מחיקת חמש חומצות אמינו בעכברי NKCC2 של C57BL/6 משפיעה על ניתוח זרחון NKCC2 אך אינה משפיעה על תפקוד הכליות
Feb 19, 2022
מבוא
איבר העולה העבה (TAL) של היונקכִּליָהחיוני לשליטה על נפח הנוזלים החוץ-תאי, ריכוז השתן, סידן (Ca 2 פלוס) ומגנזיום (Mg 2 plus ), כמו גם איזון pH. 1 מסלול ההובלה העיקרי של Na plus ב-TAL הוא Na plus - K plus - 2Cl − cotransporter (NKCC2), אשר מעוכב באופן ספציפי על ידי משתני לולאות. 1 ההובלה המשותפת של יוני Na plus , K plus ו- 2Cl − דרך NKCC2 היא אלקטרונית אך תלויה בהפרשת K פלוס אלקטרוגני דרך הקודקודית שֶׁל הַכְּלָיוֹתמדולה חיצונית K פלוס ערוץ ROMK. 2 הגומלין של NKCC2 עם ROMK יוצר שיפוע אלקטרוכימי חיובי לומן, המשפר את הספיגה מחדש של Na plus ומניע את ההובלה הפרא-תאית של Ca 2 plus ו-Mg 2 plus. 3 המשמעות של NKCC2 עבור TAL ותפקוד כליותמודגם על ידי תסמונת ברטר סוג I, הפרעה גנטית הנגרמת על ידי מוטציות אובדן תפקוד ב-NKCC2, המתבטאת בחומרהשֶׁל הַכְּלָיוֹתבזבוז מלח ונוזלים, אלקלוזיס מטבולי היפוקלמי והיפרקלציוריה. 3
NKCC2 הוא חבר במשפחת הנשאים המומסים 12 (Slc12) של חלבוני הובלה ממברנה הכוללת גם את ה-NKCC1 המבוטא בכל מקום ואת הצינורית המפותלת הדיסטלית (DCT) הספציפית Na plus - Cl - cotransporter (NCC). 2 הפעילות של NKCC2 מתאמת באופן חיובי עם זרחון של הקוטרנספורטר במספר שיירי סרין ותראונין על הזנב הציטופלזמי N-טרמינלי. 4 רצפי חומצות האמינו המקיפים את אתרי הזרחון הללו נשמרים מאוד ומראים רמה גבוהה של דמיון בין NKCC2, NKCC1 ו-NCC. 2 הזרחון של NKCC2 מגורה על ידי מספר מסלולים הורמונליים ולא הורמונליים. הורמונים כגון ארגינין וזופרסין (AVP) ואנגיוטנסין II (ANGII) מעוררים NKCC2 באמצעות ייצור cAMP מוגבר והפעלה של חלבון קינאז A (PKA). 5 PKA נחשב כמזרחן ישירות של NKCC2 ב-Ser126, מה שמגביר את האקסוציטוזיס של שלפוחיות המכילות NKCC2 ומכאן את השפע של הטרנספורטר בממברנת הפלזמה האפיקלית. 6 כמו כן, שינויים בריכוזי הכלוריד התוך תאי מסדירים את הזרחון של NKCC2. ריכוז נמוך יותר של Cl − מגרה את הקינאזות ללא ליזין (K) WNK1 ו-WNK4 לזרחן ולהפעיל את הקינאזות במורד הזרם הקשורות לפרולין אלנין עשיר קינאז (SPAK) או קינאז 1 (OXSR1) ). 7- 9 לאחר קשירה למוטיב "RFxV" ב-NKCC2, הקינאזות הללו מזרחות את NKCC2 בשני שיירי תראונין (T96 ו-T101). 2 דה-פוספורילציה של שאריות אלו מתווכת על ידי ה-phosphatase calcineurin, תוך הדגשה כי NKCC2 הוא יעד למספר מסלולי איתות. 10
כדי לחקור את תפקוד NKCC2, מספר קבוצות כולל שלנו פיתחו נוגדנים ספציפיים לפוספופורם נגד Thr96 ו/או Thr101. 11- 17 הנוגדנים שימשו להערכת זרחון NKCC2 במערכות ביטוי הטרולוגיות 7,11,17,18,19,20 ובמודלים של בעלי חיים כולל חולדות 10,21,22,23,24,25 ועכברים. 14,15,16,17,19,26,27 עם זאת, בעת שימוש נוגדן pT96/101 NKCC2 שלנו, השגנו תוצאות לא עקביות בדגמי העכברים השונים שלנו. בעוד שזיהינו אותות pNKCC2 חזקים בכליות מעכברים ברקע גנטי של 129Sv, לא קיבלנו אותות pNKCC2 מהימנים בכליות מעכברי C57BL/6, אך ראינו תגובתיות צולבת של נוגדני pNKCC2 עם pNCC. מעבדות אחרות, כולל אלה של JA McCormick ו-AA McDonough (תקשורת אישית) ערכו תצפיות דומות. 18,28,29 יתר על כן, הבדלי זנים בולטים תוארו בעכברים עבורשֶׁל הַכְּלָיוֹתתפקוד 30 כולל הפרשת Ca 2 בשתן נמוכה משמעותית ב-C57BL/6 בהשוואה לעכברי 129Sv. 31 לכן, שיערנו שעכברי C57BL/6 מבטאים וריאנט גנטי של NKCC2 שמשפיע על זרחון NKCC2 ואוליתפקוד כליותשמסבירים את הבדלי הזנים שנצפו. המחקר הבא נועד לבחון באופן שיטתי השערה זו.
מילות מפתח:הומאוסטזיס יונים, כליות, NKCC2, זרחון, הבדלי זנים
תוצאות
2.1|לעכברי C57BL/6 יש מחיקה של חמש חומצות אמינו ב-NKCC2 שמפריעה לזיהוי של NKCC2 מזורחןראשית, יישרנו עבור כמה מינים את רצפי חומצות האמינו ה-N-טרמינליות שפורסמו (מזהות שעתוק בטבלה S1) של NKCC2 ו-NCC (איור 1A,B, בהתאמה) התואמים לאפיטופים המוכרים על ידי הנוגדנים האנטי-pNCC ואנטי-pNKCC (איור 1C). היישור אישר את מידת השימור הגבוהה של אתרי הזרחון של NKCC2 ו-NCC 7, אשר מסבירה ככל הנראה את התגובתיות ההדדית של נוגדני pNKCC2 ו-pNCC שנצפו על ידינו ואחרים. 18,28,29 באופן מעניין ותואם את ההשערה שלנו, היישור גם חשף מחדש מחיקה של חמש חומצות אמינו שלא מוערכות עד כה ברצף של NKCC2 מעכברי C57BL/6 (ΔF97- T101) (איור 1A) . רצף של ה-DNA משתי מושבות עכברים C57BL/6 שונות שנשמרו במעבדת ג'קסון בארה"ב או Janvier Labs בצרפת אישר מחיקת נוקלאוטידים באקסון 2 של C57BL/6 NKCC2 התואמת את מחיקת חומצות האמינו שהוזכרו לעיל (איור S1 ,טבלה S2).
