ניסוי לא אקראי שחוקר את ההשפעה של צריכת אורז חום על מיקרוביוטה של ​​המעיים, תשומת לב וזיכרון עבודה לטווח קצר בילדים בגילאי בית ספר תאילנדי חלק 2

2.4. ניתוח כמותי של מיקרוביוטה צואה

דגימות צואה נאספו מילדים בקו הבסיס, בשבועות 4, 15, 56 ו-61, ושבוע 71 במיכלים מעוקרים והוקפאו מיד ב-80 ◦C. חילוץ DNA מיקרוביאלי ומדידה כמותית של השפע המוחלט של מיקרוביוטאה צואה בוצעו כפי שתואר קודם לכן [29].

הקשר בין מדדים כמותיים לזיכרון הוא נושא שראוי למחקר. עבור בעיות רבות בחיים, בעיות זיכרון הן לרוב אלו שמטרידות אנשים, כמו חוסר יכולת לזכור דברים חשובים, שכחת זמני פגישות וכו'. בשלב זה, שיטות מדידה כמותיות יכולות לעזור לנו להבין את מצב הזיכרון ולבצע שיפורים ממוקדים. .

שיטות מדידה כמותיות יכולות לכמת את הזיכרון של אנשים באמצעים מדעיים. על בסיס זה, מוצעות כמה שיטות ספציפיות ויעילות לאימון זיכרון. בחיי היומיום, אנו יכולים גם להשתמש בשיטות פשוטות לאימון זיכרון, כמו שינון מילים, שירה וכו'. כל אלו הן דרכים יעילות לפיתוח זיכרון טוב.

יחד עם זאת, אנו יכולים גם לשפר את הזיכרון בכל היבטי החיים. למשל, אם נרצה לזכור מילת אוצר מילים חדשה, נוכל לקרוא אותה מספר פעמים, לכתוב אותה מספר פעמים או לשייך אותה למשמעות שלה, כך שהזיכרון יהיה עמוק יותר.

בעידן של פיצוץ המידע, לעתים קרובות אנו מרגישים מוצפים ממידע. הרבה פעמים אנחנו צריכים לזכור הרבה דברים, אבל אנחנו לא יודעים איך להתמודד עם המידע הזה. בשלב זה, אנו יכולים להשתמש בשיטות מדידה כמותיות כדי לקבוע את מצב הזיכרון שלנו, ולאחר מכן לאמן ולשפר בהתבסס על מצבים ספציפיים. באמצעות שיטות זיכרון סבירות, אנו יכולים לשפר ביעילות את הזיכרון שלנו ולספק יותר נוחות לחיינו ולעבודתנו.

בקיצור, הקשר בין מדידה כמותית לזיכרון הוא בלתי נפרד. עלינו להשתמש בשיטות מדעיות כדי לגלות את תנאי הזיכרון שלנו, ולאחר מכן לבצע אימון יעיל המבוסס על מצבים ספציפיים. אני מאמינה שכל עוד נתאמן ללא הפוגה, נוכל לחזק את הזיכרון ולשפר את איכות חיינו. ניתן לראות שאנו צריכים לשפר את הזיכרון, ו-Cistanche deserticola יכולה לשפר משמעותית את הזיכרון, מכיוון ש-Cistanche deserticola יכולה לווסת גם את איזון הנוירוטרנסמיטורים, כמו הגדלת רמות האצטילכולין וגורמי גדילה. חומרים אלו חשובים מאוד לזיכרון וללמידה. בנוסף, בשר יכול גם לשפר את זרימת הדם ולקדם אספקת חמצן, מה שיכול להבטיח שהמוח יקבל מספיק חומרים מזינים ואנרגיה, ובכך לשפר את חיוניות המוח וסיבולת.

