מודל חדשני של עכבר אטקסי של אטקסיה טלנגיאקטזיה הנגרמת על ידי מוטציית שטות רלוונטית מבחינה קלינית (חלק 2)

למידע נוסף אנא צור קשרdavid.wan@wecistanche.com

3.0 דיון

על ידי הגברת הלחץ הגנוטוקסי באמצעות הוספת פגיעה משנית למסלול ה-DDR, יצרנו מודל עכבר חדש המציג את הסט המקיף ביותר של תסמיני AT מכל מודל עד כה. זה כולל אטקסיה חמורה ומתקדמת הקשורה לאטרופיה של המוח הקטן והפרעות בתכונות PN יחד עם שכיחות גבוהה של סרטן ופגמים בהתפתחות תאי חיסון. יחד, מחלות נלוות אלה מקיפות את שלושת הגורמים המובילים למוות בטרם עת בAT - כל אחד תורםעד כשליש ממקרי המוות. מבין אלה, ההשפעה הבלתי-יכולה של אטקסיה היא החודרת ביותר ומדווחת על ידי מטופלים ומטפלים כבעלת ההשפעה הגדולה ביותר על איכות חייהם. מסיבה זו, הנוכחות של אטקסיה וניוון מוח הקטן במודל העכבר החדש הזה היא בעלת משמעות רבה, שכן הוא מספק לראשונה משאב לא רק להבהיר את המנגנונים של תפקוד לקוי נוירולוגי, אלא גם מודל in vivo הדרוש באופן קריטי. בדוק טיפולי AT נחוצים מאוד, כגון תרכובות הקריאה שאנו מתארים כאן. מצאנו מספר קווי דמיון בין ההתקדמות הכוללת של אטקסיה ב-Atm3535; עכברי Aptx וחולי AT. ב-AT קליני, ליקויים מוטוריים נצפים בערך בגיל שנתיים, כאשר הורים ורופאים מזהים יכולת ירודה לעבור מפעוט לשער חלק, מתואם רפלקסיבי - למרבה הצער, מעט ידוע על ליקויים מוטוריים בשלבים מוקדמים יותר עקב המחלות שכיחות נמוכה וחוסר נוכחי של בדיקות אבחון מוקדמות (Rothblum-Oviatt et al. 2016). חולים בדרך כלל לומדים ללכת ללא סיוע ותסמינים נוירולוגיים נוטים להישאר יציבים במהלך 4 עד 5 השנים הראשונות לחייהם (Rothblum-Oviatt et al. 2016). מצאנו התקדמות מוקדמת דומה של ליקויים מוטוריים ב-Atm735×R3x; עכברי Aptx^', שמזהים ליקויים מוטוריים קלים מוקדמים ב-P8 (היעדר רפלקס מיישר) ואחריו תקופה של יציבות יחסית, לפני תחילתה של אטקסיה מתקדמת וחמורה המתפתחת לאחר p210 שכללה שינויים בהליכה, רפלקס הבהלה, רעד ותנועה. פעילות. מספר שאלות חשובות עולות מתוך ממצאים אלה, כולל האם ל-ATM ו/או APTX יש תפקיד נוירו-התפתחותי ב-

מוֹחַ מְאוּרָך. מחקרים עתידיים המתמקדים בשלב המוקדם של ההפרעה יהיו קריטיים בהבנה אם המוח הקטן מתפתח כרגיל לפני תפקוד לקוי או אם ליקויים התפתחותיים הם סיבה ראשונית. כמו כן, מצאנו, בדומה לחולי AT, כי חומרת האטקסיה שהתפתחה מאוחרת הייתה משתנה, כאשר חלק מהעכברים הסתובבו עם שער אחורי מגושם ובעל צעדים גבוהים (וידאו 3) ואחרים נעים כמעט לחלוטין באמצעות עיוות של תא המטען האחורי ( Fig.1E ו-Video 4)(Rothblum-Oviatt et al.2016; Levy and Lang 2018; Boder and Sedgwick 1958). בסך הכל, מצאנו כי Atm?35×xR35×; העכברים של Aptx פיתחו אובדן מתקדם חזותי עמוק וניתן למדידה בקואורדינציה המוטורית בדומה לזה שנצפה בחולי AT, שניצל על ידי ביטוי של עותק אחד לפחות של ה-Atm או Aptx get he. אובדן הקואורדינציה המוטורית ב-AT יוחס לניוון מוחי בשל הנוירופתולוגיה הסלקטיבית יחסית שלו על פני המוח ותפקידו הסיבתי במספר צורות שונות של אטקסיה (Hoche et al.2012). עולה בקנה אחד עםחולה ATמחקרי הדמייה (Wallis et al.2007; Sahama et al.2015; Sahama et al. 2014; Dineen et al. 2020; Tavani et al. 2003; Quarantelli et al.2013), אנו מוצאים שגודל המוח הקטן ב-Atm735×R3× ; עכברי Aptx הם תחילה נורמליים, אך מתנוונים בהדרגה במקביל לשינויים בתפקוד הנוירולוגי. בעוד שאובדן רקמת המוח נחשב לגורם עיקרי לאטקסיה בבני אדם, לא ברור מנתונים קליניים אם חומרת האטקסיה היא מנבא טוב למידת ניוון המוח הקטן שנמצא לאחר המוות (Aguilar et al. 1968b: Crawford et al, 2006 : Dineen et al.2020). בכספומט?35×R35×; עכברי Aptx^, אנו מוצאים ניוון ברור הקשור להידלדלות של שכבת הדנדריט של נוירון Purkinje שקודמת לליקויים ההתנהגותיים החמורים המאוחרים. התצפיות ההיסטולוגיות שלנו ב-Atm?35xR35×; Aptx'mice מציעים ששינויים בתפקוד המוח הקטן עצמו, ולא אובדן עמוק של תאים מוחיים, מספיקים כדי לגרום לפנוטיפ האטקסי, בהתאם לתצפית של פגמים התנהגותיים לפני אובדן PN משמעותי במספר SCAs (Shakkottai et al. 2011: Lorenzetti et al. 2000; Clark et al. 1997; Jayabal et al.2016). הסיבה לכך שחסר ב-ATM ו-APTX נדרש כדי ליצור אטקסיה בעכברים כאשר אובדן של אחד מהם מספיק כדי לגרום לאטקסיה בבני אדם עדיין לא ברורה. אפשרות אחת היא שמוח המכרסם עשוי לנצל בצורה גמישה יותר מסלולים מפצים או חלבונים מיותרים תוך תגובה ל-10-20k נגעי ה-DNA המשפיעים על תאים בכל יום (Lindahl and Barnes 2000). קיימות מספר צורות של תיקון DNA כדי לעמוד באתגר זה, כולל תיקון כריתת בסיס (BER), תיקון כריתת נוקלאוטידים (NER),

