטים נוספים:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

קבל תמצית CISTANCHE אורגנית טבעית עם 25% אכינאקוסיד ו-9% אקטוזיד לכליות