לחץ על יודע תוספי מזון כדי להגביר את הזיכרון

בקצרה, DNA גנומי מיקרוביאלי הופץ מדגימות צואה באמצעות ערכת DNA לצואה של innuPREP (Analytik Jena Biometra,Jena, גרמניה), וריכוז וטוהר ה-DNA נקבעו באמצעות Take 3Micro-Volume Plate (Biotek, Winooski, VT, ארה"ב).

השפע המוחלט של גנים rRNA של microbiota16s הוכמת לאחר מכן באמצעות qPCR באמצעות Real-Time Thermal CyclersCFX96 TouchTM (Bio-Rad, סינגפור) בהתבסס על הפריימרים הספציפיים המוצגים בטבלה S1.

תנאי ה-qPCR והערכות מספר העתקות המיקרוביוטה בוצעו בעקבות הפרוטוקול הקודם [37]. מספר העותק Log10 של 16S rRNA לגרם של צואה רטובה מוצג בנתונים המשלימים שלנו.

2.5. ניתוח סטטיסטי

הפצת הנתונים נבדקה באמצעות מבחן Shapiro–Wilk ומבחן Levene (חבילת סטטיסטיקה גרסה 4.0.3). חבילת R ggplot2 שימשה להדמיית נתונים [38]. תיקון p-value (BH) של Benjamini-Hochberg (BH) הוחל לתיקון בדיקות מרובה (q-value). המובהקות נקבעה ב-q < 0.05. כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו בתוכנת R גרסה 4.0.3 [39].

ההבדלים בשפע המוחלט הממוצע של מיקרוביוטת מעיים בין קבוצות ההתערבות עבור כל נקודת זמן נקבעו על ידי בדיקת t-test או מבחן סכום דירוג Wilcoxon בהתאם לנורמליות של התפלגות הנתונים.

שינויים במיקרוביוטה של ​​המעי בין נקודות הזמן של כל שלב (בתוך הנבדקים) הוערכו באמצעות מבחני t-בצמד או מבחני דירוג חתומים של Wilcoxon בעקבות תוצאות משמעותיות מהמדדים החוזרים החד-כיוונים ANOVA או מבחן פרידמן (p < 0.05 ). שינויים בשפע המוחלט של מיקרוביוטה של ​​המעיים בין השבועות התבטאו כשינויי קיפול שעברו טרנספורמציה של log2 (Log2FCs).

הקשרים בין השפע המוחלט של מיקרוביוטה במעיים לגיל של ילדים בגיל בית ספר נקבעו באמצעות מקדם המתאם של פירסון או ספירמן.

הקשר בין מיקרוביוטה של ​​המעי והתערבות בכל נקודת זמן, תוך התאמה למשתנים דמוגרפיים (גיל, מין, BMI z-score, מצב לידה, שיא לידה ומוצא אתני), הוערך באמצעות ניתוח רב-משתני פרמוטציוני של שונות (PERMANOVA) תוך שימוש בפונקציית Adonis . כדי לחקור את השפעת ההתערבות לאורך השבועות של כל שלב, PERMANOVA בוצעה תוך שימוש במשתתפים כשכבות והתאמת משתנים. התנאי להומוגניות המבוססת על מרחק אוקלידי נמדד באמצעות פונקציית הבטאדין.

התמורה בוצעה ב-999 בחבילת R vegan(2.6-2) [40]. עוד קבענו את השפעת ההתערבות על מיקרוביוטת המעיים באמצעות ניתוח יתירות (RDA) תוך התאמה למשתנים משתנים.

הטיפולים שימשו כמשתני הסבר מוגבלים, והשפע המוחלט של מיקרוביוטה במעיים שימש כמשתני תגובה. המשמעות של אילוצים הוערכה באמצעות מבחן תמורה דמוי ANOVA (תמורה=999). בחירה שלב של משתני הסבר בוצעה באמצעות פונקציית השלב המבוססת על קריטריוני AIC.