כדי לאפיין את ההשפעה של מחיקת חמש חומצות האמינו על הזיהוי החיסוני של NKCC2 הכולל ומזרחן, חקרנו באופן שיטתי את הכליות של עכברי C57BL/6 ו-129Sv על ידי אימונוהיסטוכימיה ואימונובלוטינג. אימונופלואורסצנטי עם נוגדן נגד סך NKCC2 הראה אות פלואורסצנטי חזק בממברנת הפלזמה האפיקלית של TALs של עכברים 129Sv ו-C57BL/6. עם זאת, הנוגדן pT96/T101 NKCC2 שפותח בעבר הראה תיוג אפיקלי חזק של TALs רק בעכברי 129Sv, בעוד של-TALs של עכברי C57BL/6 היה צביעה חיסונית חלשה מאוד (איור 1D). בהתאם לכך, ניתוח ה-Western blot גילה פס חזק עבור סך NKCC2 בשני זני העכברים, בעוד שהנוגדן pT96/T101 NKCC2 זיהה פס חזק בגודל הצפוי (170 kDa) רק בעכברי 129Sv (איור 1E). במקום זאת, כליות של עכברי C57BL/6 חשפו פס ב-130 kDa התואם לגודל הצפוי של NCC (איור 1E). תוצאות דומות התקבלו עם נוגדנים אחרים ששימשו בעבר לחקר זרחון NKCC2 (איור S2). הנוגדן pT212/T217 NKCC1 R5 11 הראה בנוסף לאות pNCC אות חלש בגודל הצפוי עבור pNKCC2 (איור S2). הרצועה החיסונית של pNKCC2 הפכה אינטנסיבית יותר כשהיא טריהכִּליָהנעשה שימוש ב-lysates. השימוש במאגר תמוגה עם חומרי ניקוי (חיץ RIPA) לא השתפר אך הפחית את עוצמת האות (איור S3).
איור 1 הנוגדן pT96/T101 NKCC2 אינו מזהה אות pNKCC2 גלוי בעכברי C57BL/6. A, NKCC2 יישור רצף חומצות אמינו של מינים שונים ושני זני העכברים 129Sv ו-C57BL/6. מזהי רצף NKCC2 עבור המינים השונים מפורטים בטבלה S1. האזור השמור ביותר המקביל ל-Thr96 העכבר ל-Thr101 העכבר מסומן באפור. B, יישור רצף חומצות אמינו של NCC במינים שונים. מזהי רצף NCC עבור המינים השונים מפורטים בטבלה S1. C, רשימת אפיטופים של נוגדנים נפוצים ומפורסמים המזהים pT53 או pT58NCC, כמו גם pNKCC2 במיקום השמור סביב Thr96 עד Thr101. ד, צביעת אימונו של סך ו-pT96/T101 NKCC2 בחתכי קריו עוקבים של עכברים עם רקע 129Sv ו-C57BL/6. סרגל קנה מידה=50 מיקרומטר. E, Immunoblot של סך ו-pT96/T101 NKCC2 של עכברים עם רקע 129Sv ו-C57BL/6. הערכים הם אמצעים ± SEM, n=5 עכברים לקבוצה, החצים הירוקים מצביעים על הרצועות הספציפיות בעוד שראשי החצים האדומים מצביעים על הרצועות הלא ספציפיות. סמני משקל מולקולרי כלולים. סך רצועות NKCC2 ו-pT96/T101 צפויות ל-170 kDa. F, Immunoblots עבור total ו- pT96/T101 NKCC2, סך ו- pT53 ו- pT58 NCC בעכברי NCC WT ו- NCC נוקאאוט (KO) מרקע שונה. החצים הירוקים מצביעים על הרצועות הספציפיות בעוד שראשי החצים האדומים מצביעים על הרצועות הלא ספציפיות. סמני משקל מולקולרי כלולים. סך רצועות NCC ו-pT58 ו-pT53 צפויות ל-130 kDa, רצועות סה"כ ו-pT96/T101 NKCC2 צפויות ל-170 kDa
כדי לבדוק אם נוגדן pT96/T101 NKCC2 שלנו אכן מגיב עם NCC מזורחן בעכברי C57BL/6, בדקנוכִּליָהlysates מעכברים מסוג 129Sv ו-C57BL/6 ועכברי נוקאאוט C57BL/6 NCC עם נוגדנים נגד סך NKCC2, pT96/T101 NKCC2, סך NCC ו-NCC פוספוריל (pT53 ו-pT58 NCC) (איור 1F). הנוגדן pT96/T101 NKCC2 והנוגדנים נגד סך NCC ו-pNCC לא זיהו פסים ב-130- 170 kDa בעכברי הנוקאאוט C57BL/6 NCC (איור 1F). מעניין לציין שהאימונובלוט כמו גם ניסויים אימונוהיסטוכימיה נוספים (איור S4) מצביעים על כך שלא רק נוגדני pNKCC2 מגיבים עם NCC בעכברי C57BL/6 אלא נוגדני pNCC שלנו (pT53 NCC ו-pT58 NCC) מגיבים עם NKCC2 ב-129Sv עכברים בריכוזים בהם נעשה שימוש.