לחץ כאן כדי ללמוד עוד על Cistanche

כמו גם חיבור קצה הומולוגי ולא הומולוגי (HEJ ו-NHEJ, בהתאמה), שכולם ATM ו-APTX היו מעורבים בהם (Chou et al.2015; Caglayan et al.2017; Wakasugi et al. 2014; Tumbale et al. 2018; Chatterjee and Walker 2017) לחלופין, זה עשוי להיות במקרה שחסר ב-ATM או APTX לבדו אינו משפיע בצורה מספקת על בריאות התא במהלך תוחלת החיים הקצרה יחסית של העכבר, ולכן חיסול שני החלבונים הכרחי כדי להשיג הצטברות מספקת של נזק ל-DNA שיתבטא בפרק זמן זה. אפשרות זו מתחזקת על ידי העובדה של-ATM ו-APTX יש תכונות ביוכימיות ותפקידים פונקציונליים ברורים בתגובת הנזק ל-DNA, ולכן מחסור בשניהם צפוי לגרום לפגיעה רחבה יותר ביציבות הגנום (כלומר, לחץ גנוטוקסי מוגבר). הממצא שלנו ששני חלבוני מסלול יציבות גנום נדרשים כדי לגרום לפגמים נוירולוגיים בעכברים, מרמז מאוד על אובדן ה-Oriole של ATM בתיקון ה-DNA, ולא פונקציות פוטנציאליות באיתות עקה חמצונית, מיטופאגיה או תפקוד מיטוכונדריאלי שגורמים לפגמים המוחיים ( שילה 2020). עם זאת, לא ניתן לשלול לחלוטין חלופות, שכן APTX, כמו ATM, נצפתה בתוך המיטוכונדריה של תאי המוח, שם הוא נחשב לתמוך בעיבוד ה-DNA המיטוכונדריאלי (Meagher and Lightowlers 2014; Sykora et al. 2011). מודל העכבר החדש הזה מספק כלי חדש לחקור את האפשרויות הללו ולהגדיר באופן מכניסטי כיצד אובדן ATM ו-APTX גורם בסופו של דבר להפרעה בתפקוד המוחין. ההפרעות הביו-פיזיקליות שנצפו ב-PNs שתועדו מה-AtmR35XR35X; עכברי Aptx נמצאים באופן דומה במספר דגמי עכברים אחרים של אטקסיה. זה כולל שינויים שצפינו בהתנגדות קלט PN, קיבולת ממברנה, סף ורוחב AP, שתוארו גם במודלים של עכברים של SCA כמו 1, 3 ו-7 (Stoyas et al.2020; Shakkottai et al.2011; Dell 'Orco et al.2015). יתרה מכך, ההפחתה המתקדמת בתדירות הירי של פוטנציאל הפעולה של PN שעליו אנו מדווחים מתאמת באופן חיובי עם התפתחות אטקסיה ב-AtrnR35XR35X; Aptx'עכברים מדווחים במספר רב של דגמי עכברים אטקסיים, כולל SCAs 1, 2, 3,5, 6 ו-13 וכן בכמה צורות אפיזודיות (ראה סקירה (Cook, Fields ו-Watt 2021)). בהתחשב בחפיפה המשמעותית בהפרעות PN שנצפו על פני אטקסיות רבות ושונות הנגרמות על ידי פגמים תאיים מובהקים, שחזור תדרי ירי PN AP נחשב לגישה טיפולית בעלת בסיס רחב. עם זאת, עדיין לא ברור אם ירי מופחת של PN הוא גורם סיבתי לאטקסיה. יתרה מכך, עדויות ניסויות מצביעות על כך ששינויים בפעילות PN עשויים להיות למעשה תגובה כללית לשמירה על הומאוסטזיס במהלך פגיעה מתמשכת הקשורה למחלה בפיזיולוגיה של PN (Dell'Orco et al.2015). לפיכך, נדרשים מאמצים מתמשכים בכל האטקסיות המוחיות כדי לקשר את ההפרעות הגנטיות, המולקולריות והתאיות הנגרמות על ידי מחלה לשינויים הספציפיים באיתות העצבי המוחין שבסופו של דבר מייצרים את האטקסיה. חשיבות משמעותית במאמץ זה תהיה הקביעה האם פגמים מוחיים הגורמים למחלה גורמים בדרך כלל או דיפרנציאלית לאטקסיה באמצעות אובדן תפקוד המוח הקטן (למשל, אובדן אותות מתואמים במהלך תנועה), או מהשפעה דומיננטית-שלילית (למשל, שיבוש עצבי במורד הזרם. מעגלים עם דפוסי פלט עצביים חריגים). בסופו של דבר, בעוד שלאסטרטגיה טיפולית נפוצה לטיפול באטקסיות מוחין תהיה ההשפעה הגדולה ביותר, גישה מכוונת המתייחסת לגורמים הגנטיים והמולקולריים המובהקים של תפקוד תאי עשויה להיות נחוצה כדי לפתח בהצלחה תרופה יעילה. הקשר המכניסטי בין חוסר ב-DNA תפקוד לקוי של חלבוני יציבות כמו ATM ו-APTX ו-PN רחוק מלהיות ברור. התוצאות שלנו מצביעות על כך שההשפעה של אובדן ATM ו-APTX על PNs היא מהותית, מכיוון שאיננו מוצאים שינויים בתכונות הפרה-סינפטיות של תאי גרגירים או עדות לאובדן הסלולרי שלהם (ללא שינוי בעובי GCL). יתרה מכך, בעוד שצפינו הבדלים בפלסטיות לטווח קצר של תשומות שמן זית נחותות ב-PNs חסרי ATM ו-APTX ובסוג בר, תוצאות אלו מצביעות ככל הנראה על שיבוש בהומאוסטזיס Ca2* שעלול להוביל להפחתה ב-Inositol 1,4,5- ביטוי של קולטן טריפוספט 1(ltpr1), בדומה לאלו שנצפו במודלים של SCAs 1,2 ו-3 עכברים כמו גם עכברים חסרי ATM (Kim et al.2020; Chen et al.2008; Demirci et al.2009; Shakkottai et al. al.2011). למרות שזה מספק דרך מבטיחה לבדיקה והשוואה עתידית, עדיין לא ברור, אפילו עבור SCAs, אם שינויים בהומאוסטזיס Ca²* הם הגורם הסיבתי או סתם עוד סימפטום או אפילו תגובה מפצה של PNs חולים או מופרעים (Dell 'Orco et al.2015). במערכת החיסון, ATM מעורב בתיקון של הפסקות DNA המתרחשות באופן טבעי במהלך סידור מחדש של גנים של גנים קולטן אנטיגן במבשרי תאי B ו-T, תופעה קריטית לגיוון קולטני אנטיגן (LG ו-TCR) של תאים אלה. למצוא את זהתא Tהפרופורציות בדם מופחתות באופן משמעותי עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים בבני אדם ובעכברי נוקאאוט AT (Schubert, Reichenbach ו-Zielen 2002; Hathcock et al.2013; Chao, Yang, and Xu 2000; Barlow et al.1996). צמצום זה של תאי T בפריפריה מתאם ככל הנראה עם פגם בחסינות התאית וההומורלית כאחד. חשוב לציין שדי בביטוי של עותק אחד של הגן ATM כדי לשחזר חוסרים של CD4 פלוס בדם, מה שמצביע על כך שלטיפולים המסוגלים לשחזר ביטוי ATM חלקי תהיה יעילות טיפולית. למרות שלא הערכנו את התפתחות תאי B במאמר זה, סביר להניח שמסקנות דומות יחולו על תהליך זה בהתחשב בדמיון המכניסטי שלהם (Marshall et al. 2018). כצפוי, הפחתת תאי ה-T בדם היקפי קשורה להתפתחות פגומה של תימוציטים. בתימוס מצאנו שני פגמים עיקריים. האחד, המושרה בעיקר על ידי מחסור ב-APTX, מתבטא בפגם במעבר DN3 ל-DN4 שחפף עם סידור מחדש מוקדם של מוקד ה-TCR. הפגם השני, הנגרם בעיקר על ידי מחסור ב-ATM, מתאם עם ירידה בהתקדמות של CD4*CD8 חיובי כפול לתאים חיוביים בודדים, בעיקר תימוציטים CD4'. בעוד שממצא ה-APTX היה מפתיע, מכיוון שהמחסור בו (AOA 1) אינו קשור לחסרים חיסוניים, ידוע כי APTX יוצר אינטראקציה עם חלבוני סידור מחדש של גן TCR, כולל XRCC4 (Clements et al. 2004). מחקרים עתידיים שמטרתם להגדיר את תפקידו של APTX במנגנוני חיבור קצה במהלך סידור מחדש של גן TCR יהיו