התוצאות הקוגניטיביות בין קבוצות ההתערבות עבור כל שבוע הושוו תוך שימוש במבחן ה-t-2-דגימות של Welch או במבחן סכום הדירוג של Wilcoxon. הבדל בביצועים קוגניטיביים לאורך השבועות של כל שלב (בתוך הנבדקים) נקבע באמצעות מבחן הדרגה החתום של Wilcoxon בעקבות תוצאות משמעותיות ממבחן פרידמן (p < 0.05).

השתמשנו ב-RDA כדי לקבוע את השפעת ההתערבות על הביצועים הקוגניטיביים של ילדים בגיל בית הספר תוך התאמה לגיל ומגדר. ההשפעה של נקודות זמן על שפע המיקרוביוטה של ​​המעיים הוערכה גם באמצעות RDA תוך שימוש במשתתפים כשכבות.

מצב ה-RDA התנהל כמתואר לעיל. כדי לקבוע את הקשר בין ביצועים קוגניטיביים למיקרוביוטה של ​​המעיים, השתמשנו במקדם מתאם הדירוג של Spearman.

ניתוח ריבוי גורמים (MFA) בוצע כדי לחקור את הווריאציות במיקרוביוטה של ​​המעיים שניתן להסביר על ידי משתני ההתערבות והמארח (גיל ומין) באמצעות FactoMine R גרסה 2.4 [41] והדמיה עם Factoextra גרסה 1.0. 7 [42].

3. תוצאות

3.1. מאפיינים של ילדים בגיל בית ספר

לאחר בקרת איכות הנתונים (איור 1), ניתחנו את 85 ו-57 הילדים הנותרים בשלבים I ו-II, בהתאמה. ילדים בקו הבסיס היו בממוצע בני 7.02 ו-10.52 עבור קבוצות WR ו-SLR, בהתאמה.

מאפייני הבסיס של קבוצות הביקורת וההתערבות היו שונים באופן מובהק מבחינת גיל (p < {0}}.0001), משקל (p < 0.0001), גובה (p < 0.0001), BMI z- ציון (p=0.03), וסוג האכלה (p=0.02) (טבלה S2).
דפוס דומה נצפה גם לאורך נקודות הזמן של המחקר, למעט BMI, שלא היה שונה באופן משמעותי בין קבוצות בשבוע 71 (טבלאות S3-S7).

3.2. השפעת התערבות אורז סינלק על מיקרוביוטת המעיים של ילדים בגיל בית ספר

בהתחשב בכל אחת מנקודות הזמן, לא היו הבדלים משמעותיים בשפע המוחלט של מיקרוביוטה במעיים בין קבוצות הביקורת (WR) ו-Sinlek התערבות (SLR) בשלב הראשון של ההתערבות (שלב I; קו בסיס, שבוע 4 ושבוע 15 ).

השוואות רב-משתניות באמצעות PERMANOVA (בשוליים) הראו גם שלהתערבות בשלב I לא הייתה השפעה משמעותית על שינויים במיקרוביוטה של ​​המעי לאחר התאמה למשתנים דמוגרפיים (Supplementary File S1).

עוד קבענו קשר בין שפע המיקרוביוטה של ​​המעי לגיל ומצאנו שלקטובצילוס נמצא בקורלציה שלילית לגיל בקו הבסיס (המתאם של פירסון; R {0}} −0.24, p {{ 3}}.026) ושבוע 4 (המתאם של פירסון; R=−0.3, p=0.002) (איור 2b,d). עבור השלב השני של ההתערבות (שלב II), שינויים בשפע החיידקים, לעומת זאת, סומנו בשבועות 61 ו-71. השפע של סך החיידקים (ש=0.032) ו-Firmicutes (ש=0.032 ) עלו באופן משמעותי, בעוד שרמת Gammaproteobacteria (q < 0.0001) ירדה משמעותית בעקבות התערבות SLR בשבוע 61 (איור 2e-g).