הפרשת סידן ומגנזיום בשתן שונה בין עכברים 129Sv ו-C57BL/6
כדי לקבוע אם המחיקה (F97- T101) ב-NKCC2 עשויה להיות קשורה להבדלים פיזיולוגיים בין עכברים 129Sv ו-C57BL/6, השווינו צריכת מים, רמות יוני פלזמה והפרשת נוזלים ויונים בשתן בין שני זני העכברים. כפי שסוכם בטבלה 1, רוב הפרמטרים שהוערכו לא היו שונים בין הזנים. עם זאת, עכברי C57BL/6 הראו הפרשת Ca 2 פלוס בשתן נמוכה יותר והפרשת Mg 2 פלוס בשתן גבוהה יותר מאשר עכברי 129Sv. רמות Ca 2 פלוס ו-Mg 2 פלוס בפלזמה היו דומות עבור שתי הקבוצות, מה שמצביע על כך שהעכברים היו במצב יציב שבו מאזן הומיאוסטטי של ספיגה חוזרת במעיים, גיוס רקמות (למשל מעצם)שֶׁל הַכְּלָיוֹתהושגה הפרשה של יוני Ca 2 פלוס ו-Mg 2 פלוס. כדי לבדוק אם שיעורי הפרשת Ca 2 פלוס ו-Mg 2 פלוס השונים בשתן נובעים מהבדלים בספיגת יונים אלו במעי, השווינו את צריכת המזון היומית, תפוקת הצואה והפרשת Ca 2 פלוס ו-Mg 2 פלוס בצואה עבור השניים. זני עכברים. כפי שמוצג באיור S5, צריכת המזון והוצאת Ca 2 פלוס בצואה היו דומים, אך הפרשת Mg 2 פלוס בצואה היומית הייתה נמוכה יותר בעכברי C57BL/6 מאשר בעכברי 129Sv, דבר המצביע על כך שלעכברי C57BL/6 יש יותר ספיגה חוזרת של Mg 2 במעיים יותר מעכברי 129Sv. בהתאם להנחה זו, לעכברי C57BL/6 היה ביטוי קולוני חזק יותר של תעלת המגנזיום TRPM6 (איור S6), כמו גם מגמה לרמות גבוהות יותר של Mg 2 פלוס בפלזמה בהשוואה לעכברי 129Sv, אם כי ההבדלים לא הגיעו למובהקות סטטיסטית. כדי להעריך את התרומה האפשרית של העצם, ניתחנו באמצעות מיקרו-CT את צפיפות המינרלים של העצם בשני הזנים. בדומה לדיווחים קודמים, ל-32 עכברים C57BL/6 הייתה צפיפות מינרלים נמוכה למדי של עצם (איור S7), מה שעשוי להסביר מדוע עכברים אלה נוטים לשמר יוני Ca 2 פלוס באמצעות כמות מופחתתשֶׁל הַכְּלָיוֹתCa 2 פלוס הפרשה. בהתאם לקצב ספיגה מחדש של Ca 2 צינורי משופר, הכליות של עכברי C57BL/6
ביטאו יותר TRPV5 Ca 2 פלוס ערוץ ברמות חלבון מאשר כליות של עכברי 129Sv (איור 2). לעכברי C57BL/6 היה גם ביטוי NCC mRNA וחלבון גבוהים משמעותית מאשר לעכברי 129Sv (איור 2A). כמו כן, שפע החלבון של NKCC2 הכולל, NCC כולל ומפוספוריל ושל סך - ENaC היו גבוהים יותר ב-C57BL/6 מאשר בעכברי 129Sv (איור 2B,C). השפע של הצורות המבוקעות פרוטאוליטי ומכאן הפעילות של - ו- ENaC לא היו שונות מה שמרמז על כך שהשֶׁל הַכְּלָיוֹתפעילות ENaC הייתה דומה עבור שני הזנים (איור 2B, C).
אין עדות לשינוי בתפקוד גפיים עולה עבה בעכברי C57BL/6 בהשוואה לעכברי 129Sv
השפע הגבוה יותר של סך NKCC2, סך NCC ו-NCC מזורחן בכליות של עכברי C57BL/6 עשוי להיות תגובה מפצה להפחתת הזרחון של NKCC2. כדי לבדוק אם הפעילות של NKCC2 ו-NCC שונה בין זני העכברים, ביצענו בדיקת bumetanide ו- thiazide בהתאמה. זריקה בודדת של bumetanide או hydrochlorothiazide עוררה natriuresis חזקה אשר הייתה בולטת יותר עבור bumetanide מאשר עבור hydrochlorothiazide. עם זאת, התגובות המשתנות היו דומות לחלוטין בשני הזנים, דבר המצביע על כך שהפעילויות התפקודיות של NKCC2 ו-NCC לא היו שונות בין עכברי C57BL/6 ו-129Sv (איור 3A-D). ככל הנראה, שפע חלבון ורמות זרחון אינם בהכרח תואמים את הפעילויות התפקודיות שלשֶׁל הַכְּלָיוֹתחלבונים להובלת יונים כפי שציינו לאחרונה גם האנטר ועמיתיו. 33 כדי להעריך עוד יותר את תפקוד TAL, ביצענו בדיקת הגבלת מים שבה הייתה לעכברים במשך 24 שעות גישה למזון רטוב, אך לא למי ברז. בתנאים אלה, שני זני העכברים העלו את האוסמולריות של השתן לערכים דומים (טבלה 1). יתר על כן, עכברי C57BL/6 ועכברי 129Sv הראו את אותה הפרשה בשתן של אורומודולין (חלבון Tamm- Horsfall) (טבלה 1), אשר מיוצר ומופרש לשתן בהתאם לפעילות התפקודית של תאי ה-TAL. 3
הכלאה של עכברים 129Sv ו-C57BL/6 מרמזת שמחיקת חמש חומצות האמינו ב-NKCC2 אינה מפרידה פנוטיפ ספציפי
הנתונים המוצגים מצביעים על כך שהפרשי הזנים בהפרשות יונים בשתן ושֶׁל הַכְּלָיוֹתשפע חלבון אינו קשור למחיקת חמש חומצות האמינו ב-C57BL/6 NKCC2, אלא קשור להבדלים גנטיים אחרים בין שני זני העכברים. כדי לבדוק זאת עוד יותר, הכלאנו עכברים 129Sv ו-C57BL/6 לדור ה-F2 שבהם הבדלי הזנים הגנטיים (כולל אלה ב-NKCC2) צריכים להיות באופן אקראי
מופץ לעכברים. לאחר מכן השווינו עכברי F2 שהיו הומוזיגוטים עבור NKCC2 באורך מלא (f/f), הומוזיגוטים עבור מחיקת NKCC2 (Δ/Δ), או הטרוזיגוטיים עבור מחיקת NKCC2 (f/Δ). למעט דפוסי הקישור השונים הצפויים של הנוגדנים הספציפיים לפוספופורם נגד NKCC2 ו-NCC (והבדל לא ברור של ביטוי ROMK ברמת ה-mRNA, אך לא חלבון), אף אחד מההבדלים שזוהו בעבר בין שני הזנים לא ניכר ב העכברים f/f, Δ/Δ או f/Δ של דור F2 (איור 4 וטבלה 2). בפרט, לא היו הבדלים בהפרשת Ca 2 פלוס או Mg 2 פלוס בשתן, כמו גם לא הבדלים ברמות Ca 2 פלוס או Mg 2 פלוס בפלזמה, מה שמצביע על כך שהבדלי הזנים בין עכברים 129Sv ו-C57BL/6 אינם תלויים ב מחיקת חמש חומצות האמינו ב-NKCC2.