חשוב, והאפשרות שמנגנוני חיבור קצה אלטרנטיביים, כמו שימוש במיקרוהומולוגיות, מסבירים את היעדר ליקוי חיסוני בהיעדרו מצריכה חקירה נוספת (Bogue et al. 1997). השרידות של Atm?35×/R35×; Aptx'ceis ארוכים בהרבה מדגמי עכברי AT קודמים. לשם השוואה, הראשוןAT KOמודל עכבר שדווח על ידי Barlow et al. מת מטימומה בדרך כלל תוך 2-4 חודשים לאחר הלידה (Barlow et al. 1996). הירידה בהישרדות הסרטן במודלים של עכברי נוקאאוט זה ובמודלים רבים אחרים של עכברי AT היא ככל הנראה גנטית, שכן זן הרקע המכיל את המוטציה הוכח כבעל השפעות משמעותיות על שכיחות הסרטן והישרדות, עם A/J ו-C57BL/6

רקע בעל יכולת שרידות מוגברת משמעותית על פני זני BALBC ו-129S (Genik et al. 2014). העובדה שהעכברים חסרי הכספומט שלנו נוצרו על רקע C57BL/6 כנראה עומדת בבסיס; שעכברי Aptx*t לא מפתחים אטקסיה, זה תוחלת החיים הארוכה יחסית שלהם. בהתחשב בכך שה-Atm35xR35×; לא סביר שהמוות המוקדם בעכברי AT KO מונע תצפית על פנוטיפ אטקסי שאחרת יתפתח בעכברים אלה. עם זאת, לא ידוע אם הרקע C57BL/6 מעניק עמידות לפיתוח אטקסיה, כפי שקורה לסרטן. הגדרת הגורמים הגנטיים או אולי האפיגנטיים המשפיעים על חומרת המחלה יכולה לספק דרכים להתפתחות טיפולית עתידית. בהתחשב באופי הגלובלי של מוטציית האפס של ATM ו-APTX במודל העכבר שלנו, איננו יכולים לשלול לחלוטין שפגמים חוץ-מוחיים עשויים לתרום גם לפנוטיפ האטקסי החמור, ובכך לבדיקה עתידית מחוץ למוח הקטן במוח הקדמי, גזע המוח, חוט השדרה. , ואפילו שריר יצטרך להיות מוליך. בתוך המוח הקטן, בעוד שמצאנו כמה הבדלים אנטומיים בתכונות הירי של PN באזורים שונים של המוח הקטן, לא זיהינו הבדלים אזוריים ברוחב ML או צפיפות PN. עם זאת, ישנם אתגרים בשימוש באנטומיה אזורית כגורם קיבוץ במוח הקטן, מכיוון שהקפלים הפיזיים של הרקמה אינם בהכרח מתואמים עם הגבולות של תחומי מאפיינים תפקודיים, מולקולריים או פיזיולוגיים שתוארו (Apps and Hawkes 2009 ; Tsutsumi et al.2015; Gao, van Beugen, and De Zeeuw 2012; Zhou et al.2014). ניסויים המתמקדים בבחינת היקף הפגמים המוחיים בתחומים אלה יהיו חשובים במחקרים עתידיים ובהשוואה לדיווחים האנקדוטליים על הבדלים אנטומיים בחולי AT (Verhagen et al.2012; De Leon, Grover, and Huff 1976; Amromin, Boder, ו-Teplitz 1979; Monaco et al. 1988; Terplan and Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare and Lopez 1967; Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983). אמנם אנו מזהים שני שלבים פוטנציאליים בהתקדמות של אטקסיה ב-Atm735wR35x; עכברי Aptx, השלב המאוחר של אטקסיה חמורה מתפתח בבגרות בעכברים, בהשוואה לתחילת הילדות בבני אדם. זה עשוי להגביל את השימוש בו בחלק מהמחקרים הנוירו-התפתחותיים. כמו כן, הפרשנות של ניסויים עתידיים חייבת להביא בחשבון בזהירות את העובדה שהמודל החדש הזה מבטא מוטציות אפס בשני גנים של יציבות גנום בו זמנית, מצב שלא זוהה בחולים אנושיים עם AT או AOA1. לבסוף, זיהוי היכן, מתי וכיצד מחסור בכספומט גורם לפתולוגיה ואטקסיה במוח הקטן היה אתגר, שכן עכברים קודמים חסרי כספומט חסרים בדרך כלל את התכונות האופייניות הדרושות לקישור סיבתי בין חוסרים תאיים ומולקולריים לפנוטיפ האטקסי. הוגדרו כיווני חקירה מבטיחים מרובים, כולל אלו המתמקדים ברמת העצבים, כאשר ATM מעורב באיתות של מתח חמצוני (Chen et al.2003) ותפקוד סינפטי (Li et al.2009; Vail et al.2016), כמו כמו גם תפקוד גלייה, כאשר עדויות עדכניות מצביעות על כך שפתולוגיית גליה עשויה להיות גורם מוביל בפתולוגיה של המוח הקטן (Kaminsky et al. 2016; Campbell et al.2016; Petersen, Rimkus, and Wassarman 2012; Weyemi et al.2015). מודל חיה חדשני זה מספק כלי חדש לבדיקת השערות מכניסטיות בנוגע לאופן שבו מחסור בכספומט גורם לפתולוגיה מוחית ולאטקסיה. בנוסף, מודל זה עשוי לשמש בעיקר ככלי פרה-קליני קריטי לבדיקת מועמדים טיפוליים שהוצעו בעבר (Browne et al.2004; Chen et al.2003) ותרכובות ה-SMRT שלנו (Du et al. 2013). לא ניתן להפריז במגבלות החמורות של חוסר מודל פרה-קליני מתאים לבדיקות טיפוליות, במיוחד עבור הפרעות נדירות כמו AT ו-AOA1.