חיידקים אלה היו גם קשורים באופן מובהק לגיל, שבו השפע של סך החיידקים (הקורלציה של פירסון; R {{0}} −0.32, p=0.0 15) ו-Firmicutes (המתאם של פירסון; R=−0.32, p=0.014, איור 2h) ירד ככל שהגיל עלה, בעוד שהשפע המוחלט של Gammaproteobacteriawa נמצא בקורלציה חיובית עם הגיל (מתאם של פירסון; R { {11}}.62, p < 0.0001, איור 2i).

בשבוע 71, רמת ה-Bacteroidetes ירדה באופן משמעותי בקבוצת ה-SLR (q < 0.0001)(איור 2j), והשפע שלה היה מתאם חיובי עם הגיל (מתאם הדירוג של ספירמן; R { {4}}.57, p < 0.0001, איור 2l).

בהתחשב בשינויים בשפע המיקרוביוטה של ​​המעי לאורך השבועות (בתוך הנבדקים) של קבוצות הביקורת וההתערבות, ראינו דפוסים דומים בשתי קבוצות המשתתפים. נראה כי Gammaproteobacteria השתנה מאוד בעקבות התערבות: השפע שלה ירד באופן משמעותי בשבוע 4 ושבוע 61 (איורים 3a,b,S1c ו-S2c, קובץ משלים S2).

עם זאת, נראה כי רמות החיידקים הללו חוזרות לאחור בנקודת הסיום של כל שלב (שבוע 15 ושבוע 71). יתר על כן, השפע של Bacteroidetes עבור קבוצת SLR היה נמוך יותר בשבוע 71 בהשוואה לשבועות 56 ו-61 (איורים 3a ו-S2e). ירידה הדרגתית בשכיחות של שני טקסונים מיקרוביאליים, דהיינו, Ruminococcus ו-Bacteroides, נצפתה גם במהלך שלב II, כאשר השפע שלהם היה הנמוך ביותר בנקודת הסיום של הניסוי (שבוע 71) (איורים 3b ו-S2f,g), ללא קשר להתערבות.

יתרה מזאת, הערכנו אם היו הבדלים בשפע של מיקרוביוטה של ​​המעי בין טיפולים ובין השבועות תוך שימוש במשתתפים כשכבות. PERMANOVA הצביע על כך שלנוכחות הטיפול ו/או נקודת הזמן (שבוע) של הניסוי במהלך שני השלבים היו השפעות שוליות משמעותיות על שפע של מיקרוביוטה במעיים (p < 0.05).

הפיזור (השונות) בין קבוצות ומודל המתייחס למשתנים דמוגרפיים בעלי מובהקות סטטיסטית מסוכמים בקובץ המשלים S3. עוד חקרנו את חוזק הקשר והשונות של מיקרוביוטה של ​​המעי הוסבר על ידי ההתערבות באמצעות RDA. הבדלים משמעותיים נמצאו רק בשלב II.

השפע של Gammaproteobacteria היה מועשר יותר בקבוצת הביקורת (WR) מאשר בקבוצת ה-SLR, בעוד שמספר גבוה יותר של חיידקים, Firmicutes ו-Bacteroidetes היו קשורים להתערבות SLR בשבוע 61 (RDA1 הסביר 30.58% מהשונות הכוללת, R2adj {{5} }.29,p=0.001, איור 3ג). בשבוע 71, השפע של Bacteroidetes היה גבוה יותר בקבוצת הביקורת מאשר בקבוצת ה-SLR (RDA1 הסביר 8.18% מהשונות הכוללת, R2adj=0.06,p=0.005, איור 3d) .

לאחר מכן המשכנו עם בחירה שלבית של משתנים מסבירים (התערבות ומשתנים דמוגרפיים) על סמך ה-AIC. המודל גילה שרק ההתערבות הסבירה באופן מובהק את השונות בפרופילי המיקרוביוטה של ​​המעיים של ילדים בגיל בית ספר (ש=0.035).