נוגדן pT96 NKCC2 חדש מזהה pNKCC2 בשני הזנים
מאחר שמחיקת חמש חומצות האמינו ב-NKCC2 מעכבת זיהוי אמין של זרחון NKCC2 בעכברי C57BL/6 בעת שימוש בנוגדנים זמינים, יצרנו נוגדן חדש המכוון נגד הפוספוסיט T96 בעכברי C57BL/6. ארנבות חוסנו עם פוספופפטיד שתואם לרצף חומצות האמינו של C57BL/6 NKCC2 המקיף את T96 (YYLQ(p)TMDA). האנטיסרים מטוהרו בזיקה ואופיינו על ידי אימונובלוטינג ואימונוהיסטוכימיה (איור 5). הנוגדן זיהה פס בודד בגודל הצפוי של 170 kDa בכליות של 129Sv, C57BL/6 מסוג פראי ונוקאאוט C57BL/6 NCC
עכברים (איור 5A). הלהקה הייתה שונה בבירור מזו שזוהתה עבור NCC ב-130 kDa. דה-פוספורילציה של 129Svכִּליָהדגימות עם פוספטאז אלקליין במעי העגל (CIAP) חיסלו לחלוטין את האות שהושג עם הנוגדן pT96 NKCC2 החדש, בעוד שהאות עם הנוגדן NKCC2 שאינו ספציפי לפוספופורם היה גלוי בדגימות הבקרה והדפוספורילציה (איור 5B). מעניין לציין שגם זרחון NKCC2 בוטלה במידה רבה כאשרכִּליָהlysates הודגרו ב-37 מעלות למשך שעה אחת ללא CIAP (כנראה בגלל פעילות של פוספטאז אלקליין אנדוגני מהצינוריות הפרוקסימליות). ניסויי דה-פוספורילציה באמצעות למבדה פוספטאז בחתכים עוקבים של פרפין-כליות של עכברי C57BL/6 אישרו עוד שהנוגדן החדש מזהה רק NKCC2 מזורחן (איור 5C). יתר על כן, קרינה אימונו בחתכים רצופים הדגימה שהנוגדן חדש צובע רק את קרום הפלזמה האפיקלית של TALs חיוביים ל-NKCC2- אך לא של DCT חיובי ל-NCC בעכברים 129Sv ו-C57BL/6 (איור 5D), מה שמרמז שהחדש נוגדן pNKCC2 אינו מגיב בצלב עם pNCC. מסקנה זו אושרה גם באמצעות lysates של תאים מתאי MDCKI המבטאים NKCC2 אנושי (hNKCC2) ו-NCC אנושי (hNCC). אימונובלוטים של משקעים אימוניים (IP) וליזטים של תאים שלמים הוכיחו שהנוגדן החדש pT96 NKCC2 מזהה NKCC2 אנושי אך לא NCC אנושי (איור S8A). מעניין, למרות שהנוגדן החדש הועלה נגד pNKCC2 של עכברי C57BL/6, הנוגדן החדש זיהה זרחון של NKCC2 באופן שווה בכליות של שני זני העכברים על ידי אימונוהיסטוכימיה (איור 6A) ואימונובלוטינג (איור 6B).
הנוגדן pT96 NKCC2 החדש מאפשר ניתוח של זרחון NKCC2 מוסדר
הזרחון ומכאן הפעילות של NKCC2 ו-NCC מוסדרים על ידי ריכוזי יונים תאיים. אקס נמוך [Cl-] מגביר את הזרחון של NKCC2 ב-Thr96 ו-Thr101 ושל NCC ב-Thr53 ו-Thr58 באמצעות הפעלה של מסלול WNK/SPAK/OSR1. 7,8,18,29,35 באופן דומה, [K פלוס] גבוה מקטין במהירות את הזרחון של NCC, אך נחשב כבעל השפעה מועטה או ללא השפעה על זרחון NKCC2. 12,36,37,38 כדי לבדוק האם נוגדן pT96 NKCC2 החדש שפותח מסוגל לזהות סוג זה של ויסות דיפרנציאלי של זרחון NKCC2,כִּליָהפרוסות של עכברי C57BL/6 נחשפו ex vivo ל-110 או 5 mM [Cl-] ex ול-3 או 10 mM [K plus ] ex בהתאמה. כצפוי, האקס [Cl-] הנמוך הגביר מאוד את הזרחון של NCC ו-NKCC2 (איור 7A,B), בעוד שהאקס הגבוה [K פלוס] רק הפחית את הזרחון של NCC אך לא שינה את הזרחון של NKCC2 (איור 7C,D). באופן דומה, הנוגדן החדש שזוהה השתנה באותה מידה
איור 4 אין שינויים משמעותיים בביטוי mRNA וחלבון של עיקרישֶׁל הַכְּלָיוֹתמעבירי יונים ותעלות בדור ה-F2 הכלואים. א, עלילת בר של רמות ביטוי mRNA יחסית בשלוש קבוצות העכברים. כל הערכים נורמלו לעכברי f/f. ערכים הם אמצעים ± SEM. ב, שפע חלבון בעכברכִּליָהליזטים מבעלי חיים מדור F2. שלוש הקבוצות מתאימות ל-NKCC2 באורך מלא (f/f), NKCC2 הומוזיגוטי למחיקה (Δ/Δ) או NKCC2 הטרוזיגוטי למחיקה (f/Δ/). סמני משקל מולקולרי כלולים. NKCC2 ו-pNKCC2 צפויים ל-170 kDa, NCC ו-pNCC ב-130 kDa, TRPM6 ב-260 kDa, - ENaC ב-95 kDa ו-34 kDa (מבוקע), - ENaC ב-100 kDa, - ENaC ב-100 kDa ו-(cleve) , ROMK ב-55 kDa (מסוכרן בוגר), 43 kDa (ליבה מסוכרר) ו-34 kDa (לא גליקוזיל). חיצים ירוקים מצביעים על הרצועות הספציפיות בעוד שראשי החצים האדומים מצביעים על הרצועות הלא ספציפיות. C, ניתוח דנסיטומטרי של שפע חלבון בהשוואה לעכברי f/f ו-Δ/Δ. עוצמות הלהקה מעכברי Δ/Δ מנורמלות לאלו מ-f/f. (הערכים הם ממוצעים ± SEM; n=5 עכברים/קבוצה; *P < .05,="" †="" p="">< .01,="" ‡="" p=""><>
זרחון NKCC2 שעורר בתאי MDCKI המבטאים NKCC2 אנושי (hNKCC2) או NKCC2 של עכבר (mNKCC2(C57BL/6)) על ידי תנאים היפוטוניים של כלוריד חוץ תאי נמוך (איור S8B). בכִּליָהפרוסות שהודגרו ב-5 mM [Cl − ] ex, גם הנוגדנים האנטי-עכבר pT96/T101 NKCC2 39 ונוגדני pT212/T217 NKCC1 R5 11 האנטי-אנושיים שתוארו בעבר מזהים אותות חלשים עבור NKCC2 ו-NCC, אשר הופכים ברורים יותר כאשר יותר חלבונים נטענים ומצטלמים אימונובלוטים בהגדרות משופרות (איור S9).