4.0 חומרים ושיטות

4.1 הצהרת אתיקה

מחקר זה בוצע בהתאם להמלצות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות. כל החיות טופלו לפי פרוטוקולים מאושרים של הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במכון לונדקוויסט (31374-03,31773-02) וב-UCLA(ARC-2007-082, ARC{{3} }). הפרוטוקול אושר על ידי הוועדה לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של מכון Lundquist (מספר הבטחה: D16-00213). נעשה כל מאמץ כדי למזער את הכאב והסבל על ידי מתן תמיכה בעת הצורך ובחירת נקודות קצה אתיות.

4.2 עכברים

All mice were group-housed and kept under a 12-h day/night cycle with food and water available ad libitum. Animals were housed within the general mouse house population, and not in specialized pathogen-free rooms. Older animals were made available wetted food or food gel packs on the ground of the cages as ataxia developed. Atm35 and Atm935×mice were created and provided by Dr. Hicks and colleagues at the University of Manitoba. These mice were created to contain the c.103C>מוטציית T נמצאה באוכלוסייה גדולה של צפון אפריקהבְּחולים using recombineering Gateway technology and site-directed mutagenesis. A C>T mutation at this position in the mouse Atm gene creates a TAG G stop codon. The same mutation in the human ATM gene produces a TGA G stop codon. In consideration of the use of these models for therapeutic interventions, we chose to create a mouse model for each of the two PTC codons(Fig.1A). A modified Gateway R3-R4-destination vector was used to pull out the desired region of the mouse Atm gene from a Bacterial Artificial Chromosome (BAC) and subsequently mutated to create either a TAG G stop codon at codon 35(M00001, position 103(C>T))or a TGA G stop codon (M00002, position 103 (CAG>TGA), משכפל את ה-AT PTC האנושי). האללים הגנומיים שובטו לאחר מכן לגרסה שונה של וקטור המיקוד ליונקים NorCOMM באמצעות 3-way Gateway Reaction (Bradley et al. 2012). וקטורי המיקוד שהתקבלו הועברו אלקטרופורציה לתוך תאי C2 ES (C57BI/6N, שמקורם במעבדת A. Nagy, טורונטו, קנדה) ושיבוטים ממוקדים בהצלחה זוהו על ידי בחירה עם G418 (Gertsenstein et al.2010). שילוב של קלטת המיקוד שעברה מוטציה בלוקוס הגן Atm אושר על ידי Southern blot, ועל ידי רצף של מוצרי PCR כדי לאשר את נוכחות המוטציה של Atm PTC, מיקוד ללא שגיאות במיקום Atm ורכיבים תפקודיים נטולי שגיאות של

וקטור (נתונים לא מוצגים). שיבוטי ES חיוביים שימשו להזרקת בלסטוציסט כדי להשיג את השורות הטרנסגניות. האלל הטרנסגני הכיל פרומטור-דלתא אנושי בטא-אקטין פלוקסTK1-ניאו cassette in the intron upstream of the region containing the mutated exon. This floxed cassette was subsequently excised by crossing with a Cre driver mouse(B6.C-Tg(CMV-are)1Cgn/J) to generate Atm3x+ and AtmM1(103CTMFcc, respectively) mouse lines Atm35×+ (MGI nomenclature: AtmTM1(103CAG>TGA)MFGCc;(איור 1A). גנוטייפ של שני קווי ה-Atm בוצע על ידי שימוש בפריימרים הבאים ב-Tm 62 מעלות: פריימר של גן Atm קדימה (F):5'-CCTTTGAGGCATAAGTTGCAACTTG-3'; ו-Atm gene reverse(R)primer: 5'-GTACAGTGTATCAGGTTAGGCATGC-3', יוצר תוצר אלל מסוג פראי של 151bp או תוצר אלל ממוקד של 241bp (איורים 1A, 1B). Atmn35~ ו-Atm035×v היו הוצלבה חזרה עם עכברי C57Bl/6J במשך 9 דורות (99.2 אחוזים איזוגניים) לפני שימור ההקפאה ולאחר מכן הגזרה מחדש באמצעות אמהות פונדקאיות C57BI/6J. Atm735× ו-Atm?35x ו-Atm 35×/Q35× היו מגדלים שהתקבלו מעכברים F1 אחיהם Atm35 ו-Atm835X פלוס. AtmR35×k35×: שניהם נמצאו פוריים. עכברי Aptx נוקאאוט (Aptx) נוצרו וסופקו לד"ר Mathews כעוברים מד"ר McKinnon (Ahel et al.2006), ולאחר מכן נגזרו מחדש באמצעות אמהות פונדקאיות C57Bl/6J. עכברי Aptx נמצאים על רקע מעורב של C57Bl/6 ו-129. Atm35k35; מ-Atm35X נוצרו עכברי Aptx משילובים שונים מסוג wildtype, הטרוזיגוטי והומוזיגוטי; מגדלי Aptxt נוצרו על ידי הצלבת עכברי Atm?35×R35 ו- Aptx^. קבוצה אחת של עכברי מוטציה כפולה ועכברי ביקורת תואמים שימשה במחקר ההתנהגותי האורך עבור ניתוחי הליכה ובדיקות SHERPA (איורים 2,3). קבוצות נוספות מרובות של עכברי מוטציה כפולה ועכברי ביקורת תואמים לגיל שימשו לניסויים אלקטרופיזיולוגיים, אימונוהיסטולוגיים וניסויי קוטב אנכי (איורים 4, 7). ניסויים אימונולוגיים וחלבונים בוצעו באמצעות עכברים שגדלו מהעכברים המקוריים של AtmR35× ו-Atm35× (איורים 5, 6 ו-8). גנוטייפ בוצע מדגימות רקמת אוזניים של עכברי P8-11. נעשה שימוש בשיטות PCR בזמן אמת שבוצעו על ידי Transnetyx Inc. כדי לקבוע את הגנוטיפ של כל חיה. ניתן לזהות בעלי חיים באמצעות קעקועי אצבע שניתנו במקביל לביופסיית אוזניים. פריימרים ייחודיים עבור Atm35× ו-Atm35× כמתו ושימשו לזיהוי עכברים מסוג פרא, הטרוזיגוטיים והומוזיגוטים (המפורטים לעיל). primers Aptx'and Aptx*" שימשו להערכת הגנוטיפים שלהם.

4.3 בריאות בעלי חיים

בעלי חיים נשקלו באמצעות משקל דיגיטלי לפי P8, 45, 120,210,400. מוות של בעלי חיים תועד היום שבו נמצא מת, או ביום ההמתה שבו החיות הגיעו לנקודת קצה הומאנית (חיה שלא הצליחה לתקן את עצמה בשנות ה-60, שפל שיער משמעותי המעיד על חוסר טיפוח עצמי או מצוקה מוגזמת כפי שצוין על ידי הווטרינר צוות). פגרי בעלי חיים הוקפאו מיד עם מותם, ונתיחה שלאחר המוות בוצעו במנות. סיבת המוות הסבירה נקבעה כמיטב יכולתנו בשיתוף עם וטרינר הצוות (ד"ר קטלינה גוארה) על ידי בדיקה חזותית של האיברים הפנימיים. כמה עכברים עברו קניבלציה או הושלכו בטעות על ידי צוות vivarium והיו

לכן תויגו כ"חסרים". עכברים ללא סיבת מוות חזותית ניתנת להבחין תויגו "בלתי ניתנת להגדרה". עכברים שנמצאו עם מסות ביתיות בסמוך למקום שבו התימוס בדרך כלל יהיה בעכברים צעירים, צוינו כבעלי "סרטן התימוס". סיבות מוות סבירות (למשל, כבד מוגדל, חסימת שתן) סומנו "אחר".