3.3. ביצועים קוגניטיביים בין קבוצות הבקרה וההתערבות

בשלב I, מצאנו הבדלים משמעותיים בין קבוצות הבקרה וההתערבות בתוצאות הקוגניטיביות. קבוצת ה-SLR הראתה ציונים גבוהים יותר באופן מובהק במבחן הקשה על בלוק Corsi (המכונה MMG, משחק התאמת זיכרון) וביצועים כלליים (OVP) במבחן הערנות הפסיכו-מוטורית (PVT-B), בעוד שזמני התגובה (RT) והפסקות היו נמוכים יותר מהביקורת. קבוצה (איור 4).

בשלב II, דפוסי הביצועים הקוגניטיביים נותרו ללא שינוי. כמו כן, השווינו ביצועים קוגניטיביים (בתוך נבדקים) על פני השבועות של כל שלב ומצאנו שקבוצת הביקורת (שלב I) תפקדה טוב יותר לגבי הפסקות בשבוע 15 בהשוואה לקו הבסיס ושבוע 4 (ש=0.02) (איור S3). RT היה גבוה יותר בשבוע 15 בהשוואה לשבוע 4 (ש=0.008), בעוד שלא זוהו הבדלים משמעותיים ב-MMG או OVP. MMG הייתה התוצאה הקוגניטיבית היחידה שהייתה גבוהה משמעותית עבור קבוצת ה-SLR (שלב I) בשבוע 15 בהשוואה לקו הבסיס (ש=0.003) ושבוע 4 (ש=0.03) (איור S4) .

בשלב II, לא היו הבדלים משמעותיים על פני השבועות באף אחת ממדידות הביצועים הקוגניטיביים בקבוצת הביקורת או ה-SLR. יתרה מכך, גיל ומגדר נכללו גם הם ב-RDA, והתוצאות לא הראו השפעה של התערבות על הביצועים הקוגניטיביים של ילדים בכל אחת מהקבוצות בכל אחת מנקודות הזמן במהלך 71 השבועות של הניסוי.

גיל, לעומת זאת, נמצא כמתאר בצורה מובהקת את השונות של התוצאות הקוגניטיביות בקו הבסיס (p=0.008), שבוע 4 (p=0.005), ושבוע 15 (p=0 .028) (איור 5), שעבורו גיל היה מתאם חיובי עם MMG ו-OVP. לא נמצאו השפעות משמעותיות שנגרמו מההתערבות, הגיל או המגדר על ביצועים קוגניטיביים בשבוע 56, שבוע 61 או שבוע 71.

כאשר שוקלים פרופילים קוגניטיביים לאורך השבועות של כל טיפול בכל שלב, הן השבוע (p=0.001) והן המגדר (p=0.001) תיארו באופן מובהק שינויים בביצועים הקוגניטיביים של קבוצת הביקורת (שלב I) , עבורם המין הנשי ושבוע 15 היו בקורלציה חיובית עם MMG ו-OVP (איור S5a).

ילדים הציגו ביצועים טובים יותר ב-MMG בשבוע 15 בקבוצת ה-SLR (שלב I), בעוד שהמין הנשי היה בקורלציה חיובית עם פגמים ו-RT (איור S5b). השפעת הטיפול המותאם לגיל ומגדר הוערכה גם עבור כל שלב תוך שליטה על השבוע (נקודות זמן). ה-RDA הראה שלגיל היה קשר חזק עם OVP ו-MMG בשלב I (איור S6a), בעוד שבשלב II, הביצועים לגבי RT והפסקות היו גרועים יותר בקבוצת SLR מאשר בקבוצת הביקורת (איור S6b).
בסך הכל, גיל ונקודות זמן היו קשורים יותר לביצועים הקוגניטיביים של ילדים בגיל בית ספר מאשר בהתערבות, והשפעת ההתערבות נצפתה רק כאשר הגבלת דגימות בכל שבוע של שלב II לאחר התאמה לגיל ומין.