דִיוּן
עכברי C57BL/6 ו-129Sv הם שניים מזני העכברים הנפוצים ביותר למחקר ביו-רפואי. הגנום של עכברי C57BL/6 היה הראשון שרוצף עבור העכבר 40 ומאז שימש כגנום הייחוס לניתוח של וריאציות גנטיות ופנוטיפיות בין זני עכברים. 41- 44 עבורכִּליָהמחקר, הבדל מהותי אחד בין עכברי C57BL/6 ו-129Sv נוגע לביטוי של הגן רנין. כמו בני אדם, עכברי C57BL/6 מכילים רק גן רנין אחד, בעוד שלעכברי 129Sv יש שני עותקים, מה שעשוי להסביר את הרגישות הגבוהה יותר של זן עכברים זה ליתר לחץ דם 45,46 ולפגיעה ביתר לחץ דם. 47 עם המחקר הנוכחי, אנו מוסיפים הבדל גנטי חשוב נוסף שצריך לקחת בחשבון. אנו מתארים מחיקה של חמש חומצות אמינו לא מוערכות עד כה ב-NKCC2 (ΔF97- T101), הקיימת ב-C57BL/6 אך לא בעכברי 129Sv, שמפריעה לזיהוי של זרחון NKCC2 עם רוב הנוגדנים הזמינים בעבר, אך אינה מפריעה באופן משמעותי לזיהוי של זרחון NKCC2. פְּגִיעָהתפקוד כליות.
אתרי הזרחון העכבר NKCC2 N-terminal T96 ו-T101 נשמרים מאוד על פני מינים ובין NKCC2, NKCC1 ו-NCC (איור 1). 48 לכן, אין זה מפתיע שנוגדנים המכוונים נגד אתרי זרחון אלה מגיבים בגיבוי צולב עם שאר ה-cotransporters. מחקרים קודמים דיווחו כי נוגדנים נגד NCC מזורחת מזהים גם NKCC2 7,18,28,29 מזורחן וכי נוגדן pNKCC1 מאפשר ניתוח של רמות הזרחון של NKCC1 וגם של NKCC2. 11 בהתאם לכך, ראינו תגובתיות צולבת של נוגדני pNCC (pT53 ו-pT58) שלנו עם NKCC2 מזורחן ושל נוגדן pT96/pT101 NKCC2 שלנו עם NCC מזורחן. עם זאת, תגובתיות ההצלבה של נוגדני pNCC עם NKCC2 נראתה רק בכליות של עכברי 129Sv, אך לא בכליות של עכברי C57BL/6. לעומת זאת, הנוגדן שפותח בעבר ל-NKCC2 pT96/pT101 לא הראה או במקרה הטוב אות חלש מאוד עבור pNKCC2 בכליות של עכברי C57BL/6 וזיהה בעיקר NCC מזורחן בזן זה. כעת, אנו מקשרים את התצפיות המבלבלות הללו למחיקת חמש חומצות אמינו ב-NKCC2 של עכברי C57BL6 (ΔF97- T101). הרגולציה של זרחון NKCC2 נבדקה-
עזר במסגרות ניסוי שונות ולגירויים שונים כולל וזופרסין, 14,21,24,25,49 uromodulin 19,20,50 ומעכבי calcineurin. 10,26 בעוד שרוב המחקרים בוצעו במערכות ביטוי הטרולוגיות 10,19,20,25,50 או בחולדות 10,24 ועכברים 19,26 המבטאים NKCC2 באורך מלא, חלק מהמחקרים בוצעו גם בעכברי C57BL/6. 7,18,27,28,29,51 כפי שאנו מדווחים כאן, עכברי C57BL/6 מבטאים וריאנט NKCC2 עם מחיקת חמש חומצות אמינו המפריע לזיהוי נכון של זרחון NKCC2 ואשר נושא בסיכון כי pT96/T101 NKCC2 הסטנדרטי נוגדנים והנוגדן R5 אנטי פוספו-NKCC1 מגיבים עם NCC מפוספוריל לפחות בתנאים המשמשים בעבודתנו. לא ניתן לשפוט את ההשפעה של תגובה צולבת זו על מסקנות ניסוי קודמות, אך על פי התצפיות שלנו, יש לעיין מחדש בנתונים מעכברי C57BL/6 ולפרש אותם בזהירות. למרות העובדה שלמחיקת חמש חומצות האמינו הייתה השפעה חזקה על זיהוי זרחן NKCC2, אין לנו הוכחות לכך שהמחיקה משפיעה באופן משמעותי על הפעילות התפקודית של ה-cotransporter. לעכברי C57BL/6 היה למעשה הפרשת Mg 2 פלוס בשתן גבוהה יותר והפרשת Ca 2 פלוס בשתן נמוכה יותר 31 מאשר לעכברי 129Sv, אך מצאנו שהבדלים אלו כנראה אינם קשורים להובלה פר-תאית שונה של קטיונים אלו לאורך ה-TAL, אך הם התוצאה של ספיגה מוגברת של Mg 2 בתוספת של TRPM6- במעי ועלייה בספיגה מחדש של Ca 2 תלויה ב-TRPV5- ב-DCT2 וב-CNT. האחרון גורם לאיזון Ca 2 פלוס חיובי שעשוי לסייע להגדלת צפיפות המינרלים הנמוכה של העצם של עכברי C57BL/6. הממצא שעכברי C57BL/6 ו-129Sv מראים את אותו הדברשֶׁל הַכְּלָיוֹתהתגובות למשתני לולאה ותיאזידים ולהגבלת מים מרמזות עוד על כך שמחיקת חמש חומצות האמינו ב-NKCC2 אינה פוגעת באופן משמעותי בתפקוד TAL. והכי חשוב, לעכברים מדור F2 של עכברי C57BL/6 ו-129Sv מוצלבים יש אותו הדברשֶׁל הַכְּלָיוֹתפנוטיפ בלתי תלוי בשאלה אם עכברים מבטאים באורך מלא (f/f) NKCC2 או NKCC2
הומוזיגוט (Δ/Δ) עבור המחיקה. תצפיות אלה בעכברים עולות בקנה אחד עם נתונים פונקציונליים קודמים ממערכות ביטוי הטרולוגיות. בעוד שמוטציות של שיירים בודדים ב-NKCC1 (T217 באדם, T211 בעכבר) או NCC (T60 באדם, T58 בעכבר) מבטלות את הפעילות של פורטרים קוטרנסים אלה, מוטציות של השייר המקביל ב-NKCC2 (T105 באדם, T101 בעכבר) ) יש השפעה מועטה או אפילו לא על הבסיס ועל פעילות NKCC2 מגורה. 35,52,53 גם כאשר שני שרידי התראון ב-NKCC2 עוברים מוטציה לאלנין, הפעילות התפקודית של NKCC2 עדיין מגיעה ל-70 אחוז מהפעילות המקסימלית, 35 מה שמצביע על כך שהזרחון של אתרים אלו מעיד אך אינו חיוני לפעילות NKCC2.