4.4 התנהגות

לפני ביצוע בדיקה התנהגותית כלשהי, עכברים התאקלמו לחבילת ההתנהגות למשך 20 דקות בערך. עכברים נבדקו בשעות שונות של היום, בהתאם למחזור היומי שלהם. סוללה של בדיקות התנהגות בוצעה על עכברים נאיביים מוטנטים כפולים של הגנוטיפים המצוינים בנקודות זמן שונות בהתאם להתנהגות אך באותה קבוצת עכברים. סוללת הבדיקות כללה את הערכת ה-Catwalk Gait (P45, 120,210, 400) ותת-קבוצה של מבחני SmithKline-Beecham Harwell Imperial-College ו-Royal-London-Hospital Phenotype Assessment(SHERPA) (P30 ו-400). בדיקות אלו נערכו על ידי ליבת ההתנהגות של UCLA. עכברי מוטציה כפולה ועכברים בקרה נבדקו בנוסף במבחן הקוטב האנכי. כל מכשירי ההתנהגות נמחקו עם אתנול (70 אחוז) בין כל נבדק.

ניתוח הליכה

השתמשנו במערכת ניתוח הליכה של Noldus Catwalk המיועדת למדידה אוטומטית למחצה ולנתח את ההליכה של עכברים במהלך תנועה רגילה. בקצרה, התנועה של עכברים על פני מסדרון עם תחתית זכוכית היא וידאו מוקלט ממיקום מרכזי. הדפסי כפות מודגשים בסרטון עקב תאורה קלה על פני משטח ההליכה מזכוכית. כל שלב בעכבר בסרטון מזוהה לאחר מכן באמצעות Catwalk XT (Noldus) בצורה חצי אוטומטית. ריצה עבור כל עכבר מורכבת משלושה ניסויים של אמבולציה עקבית על פני הפלטפורמה המנוטרת. רק ניסויים עקביים מתקבלים, ועכברים עשויים לקחת עד 10 ניסיונות להשלים 3 ניסויים תואמים בכל כיוון על פני המסדרון. ניסויים תואמים הוגדרו כאלה עם תנועה על פני הפלטפורמה באורך של מתחת ל-5 s ועם לא יותר מ-60 אחוז משתנה במהירות. לאחר שהונחו על הפלטפורמה, עכברים בדרך כלל רצו הלוך ושוב ללא כל צורך בהנחיית נסיין.

מוט אנכי

עכברים ממוקמים בחלק העליון של בורג בגובה 80 ס"מ כשהאף שלהם פונה כלפי מטה וכפותיהם האחוריות קרוב ככל האפשר לחלק העליון. עכברים משוחררים מיד, והזמן התחיל מיד עם המיקום.

הזמן נעצר כאשר הכפה הקדמית הראשונה נוגעת במשטח שמתחת למוט. הנטייה הטבעית של עכבר היא לטפס מיד במורד המוט, והם מקבלים עד 60 שניות לחצות את המוט, אחרת, הם נעזרים לרדת מהעמוד. ניסוי שלא הושלם מקבל אוטומטית זמן של 30 שניות, שכן 95 אחוז מהעכברים שלא ירדו תוך 30 שניות עדיין היו על הקוטב בסימן שנות ה-60. מבחני התנהגות SHIRPA נערכו על ידי אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס ההתנהגותית ב-P30

ו-P400. כל הפרמטרים מקבלים ניקוד כדי לספק הערכה כמותית. מה שמאפשר השוואת תוצאות הן לאורך זמן והן בין מעבדות שונות. כל עכבר נבדק ברצף בכל ההתנהגויות בתוך ~20-דקות פרק זמן לפני המעבר לעכבר הבא. הנסיין היה עיוור לגנוטיפ של בעלי חיים. המסך בוצע כפי שתואר קודם (Rogers et al. 1997).

התבוננות התנהגותית

המסך הראשי מספק פרופיל תצפית התנהגותי וההערכה של כל חיה מתחילה בהתבוננות בהתנהגות בלתי מופרעת בצנצנת צפייה (קוטר 10 ס"מ) למשך 5 דקות. בנוסף להתנהגויות הניקוד של תנוחת גוף, פעילות ספונטנית, קצב נשימה ורעד, הצופה רושם כל מקרים של התנהגות ופרכוסים מוזרים או סטריאוטיפיים, ליקוק כפייתי, נשיכה הרסנית, ורטרופולסציה (הליכה לאחור) ואינדיקציות למרחב. אִי הִתמַצְאוּת.

התנהגות זירה

לאחר מכן, העכבר מועבר לזירה (30 ס"מ x 50 ס"מ) לבדיקת עוררות העברה ותצפית על התנהגות נורמלית. הזירה מסומנת לרשת של ריבועים בגודל 10 על 10 ס"מ כדי למדוד פעילות תנועתית בתוך תקופה של 30 שניות. בזמן שהעכבר פעיל בזירה, מתועדים מדדים של תגובת הבהלה, הליכה, הרמת האגן והגבהה של הזנב.

איפוק שכיבה

בעל החיים מרוסן בתנוחת שכיבה כדי לתעד התנהגויות אוטונומיות. במהלך הערכה זו, הוערכו חוזק האחיזה, טונוס הגוף, רפלקס הפינה, רפלקס הקרנית, צביטה בבוהן, תמרון החוט וקצב הלב.

איזון והתמצאות

לבסוף, בוצעו מספר מדדים של תפקוד המערכת הוסטיבולרית. בוצעו בדיקות רפלקס יישור, רפלקס יישור מגע וגיאוטקסיס שלילי. במהלך ההליך הזה נרשמו קולות, הטלת שתן ופחד כללי, עצבנות או תוקפנות.