3.4. קשר בין מיקרוביוטה של ​​המעיים וביצועים קוגניטיביים של ילדים בגיל בית ספר

מצאנו מתאמים חלשים בין מיקרוביוטה של ​​המעי לתוצאות קוגניטיביות בכל נקודות ההתערבות בהתבסס על מקדמי המתאם של ספירמן. מספר קשרים היו מובהקים (p < {0}}.05), אך רק קשר אחד, זוהה בשבוע 4 עבור קבוצת SLR (Roseburia vs. Lapses, rho=−0.40, q {{6 }}.04), נשאר משמעותי לאחר התאמה עבור השוואות מרובות (איור S7).

כמה קשרים שהתקרבו למשמעות נמצאו בשבוע 56 ובשבוע 71. הקשרים שזוהו בקבוצת ה-SLR בשבוע 56 כללו את Faecalibacterium–RT (rho=0.62, q=0.07 ), Prevotella–OVP(rho=−0.55, q {{10}}.08), Gammaproteobacteria–OVP (rho=−0.58, q=0.07), ו-Faecalibacterium–OVP (rho=−0.64, ש'=0.05). בשבוע 71, Faecalibacterium נמצא בקורלציה חיובית עם RT בקבוצת הביקורת (rho=0.62, q=0.07).

בהתחשב בגיל ובמין, ניתוח נוסף של הקשר בין מיקרוביוטה במעיים וביצועים קוגניטיביים בכל נקודת זמן בוצע באמצעות MFA כדי לחשוף שינויים בין הפרופילים האישיים של קבוצות הטיפול (קובץ משלים S4).

למרות שוריאציה אינדיבידואלית הוסברה על ידי שפע המיקרוביוטה של ​​המעי ב-Dim 1 של שני השלבים (p < 0.0001), הבדל חזק בין קבוצות הבקרה ל-SLR צוין ב-Dim. 2 (איורים 6 ו-7). פרופיל הניגודיות בין שתי הקבוצות הללו הושפע מגיל ומ-OVP, שהיו בקורלציה חיובית עם Dim 2 (p < 0.0001), בעוד שגם RT וגם lapses היו בקורלציה שלילית (p < 0.0001).

עם זאת, Gammaproteobacteria הייתה המשפיעה ביותר בתיאור וריאציה אינדיבידואלית בממד זה בשבוע 61 (p < 0.0001). הרמה של חיידק זה הייתה נמוכה יותר בקבוצת SLR (קואורדינטה=-1.35, p < 0.0001).

למרות גדלי מדגם לא שווים, ה-MFA הצביע על כך שההבדל בפרופילים של ילדים בגילאי בית ספר בניסוי קליני לא אקראי זה הושפע יותר מגיל וביצועים קוגניטיביים מאשר ממיקרוביוטה של ​​המעי, מה שמרמז על פחות תרומה של ההתערבות לשונות אינדיבידואלית במחקר זה.

4. דיון

המחקר שלנו לא ראה שינויים משמעותיים בשפע המוחלט של מיקרוביוטה במעיים לאחר השלב הראשון של התערבות האורז Sinlek בילדים בגיל בית ספר. עם זאת, הבדלים משמעותיים בין הקבוצות צוינו בשלב II (שבועות 61 ו-71) עבור totalbacteria, Firmicutes, Bacteroidetes ו-Gammaproteobacteria.

כמו כן, ראינו הבדלים משמעותיים בביצועים קוגניטיביים בין קבוצת הביקורת וההתערבות בשני השלבים. לא מצאנו מתאם חזק בין מיקרוביוטה של ​​המעי לביצועים קוגניטיביים בשום נקודת זמן.

ניתוחים נוספים העלו כי בקבוצה זו, התערבות אורז Sinlek לא תרמה לשונות במיקרוביוטה של ​​המעיים ובפרופילים הקוגניטיביים של ילדים בגיל בית הספר, שכן התוצאות הושפעו בעיקר מגיל.

For more information:1950477648nn@gmail.com