אתרי זרחון הם לרוב הומולוגיים בין חלבונים. לפיכך, הבעיה של תגובתיות צולבת של נוגדנים ספציפיים לפוספופורם אינה ייחודית לנוגדנים המכוונים נגד NCC מזורחן, NKCC2 ו-NKCC1, אלא דווחה גם עבור חלבונים אחרים כגון קינאזות 1 ו-2 54 התלויות בציקלין והחוץ-תאי. קינאזות 1 ו-2 מווסתות אותות. 55 באופן עקבי, בכל פעם שמשתמשים בנוגדנים ספציפיים למצב זרחון, יש צורך בבקרות ניסוי קפדניות כדי לאשר את הספציפיות של האותות שזוהו. זה עשוי לכלול (א) אישור לכך שהנוגדן המופעל מזהה את החלבון במשקל המולקולרי הצפוי (אימונובלוטינג) ו/או בלוקליזציה התאית והתת-תאית הצפויה (אימונופלואורסצנטי), (ב) אימות שהנוגדן יוצר אינטראקציה ספציפית עם האפיטופ הפוספוריל שימוש במבחני תחרות עם הפפטידים המפוסחנים והלא-מזרחנים, ו-(ג) הדגמה כי
הנוגדן הוא פוספופורמי ספציפי על ידי השוואת דגימות רקמה מזורחת ודפוספורילציה. בקרות אלה עשויות להיות משלימות על ידי בקרות גנטיות הכוללות בדיקה של רקמות מחיות נוקאאוט ו/או תאים המבטאים בצורה הטרולוגית את החלבון המעניין. במחקר הנוכחי, השתמשנו בגישות שהוזכרו לעיל כדי לאפיין באופן יסודי נוגדן pT96 NKCC2 חדש שמזהה NKCC2 מזורחן בכִּליָהדגימות מעכברי C57BL/6 ו-129Sv באותה מידה. הנוגדן הוא ספציפי לפוספופורם ואינו מראה תגובתיות צולבת לכאורה עם NCC מפוספוריל באף אחד מהתנאים שנבדקו. באמצעות נוגדן זה אישרנו כי ריכוזי כלוריד חוץ-תאי נמוכים מגבירים את הזרחון של NKCC2 באתר זה, 7,8 בעוד שלריכוזי אשלגן חוץ-תאיים משתנים אין תפקיד רגולטורי משמעותי. 24 לסיכום, העבודה שלנו חושפת הבדל זן קריטי ברצף חומצות האמינו של NKCC2 של עכבר שמשפיע על הזיהוי ומכאן על הניתוח של זרחון וויסות NKCC2. נוגדן pT96 NKCC2 שפותח לאחרונה עוקף את האזהרה הטכנית הזו ומאפשר זיהוי אמין של זרחון NKCC2 שונה ללא תלות ברקע הגנטי של מודלים של עכברים. יתרה מכך, המחקר שלנו מדגיש שוב שיש לקחת בחשבון הבדלי רקע גנטי בעת ניתוח מודלים של עכברים.
חומרים ושיטות
חיות,עכברים זכרים בהתאמה לגיל (6- 8 שבועות) היו מזנים 129S6/SvEvTac, C57BL/6J, המכונה בזאת 129Sv ו-C57BL/6, או זן היברידי מעורב 129S/B6 בדור F2. כל הניסויים בבעלי חיים נערכו על פי חוקי רווחת בעלי חיים בשוויץ ואושרו על ידי המינהל הווטרינרי של קנטון ציריך, שוויץ (רישיונות: 141/2014, 185/2017 ו-135/2018). עכברים עברו גנוטיפ למחיקת 15 בסיסים באמצעות PCR סטנדרטי עם פריימרים שסופקו בטבלה S3. באורך מלא (f/f) ל-NKCC2 יש תוצר PCR צפוי של 87 bp בעוד שרצף NKCC2 שנמחק (Δ/Δ) צפוי ל-70 bp.
עיבוד רקמותעכברים הורדמו עם שילוב של איזופלורן (2 אחוזים - 4 אחוזים, 0.5 ליטר לדקה; Provet; CH) ו-Temgesic (Buprenorphine; 0.05- 0. 4 מ"ג/ק"ג משקל גוף; אינדיבור; CH). לצורך ניתוח ביוכימי, עכברים הורדמו וזלפו דרך החדר השמאלי של הלב עם מלח פוספט מאוחסן (PBS). כליות ומעי גס דיסטלי נקצרו, הוקפאו בחנקן נוזלי ואוחסנו ב-80 מעלות עד לעיבוד נוסף. עבור אימונוהיסטוכימיה, הכליות נקבעו באמצעות פרפורמלדהיד (PFA) 3 אחוז במאגר פוספט 0.1 M (pH 7.4, 300 mOsm) על ידי זלוף רטרוגרדי של העכבר שהורדם עמוק באמצעות אבי העורקים הבטן ואחריו שטיפה קצרה עם 0.1 M phos phate buffer (0.2 M NaH 2 PO 4 x H 2 O, 0.2 M NaH 2 PO 4 x 2H 2 O, 0.1 M CaCl 2 ). לאחר מכן, הכליות הוסרו, חתכו לחתיכות והוקפאו בפרופאן נוזלי ואוחסנו ב-80 מעלות.