ציוד בשימוש

1.זירת פרספקס שקופה (מידות פנימיות בקירוב 55x33x18 ס"מ). על רצפת הזירה יריעת פרספקס מסומנת ב-15 ריבועים (11 ס"מ). חוט אופקי קשיח (קוטר 3 מ"מ) מאובטח לרוחב הפינה הימנית האחורית כך שהחיות לא יוכלו לגעת בצדדים במהלך תמרון החוט. רשת (40x 20 ס"מ) עם רשת של 12 מ"מ (בערך) מאובטחת לרוחב הקופסה למדידת מתלי זנב והתנהגות חוזק האחיזה. 2. גליל פרספקס שקוף (15 x ll ס"מ) שימש כצנצנת צפייה. 3. רצפת רשת אחת (40x 20 ס"מ) עם רשתות 12 מ"מ שעליהן עומדות צנצנות צפייה.4. ארבעה תומכים גליליים מנירוסטה (3 ס"מ אורך x 2.5 ס"מ קוטר) להעלאת רשתות מהספסל. 5. לוחית נירוסטה מרובעת אחת (13 ס"מ) להעברת בעלי חיים לזירה. 6. חתוך אורכים של 3/0 מרסילק המוחזק במלקחיים לבדיקות רפלקס הקרנית והסיבה 7. מוט דיבל מפלסטיק הושחז לנקודת עיפרון כדי לבדוק ריור ונשיכה.8. זוג מלקחיים של ציוד לנתח, מעוקלים עם נקודות עדינות (מלקחיים של 125 מ"מ, פיליפ האריס סיינטיפיק, מס' ד' 46-174), עבור צביטה בבוהן. 9.שעון עצר.10. תיבת קליק IHR משמשת לבדיקת תגובות הבהלה. ה-Click Box מייצר צליל קצר של 20 קילו-הרץ ב-90dB SPL כאשר הוא מוחזק 30 ס"מ מעל העכבר. צור קשר עם פרופ' KP Steel, MRC Institute of Hearing Research, University Park, Nottingham NG7 2RD. 11. סרגל. 12. צינור פרספקס שקוף 30 ס"מ בקוטר פנימי של 2.5 ס"מ לרפלקס יישור המגע. 4.5 אלקטרופיזיולוגיה הכנת פרוסה מוחית חריפה פרוסות פרסאגיטליות חמודות בעובי 300 מיקרומטר הוכנו מהמוח הקטן של עכברים נסיוניים ובקרה. על ידי ביצוע שיטות שפורסמו (Hansen et al., 2013). בקצרה, המוח הקטן הוסרו במהירות וטבלו בתמיסה חוץ-תאית קרה כקרח בהרכב של (mM): 119 NaCl, 26 NaHCOg, 11 גלוקוז, 2.5 KCl, 2.5 CaCla, 1.3 MgCla, ו-1 NaHzPOa, pH7.4 כאשר בגז עם 5 אחוז CO-/95 אחוז O2. המוח הקטן נחתך בפראזגיטלית באמצעות ויברטום (Leica VT-100, Leica Biosystems, Nussloch, גרמניה) והודגרו בתחילה ב-35 מעלות למשך -30 דקות, ולאחר מכן עברו שיווי משקל ואוחסנו בטמפרטורת החדר עד לשימוש. אלקטרופיזיולוגיה חוץ-תאית הקלטות חוץ-תאיות ותוך-תאיות התקבלו מתאי עצב Purkinje (PNs) בפרוסות מפוזרות כל הזמן בתמיסה חוץ-תאית עם בועות קרבוגן ונשמרו ב-37 מעלות צלזיוס (חוץ-תאית) או 32 מעלות (תוך-תאית) ± 1 מעלות (ראה לעיל). תאים הוצגו עם אופטיקה DIC ואובייקט טבילה במים 40× (NA 0.75) באמצעות מיקרוסקופ Zeiss Examiner. פיפטות זכוכית בעלות התנגדות של ~3 MQ (דגם P-1000, Sutter Instruments, Novato, CA) מולאו בתמיסה חוץ-תאית והוצבו ליד גבעות אקסון PN על מנת למדוד מעברי זרם קיבוליים הקשורים לפוטנציאל פעולה במצב מהדק-מתח עם פוטנציאל הפיפטה ב-0 mV. עבור הקלטות של טלאים-מהדקים של תא שלם, פיפטות מולאו בתמיסה תוך-תאית (mM): 140 חודשים (CH3KO3S), 10 NaCl, 2 MgCl2, 0.2 CaClz, 10 HEPES, 14 Phosphocreatine (מלח טריס), 1 EGTA, 4 Mg -ATP,0.4 Na-GTP.100 מיקרומטר פיקרוטוקסין (Sigma) נוספה כדי לחסום כניסות סינפטיות GABAegeric מעכבות. הנתונים נרכשו באמצעות

מגבר MultiClamp 700B במהירות 20 או 100 קילו-הרץ במצב מתח או זרם, Digidata 1440 עם pClamp10(התקנים מולקולריים, Sunnyvale, קליפורניה) ומסונן ב-2 עד 4 קילו-הרץ. התנגדות הסדרה הייתה בדרך כלל בין 10 ל-15 MQ. עמידות סדרתית טופלה ב-80 אחוזים עבור ניסויים פלסטיים קצרי טווח בלבד. עבור הקלטות חוץ-תאיות, בסך הכל נרשמו 20 עד 45 PNs מכל חיה בכל הגנוטיפים, המינים וקבוצות הגיל. ההקלטות הופצו על פני הציר המדיאלי-לטרלי וגם הציר הרוסטרוקאודלי של המוח הקטן. נבדקו רק תאים בעלי מראה "בריא" (ניגודיות נמוכה של גבולות תא) וקצב ירי קבוע ללא הפרעה. במהלך הניתוח, נמצאו לכמה תאים פערים בירי של יותר מ-2 שניות, ותאים אלו בוטלו מהניתוח, מכיוון שסוג ירי זה קשור להיות "לא בריא". רקמה מוטנטית כפולה לא הייתה שונה מבחינה איכותית ב הופעה תחת מיקרוסקופיה DIC לפני ההקלטות, וגם מספר התאים ה"לא בריאים" לא היה גדול מזה של גנוטיפים אחרים (7 אחוזים לעומת 4 עד 11 אחוזים מכלל התאים בגנוטיפים בקרה ב-P400). השוואה מרחבית של פעילות עצבית התקבלה על ידי רישום מקטעים סדרתיים בפלקולוס, פרוסות לרוחב (2"ד או 3'), ביניים (6" או 7) ומדיאליות (11" או 12t). קבוצות הגיל הצעירות יותר (P45 ו-110) כדי להתאים באופן גס את המיקום היחסי של ההקלטות על פני קבוצות הגיל. 0-3 הקלטות בוצעו מכל אונה בתוך כל פרוסה בהתאם לאיכות הרקמה ובריאותו. כל הקלטה נמשכה {{29} } דקה. 3 עד 5 עכברים שימשו עבור כל קבוצת גיל, והנסיין היה עיוור לגנוטיפ, גיל ומין.

הקלטות תוך-תאיות התקבלו מ-PNs באונה IIl או VIl של המוח הקטן המדיאלי (כלומר, vermis); לא נצפו הבדלים סטטיסטיים במאפיינים בין האונות.

ניתוחים

מרווחי אינטרוולים עם פוטנציאל פעולה ספונטני זוהו ונותחו באמצעות שגרות סטנדרטיות ומותאמות אישית ב-ClampFit (התקן מולקולרי), GoPro (Wavemetrics) ו-Excel (Microsoft). באופן ספציפי, פוטנציאל פעולה זוהה, וסטטיסטיקות מתקדמות (כלומר, תדירות ואורך מרווח) נקבעו תוך שימוש ב-AdaptedlgorProroutines (TaroTools;https://sites.google.com/site/tarotoolsregister/). מקדם הווריאציה של מרווח הבין-ספייק הממוצע (CV) ומרווח הבין-ספייק החציוני (CV2=2 ISIn פלוס 1-ISInl/(ISIn פלוס 1 פלוס ISIn)) חושבו ב-Excel באמצעות פקודות מאקרו מותאמות אישית. מאפייני הממברנה הסטנדרטיים נותחו באמצעות lgorPro. RM נקבע על ידי ממוצע של 3 תגובות עקבות מתח לפולס צעד של -5 mV מפוטנציאל החזקה של-80 mV ומדידת סטיית הזרם שנוצרה בין 900 ל-1000 ms לאחר ההתחלה. קבוע הזמן של הממברנה נמדד על ידי התאמת מעריכי יחיד לשלב הדעיכה הראשוני מ-90 אחוז ל-10 אחוז מהשיא. CM חושב על ידי חלוקת קבוע הזמן של הממברנה באירועי RM.sEPSC שתועדו על פני תקופה של 1-דקות, זוהו ונמדדו באמצעות Neuroexpress (v21.1.13). אקסוני סיבים מקבילים ומטפסים עוררו באמצעות אלקטרודות תטא זכוכית (WPI) ומבודד גירוי מבוקר TTL (ISO-Flex, AMPI). אמפליטודות EPSC מעוררות וקבועי זמן דעיכה (1 exp. עבור מקביל ו-2 exp. עבור סיבים מטפסים) נותחו באמצעות שגרות מותאמות אישית ב-lgorPro. פוטנציאל הפעולה נבדק כחלק ממערך של הזרקות זרם של 1 שניה בין -500 ל-2250 pA (צעדים של 250 pA) עם זרם החזקה מותאם לשמירה על פוטנציאל של ~70 mV. צורות גל פוטנציאלי פעולה נמדדו באמצעות התאמה אישית

שגרות ב-lgorPro. סף פוטנציאל הפעולה הוגדר כמתח הממברנה הראשון שבו הנגזרת הראשונה עברה את 30 mV/ms (Zhu et al.2006).

4.6 בדיקת אטרופיה מוחית

גודל המוח הקטן מיד לאחר הסרת המוח מהגולגולת, התקבלה תמונה גב שלם. לאחר מכן התמונות עובדו באמצעות פיג'י (NIH). גודל המוח הקדמי והמוח הקטן הוערכו על ידי התוויה של המרחב הממדי 2- ואז חישוב השטח. נרמלנו את ההבדלים האפשריים בגודל המוח הכולל על ידי חלוקת התוצאות של המוח הקטן בגודל המוח הקדמי כדי לייצר יחס יחסי בין המוח הקטן למוח הקדמי. הנסיינים היו עיוורים לגנוטיפ של החיה. אימונוהיסטוכימיה בנקודות הקצה של המחקר המתאימות (P45, 120,210,4{{7{{104}}}}0), עכברים זכרים ונקבות מכל הגנוטיפים מיוצג במחקר זה הורדם עם איזופלורן ועבר זלוף טרנסלבבי עם מי מלח מבוצר פוספט ואחריו 4 אחוז (w/v) פרפורמלדהיד מאוחסן (PFA) ולאחר מכן נותח כדי לחלץ את המוח. תמונות של כל המוח צולמו מיד לאחר הסרת המוח מהגולגולת והמוח הוטמע ב-4% PFA למשך 24 שעות, ולאחר מכן הוגן בהקפאה ב-TBS עם 0.05% אזיד ו-30% סוכרוז למשך 72. שעות ונשמר ב-4 מעלות עד לשימוש נוסף. המוח הקטן הופרד מהמוח הקדמי וחתך פרסאגיטלי באמצעות מיקרוטום הזזה （Microm HM 430, Thermo Scientific） שהוגדר לחתך בעובי של 40 מיקרומטר. קטעי המוח הקטן נאספו בסדרה של שישה ואוחסנו ב-TBS-AF(TBS עם 30 אחוז סוכרוז, 0.05 אחוז נתרן אזיד ו-30 אחוז אתילן גליקול) ב-4 מעלות או -20 מעלות עד לשימוש נוסף. להדמיה חיסונית של נוירוני Purkinje, קטעי המוח הקטן של שני Atm*; Aptx*t ו-Atm?35×R35×; Aptx^(n=5 לכל גנוטיפ) נשטפו במשך 5 דקות ב-TBS שלוש פעמים ולאחר מכן נחסמו בסרום עיזים רגיל בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, ולאחר מכן דגירה ציפה חופשית בארנב או עכבר אנטי-קלבינדין D -28k (1:1000) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על גבי שייקר מסלולי. לאחר מכן נשטפו המקטעים במשך 5 דקות עם TBS שלוש פעמים, ולאחר מכן דגירה צפה חופשית ב-Alexa Fluor 488 נגד ארנבת עיזים או עכבר (1:1000) למשך שעה אחת בחושך בטמפרטורת החדר על שייקר אורביטלי. לאחר דגירת נוגדנים משני, קטעים נשטפו במשך 5 דקות ב-TBS שלוש פעמים, ואז הורכבו והחליקו עם Fluoromount-G עם DAPI. עבור חלקים מסוימים, נוגדנים נגד Caspase-3(1:200) ו-anti-CD68(1:400) נבדקו בנוסף במקביל ל-Calbindin באמצעות נוגדן משני של Alexa Fluor 647 (1:500). השקופיות נסרקו באמצעות Stereo Investigator (MBF Bioscience, ver.2020) על מיקרוסקופ Zeiss המצויד ב-ApoTome 2 (Carl Zeiss Microscopy, Axio Imager.M2) תוך שימוש באובייקטיב 2.5, 10,20,40 או 63x, ותמונות נלכד עם מצלמת CMOS של Hamamatsu (Hamamatsu Photonics, ORCA Flash 4.0 LT פלוס). כדי לכמת את מספר התאים התגובתיים עם קלבינדין בכל אונה בתמונות שהתקבלו, השתמשנו ב-Stereo Investigator כדי לצייר באופן אקראי 2 קווים באורך של בין 300 ל-500 מיקרומטר ב כל אונה וספרו באופן ידני את המספר הכולל של PNs לאורך בעובי 40 אום של פרוסת הרקמה בהגדלה של פי 40. לאחר מכן בוצעו צפיפות 2D (מספר PNs/(אורך ליניארי*40 אום עובי)) של שתי הדגימות לאונה. ממוצע להשוואה נוספת בין אונות ובעלי חיים. רוחבי דנדריטים PN חיוביים של Calbindin נמדדו במיקום מוגדר מראש באונה VI מכל חיה בחתכי רקמה עבים של 25 או 40 אום בהגדלה של פי 20. רוחב דנדריטי של הענפים הראשוניים והמשניים נמדד בקו האמצע בין גופי תאי ה-PN לבין קצה השכבה המולקולרית. נמדדו בין 7 ל-13 דנדריטים לכל קטע, קטע אחד לכל בעל חיים. עבור מדידות סומטיות PN, Stereo Investigator שימש לבחירה אקראית של PNs המופצים על פני כל הקטע המדיאלי בהגדלה של פי 20. רוחב ה-PN הממוצע לכל בעל חיים נקבע על ידי ממוצע תוצאות על פני 3 קטעים סדרתיים (16 עד 37 PNs לכל קטע). רוחבי PN נמדדו בניצב לשכבת ה-PN או לדנדריט היוצא אם נטויה ביותר מכמה מעלות. רוחבי השכבה המולקולרית ושכבת התא הגרנולה (מומחזים עם כתמי Calbindin ו-DAPI, בהתאמה) הוערכו ב-Stereo Investigator על ידי ממוצע של שתי מדידות רוחב במיקומים מוגדרים מראש עבור כל אונה, בערך באמצע הדרך יחד עם ההיקף הארוך של כל אונה בהגדלה של פי 2.5. CD68 חיוביות בקטעי המוח הקטן נכמתה על ידי מדידת אחוז השטח הכולל של CD68 בתוספת צביעה חיובית על פני כל הקטע המוח הקטן המדיאלי. 10x תמונות תפורות הוגדרו לבקרה השלילית וכומתו באמצעות ImageJ, קטע אחד לכל חיה. כדי לכמת את האחוז של PNs חיוביים ל-Calbindin שהיו חיוביים עבור Caspase מפוצל -3, ספרנו PNs על פני כל המוח הקטן באמצעות Stereo Investigator. שלוש תמונות תפורות בהגדלה פי 20 לכל חיה נבדקו והתוצאות היו ממוצעות. הסף לחיוביות של Caspase-3 נקבע מקטעי ביקורת שנצבעו בנוגדנים המשניים בלבד. לניתוח היסטולוגי לא פלואורסצנטי, 25-מקטעי רקמה צפים חופשיים בעובי אממ על שקופיות טעונות חיוביות וייבוש באוויר למשך הלילה. הרקמה נשטפה במי מלח מבוצר פוספט (PBS) פעמיים למשך 5 דקות, ולאחר מכן נצבעה ברצף עם 0.1 אחוז המטוקסילין ב-95 אחוז אתנול במשך ~25 שניות ו-0.5 אחוז אאוזין ב-95 אחוז אתנול במשך ~3 שניות ונשטפה במים מזוקקים כפולים לאחר מכן. כל כתם. לאחר מכן, הרקמה התייבשה למשך דקה בשטיפת 95 אחוז אתנול, 100 אחוז אתנול ו-100 אחוז קסילן, ולאחר מכן כוסתה ב-Permount. השקופיות צולמו באמצעות מצלמה צבעונית (Q Imaging, MBF Biosciences) על אותו מיקרוסקופ Zeiss ותוכנת רכישת MBF. הנסיינים היו עיוורים לגנוטיפ העכבר שבו נבדקו קטעים, וסדר הבדיקה היה שזור עבור כל המדידות ההיסטולוגיות.