מחקרים בכלוב מטבולילאחר הסתגלות לכלובים מטבוליים (Techniplast), הוחזקו עכברים בכלובים המטבוליים במשך ארבעה ימים רצופים עם גישה חופשית למי ברז ולמאכל מעבדה סטנדרטי (Ssniff, Spezialdiäten GmbH). משקל הגוף, צריכת המזון והמים נרשמו מדי יום ונאספו שתן וצואה במשך 24 שעות.
פרוטוקול הגבלת מיםעכברים נשמרו במשך 24 שעות בכלובים מטבוליים (Techniplast) ללא גישה למי ברז. אבקת צ'או סטנדרטית למעבדה (Ssniff, Spezialdiäten GmbH) עורבבה עם מים 1:1, 24 שעות נאספו שתן וצואה ונותחו. לאחר 24 שעות, העכברים הוחזרו לכלובים רגילים (T 2L (IVC), LASC, UZH).
מדידות ביוכימיותריכוזי השתן של Na plus, K plus, Ca 2 פלוס נותחו על ידי פוטומטריית להבה (EFOX 5053, Eppendorf). ריכוזי השתן והפלזמה של Mg 2 פלוס נמדדו במרכז ציריך לפיזיולוגיה אינטגרטיבית של מכרסמים עם מערכת SYNCHRON LX ®, UniCel ® DxC 800 Synchron ® Clinical System ו- Synchron ® System Multi Calibrator. קריאטינין בשתן נמדד בשיטת Jaffe. ריכוזי גזים ויונים בדם נמדדו בדם מלא בהפארין באמצעות מנתח גז הדם ABL825Flex (רדיומטר) מיד לאחר איסוף הדם מהווריד הנבוב. רמות אלדוסטרון בפלזמה וריכוז השתן של uromodulin (UMOD) נמדדו עם ערכות ELISA זמינות מסחרית (ערכת אלדוסטרון ELISA מאת Cayman; #501090 וערכת Mouse Uromodulin ELISA מאת Abcam; ab245726 בהתאמה).
תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (RT-qPCR)
RNA בודד מכליות וממעי הגס הדיסטלי באמצעות ערכת בידוד RNA total SV (PROMEGA). ריכוזים שווים של RNA מבודד (250 ng ב-129Sv לעומת C57BL/6 או 500 ng ב-f/f, Δ/Δ ו-f/Δ) הועתקו לאחור ל-cDNA עם ערכת GoScript™ Reverse Transcriptase (PROMEGA). ה-cDNA שנוצרו דוללו עוד יותר במים ללא DNAse/RNAse (1:5). פריימרים תוכננו לכימות של סך Slc12a1, Slc12a3, Trpm6, Trpv5, Scnn1a, Scnn1b, Scnn1g ו-Kcnj1 (טבלה S3). ניתוח PCR כמותי בוצע באמצעות LightCycler ® 480 (Roche) למדידת רמות ביטוי של הגנים המעניינים. ביטוי גנים יחסי חושב בשיטת delta Ct תוך שימוש ב-actin כגן הייחוס.
ניתוח כתם מערביהכליות עברו הומוגניות במאגר תמוגה ללא חומר ניקוי (DFLB) המכיל מניטול 200 mM, HEPES [4- (2- הידרו קסיאתיל)- 1piperazineethanesulfonic חומצות] 80 mM, אשלגן סיום הידרוקסיד 41 mM, מעכבי פרוטאז (Complete Ultra, Roche) ומעכבי פוספטאז (PhosSTOP, Roche) באמצעות 32 Magna Lyser Green Beads (Roche) בהומוגנית רקמות Precellys 24 (Bertin Instruments, Montigny-le- Bretonneux). חרוזים שוקעו על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות (1987 rcf) והחלבון המכיל את הסופרנטנט אוחסן במנות חד פעמיות ב-80 מעלות. עבור Western blot, 50 מיקרוגרם של חלבון טופלו במאגר Laemmli, מופרד על ידי SDS-PAGE תוך שימוש בג'לים של 8% - 12 אחוזים ולאחר מכן הועברו לממברנות ניטרוצלולוזה. אתרי קישור לא ספציפיים נחסמו באמצעות 1x Odyssey Blocking Solution (Li-COR Biosciences) לפני שהממברנות הודגרו עם נוגדנים ראשוניים (טבלה S4) מדוללים ב-0.2x Odyssey Blocking Solution ב-4 מעלות למשך 12 שעות. לאחר כביסה ב-PBS- 0.1 אחוז Tween, הממברנות הודגרו עם נוגדנים משניים (עז-אנטי-ארנב IRDye 800 או צבע עז-אנטי-עכבר IR 680, 1:10'000, LI - COR Biosciences) מדולל ב-0.1x חיץ חוסם קזאין (Sigma). להקות שזוהו הוצגו באמצעות מערכת ההדמיה האינפרא אדום של Odyssey (Li-COR Biosciences). כדי להבטיח טעינת חלבון שווה, ממברנות נצבעו יחד עם נוגדן נגד - אקטין או חלבון כולל נצבע באמצעות REVERT Total Protein Stain (Li-COR Biosciences) לפני זיהוי נוגדנים. רצועות אימונוגרפיות כומתו בפיג'י (ImageJ) ונורמלו כנגד - אות אקטין או כתם חלבון REVERT Total בהתאמה.
אימונוהיסטוכימיהקטעי קריוסטט (עובי 4 מיקרומטר) נחסמו עבור קשירת נוגדנים לא ספציפיים עם 10 אחוז סרום עיזים תקין ולאחר מכן הודגרו עם נוגדנים ראשוניים (טבלה S4)
לילה ב-4 מעלות. לאחר כביסה עם 1X PBS, השקופיות הודגרו עם נוגדנים משניים (Cy3 - מצומד עז- אנטי-ארנב IgG, מספר מוצר 111- 165- 144, 1:1000 ו-FITC - מצומד עז-אנטי-עכבר IgG , מספר מוצר 115- 095- 068, 1:100 בהתאמה, שניהם מ-Jackson Immuno Research Laboratories) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. כל הנוגדנים היו מדוללים ב-1 אחוז BSA/1xPBS. גרעיני תאים נצבעו ב-DAPI (4′,6- Diamidino- 2- phenty-indole, Sigma- Aldrich, Co.) בריכוז של 0.1 מיקרוגרם/מ"ל. ההדמיה בוצעה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי Leica DM6000 B (Leica Microsystems, 35578) עם מצלמה דיגיטלית Leica DFC350 FX פלואורסצנטי מונוכרום (Leica Microsystems, 35578). התמונות עובדו בפיג'י (ImageJ).