4.7 מדידות ציטומטריית זרימה

ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי דם ותימוס בוצע על ידי צביעה בנוגדנים ספציפיים נגד עכברים∶CD4, CD8, CD3, CD44 ו-CD25. בקצרה, דגימות דם מלא (50 μ) נצבעו באמצעות נוגדנים עם תווית פלואורסצנטי, ואז כדוריות דם אדומות עברו ליטוש באמצעות תמיסת מזיגה BD בעוד שכדוריות דם לבנים חיים נצבעו באמצעות כתם כדאיות. תימי התנתקה מכנית. 1 עד 2 מיליון תאי תימוס נצבעו באופן דומה באמצעות נוגדנים ספציפיים עבור CD4, CD8, CD44 ו-CD25. ניתוח של תאי דם לבנים מוכתמים אימונו או דגימות תימוס בוצע באמצעות FACS ARIA l והנתונים נותחו באמצעות תוכנת FlowJo כפי שדווח בעבר (Sanghez et al. 2017).

4.8 BIots מערביים

תמציות חלבון (תאים/רקמות) הומוגגו במאגר תמוגה רדיואימוני (RIPA) (150 mM NaCl,1 אחוז Nonidet P-40 [NP-40],0 .5 אחוזים דאוקסיכולאט,0.1 אחוז SDS,50 מ"מ Tris, pH 8.0) עם מעכבי פרוטאז (10 ug/ml AEBSF, 10 ug/ml leupeptin, 5 ug/ml pepstatin, 5 ug/ml chymotrypsin, 10 אג'/מ"ל אפרוטינין). תמציות החלבון עברו צלילים ולאחר מכן נגרמו על ידי צנטריפוגה ב-13,000 סל"ד למשך 15 דקות ב-4C. בדיקת חלבון BCA שימשה לכימות ריכוזי חלבון. דגימות המכילות כמויות שוות של חלבון 50 עד 100 ug לכל נתיב הופרדו באמצעות 4 עד 12 אחוז שיפוע TGX ג'לים מראש BioRad ולאחר מכן הועברו על ידי TransBlot Semi-Dry BioRad באמצעות חבילת העברה Nitrocellulose. כתמים שהועברו נצבעו על ידי כתם Ponceau S עבור העמסת חלבון שווה ולאחר מכן נשטפו ונחסמו עם חלב יבש ללא שומן של 5 אחוזים ב-TBST למשך 60 דקות בטמפ' החדר. נוגדנים ראשוניים הודגרו עם ניעור לילה ב-4 מעלות. נבדקו כתמים עבור הנוגדנים הבאים: ATM (D2E2) איתות תא mAb של ארנב, בדילול 1:1000, -אקטין (D6A8) איתות תא mAb של ארנב, GAPDH (D16H11) איתות תא mAb של ארנב ואחריו חזרת מתאימה עם פרוקסידאז. HRP) משני נגד ארנב, נגד עכבר למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר כביסות מרובות עם TBST, ביטוי חלבון זוהה על ידי מצע chemiluminescence Radiance Plus באמצעות מערכות ההדמיה Azure c400 ו-BioRad ChemiDoc. ניתוח דנסימטרי של הכספומט בוצע באמצעות ImageJ. בוצעו ניסויים עם 2 שכפולים טכניים ו-2-3 ביולוגיים כפי שצוין.

4.9 הערכה סטטיסטית

מספר החיות שנבחרו עבור כל קבוצה התבסס על ניתוחי כוח אפריוריים באמצעות GPower v3.1 על בסיס גודל של 0.5, כוח של 0.8, וגדלים של אפקטים נאמדים מנתונים ראשוניים או לימודים קודמים. השתמשנו הן בשיטות פרמטריות (1- והן ב-2-דרך ANOVA) עבור שיטות סטטיסטיות בחלוקה נורמלית ולא פרמטרית (Kruskal Wallace) עבור נתוני מרווחים כדי לבדוק הבדלים בין קבוצות ולאחר מכן בדיקות השוואות מרובות בזוגות כפי שצוין ב הטקסט. חריגים עבור נתונים חיסוניים באיורים. 6 ו-7 לא נכללו באמצעות שיטת ROUT (ש=2 אחוז). הניתוחים הספציפיים המשמשים עבור כל מערך נתונים מצוינים בכל מקרא איור. עבור כל הנתונים: ns לא מובהק,*p פחות או שווה ל-0.05,** p<0.01,***><0.001,****><0.0001. data="" are="" reported="" as="" mean="" ±="" sem="" and="" box="" and="" whisker="" plots="" indicate="" the="" minimum,="" first="" quartile,="" median,="" third="" quartile,="" and="" maximum="" data="" values.="" all="" figures="" and="" statistical="" analyses="" were="" completed="" using="" excel="" (microsoft="" 360)="" or="" prism="" v8="" and="" 9="">