יצירת נוגדן pT96 NKCC2 מטוהר ארנב-אנטי-עכברייצור הנוגדנים בוצע על ידי שירות הנוגדנים Pineda (ברלין, גרמניה). ארנבות חוסנו עם פוספופפטיד הכולל את חומצות האמינו 105- 114 של רצף NKCC2 של עכבר C57BL/6 (NH2- YYLQ(p) TMDAV-COOH). חלק IgG מונוספציפי טוהר בזיקה כנגד הפוספופפטיד ולאחר מכן נספג מראש עם ה-dephosphopeptide וכתוצאה מכך נוצר שבריר נוגדנים ספציפי לפוספופורם. סגוליות נוגדנים של חלק זה נבדקה על ידי אימונוהיסטוכימיה וניתוח כתם Western (איור 5 ואיור S4).
טיפול בפוספטאזליזטים של חלבונים הודגרו במשך שעה אחת ב-37 מעלות עם פוספטאז בסיסי של מעי עגל (CIAP) (1 U/1 מיקרוגרם חלבון) כדי לגרום להידרוליזה של קבוצות 5'- פוספטים של חלבונים פוספטיים, אשר עיכבו את הקישור הספציפי של pT96 נוגדן NKCC2 לחלבונים על קרום הכתם המערבי של ניטרוצלולוזה (איור 5B). נעשה שימוש בכליות משובצות בפראפין מעכברי C57BL6. טיפול בחתכים באמצעות פוספטאז אלקליין מעי עגל (Sigma Aldrich) בוצע כמתואר קודם לכן עם שינויים קלים. 56 לאחר חסימה של קבוצות אלדהיד חופשיות, החלקים נשטפו חמש פעמים במאגר פוספטאז אלקליין (100 מ"מ Tris, 50 מיקרומטר CaCl 2, 0.1 מ"מ MgCl 2, 8.4 מיקרומטר לאופטין, 4 מ"מ Pefablock, pH 9.0). מאוחר יותר, החתכים הודגרו במאגר פוספטאז אלקליין עם או בלי פוספטאז אלקליין במעי העגל (~130 יחידות/מ"ל) באינקובטור בטמפרטורה של 35 מעלות למשך שעתיים. אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופ אור בוצעו לאחר מכן כמפורט. 57
יישור רצף חומצות אמינורצפי חומצות האמינו עבור מינים וזני עכברים שונים התקבלו מבסיס הנתונים הפתוח "Ensembl Genome Browser" (www.ensem bl.org, Sanger Institute). 42 המקורות של מזהי התמלול מפורטים בטבלה S1. הרצפים יושרו באמצעות Qiagen © CLC Main Workbench 20.
פרוסות כליהכִּליָהפרוסות של עכברים C57BL/6 שימשו עבור ניסויים לשעבר vivo כפי שתואר קודם לכן. 12 בקצרה, עכברים צמו לילה עם גישה חופשית למים כדי למנוע השפעות אפשריות של צריכת יונים בתזונה על רמות הזרחון של NKCC2 ו-NCC. כליות הוצאו מבעלי חיים מורדמים, חתכו לפרוסות בעובי 280 מיקרומטר באמצעות מכונת פריסה רוטטת (Vibratome, Microm; Thermo Scientific), והונחו בתמיסת רינגר (במ"מ): 98.5 NaCl, 25 NaHCO 3, 3 KCl, 1 Na 2 HPO 4, 2.5 CaCl 2, 1.8 MgCl 2 ו-25 גלוקוז למשך 30 דקות ב-30.5 מעלות עם בעבוע מתמיד עם 95 אחוז O 2 ו-5 אחוז CO 2. לאחר מכן, תמיסת Ringer הוחלפה בתמיסות דומות אך עם Cl - שונה (5 מ"מ עבור Cl נמוך - 110 מ"מ עבור Cl רגיל - ) וריכוזי K פלוס (3 מ"מ עבור K פלוס רגיל, 10 מ"מ עבור K פלוס גבוה) עבור 30 דקות נוספות. לבסוף, פרוסות הוקפאו בחנקן נוזלי.
סטָטִיסטִיקָהנעשה שימוש במבחן t של תלמיד בלתי מזווג ובמבחן של Welch במקרה של שונות לא שוות כדי להשוות בין שתי קבוצות (GraphPad Prism, גרסה 8.0.2). לצורך השוואה מרובה, בוצעה ANOVA חד כיוונית או דו כיוונית ולאחר מכן לאחר מבחן ההשוואה המרובה של Tukey (GraphPad Prism, גרסה 8.0.2). הנתונים מוצגים כאמצעים ± SEM (בטבלאות ואיורים). הבדלים נחשבו מובהקים כאשר P <>
תודות המחברים מודים לד"ר גארי שול (אוניברסיטת סינסינטי, סינסינאיט, OH) על סיפוק עכברי NCC-KO, ד"ר ביף פורבוש (בית הספר לרפואה ייל, ניו הייבן, CT) על הנוגדן "R5" pNKCC1 שלו, ולד"ר הנריק דימק ( אוניברסיטת דרום דנמרק, אודנס, דנמרק) עבור נוגדן NCC הכולל של העכבר החד שבטי שלו. המחברים גם מוקירים את מוניק קארל ואינג'ר מרטה פולסן על הסיוע הטכני וד"ר אסתר בנקי על הסיועכִּליָהדגימות. מדידות צפיפות מינרל העצם וחלק מניתוח השתן והפלזמה נעשו על ידי ד"ר פטרה סיבק ונדין נגלה (פיזיולוגיה אינטגרטיבית של מכרסמים בציריך, אוניברסיטת ציריך) בהתאמה. הוערך מאוד הקלט המועיל של ד"ר אלישיה מקדונו (אוניברסיטת דרום קליפורניה) ושל ד"ר אוליבייה דוויסט (אוניברסיטת ציריך).
ניגוד עניינים הקבוצה של JL מקבלת תמלוגים עבור נוגדנים מורשים נגד NCC ו-Ned פוספוריל4- 2 מ-Milipore ו-Abcam בהתאמה. שני הנוגדנים לא שימשו במחקר הנוכחי. יתרה מכך, JL קיבלה בשנת 2019 הוקרה מ-VIFOR עבור מצגת בעל פה בסימפוזיון שאורגן על ידי VIFOR.